Mielinizacja in vitro aksonów obwodowych w kokulturze eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego szczura i komórek Schwanna

Model ten daje eksperymentalne możliwości badania różnych aspektów mielinizacji obwodowego układu nerwowego in vitro. Umożliwia kwantyfikację mieliny i badanie interakcji komórek Axon-Schwann. Kokultura rozwija silną mielinizację od 14 dnia.

Hodowle eksplantatów DRG zapewniają przewagę w postaci nienaruszonej architektury strukturalnej w porównaniu ze zdysocjowanymi kulturami neuronalnymi. Metoda ta jest dostępna do badań przesiewowych w kierunku związków tropotycznych w chorobach zapalnych i neurodegeneracyjnych układu nerwowego. Na początek wysterylizuj obszar roboczy w tułowiu szczura poddanego eutanazji 70% etanolem.

Otwórz nożyczkami grzbietową dolną lewą kończynę szczura i ostrożnie usuń mięsień udowy bicepsa. Rozluźnij nerw kulszowy poprzez płynne uniesienie za pomocą zakrzywionych kleszczy, upewniając się, że nie posiniaczysz nerwu. Za pomocą kleszczy przenieś przycięte nerwy do naczynia do hodowli tkankowej z lodowatym podłożem L-15 firmy Leibovitz z 50 mikrogramami na mililitr gentamycyny.

Następnie, za pomocą mikroskopu stereoskopowego, usuń tłuszcz, mięśnie i naczynia krwionośne z nerwów za pomocą dwóch par cienkich kleszczy. Zidentyfikuj bliższe i dystalne końce nerwu kulszowego i usuń epineurium za pomocą jednej pary drobnych kleszczyków w kierunku proksymalnym do dystalnego, przytrzymując bliższy koniec nerwu drugą parą cienkich kleszczy. Po przeniesieniu oczyszczonych nerwów do innego naczynia do hodowli tkankowej z lodowatą pożywką L-15 Leibovitza z Gentamycyną, należy drażnić izolowane pęczki nerwowe, aby oddzielić i wyizolować pojedyncze włókna nerwowe za pomocą dwóch par cienkich kleszczy.

Przenieś włókna nerwowe do 50-mililitrowej rurki za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej i weź jak najmniej pożywki. Następnie kilkakrotnie dodaj 50 mililitrów pożywki L 15 firmy Leibovitz z gentamycyną do włókien nerwowych w slew. Odwirować probówkę zawierającą włókna nerwowe o stężeniu 188 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po usunięciu supernatantu przenieść osad z pozostałą pożywką L-15 Leibovitza do 60-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowych. Przepłucz 50-mililitrową probówkę 10 mililitrami roztworu do trawienia enzymatycznego i dodaj go do naczynia z włóknami nerwowymi. Ostrożnie rozprowadź włókna nerwowe w naczyniu końcówką pipety.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 18 godzin. I zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając 10 mililitrów przy 40% FCS w HBSS. Przenieś strawione nerwy do 50-mililitrowej probówki i odwiruj w temperaturze 188 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odrzuceniu supernatantu zawiesić osad w 10 mililitrach DMEM zawierających 10% FCS i 50 mikrogramów na mililitr gentamycyny. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 100 mikrometrów. po odwirowaniu w stężeniu 188 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ponownie zawiesić osad z czterema mililitrami DMEM zawierającego FCS i gentamycynę.

Dodaj dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdej z dwóch 60-milimetrowych naczyń do hodowli tkankowych pokrytych polilizyną i lamininą. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, pozostawiając płytki nietknięte przez dwa dni w inkubatorze. Odwirować zawiesinę komórek Schwanna o sile 188 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić osad komórkowy w 90 mikrolitrach magnetycznego buforu do separacji komórek na jeden razy 10 do siódmej komórki.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów mikro kulek ti1 na jeden razy 10 do siódmych komórek. Zawiesinę roztworu inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza. Następnie dodaj dwa mililitry do buforu do separacji komórek magnetycznych do zawiesiny komórek.

Po odwirowaniu w temperaturze 300 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach magnetycznego buforu do separacji komórek. Umieść magnetyczną kolumnę do separacji komórek w separatorze komórek i zwilż kolumnę jednym mililitrem bufora do separacji komórek magnetycznych. Następnie nałóż do niego komórki, aby zebrać przepływ do odwirowania.

Ostrożnie wyjmij macicę od ciężarnej szczurzycy, która została poddana eutanazji i umieść ją w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej z lodowatym HBSS. Trzymając macicę za pomocą zakrzywionych kleszczy, otwórz ścianę macicy za pomocą cienkich kleszczyków. Wyjmij jeden worek owodniowy i otwórz go ostrożnie, ściskając otwór drobnymi kleszkami.

Szybko usuń wszystkie zarodki z macicy i przenieś je do naczynia wypełnionego HBSS. Delikatnie umieść tułów zarodka w 35-milimetrowym naczyniu wypełnionym HBSS. pod mikroskopem stereoskopowym Otwórz grzbietową część tułowia, aby podzielić zarodek na dwie połowy.

Obróć jedną połowę na bok i zidentyfikuj pasmo zwojów korzenia grzbietowego lub DRG, znajdujące się w linii w grzbietowej części zarodka. Wytnij DRG jako całe pasmo za pomocą cienkich kleszczy i mikronożyczek. Po umieszczeniu DRG w świeżym naczyniu wypełnionym dwoma mililitrami HBSS, oddziel pojedynczy DRG od pozostałej tkanki za pomocą drobnych kleszczyków i mikronożyczek.

Weź 4-dołkową płytkę zawierającą 190 mikrolitrów pożywki wzrostowej DRG w każdym dołku i ostrożnie przenieś pojedynczy DRG na środek każdej studzienki za pomocą drobnych kleszczyków i szpatułki. Następnie umieść kultury eksplantatów DRG w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia ostrożnie dodaj 50 mikrolitrów pożywki wzrostowej DRG do każdej studzienki i obserwuj przyleganie eksplantatu DRG i wzrost aksonów za pomocą mikroskopu codziennie.

W przypadku wspólnej hodowli w trzecim dniu hodowli eksplantatów DRG ostrożnie zastąp pożywkę wzrostową DRG 250 mikrolitrami pożywki do kohodowli zawierającej 30 000 komórek Schwanna na studzienkę. W celu przeprowadzenia barwienia immunocytochemicznego należy utrwalić komórki na szkiełkach nakrywkowych, inkubując umyte komórki DPBS w 4% paraformaldehydzie przez 10 minut. Zrób zdjęcia immunocytochemicznie wybarwionych próbek w ośmiu zdefiniowanych regionach otaczających eksplantat DRG w środku, używając odwróconego mikroskopu.

Przedstawiono tutaj wygląd komórek Schwanna o wydłużonej i wrzecionowatej morfologii oraz cienkich aksonów DRG w kokulturze. Mielinizację w kokulturze oceniano w różnych dniach poprzez barwienie eksplantatów DRG i komórek Schwanna pod kątem zasadowego białka mieliny lub MBP, tubuliny beta trzy i DAPI. Sieć aksonalna w kokulturze była gęsta i nie zmieniała się widocznie w trakcie obserwacji w czasie.

Pierwsze oznaki mielinizacji były widoczne w 10 i 12 dniu kohodowli. Od 14 dnia sygnał MVP był wyraźniejszy i wykryto aksony owinięte mieliną. Mielinizacja nasilała się wraz z czasem kohodowli do 20 dnia.

Mielinizację określono ilościowo jako stosunek MVP i beta trzech obszarów tubulinowo-dodatnich. Znaczny wzrost mielinizacji zaobserwowano w dniach 18 i 20 w porównaniu z dniem 10. Kultury eksplantatów DRG są delikatne i należy się z nimi obchodzić ostrożnie.

Na przykład po wyjęciu z inkubatora lub podczas wymiany podłoża i utrwalania. Analiza ekspresji genów w próbkach współhodowlanych może być przeprowadzona w celu bardziej szczegółowego zbadania mieliny. Tutaj wykryliśmy markery mielinowe PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 w 22 dniu.