Name: In vitro Badanie wpływu bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej na migrację komórek grzebienia nerwowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Poznaj metodę badania migracji komórek grzebienia nerwowego w macierzy zewnątrzkomórkowej bogatej w kwas hialuronowy. Technika umożliwia analizę przylegania i degradacji HA oraz screening leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażam wielkie podziękowania dla Fumitoshi Irie i Yu Yamaguchi za ich zachętę i uprzejme sugestie w ustanowieniu tej metody. Prace te były wspierane przez granty na programy badań naukowych z Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (#19KK0232 do T.I., #20H03896 do T.I.). Pierwotna metoda powlekania HA na podłożach szklanych oraz testów degradacji HA in situ na podłożach została opisana w Yamamoto i wsp. (2017)8, natomiast metoda otrzymywania substratów mieszanych HA/Col1 została opisana w Irie i wsp. (2021)7.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Wyższej Szkoły Stomatologii Uniwersytetu w Osace.
1. Hodowla komórek grzebienia nerwowego czaszki myszy
UWAGA: Linia komórkowa grzebienia nerwowego użyta w tym badaniu składa się z komórek O9-1, pierwotnie pochodzących z Wnt1-Cre; Komórki wykazujące ekspresję R26R-GFP wyizolowane z mysich zarodków E8.512 (patrz dyskusja). Opisana tutaj metoda hodowli komórek O9-1 jest zgodna z wcześniej ustalonym protokołem13.
<ol>
	<li>Przygotuj płytę pokrytą matrycą membrany podstawnej.
	<ol>
		<li>Rozmrozić matrycę błony podstawnej (patrz tabela materiałów) na lodzie. Rozcieńczyć matrycę w stosunku 1:50 w schłodzonym 1x PBS i trzymać na lodzie.</li>
		<li>Pokryć 10-centymetrową płytkę hodowlaną 10 ml rozcieńczonego roztworu macierzy błony podstawnej. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i odessać matrycę przed użyciem.</li>
		<li>Umyj płytkę 3x 2 ml PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla komórek O9-1 na płytce pokrytej matrycą błony podstawnej.
	<ol>
		<li>Ogrzać kompletną pożywkę z embrionalnych komórek macierzystych (ES) (patrz tabela materiałów) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać zawiesinę komórek O9-1 (patrz tabela materiałów) i policzyć liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz tabela materiałów). Dostosuj stężenie komórek do 1,1 × 106/ml za pomocą kompletnej pożywki komórkowej ES.</li>
		<li>Dodać 8 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki komórkowej ES do pokrytej matrycą płytki hodowlanej o średnicy 10 cm i wysiewać komórki O9-1 w proporcji 1,1 x 106 komórek/płytkę. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .</li>
		<li>Następnego dnia należy zastąpić pożywkę świeżą, kompletną pożywką z komórek ES (wstępnie podgrzaną do temperatury 37 °C). Następnie wymieniaj na świeże podłoże co 2-3 dni. 
		UWAGA: Gdy komórki są w około 80% zlewające się (3-4 dni po posiewie, można je zdysocjować za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i dalej pasażować lub zamrozić do późniejszego wykorzystania. Reprezentatywne obrazy komórek O9-1 są pokazane w Rysunek 1.</li>
		<li>Umyj płytkę hodowlaną 2 ml 1x PBS przed trypsynizacją. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Sprawdzić, czy komórki zostały całkowicie oderwane; W razie potrzeby delikatnie postukaj kilka razy w bok talerza.</li>
		<li>Dodać 2 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki z komórek ES do płytki hodowlanej i przenieść zdysocjowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o masie 300 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Odrzucić sklarowany osad bez naruszania osadu komórkowego. Następnie dodać 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki z kompletnymi komórkami ES do probówki i dokładnie zawiesić komórki przez pipetowanie. Zasiaj komórki na nowej płytce hodowlanej o pożądanej gęstości komórek.</li>
		<li>Alternatywnie, należy przygotować zamrożony wywar komórkowy, dodając 1 ml pożywki do zamrażania komórek zawierającej 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) do probówki w miejsce kompletnej pożywki z komórek ES i dokładnie zawieszając komórki. Przenieść zawiesinę komórek do probówek kriogenicznych i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie dania z HA/Col1
UWAGA: Oryginalna metoda powlekania HA/Col1 na naczyniach ze szklanym dnem została zaproponowana przez Irie et al.7.
<ol>
	<li>Ostrożnie dodać 50 μl nierozcieńczonego trietoksysilanu do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 3,5 cm (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) i chronić przed światłem. 
	UWAGA: Inkubacja z trietoksysilanem nie powinna przekraczać 5 minut. Może to wpłynąć na wydajność powlekania i wytworzyć niepożądane produkty.</li>
	<li>Umyj naczynie szybko 3x 2 ml wody destylowanej. Dodać 50 μl 0,25% aldehydu glutarowego, rozcieńczonego 100x w PBS, na miskę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj szybko 4x 2 ml PBS. Następnie obtocz naczynia w 300 μl kolagenu typu I w 0,2 N kwasie octowym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj szybko 3x 2 ml PBS. Dodać 300 μl 200 μg/ml hialuronianu sodu-H2 znakowanego fluoresceinaminą (FAHA-H2) (rozcieńczonego w PBS) do każdego naczynia i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Umyć ponownie 3x z 2 ml PBS. Po zassaniu PBS należy suszyć płytkę na powietrzu przez 5 minut na czystej ławce. 
	UWAGA: FAHA-H2 jest hialuronianem sodu znakowanym fluoresceinaminą o średniej masie cząsteczkowej w zakresie 1,200-1,600 KDa. Kwas hialuronowy o odpowiedniej masie cząsteczkowej może być stosowany zgodnie z projektem badawczym.</li>
</ol>
3. Test migracji na szalce pokrytej HA/Col1
UWAGA: Test oparty na zamykaniu ran przy użyciu zdefiniowanych 500 μm bezkomórkowych luk w substratach Col1/HA został przeprowadzony przy użyciu 2-dołkowych wkładek do hodowli (patrz Tabela Materiałów). Komórki O9-1 wyrażają Tmem2, który jest wymagany do adhezji i degradacji HA w przestrzeni zewnątrzkomórkowej9 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3).
<ol>
	<li>Po wysuszeniu powlekanego naczynia ze szklanym dnem przymocuj 2-dołkowe wkładki hodowlane do naczyń i napełnij wkładki zewnętrznie 1 ml PBS.</li>
	<li>Wysiewaj komórki O9-1 do studzienek w proporcjach 1 x 104 komórki w 100 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na wkładkę. Hodować komórki przez 2 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij wkładki z powlekanych naczyń ze szklanym dnem za pomocą pęsety. Delikatnie umyj powlekane naczynia ze szklanym dnem 2 ml 1x PBS, aby usunąć komórki i resztki komórek. Dodaj 2 ml świeżego DMEM zawierającego 2% FBS do naczyń hodowlanych.</li>
	<li>Rejestruj obrazy z kontrastem fazowym teraz jako punkt początkowy za pomocą uniwersalnego mikroskopu fluorescencyjnego w trybie monochromatycznym z ustawieniami wysokiej rozdzielczości (wzmocnienie przy 6 dB, bez binningu). W tym badaniu do obrazowania użyto soczewek obiektywowych o powiększeniach od 4x do 20x (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Uchwyć obrazy kontrastu fazowego z odpowiednimi paskami skali i zapisz je w formacie TIFF.</li>
	<li>Hodować komórki przez dodatkowe 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Rejestruj obrazy z kontrastem fazowym po 24 godzinach i 48 godzinach w hodowli za pomocą uniwersalnego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Utrwalić komórki po 48 godzinach za pomocą 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie umyj naczynia 3x po 5 minut z 1 ml świeżego PBS.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe z podłożem montażowym (patrz tabela materiałów) w celu dalszej obserwacji morfologicznej. 
	UWAGA: Naczynia można natychmiast zobrazować lub przechowywać do 2 miesięcy w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Opcjonalnie: Znakuj immunologicznie komórki pod kątem interesujących ich białek. 
	UWAGA: Protokół wykrywania kompleksu adhezji ogniskowej (FA) za pomocą mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-winkuliny (patrz tabela materiałów) jest opisany tutaj jako przykład.
	<ol>
		<li>Inkubować szalki (od kroku 3.6) z 0,5 ml buforu blokującego (5% normalnej surowicy koziej w PBS) przez 60 min. 
		UWAGA: Należy wybrać odpowiedni bufor blokujący dla przeciwciała pierwszorzędowego. Typowym buforem blokującym byłoby 5% normalnej surowicy tego samego gatunku, co zastosowane przeciwciało drugorzędowe.</li>
		<li>Przygotować rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe w buforze do rozcieńczania przeciwciał (1% normalna surowica kozia w PBS). Inkubować szalki z 0,5 ml rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Należy wybrać odpowiedni bufor do rozcieńczania przeciwciał. Zazwyczaj przeciwciało stosuje się w rozcieńczeniu 1:50-1:200.</li>
		<li>Płukać 3x przez 5 minut każdy po 2 ml PBS. Przygotować rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe przeciwko mysim pochodzącemu z kóz w buforze do rozcieńczania przeciwciał (1% normalna surowica kozia w PBS). Inkubować szalki z 0,5 ml rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego przez 1-3 godziny w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Zazwyczaj przeciwciało drugorzędowe stosuje się w rozcieńczeniu 1:500-1:1,000. DAPI może być używany do barwienia jąder.</li>
		<li>Płukać 3x 2 ml PBS przez 5 minut za każdym razem. Umieścić szkiełko nakrywkowe z 50 μl podłoża montażowego. 
		UWAGA: Naczynia można obrazować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego typu "wszystko w jednym" z filtrem GFP (wzbudzenie: 470/40, emisja: 525/50) i filtrem TexasRed (wzbudzenie: 560/40, emisja: 630/75) w trybie monochromatycznym z ustawieniami wysokiej rozdzielczości (wzmocnienie na poziomie 6 dB, bez binningu). Do obrazowania w tym badaniu użyto soczewek obiektywowych o powiększeniach od 4x do 20x. 
		UWAGA: Szkiełko można przechowywać do 2 miesięcy w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie ImageJ 1.51s. W oknie ImageJ wybierz Plik > Otwórz z paska menu, aby otworzyć zapisany plik obrazu.</li>
	<li>Aby ustawić skalę pomiaru, narysuj linię o tej samej odległości co podziałka liniowa. Przejdź do pozycji Analizuj > Ustaw skalę i wpisz znaną odległość oraz jednostki linii w odpowiednich polach w oknie Ustaw skalę.</li>
	<li>Narysuj linię prostą między odstępami między komórkami i naciśnij Analizuj > Zmierz, aby przenieść wartości do okna danych. Zmierz co najmniej pięć różnych pozycji w każdej próbce i uśrednij odległości, aby uzyskać reprezentatywne dane próbki. Analizy statystyczne należy wykonywać przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+switches+in+mammalian+neural+crest+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326(2013).</li>
<li>Casini, P., Nardi, I., Ori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+is+required+for+cranial+neural+crest+cells+migration+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development.</a> Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).</li>
<li>Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versican+is+selectively+expressed+in+embryonic+tissues+that+act+as+barriers+to+neural+crest+cell+migration+and+axon+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth.</a> Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).</li>
<li>Camenisch, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+hyaluronan+synthase-2+abrogates+normal+cardiac+morphogenesis+and+hyaluronan-mediated+transformation+of+epithelium+to+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).</li>
<li>Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-valve+mesenchyme+formation+is+dependent+on+hyaluronan-augmented+activation+of+ErbB2-ErbB3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors.</a> Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).</li>
<li>Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+hyaluronan+synthase-2+in+craniofacial+and+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development.</a> Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).</li>
<li>Irie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+surface+hyaluronidase+TMEM2+regulates+cell+adhesion+and+migration+via+degradation+of+hyaluronan+at+focal+adhesion+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100481(2021).</li>
<li>Yamamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+homolog+of+the+zebrafish+transmembrane+protein+2+%28TMEM2%29+is+the+long-sought-after+cell-surface+hyaluronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).</li>
<li>Inubushi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+surface+hyaluronidase+TMEM2+plays+an+essential+role+in+mouse+neural+crest+cell+development+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival.</a> PLoS Genetics. 18 (7), 1009765(2022).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51046(2014).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).</li>
<li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li>
<li>Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+manipulation+of+O9-1+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Humphries, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinculin+controls+focal+adhesion+formation+by+direct+interactions+with+talin+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin.</a> Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).</li>
<li>Perris, R., Perissinotto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+extracellular+matrix+during+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration.</a> Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).</li>
<li>Perris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+changes+in+the+distribution+of+proteoglycans+during+avian+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development.</a> Development. 111 (2), 583-599 (1991).</li>
<li>Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decorin+developmental+expression+and+function+in+the+early+avian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decorin developmental expression and function in the early avian embryo.</a> The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).</li>
<li>Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+avian+neural+crest+cell+migration+on+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin.</a> Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).</li>
<li>Chevalier, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+tissue+mechanical+properties+affect+enteric+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration.</a> Scientific Reports. 6, 20927(2016).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+and+Migration%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
<li>Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+methods+for+cell-cycle+synchronization+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells.</a> Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).</li>
<li>Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+T+lymphocyte+adhesion+receptor+for+an+alternative+cell+attachment+domain+%28CS-1%29+in+plasma+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin.</a> Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).</li>
<li>Robert, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+3-aminopropyltriethoxysilane+layers+formed+on+silanol-terminated+silicon+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces.</a> The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).</li>
</ol>

Autor oświadcza, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Różne komponenty ECM regulują emigrację/migrację NCC. Na przykład HA pozytywnie reguluje migrację NCC 2,15. Co ciekawe, badanie oparte na genetycznych mysich modelach Tmem2, hialuronidazy powierzchniowej komórki, wyjaśniło wymóg degradacji HA w migracji NCC9. Kolageny są również obfite w ECM otaczającym cewę nerwową16. Wykazano, że Decorin, mały proteoglikan bogaty w leucynę, reguluje migrację NCC podczas rozwoju ne...

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to multipotencjalna populacja komórek, która jest obecna w rozwijających się zarodkach i pochodzą z granicy płytki nerwowej podczas neurulacji. Przyczyniają się do tworzenia różnych tkanek, w tym obwodowego układu nerwowego, układu sercowo-naczyniowego, tkanek twarzoczaszki i szkieletu1. Po indukcji i specyfikacji NCC na granicy płytki nerwowej, NCC emigrują z nabłonka nerwowego i migrują w kierunku miejsc tkankowych pochodzących z NCC1.
Hialuronan (HA) to niesiarczanowy glikozaminoglikan rozprowadzany w różnych tkankach jako składnik macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Znaczenie kwasu hialuronowego w rozwoju zarodka wykazano w systemach modelowych poprzez ablację genów odpowiedzialnych za metabolizm kwasu hialuronowego. Na przykład stwierdzono, że mutacje w genach syntazy hialuronianu (Has1 i Has2) u Xenopus prowadzą do wad migracji NCC i wad rozwojowych twarzoczaszki2. Ponadto donoszono, że proteoglikany wiążące HA, aggrekan i versican, wywierają hamujący wpływ na migrację NCC3. U myszy ablacja Has2 prowadzi do poważnych defektów w tworzeniu poduszki wsierdziowej, co skutkuje śmiertelnością w połowie ciąży (E9.5-10)4,5,6.
Niedawno wykazano, że białko transbłonowe 2 (Tmem2), hialuronidaza powierzchniowa komórki, odgrywa kluczową rolę w promowaniu adhezji i migracji komórek rakowych za pośrednictwem integryn poprzez usuwanie HA związanego z macierzą w miejscach adhezji7,8. Niedawno Inubushi i in.9 wykazali, że niedobór Tmem2 prowadzi do poważnych wad twarzoczaszki z powodu nieprawidłowości w emigracji/migracji NCC i przeżyciu. W poprzednim badaniu9, wyrażenie Tmem2 było analizowane podczas tworzenia i migracji NCC. Ekspresję Tmem2 zaobserwowano w miejscu delaminacji NCC oraz u emigrujących Sox9-dodatnich NCC (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Dodatkowo, wykorzystując mysie komórki grzebienia czubienia O9-1 zubożone w Tmem2, badanie wykazało, że ekspresja Tmem2 in vitro była niezbędna do tworzenia przez komórki O9-1 zrostów ogniskowych i ich migracji do substratów zawierających HA (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3) < klasa sup = "xref">9.
Te wyniki zdecydowanie wskazują, że Tmem2 jest również ważny dla adhezji i migracji NCC przez ECM bogaty w HA. Jednak molekularny mechanizm adhezji i migracji NCC w ECM bogatym w HA jest nadal niejasny. W związku z tym konieczne jest ustanowienie systemu eksperymentalnego hodowli in vitro, aby w pełni zbadać adhezję i migrację NCC w obrębie ECM bogatego w HA.
Spośród licznych podejść stosowanych do testowania migracji komórek, test oparty na zamykaniu ran komórkowych jest prostą metodą często używaną w dziedzinie fizjologii i onkologii10. Podejście to jest użyteczne ze względu na jego znaczenie dla fenotypu in vivo i jest skuteczne w określaniu ról leków i chemoatraktantów podczas migracji komórek11. Możliwe jest oszacowanie zdolności migracyjnej zarówno całych mas komórek, jak i pojedynczych komórek, mierząc odległości między komórkami w czasie11. W tym manuskrypcie wprowadzono zmodyfikowany test oparty na zamykaniu ran in vitro w celu modelowania migracji NCC do tkanek bogatych w kwas hialuronowy otaczających cewę nerwową. Procedura ta ma również zastosowanie do badania różnych składników ECM (tj. kolagenów, fibronektyny i lamininy) w celu analizy roli rusztowania ECM w migracji NCC.

<table><tbody><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 10cm</td><td>CORNING</td><td>Cat. 353003</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Millipore</td><td>Cat. Nie. BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>2-dołkowe wkładki hodowlane</td><td>ibidi</td><td>Cat. Nr 80209</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 kozi anty-mysi IgG</td><td>Invitrogen Cat</td><td>. A21422</td> Automatyczny licznik komórek <td>przeciwciał wtórnych przeciw mysim przeciwciałom anty-mysim pochodzącym z kozy</td></tr><tr><td></td>, <td>Bio-Rad</td><td>Cat. Nie. TC20</td><td></td></tr><tr><td>CELLBANKER</td><td>ZENOGEN PHARMA</td><td>Kat. 11910</td><td>Medium do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>kolagen typu I</td><td>Sigma</td><td>Cat. Nr 08-115</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny ES Cell Medium</td><td>Millipore</td><td>Cat. Nie. ES-101-B</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Kat. 10184322</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s Zmodyfikowany Orzeł Średni&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>Kat. 11971025</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco</td><td>Kat. 10270106</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop fluorescencyjny</td><td>Keyence</td><td>Cat. Nie. BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresent z oznaczeniem HA</td><td>PG Research</td><td>FAHA-H2</td><td></td></tr><tr><td>Szklane naczynie dolne</td><td>Iwaki</td><td>Kat. 11-0602</td><td></td></tr><tr><td>aldehyd glulowy</td><td>Sigma</td><td>Kat. Nr G5882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher</td><td>Kat. Nie. CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało antywinkulinowe przeciwko macierzy</td> podstawnej <td>Sigma</td><td>Cat. Nie. V9264</td><td></td></tr><tr><td>nośnik montażowy</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Fisher</td><td>Cat. 50062Z</td><td></td></tr><tr><td>Komórki O9-1</td><td>Millipore</td><td>Cat. Nie. SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>Kat. 158127</td><td></td></tr><tr><td>trietoksysilan</td><td>Sigma</td><td>Cat. Nr 390143</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA</td><td>Millipore</td><td>Cat. Nie. SM-2003-C</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro badanie wpływu bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej na migrację komórek grzebienia nerwowego

In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to wysoce migrujące komórki, które pochodzą z grzbietowej części cewy nerwowej. Emigracja NCC z cewy nerwowej jest procesem niezbędnym do produkcji NCC i ich późniejszej migracji w kierunku miejsc docelowych. Droga migracyjna NCC, w tym otaczające tkanki cewy nerwowej, obejmuje macierz zewnątrzkomórkową bogatą w hialuronian (HA). Aby modelować migrację NCC do tych bogatych w HA otaczających tkanek z cewy nerwowej, w tym badaniu ustalono mieszany test migracji substratów składający się z HA (średnia masa cząsteczkowa: 1,200-1,400 kDa) i kolagenu typu I (Col1). Ten test migracji pokazuje, że komórki linii komórkowej NCC, O9-1, są silnie migrujące na mieszanym podłożu i że powłoka HA ulega degradacji w miejscu ogniskowych zrostów w trakcie migracji. Ten model in vitro może być przydatny do dalszego badania mechanistycznych podstaw związanych z migracją NCC. Protokół ten ma również zastosowanie do oceny różnych substratów jako rusztowań do badania migracji NCC.

Przeprowadzono analizę migracji na mieszanych podłożach składających się z Col1 i wysokocząsteczkowego HA (średnia masa cząsteczkowa: 1 200-1 400 kDa) zgodnie z opisanym tutaj protokołem. Stwierdzono, że komórki O9-1 znajdujące się na brzegu przerwy łatwo migrują do obszaru przerwy bogatego w HA (Rysunek 4). Immunobarwienie na marker FA, winculinę14, potwierdziło, że komórki O9-1 tworzą adhezje ogniskowe (FA) w miejscach degradacji HA (Rysunek 5</...

Ten protokół przedstawia eksperyment migracji in vitro odpowiedni do analizy funkcjonalnej cząsteczek biorących udział w migracji in vivo komórek grzebienia nerwowego do bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej.

In vitro Badanie wpływu bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej na migrację komórek grzebienia nerwowego

Neural crest cells (NCCs) are highly migratory cells that originate from the dorsal region of the neural tube. The emigration of NCCs from the neural tube ...

Kwas hialuronowy jest jedną z najobficiej występujących macierzy zewnątrzkomórkowych w modelu zwierzęcym. Wykazano znaczenie kwasu hialuronowego w rozwoju embrionalnym. Ten model in vitro jest przydatny do zbadania, w jaki sposób komórki grzebienia nerwowego przylegają i migrują w macierzy zewnątrzkomórkowej bogatej w kwas hialuronowy.Dzięki naszej technice możemy ocenić migrację i zdolność degradacji HA zarówno populacji hurtowej, jak i poszczególnych komórek w czasie. Ponadto technika ta może być stosowana do badań przesiewowych leków w celu znalezienia związku, który przyspiesza lub zapobiega degradacji HA. Na początek rozcieńczyć matrycę błony podstawnej schłodzonym PBS w stosunku 1:50 i trzymać ją na lodzie.Pokryj 10-centymetrową płytkę hodowlaną 10 mililitrami rozcieńczonego roztworu matrycy i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę. Umyj płytkę trzy razy dwoma mililitrami PBS. Aby wyhodować komórki O9-1 na płycie pokrytej matrycą, ogrzej kompletną embrionalną pożywkę macierzystą lub pożywkę z komórkami ES w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek O9-1 i policz liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Następnie dostosuj stężenie komórek do 1,1 miliona komórek na mililitr za pomocą kompletnej pożywki ES. Dodaj osiem mililitrów wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki komórkowej ES do pokrytej matrycą 10-centymetrowej płytki hodowlanej i zasiaj komórki O9-1 po 1,1 miliona komórek na płytkę.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia zastąp pożywkę świeżą, kompletną pożywką z komórek ES podgrzaną do 37 stopni Celsjusza. Następnie wymieniaj na świeże podłoże co dwa do trzech dni.Umyj płytkę hodowlaną dwoma mililitrami PBS, a następnie dodaj dwa mililitry podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA. Inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki z komórek ES do płytki hodowlanej i przenieś zdysocjowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.Odwirować probówkę o masie 300 g przez pięć minut i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodać dwa mililitry wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki z komórek ES do probówki i dokładnie zawiesić komórki przez pipetowanie. Następnie wysiewaj komórki na nowej płytce hodowlanej o pożądanej gęstości komórek.Ostrożnie dodaj 50 mikrolitrów nierozcieńczonego trietoksysilanu do naczynia ze szklanym dnem o grubości 3,5 centymetra i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Umyj naczynie trzy razy dwoma mililitrami wody destylowanej i dodaj 50 mikrolitrów 0,25% aldehydu glutarowego rozcieńczonego 100 razy w PBS na naczynie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie umyć cztery razy dwoma mililitrami PBS i pokryć naczynia 300 mikrolitrami kolagenu typu jeden na 0,2 normalnego kwasu octowego w temperaturze pokojowej przez godzinę.Ponownie umyj trzy razy dwoma mililitrami PBS. Dodaj 300 mikrolitrów po 200 mikrogramów na mililitr fluoresceinaminy, oznaczonej hialuronianem sodu H2 do każdego naczynia i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej. Umyj ponownie dwoma mililitrami PBS trzy razy.Po wysuszeniu naczynia z powlekanym szklanym dnem przymocuj dwie wkładki do hodowli studzienek do naczyń i napełnij wkładki zewnętrznie jednym mililitrem PBS. Wysiewaj komórki O9-1 do studzienek po 10 000 komórek w 100 mikrolitrach DMEM zawierających 2% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS na wkładkę. Hoduj komórki przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla, uchwyć obrazy kontrastu fazowego jako punkt początkowy, używając mikroskopu fluorescencyjnego typu "wszystko w jednym".Ostrożnie wyjmij wkładki z naczyń z powlekanym szklanym dnem za pomocą pęsety i delikatnie umyj naczynia z powlekanym szklanym dnem dwoma mililitrami PBS, aby usunąć komórki i resztki komórek. Dodaj dwa mililitry świeżego DMEM zawierającego 2% FBS do naczyń z kulturami bakterii. Hoduj komórki przez dodatkowe 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i uchwyć obrazy kontrastu fazowego po 24 godzinach i 48 godzinach w hodowli.Umyj naczynia PBS i utrwal komórki po 48 godzinach jednym mililitrem 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj naczynia trzy razy przez pięć minut, każde z jednym mililitrem świeżego PBS. Na koniec umieścić szkiełko nakrywkowe z podłożem montażowym w celu dalszej obserwacji morfologicznej.Przekroje poprzeczne cewy nerwowej zarodków flagi Tmem2 w E9.0 pokazano na tym rysunku. Sekcje na poziomie czaszki i tułowia cewy nerwowej zostały podwójnie znakowane pod kątem białka flagowego Tmem2 i hialuronianu. Ekspresję Tmem2 zaobserwowano w płytce nerwowej i obszarze granicznym cewy nerwowej, podczas gdy miejsca te były pozbawione barwienia hialuronianem.Podwójne znakowanie komórek grzebienia nerwowego dla flagi Tmem2 i Sox9 pokazano tutaj. Przekroje poprzeczne cewy nerwowej E9.0 zostały wybarwione pod kątem flagi Tmem2 i Sox9. Reprezentatywne obrazy komórek O9-1 zubożonych i kontrolnych Tmem2 hodowanych na zwykłej szalce hodowlanej pokazano na tym rysunku.Ekspresję Tmem2 w tych komórkach oceniano za pomocą qPCR z GAPDH jako wewnętrzną kontrolę normalizacji. Zubożone w Tmem2 i kontrolne komórki O9-1 hodowano przez 48 godzin na szklanych szkiełkach nakrywkowych pokrytych fluoresceinowanym hialuronanem. Aktywność degradująca hialuronian objawia się ciemnymi obszarami na tle fluorescencyjnym.Poziom degradacji hialuronianu porównano również ilościowo między komórkami zubożonymi w Tmem2 i kontrolnymi O9-1. Degradacja hialuronianu związanego z substratem w zrostach ogniskowych w komórkach O9-1 pokazano na tym rysunku. Komórki O9-1 hodowane na mieszanych substratach składających się z Col1/HA były znakowane immunologicznie przeciwciałem anty-winkulinowym.Ciemne plamy lub smugi reprezentują aktywność degradacji hialuronianu w podłożu FAHA H2. Miejsca degradacji kwasu hialuronowego i zrostów ogniskowych były kolokalizowane na mieszanych podłożach. Powlekanie naczyń ze szklanym dnem kwasem hialuronowym Coval jest krytycznym krokiem w protokole, ponieważ nieodpowiednia powłoka może spowodować, że kwas hialuronowy zostanie łatwo usunięty przez siłę mechaniczną podczas adhezji i migracji.Aby zapewnić prawidłowe pokrycie, stosujemy aldehyd glutarowy, chemicznie unieruchomiony kolagen typu pierwszego do szkła poprzez sprzężenie uzbrajające z aldehydem. Możliwe jest użycie substratu macierzy zewnątrzkomórkowej obok kolagenu typu pierwszego, ale muszą one mieć grupy uzbrajające i mogą istnieć ograniczenia w powlekaniu ich błonami na szklanych naczyniach ze względu na ich właściwości chemiczne. Dlatego może być konieczne stosowanie prób i błędów, aby określić najlepsze podejście.Ten eksperyment laboratoryjny może być pomocny w badaniu, jak działają określone cząsteczki podczas ruchu komórek grzebienia nerwowego do środowiska HA lub HA wokół cewy nerwowej. Może to być również przydatny sposób testowania leku, który może przyspieszyć lub zapobiec temu procesowi migracji. Interesujące jest wiedzieć, dlaczego Tmem2 pełni zarówno funkcje adhezji nad HA, jak i degradacji HA oraz dlaczego HA musi zostać zdegradowany w miejscu pełnej kohezji.Ponieważ kwas hialuronowy jest najpowszechniejszą substancją w macierzy zewnątrzkomórkowej, znalezienie odpowiedzi na to pytanie jest naprawdę ważne w biologii i medycynie. Ten eksperymentalny protokół jest cenny, ponieważ można go zastosować do różnych typów komórek, w tym fibroblastów skóry, komórek nabłonkowych i komórek rakowych.

in-vitro-investigation-effects-hyaluronan-rich-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Demonstrujemy, że nadekspresja receptorówy czynnika wzrostu naskórka (EGFR) zwiększa ruchliwość neuralnych komórek macierzystych (NSCs) z wykorzystaniem nowatorskiego urządzenia mikroprzepływowego opartego na żelu agarozy. Technologia ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów komórek ssaków, w których źródła komórek są ograniczone, takie jak ludzkie neuralne komórki macierzyste, a czas realizacji badania jest krytyczny.

Ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy

Obrazowanie time-lapse trójwymiarowych kultur tkankowych umożliwia badanie zachowań migracyjnych poszczególnych komórek pochodzących z wyniesienia zwojowego w reakcji na frakcjonowany ekstrakt białkowy z kory mózgu.

Zachowanie migracyjne komórek generowanych w kulturach eminencji zwojowej

Opisano metodę analizy migracji wyizolowanych komórek (komórek grzbietu neuronalnego tułowia). Metoda ta jest niedroga, łagodna i pozwala odróżnić chemotaksję zarówno od chemokinezy, jak i od innych czynników wpływających na polaryzację migracyjną, takich jak oddziaływania międzykomórkowe w pierwotnej kulturze komórek grzbietu neuronalnego tułowia.

Analiza migracji komórek grzbietowych neuralnych tułowia z wykorzystaniem zmodyfikowanego testu w komorze Zigmonda

Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.

Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić preparację premigracyjnego grzebienia nerwowego czaszki (NC) od Xenopus laevis neurulas. Te eksplantaty można posiewać na fibronektynie i hodować in vitro lub przeszczepiać z powrotem do zarodków gospodarza. Technika ta pozwala na badanie mechanizmów przejścia, migracji i różnicowania nabłonka NC do mezenchymy.

Rozwarstwienie grzebienia nerwowego Xenopus laevis do hodowli eksplantatów in vitro lub przeszczepu in vivo

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę komórek grzebienia nerwowego czaszki z modeli mysich, głównie do badania migracji komórek. Opisujemy stosowane techniki obrazowania na żywo oraz analizę zmian prędkości i kształtu komórek.

Sekcja, hodowla i analiza pierwotnych komórek grzebienia nerwowego czaszki od myszy w celu zbadania delaminacji i migracji komórek grzebienia nerwowego

Ten wszechstronny protokół opisuje izolację premigrujących komórek grzebienia nerwowego (NCC) poprzez wycięcie fałdów nerwowych czaszki z zarodków piskląt. Po posiewie i inkubacji migrujące NCC wyłaniają się z eksplantatów fałdów nerwowych, co pozwala na ocenę morfologii i migracji komórek w uproszczonym środowisku 2D.

Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

Poznaj metodę badania migracji komórek grzebienia nerwowego w macierzy zewnątrzkomórkowej bogatej w kwas hialuronowy. Technika umożliwia analizę przylegania i degradacji HA oraz screening leków.

In vitro Badanie wpływu bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej na migrację komórek grzebienia nerwowego

Przeglądaj więcej filmów