Wyznaczanie limitów termicznych dla zooplanktonu za pomocą bloku cieplnego

Ponieważ globalne temperatury nadal rosną, ilościowe określenie limitów termicznych oraz związku z aklimatyzacją i ontogenezą ma kluczowe znaczenie dla określenia podatności gatunków na przyszłe ocieplenie. W przypadku organizmów morskich o złożonej historii życia określenie limitów termicznych może być logistycznie trudne. Protokół ten wprowadza łatwą do zbudowania metodę szacowania krytycznych temperatur małych organizmów planktonowych o niewielkiej powierzchni.

Chociaż metoda została opracowana dla małego, mniej niż milimetrowego planktonu, może być zastosowana do większych organizmów morskich, które zmieściłyby się w fiolkach scyntylacyjnych o objętości około 50 mililitrów. Zacznij od podłączenia grzejnika paskowego do reostatu. Wywierć 60 otworów w siatce o wymiarach sześć na 10, aby przygotować aluminiowy blok o wymiarach 20,3 na 15,2 na pięć centymetrów i upewnij się, że otwory są oddalone o dwa centymetry od środka do środka w obu kierunkach.

Wywierć dwa dodatkowe otwory między pierwszą i drugą kolumną oraz dziewiątą i dziesiątą kolumną, dopasowując rozmiar sond regulatora temperatury. Aby utrzymać elementy na miejscu i zaizolować gotowy blok grzewczy, zbuduj obudowę z przezroczystych arkuszy akrylowych, upewniając się, że nałożenie dwóch warstw znajduje się z tyłu elementu grzejnego. W montażu końcowym nałóż pastę termiczną, aby zmaksymalizować przewodność cieplną od elementu grzejnego do bloku i od bloku do elementu chłodzącego.

Połącz łaźnię wodną z rurką Tygon i włóż sondę termostatyczną do otworów z boku bloku aluminiowego. We wszystkich wyfrezowanych otworach umieść 1,5 mililitrowe mikroprobówki wirówkowe, wypełnione wodą z kranu po brzegi. Włącz regulator temperatury i ustaw temperaturę zatrzymania grzania sondy od jednego do 35 do 37 stopni Celsjusza, a sondy drugiej do 21,5 do 22,5 stopni Celsjusza.

Obróć reostat, aby włączyć element grzejny i ustaw go na średni. Włącz łaźnię wodną i ustaw temperaturę agregatu chłodniczego na 15 stopni Celsjusza. Za pomocą termopary z elektrodą typu K sprawdzaj temperaturę wewnątrz każdej probówki mikrowirówki co 10 minut.

Dostosuj wartości punktów końcowych, zmieniając ustawienia regulatora temperatury i łaźni wodnej w razie potrzeby. Włącz recyrkulacyjną łaźnię wodną i grzałkę i ustaw je odpowiednio na 15 stopni Celsjusza i 37 stopni Celsjusza, aby wygenerować gradient temperatury od 19,5 stopnia Celsjusza do 37 stopni Celsjusza. Po umieszczeniu probówek mikrowirówek w wyfrezowanych otworach i osiągnięciu temperatury bloku grzewczego, sprawdź temperaturę wewnątrz każdej probówki mikrowirówki za pomocą termopary z elektrodą typu K.

I zanotuj te temperatury. Napełnij 1,5 mililitra mikroprobówkę wirówkową wodą morską, przefiltrowaną przez siatkę o średnicy 0,45 mikrometra. Skoncentrować kulturę badanego organizmu z odwrotnym filtrowaniem, tak aby organizmy pozostały na dnie zlewki.

Przepłukać zagęszczoną kulturę przefiltrowaną wodą morską i powtórzyć filtrowanie wsteczne jeszcze raz, aby zagęścić próbkę. Policz małe organizmy planktonowe pod mikroskopem preparacyjnym i przenieś znaną liczbę organizmów do wypełnionych do połowy probówek mikrowirówek za pomocą szklanej pipety Pasteura. Teraz dodaj przefiltrowaną wodę morską, aż końcowa objętość w tych probówkach osiągnie jeden mililitr.

Teraz umieść te rurki parami w bloku grzewczym, zaczynając od zimnego końca, aby umożliwić organizmom stopniowe rozgrzanie się do pożądanej temperatury eksperymentalnej. Odczekaj 10 minut i przenieś pary probówek do mikrowirówek do sąsiednich wywierconych otworów o wyższej temperaturze. Umieść dodatkowe pary probówek do mikrowirówek w każdym rzędzie na zimnym końcu i kontynuuj przesuwanie ich parami w kierunku cieplejszego końca.

Po napełnieniu całego bloku inkubuj go przez dwie godziny w wyznaczonej temperaturze. Pod koniec okresu inkubacji zmierz temperaturę w każdej probówce i zanotuj ją. Następnie przenieś wszystkie probówki do wstępnie oznakowanych uchwytów i inkubuj je w określonej temperaturze przez jedną godzinę, aby umożliwić regenerację.

W celu policzenia porcji żywego organizmu należy przenieść zawartość pojedynczej probówki mikrowirówki na 35-milimetrową szalkę Petriego za pomocą szklanej pipety. Pod mikroskopem preparacyjnym policz żywe i martwe organizmy i zanotuj liczby. Obserwowana liczba organizmów powinna zgadzać się z pierwotnie pobranym organizmem.

Jeśli tak się nie stanie, sprawdź bok probówek mikrowirówkowych i szalki Petriego, Wygeneruj tabelę danych w formacie CSV z interesującymi Cię nagłówkami grupującymi zmienną, temperaturą probówki w stopniach Celsjusza, liczbą żywych osób i liczbą osób martwych. Aby dopasować dane do regresji logistycznej, należy użyć uogólnionego modelu liniowego z rozkładem dwumianowym. Aby uruchomić model, wpisz source i użyj pliku języka R, modelloop.r.

Oblicz wartości predyktorów, przy których przeżyło 50% osób, aby określić medianę górnej granicy termicznej. Korzystając z tego protokołu, zmierzono przeżywalność larw piasku piaskowego, która mieściła się w zakresie temperatur od 19 do 37 stopni Celsjusza, po dwóch, czterech i sześciu dniach od zapłodnienia. Wraz z rozwojem larw piasku górna granica termiczna wzrosła z 28,6 stopni Celsjusza dwa dni po zapłodnieniu do 28,8 stopni Celsjusza po czterech dniach od zapłodnienia i około 29 stopni Celsjusza po sześciu dniach od zapłodnienia.

Czas inkubacji i rekonwalescencji zależy od gatunku. Ważne jest, aby przeprowadzić wstępny test, aby upewnić się, że wybrany czas daje wiarygodne oszacowanie żywych i martwych.