Name: Techniki i praktyki hodowli komórkowych w celu uniknięcia zanieczyszczenia grzybami i bakteriami w laboratorium badawczym hodowli komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: Poznaj techniki hodowli komórkowej zapobiegające zanieczyszczeniu grzybami, bakteriami i mykoplazmą w laboratorium badawczym. Stosowanie czystych praktyk laboratoryjnych zapewnia zdrowie i żywotność komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca stała się możliwa dzięki finansowaniu z Instytutu Medycznego Howarda Hughesa (HHMI). Pragniemy podziękować naszej szefowej laboratorium, Jue Chen, za przeczytanie manuskryptu i za jej nieustające wsparcie, Donnie Tallent za jej pomocne edycje i komentarze, a także Jeffowi Hennefeldowi z Wydziału Technologii Informacyjnych Uniwersytetu Rockefellera za jego pomoc w tworzeniu części wideo tego manuskryptu.

1. Przygotowania 
<ol>
	<li>Ogólne
	<ol>
		<li>Nosić czysty fartuch laboratoryjny przeznaczony do noszenia tylko w pomieszczeniu do hodowli komórkowych i w żadnych innych częściach laboratorium. 
		UWAGA: Fartuch laboratoryjny nie musi być sterylny.</li>
		<li>Nosić nowe rękawice, które nie dotykały żadnych innych powierzchni. Upewnij się, że rękawice są dobrze dopasowane. Najlepsze są rękawice nitrylowe, bezpudrowe. 
		UWAGA: Rękawice nie muszą być sterylne.</li>
		<li>Aby przygotować się do pracy, spryskaj rękawice, rękawy fartuchów laboratoryjnych i wnętrze szafy bezpieczeństwa biologicznego 70% EtOH. Wytrzyj powierzchnię roboczą i szklany panel do sucha niestrzępiącym się ręcznikiem papierowym. 
		UWAGA: Użycie 70% EtOH zabija bakterie z najwyższą skutecznością16. Ręcznik papierowy nie musi być sterylny.</li>
		<li>Łaźnie wodne należy przechowywać w pomieszczeniu do hodowli komórkowych i używać ich wyłącznie do podgrzewania pożywek hodowlanych lub rozmrażania komórek. Opróżnij i umyj łaźnie wodne raz w tygodniu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi czyszczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wnętrze szafy bezpieczeństwa biologicznego
	<ol>
		<li>Ogranicz liczbę przedmiotów wnoszonych do szafki. Nie przerywaj przepływu powietrza wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego, blokując przednią lub tylną kratkę. 
		UWAGA: Zobacz Rysunek 1, aby dowiedzieć się, jak powietrze przepływa wewnątrz szafy.</li>
		<li>Spryskaj wszystkie przedmioty umieszczone w szafce 70% EtOH i wytrzyj je do sucha. Zacznij od spryskania górnej części butelki z pożywką i pracy w dół. Podobnie czystym ręcznikiem papierowym wytrzyj go do sucha, stopniowo przesuwając się do dna. Nie wracaj w kierunku czapki.</li>
		<li>Jeśli szafka jest wystarczająco duża, aby pomieścić pipety serologiczne, można je umieścić w środku, w przeciwnym razie można je przechowywać w pojemniku zamontowanym na zewnątrz szafki. Przed użyciem sprawdź, czy po obu stronach dołączonej pipety nie ma, rozdarć lub nakłuć w opakowaniu. Nie zrywaj opakowania. Zamiast tego delikatnie oderwij końce opakowania, włóż pipetę serologiczną do pomocnicy do pipet i usuń opakowanie jednym płynnym ruchem.</li>
		<li>Nie najeżdżaj kursorem na otwarte butelki lub kolby; sięgaj po otwarte butelki lub kolby, ani nie otwieraj przedmiotów nad górną częścią już otwartych przedmiotów w szafie bezpieczeństwa biologicznego. 
		UWAGA: Strumień powietrza wewnątrz szafy naciska na powierzchnię roboczą, więc wszelkie zanieczyszczenia obecne na przykład na rękawie mogą dostać się do kultur komórkowych.</li>
		<li>Nie nalewać płynów. Zamiast tego dodaj je za pomocą pipety serologicznej. Po uzupełnieniu pożywki dokładnie wymieszać zawartość i parafować butelkę. Upewnij się również, że dołączyłeś etykietę z informacją o tym, czym nośnik został uzupełniony.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Praca z przylegającymi liniami komórkowymi
<ol>
	<li>Jeśli potrzebna jest plastikowa kolba, spryskaj całą torbę i umieść ją w szafce.</li>
	<li>Do zasysania pożywki lub roztworów myjących należy używać szklanych pipet z autoklawem lub jednorazowych sterylnych pipet plastikowych. Ostrożnie zdejmij metalową nakrętkę z pojemnika do przechowywania. Odizoluj jedną szklaną pipetę, delikatnie potrząsając pojemnikiem pod kątem. Sięgając do pojemnika, unikaj dotykania innych pipet. 
	UWAGA: Z wybraną pipetą należy obchodzić się tylko z jednym końcem. </li>
	<li>Szybko wymień nakrętki na butelkach tak szybko, jak to możliwe. Umieść zaślepki na powierzchni roboczej do góry nogami, tak aby obręcz nie dotykała powierzchni roboczej. Nie chwytaj nasadki od góry ani od dołu; Zamiast tego dotknij nasadek z boków.</li>
	<li>Podczas zasysania cieczy należy użyć termosu umieszczonego na zewnątrz szafki w dodatkowym pojemniku na podłodze. 
	UWAGA: Nie wrzucaj żadnych odpadów płynnych do worków na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne, ponieważ worki będą przeciekać. Podczas pracy wewnątrz szafy powstaną odpady. Zbyt częste wsuwanie i wysuwanie rąk z szafki spowoduje przerwanie przepływu powietrza. Wszelkie odpady należy tymczasowo pozostawić w szafce. Odłóż go na bok, aby nie przerywał pracy.</li>
	<li>Obficie spryskaj rękawice 70% EtOH za każdym razem, gdy wyschną. Pocieraj dłonie o siebie, aby rękawiczki nie ociekały wodą.</li>
	<li>Jeśli pipeta serologiczna omyłkowo dotknie czegoś w szafce, nie wahaj się jej wyrzucić. Zacznij od nowa od czystej pipety serologicznej zamiast używać tej, która może być zanieczyszczona.</li>
</ol>
4. Sprawdzanie i przechowywanie komórek 
<ol>
	<li>Przed umieszczeniem komórek w inkubatorze sprawdź, jak wyglądają pod mikroskopem. Jeśli komórki zostały dokładnie zawieszone, należy obserwować pojedyncze komórki.</li>
	<li>Nie mów, nie kichaj, nie kaszl ani nie oddychaj ciężko do inkubatorów. Szybko otwieraj i zamykaj drzwi inkubatora. Pozostawienie otwartych drzwi dłużej niż jest to konieczne może spowodować przedostanie się zanieczyszczeń obecnych w powietrzu do inkubatorów. 
	UWAGA: Noszenie maski podczas pracy w pomieszczeniu do hodowli komórkowych może pomóc, ponieważ mykoplazma może być obecna w jamie ustnej człowieka. Unikaj korzystania z telefonów komórkowych w pomieszczeniu do hodowli komórkowych, ponieważ rozmowa nie jest zalecana.</li>
	<li>Upewnij się, że nakrętki wszystkich butelek są szczelnie zamknięte przed wyjęciem butelek z szafki.</li>
	<li>Pożywkę do hodowli komórkowych należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używana, ponieważ jest wrażliwa na światło.</li>
	<li>Po zakończeniu prac nad hodowlą komórkową ponownie spryskaj wnętrze szafki 70% EtOH i wytrzyj powierzchnię do sucha ręcznikiem papierowym. Opróżnij worki na śmieci stanowiące zagrożenie biologiczne. Powtórz ten proces i załóż rękawiczki podczas przełączania na inną linię komórkową.</li>
</ol>
5. Praca z liniami komórek zawiesinowych
<ol>
	<li>W przypadku komórek zawiesinowych hodowanych w szklanych kolbach, upewnij się, że rękawice są dokładnie spryskane 70% EtOH, a następnie dotknij folii aluminiowej mokrymi rękawicami i spryskaj tylko dno kolby przed umieszczeniem jej w szafce.</li>
	<li>Pobierając próbkę do zliczania komórek, wyjmij z pojemnika tylko jedną probówkę o pojemności 1,5 ml. Nie dotykaj żadnych innych rurek. Umieść nasadkę do góry nogami na powierzchni roboczej. Nie dotykaj wewnętrznej krawędzi. Obchodź się z nim ostrożnie z boków i wymień go po zakończeniu.</li>
	<li>Ostrożnie zdjąć podwójnie złożony kawałek folii aluminiowej, który pokrywa całą szyjkę kolby. Szklaną kolbę należy obchodzić wyłącznie od dołu - nie dotykać jej od szyjki - po zdjęciu folii. Użyj pipety serologicznej o pojemności 1 ml, aby pobrać próbkę do zliczenia komórek.</li>
	<li>Nie pozwól, aby media spływały po bokach kolb; jeśli tak się stanie, spryskaj ręcznik papierowy 70% EtOH i natychmiast go umyj.</li>
	<li>Upewnij się, że nakrętki i folia aluminiowa są dokręcone przed wyjęciem butelek lub kolb z szaf bezpieczeństwa biologicznego.</li>
</ol>
6. Inkubacja komórek 
<ol>
	<li>Używaj oddzielnych inkubatorów dla różnych typów komórek, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu różnych typów komórek.</li>
</ol>
7. Zbiórka odpadów płynnych
<ol>
	<li>Odpady płynne należy zbierać w syforze próżniowym umieszczonym na zewnątrz szafki na podłodze w pojemniku wtórnym oznaczonym "Odpady". 
	UWAGA: Wąż jest podłączony do wysokowydajnego filtra pochłaniającego cząstki stałe (HEPA), który jest wymieniany co miesiąc.</li>
</ol>
8. Sprzątanie
<ol>
	<li>Wyjmij worek na odpady biologiczne i umyj szklane kolby tak szybko, jak to możliwe. Zachowaj protokół mycia szkła przy zlewie. Patrz plik uzupełniający 1, aby zapoznać się z protokołem prania.</li>
	<li>Szklane naczynia do hodowli komórkowych należy sterylizować w autoklawie, zamiast wysyłać je do myjni szkła. Przechowuj go oddzielnie od naczyń szklanych w głównej części laboratorium. 
	UWAGA: Ogniwa SF-9 pozostawiają obrzeża martwych komórek z boku kolb, jeśli szkło nie jest dobrze wyszorowane. Patrz Plik Uzupełniający 1, aby zapoznać się z protokołem autoklawu.</li>
</ol>
9. Organizacja 
<ol>
	<li>Zorganizuj pomieszczenie do hodowli komórkowych tak, aby wszystkie zapasy znajdowały się w jednym obszarze, minimalizując w ten sposób potrzebę opuszczania pomieszczenia przez członków laboratorium w poszukiwaniu zapasów.</li>
	<li>Wszystkie plastikowe butelki używane do pobierania komórek, a następnie ponownie wykorzystane w hodowli komórkowej, należy oznaczyć jako "Wyłącznie do hodowli komórkowych". Używaj wyznaczonych butelek do hodowli komórkowych dla jednego określonego typu komórek. Przechowuj butelki w pomieszczeniu do hodowli komórkowych, aby mieć do nich łatwy dostęp.</li>
</ol>
10. Identyfikacja skażenia bakteriami, grzybami i mykoplazmą 
UWAGA: Nieprzestrzeganie powyższego toku pracy może prowadzić do skażenia bakteryjnego, grzybowego i mykoplazmowego.
<ol>
	<li>Zawsze przed rozpoczęciem pracy należy obserwować, czy kolby są mocno zmętnione, mają dodatkowy wzrost w postaci rozmytych kulek i gęste nagromadzenie komórek z boku, z których wszystkie są wskaźnikami zanieczyszczenia. 
	UWAGA: Doświadczone oko może odróżnić zmętnienie spowodowane zanieczyszczeniem mikrobiologicznym od rzeczywistych komórek. Podczas gdy komórki powodują, że zwykle przezroczyste podłoże wydaje się mętne, zanieczyszczenie bakteryjne powoduje duże zmętnienie o białym kolorze.
	<ol>
		<li>Wizualnie zidentyfikuj zanieczyszczenie pleśnią, zwracając uwagę na pojawienie się okrągłych, rozmytych kulek unoszących się w podłożu (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Wizualnie identyfikuj skażenie bakteryjne, jeśli podłoże jest mętne, białe lub burzliwe (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Zidentyfikuj zanieczyszczenie mykoplazmą, wykonując comiesięczny test na obecność mykoplazmy. Jeden test oparty na PCR instruuje użytkowników, aby pobrali 1,5 ml próbki komórek, przeprowadzili liczenie komórek przy użyciu 10 μl, rozcieńczyli do 0,08 x 106 komórek/ml, odwirowali komórki, zlizowali komórki za pomocą buforu zawartego w zestawie i odwirowali po raz ostatni. Supernatant jest inkubowany ze starterami, które amplifikują szereg gatunków mykoplazmy. Uruchom żel DNA, aby uwidocznić prążki. Brak prążków oznacza, że mykoplazma nie została zidentyfikowana. 
		UWAGA: To główne zanieczyszczenie może być obecne w jamie ustnej człowieka. Dobrą praktyką jest badanie pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą w komórkach po ich rozmrożeniu i przed użyciem do eksperymentów. Następnie raz w miesiącu monitoruj komórki pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą. Wiele firm oferuje zestawy do testów na mykoplazmę. Wybierz taki, który jest odpowiedni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, Z. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+substrate+recognition+by+the+multidrug+resistance+protein+MRP1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1.</a> Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).</li>
<li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+as+biological+models%3A+practical+steps+for+more+reliable+research%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research.</a> Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).</li>
<li>Segeritz, C. P., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+growing+cells+as+model+systems+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Science+Methods+for+Clinical+Researchers%22%5BJournal%5D)">Cell culture: growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li>
<li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures%3A+Incidence%2C+sources%2C+effects%2C+detection%2C+elimination%2C+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li>
<li>Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+contamination%3A+sources%2C+consequences%2C+prevention%2C+and+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination.</a> Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).</li>
<li>Nikfarjam, L., Farzaneh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+and+detection+of+mycoplasma+contamination+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture.</a> Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).</li>
<li>Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell culture contamination.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).</li>
<li>Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mycoplasma+in+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detection of Mycoplasma in cell cultures.</a> Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).</li>
<li>Barth, O. M., Majerowicz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+by+transmission+electron+microscopy+of+mycoplasma+contamination+in+sera+and+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).</li>
<li>Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+are+useful+model+systems+for+medical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines are useful model systems for medical research.</a> Cancers. 11 (8), 1098(2019).</li>
<li>Gabelli, S., Zhao, C., Oberst, J. A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you">https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you</a> (2020).</li>
<li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+contamination%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell culture contamination: an overview.</a> Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).</li>
<li>Babic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-research%3A+Incidences+of+problematic+cell+lines+are+lower+in+papers+that+use+RRIDs+to+identify+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines.</a> eLife. 8, e41676(2019).</li>
<li>Visconti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+tandem+repeat+profiling+for+the+authentication+of+cancer+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells.</a> International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).</li>
<li>Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ghosts+of+HeLa%3A+How+cell+line+misidentification+contaminates+the+scientific+literature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature.</a> PLoS One. 12 (10), 0186281(2017).</li>
<li>Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference,potency%20of%20its%20antimicrobial%20properties">https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference,potency%20of%20its%20antimicrobial%20properties</a> (2023).</li>
<li>United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf">https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf</a> (2004).</li>
<li>Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html">https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html</a> (2023).</li>
<li>Coté, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+technique+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aseptic technique for cell culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1.3 (2001).</li>
<li>Uphoff, C. C., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+Mycoplasma+contamination+from+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).</li>
<li>Bykowski, T., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aseptic technique.</a> Current Protocols in Microbiology. 56 (1), e98(2020).</li>
<li>Penning, S. D. How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article">https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article</a> (2020).</li>
<li>Phelan, K., May, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+tissue+culture+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell tissue culture techniques.</a> Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).</li>
</ol>

Autor nie ma sprzecznych interesów.

Chociaż zanieczyszczenie jest jednym z głównych problemów podczas wykonywania prac związanych z hodowlą komórkową, praktyki i techniki opisane w tym manuskrypcie pomogą złagodzić ryzyko. Kluczowe kroki obejmują noszenie czystego fartucha laboratoryjnego, który jest używany tylko w pomieszczeniu do hodowli komórkowych, używanie czystych, bezpudrowych rękawiczek, które są często spryskiwane 70% EtOH i które są zmieniane podczas przełączania między liniami komórkowymi, zachęcanie każdej osoby do niedzielenia się butelkami z...

Hodowla komórkowa ma wiele zastosowań w laboratorium badawczym. Od początków hodowli komórkowych na początku XX wieku linie komórkowe przyczyniły się do postępu nauki. Linie komórkowe mają kilka zalet; Różne linie komórkowe mogą pomóc naukowcom w badaniu biologii komórki, produkcji bakulowirusa do dalszych badań lub produkcji dużych ilości białka będącego przedmiotem zainteresowania, żeby wymienić tylko kilka1. Niektóre dodatkowe zastosowania obejmują badanie wzrostu tkanek, pomoc w rozwoju szczepionek, badania toksykologiczne, badanie roli genów w zdrowych organizmach i modelach chorobowych oraz produkcję hybrydowych linii komórkowych2,3. Linie komórkowe mogą również umożliwiać produkcję leków3. Podczas pracy z liniami komórkowymi konieczne są odpowiednie techniki aseptyki; Praktyki i techniki opisane w tym manuskrypcie mają zastosowanie w laboratoriach badawczych, w których prowadzone są prace związane z hodowlami komórkowymi. Inne warunki laboratoryjne nie są omawiane.
Zanieczyszczenie jest często głównym problemem podczas wykonywania prac związanych z hodowlą komórkową. W kontekście niniejszego artykułu zanieczyszczenie ogólnie odnosi się do grzybów i bakterii. Ogólnym celem metody przedstawionej w niniejszym artykule jest dokładne opisanie najlepszych praktyk w zakresie unikania zanieczyszczeń. Wszyscy członkowie laboratorium powinni przestrzegać tych praktyk podczas pracy w pomieszczeniu do hodowli komórkowych w laboratorium badawczym. Laboratoria powinny dopilnować, aby wszyscy pracownicy aktywnie uczestniczyli w stosowaniu tych najlepszych praktyk w celu zapobiegania zanieczyszczeniu. Wiedza na temat prawidłowych praktyk i technik pomoże zapewnić, że hodowle komórkowe pozostaną żywotne, zdrowe i wolne od zanieczyszczeń. Opracowanie tej techniki opiera się na badaniach literatury, siedmioletnim doświadczeniu w pracy z kulturami komórkowymi oraz potrzebie metody, do której mogą odwoływać się co roku zarówno nowicjusze, jak i doświadczeni pracownicy zajmujący się hodowlami komórkowymi.
Istnieje potrzeba jasnej, ustandaryzowanej techniki, którą powinny stosować wszystkie laboratoria badawcze hodowli komórkowych. Znaczna część literatury na temat zanieczyszczenia kultur komórkowych omawia wykrywanie mykoplazmy, techniki aseptyczne, źródła skażenia, eliminację zanieczyszczeń i zapobieganie poprzez stosowanie antybiotyków i regularne testy4,5,6,7,8. Chociaż informacje te są pomocne, w literaturze nie ma filmów pokazujących prawidłowe techniki hodowli komórkowych, których należy przestrzegać. Przewagą przedstawionych praktyk nad technikami alternatywnymi jest skupienie się na zapobieganiu zanieczyszczeniu, zanim do niego dojdzie, a nie na wykrywaniu i korygowaniu błędów w późniejszym czasie. Co więcej, dokładna demonstracja technik aseptycznych, dyskusja na temat zapobiegania rozwojowi grzybów i bakterii oraz informacje dotyczące przepływu powietrza w komorze bezpieczeństwa biologicznego są cenne zarówno dla początkujących, jak i doświadczonych pracowników zajmujących się hodowlami komórkowymi.
Bakterie i grzyby to dwa najczęstsze rodzaje zanieczyszczeń. W kategorii bakterii mykoplazma jest poważnym problemem ze względu na jej mały rozmiar i zdolność do namnażania się, pozostając niezauważonym. Są to samoreplikujące się organizmy bez sztywnej ściany komórkowej, które do wzrostu opierają się na komórkach eukariotycznych. Mają zmniejszone zdolności metaboliczne i mogą się znacznie namnażać, pozostając nierozpoznanymi w rutynowej kontroli wzrokowej kultur komórkowych i regularnej analizie mikroskopowej, chociaż transmisyjna mikroskopia elektronowa może wykryć mykoplazmę9,10. Ponadto mogą przechodzić przez filtry mikrobiologiczne10. Pożywka do hodowli komórkowych dostarcza mykoplazmie składników odżywczych, chociaż niestety uzupełnianie pożywki antybiotykami nie wpływa na mycoplasma10. Należy zauważyć, że generalnie nie jest konieczne uzupełnianie pożywki antybiotykami; Odpowiednie techniki powinny wystarczyć do powstrzymania zanieczyszczenia. Zakażenie mykoplazmą nie prowadzi do natychmiastowej śmierci komórki, ale jest niepokojące dla badaczy, ponieważ wpływa na odtwarzalność i jakość danych. 
Wszyscy pracownicy laboratorium powinni ściśle przestrzegać dobrych praktyk hodowli komórkowych. Kultury powinny być testowane na obecność mykoplazmy po ich zakupie, podczas ich trwającej hodowli, przed kriopkonserwacją i po rozmrożeniu z ciekłego azotu2,10. Na rynku dostępne są różne testy wykorzystujące reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), test immunoenzymatyczny (ELISA) lub barwienie immunologiczne. 3 Literatura wskazuje, że "ludzkie izolaty stanowią duży procent zanieczyszczeń mykoplazmy znajdujących się w hodowli komórkowej"5. Chociaż opisano ponad 200 gatunków mykoplazm, około sześciu z nich odpowiada za większość infekcji. Te sześć gatunków to M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale i Acholeplasma laidlawii10. Podobnie jak w przypadku innych rodzajów zanieczyszczeń, powietrze i aerozole wprowadzają je do kultur komórkowych5. Znajduje to odzwierciedlenie w innych artykułach, ponieważ "ludzki operator jest potencjalnie największym zagrożeniem w laboratorium"7. Chociaż odbywa się to poprzez błąd ludzki, ryzyko można wyeliminować, przestrzegając standardowej procedury. Wydalanie przez personel nie ogranicza się tylko do skażenia mykoplazmą; Hodowle komórkowe w jednym laboratorium są zwykle zakażone tym samym gatunkiem mykoplazmy, co wskazuje, że zanieczyszczenie rozprzestrzenia się z jednej kolby do drugiej z powodu niewłaściwych technik hodowli komórkowych10.
Zapobieganie zakażeniu krzyżowemu to także kolejny powód, dla którego powinny być przestrzegane odpowiednie techniki hodowli komórkowych. Należy zauważyć, że co najmniej 15%–18% linii komórkowych na całym świecie może być zanieczyszczonych krzyżowo lub błędnie zidentyfikowanych11,12. Oprócz testowania linii komórkowych pod kątem skażenia mykoplazmą, powinny one być również testowane pod kątem zanieczyszczenia krzyżowego10. W przypadku ludzkich linii komórkowych uwierzytelnianie linii komórkowych za pomocą niedrogiej techniki opartej na DNA, zwanej profilowaniem z krótkimi powtórzeniami tandemowymi (STR), jest obecnie międzynarodowym standardem referencyjnym, ponieważ jest to łatwy sposób na potwierdzenie tożsamości linii komórkowej2,10,13,14. STR może zidentyfikować błędnie oznakowane lub zanieczyszczone krzyżowo linie komórkowe, ale nie może wykryć nieprawidłowego pochodzenia tkankowego10,13,14. Wiarygodność danych badawczych może być zagrożona, jeśli linie komórkowe są błędnie oznakowane, błędnie zidentyfikowane lub zanieczyszczone13. Podobnie jak w przypadku innych rodzajów zanieczyszczeń, zanieczyszczenie krzyżowe może wystąpić z powodu złej techniki powodującej rozprzestrzenianie się aerozoli, błędnego kontaktu prowadzącego do wprowadzenia niewłaściwego typu komórki do kolby lub użycia tej samej butelki z pożywką i odczynników z różnymi liniami komórkowymi10. Nie powinno się dzielić butelkami z pożywką; Dzielenie jednej butelki pożywki między dwiema różnymi liniami komórkowymi może pozwolić na wymieszanie tych populacji komórek, co prowadzi do tego, że szybciej rosnący typ komórek całkowicie przejmuje kolbę. Ta zamiana nie jest zauważalna i prowadzi do błędnego etykietowania i błędnej identyfikacji2. Linia komórkowa może być również pomylona z inną, jeśli kultury zostaną pomylone podczas obchodzenia się lub etykietowania10. Należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby odczynniki, pożywki i kolby były od siebie oddzielone. Każdy członek laboratorium powinien mieć własne butelki z pożywką; Nie powinno być udostępniania między członkami laboratorium. Same linie komórkowe powinny być zakupione w wykwalifikowanym banku komórek i od odpowiedniego dostawcy. Laboratoria nie powinny dzielić się komórkami. Badania pokazują, że chociaż testy STR i mykoplazmy są regularnie stosowane, w wielu artykułach naukowych w literaturze wykorzystano już błędnie zidentyfikowane lub zanieczyszczone linie komórkowe15. Przesiewanie badań w celu znalezienia tych problematycznych dokumentów i wstecznego poinformowania czytelników o tej sprawie jest uciążliwe. Zapobieganie jest najlepszym sposobem, aby upewnić się, że ten problem nie wystąpi w pierwszej kolejności.
Prosta czynność polegająca na spryskiwaniu przedmiotów 70% EtOH może zabijać organizmy; 70% EtOH działa poprzez denaturację białek i rozpuszczanie lipidów w najbardziej zanieczyszczających organizmach, w tym bakteriach i grzybach16. Badania wykazały, że 70% to najskuteczniejsze stężenie; Białka powierzchniowe nie koagulują szybko z 70% EtOH, dzięki czemu mogą dostać się do komórki, podczas gdy zawarta w nich woda jest niezbędna do procesu denaturacji białek. Ze względu na różnicę stężeń wody i alkoholu po obu stronach ściany komórkowej, 70% EtOH dostaje się do komórki, aby denaturować zarówno białka enzymatyczne, jak i strukturalne. Jeśli w kolbach zaobserwuje się rozwój pleśni, cały inkubator musi zostać odkażony, najpierw spryskując go 70% EtOH i wycierając do sucha, a następnie 16-godzinną nocną inkubację w temperaturze 60 °C17. To zabija większość pleśni i wszelkich bakterii.
Główną zaletą praktyk prewencyjnych nad alternatywnymi technikami eliminowania skażenia po jego wystąpieniu jest to, że dzięki wczesnemu zapobieganiu skażeniu, pracownicy laboratorium mogą być pewni, że ich hodowle komórkowe są zdrowe i nie będzie wysokich kosztów związanych z dekontaminacją inkubatorów lub wyrzucaniem kultur komórkowych. Eliminacja zanieczyszczeń mykoplazmą po, na przykład, nie jest efektywna7. Wczesne poświęcenie czasu na upewnienie się, że personel laboratoryjny jest odpowiednio przeszkolony, pomieszczenie do hodowli komórkowych jest samowystarczalne, a standardowa procedura pozwoli zaoszczędzić czas i pieniądze.

<table><tbody><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14-190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 Media</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td></td></tr><tr><td>Szklana kolba z przegrodą</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td>09-552-40</td><td></td></tr><tr><td>Pipety szklane</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Pomocnica do pipet</td><td>Drummond</td><td>13-681-15A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna</td><td>Corning</td><td>07-200-573</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T75</td><td>Corning</td><td>07-202-004</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td></td></tr><tr><td>*Elementy mogą się różnić, ponieważ ten film dotyczy ogólnych technik</td><td></td><td></td><td></td> hodowli komórkowych</tr></tbody></table>

techniki i praktyki hodowli komórkowych w celu uniknięcia zanieczyszczenia grzybami i bakteriami w laboratorium badawczym hodowli komórkowych

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

Hodowla komórkowa to delikatna umiejętność niezbędna do hodowli komórek ludzkich, zwierzęcych i owadzich, lub innych tkanek, w kontrolowanym środowisku. Celem protokołu jest podkreślenie prawidłowych technik stosowanych w laboratorium badawczym, aby zapobiec zanieczyszczeniu grzybami i bakteriami. Szczególny nacisk kładzie się na uniknięcie zanieczyszczenia mykoplazmą, co stanowi poważny problem w pomieszczeniu do hodowli komórkowych ze względu na jego niewielkie rozmiary i oporność na większość antybiotyków stosowanych w hodowli komórkowej. Te same techniki zapewniają ciągły wzrost i utrzymanie zdrowych komórek. Zarówno dla nowych, jak i doświadczonych użytkowników kultur komórkowych ważne jest konsekwentne przestrzeganie tych najlepszych praktyk w celu zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia. Raz w roku laboratoria powinny dokonać przeglądu najlepszych praktyk w zakresie hodowli komórkowych i w razie potrzeby przeprowadzić dyskusję lub dodatkowe szkolenie. Podjęcie wczesnych działań w celu zapobieżenia zanieczyszczeniu w pierwszej kolejności pozwoli zaoszczędzić czas i pieniądze w porównaniu z czyszczeniem po wystąpieniu zanieczyszczenia. Uniwersalne najlepsze praktyki utrzymują hodowle komórkowe w dobrym stanie, zmniejszając w ten sposób potrzebę ciągłego rozmrażania nowych komórek, zakupu drogich pożywek do hodowli komórkowych oraz zmniejszając ilość dekontaminacji inkubatora i przestoje.

Jeśli nie będą przestrzegane właściwe techniki i praktyki hodowli komórkowej opisane w niniejszej pracy, w laboratorium badawczym może dojść do zanieczyszczenia hodowli grzybami i bakteriami. Rysunek 2 przedstawia kolby z zanieczyszczeniami w hodowlach zawiesinowych oraz przylegających.
W przypadku nieprzestrzegania technik aseptycznych, po 2–3 dniach może dojść do kontaminacji pleśnią. W hodowlach komórek w zawiesinie zauważalne są pływające w pożywce okrągłe, pu...

Ten protokół przedstawia podstawowe techniki i praktyki hodowli komórkowych, które mają być stosowane w laboratorium badawczym hodowli komórkowych, aby uniknąć zanieczyszczenia przez grzyby i bakterie. W kategorii bakterii szczególny nacisk zostanie położony na zapobieganie zakażeniu mykoplazmą.

Techniki i praktyki hodowli komórkowych w celu uniknięcia zanieczyszczenia grzybami i bakteriami w laboratorium badawczym hodowli komórkowych

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...

Hodowla komórkowa to delikatna umiejętność niezbędna do hodowli różnego rodzaju komórek i tkanek w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Podstawowym problemem podczas wykonywania prac związanych z hodowlą komórkową jest zanieczyszczenie. Zanieczyszczenie to może mieć postać bakterii, pleśni lub mykoplazmy.Techniki i praktyki przedstawione w tym filmie zapewnią, że Twoje komórki pozostaną żywotne, zdrowe i wolne od zanieczyszczeń. Praktyki te powinny być ściśle przestrzegane, a cały personel laboratoryjny powinien przechodzić szkolenie co najmniej raz w roku. Przed rozpoczęciem pracy należy założyć czysty fartuch laboratoryjny przeznaczony wyłącznie do użytku w pomieszczeniu do hodowli komórkowych.Nosić nowe rękawice, które nie dotykały żadnych innych powierzchni. Upewnij się, że rękawice są dobrze dopasowane. Najlepsze są rękawice bezpudrowe nitrylowe.Fartuch laboratoryjny i rękawice nie muszą być sterylne. Aby przygotować się do pracy, spryskaj rękawice, rękawy fartucha laboratoryjnego i wnętrze szafy bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem. Spryskaj powierzchnię roboczą, boki, tył, wszelkie przedmioty w szafce i przedni szklany panel, zarówno od wewnątrz, jak i od zewnątrz.Wytrzyj powierzchnię roboczą i szklany panel do sucha niestrzępiącym się ręcznikiem papierowym. Poświęć trochę czasu na zaaranżowanie przestrzeni roboczej wewnątrz szafki. Utrzymuj kąpiele wodne w pomieszczeniu do hodowli komórkowych i używaj ich wyłącznie do celów hodowli komórkowych, takich jak podgrzewanie pożywki lub rozmrażanie komórek.Kąpiele wodne należy opróżniać i myć raz w tygodniu. Ogranicz ilość przedmiotów wnoszonych do szafy i nie przerywaj przepływu powietrza wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego poprzez blokowanie przedniej lub tylnej kratki. Spryskaj wszystkie przedmioty umieszczone w szafce 70% etanolem i wytrzyj je do sucha.Zacznij od spryskania górnej części butelki z pożywką i schodź w dół. Za pomocą czystego ręcznika papierowego zacznij od góry butelki z mediami, aby wytrzeć ją do sucha, stopniowo kierując się ku dołowi. Nie wracaj w kierunku nasadki.Sposób działania tych szafek polega na tym, że wyciągają powietrze z pomieszczenia i samej szafki przez przednie i tylne kratki. Powietrze kieruje się w stronę tylnej części szafki i do góry. Tam zanieczyszczone powietrze przechodzi przez stertę filtrów, a część przefiltrowanego czystego powietrza jest spychana na obszar roboczy w szafie.Jeśli szafka jest wystarczająco duża, aby pomieścić pipety serologiczne, można je umieścić w środku, w przeciwnym razie można je przechowywać w pojemniku zamontowanym na zewnątrz szafy. Dobrą praktyką jest sprawdzenie, czy po obu stronach zamkniętej pipety nie ma, rozdarć lub przebić w opakowaniu przed użyciem. Nie zrywaj opakowania.Zamiast tego delikatnie obierz końce opakowania. Włożyć pipetę serologiczną do przystawki do pipet i jednym ruchem płynu usunąć opakowanie. Nie najeżdżaj kursorem na otwarte butelki lub kolby.Nie zaleca się sięgania nad otwartą butelką lub kolbą, ani pracy nad otwartymi kolbami. Przepływ powietrza wewnątrz szafek napiera na wszystko, co się w nich znajduje. Sięganie do góry pozwoli rękawowi lub rękawicy znaleźć się na przedmiotach, które mogą potencjalnie zepchnąć wszelkie zanieczyszczenia znajdujące się na rękawie, na przykład, do kultury komórkowej.Jeśli to możliwe, nie nalewaj płynów. Zamiast tego dodaj je za pomocą pipety serologicznej. Dokładnie wymieszaj zawartość i parafuj butelkę.Zapisz, czym media są uzupełnione. Jeśli pracujesz z przylegającymi kulturami i potrzebujesz plastikowej kolby, spryskaj całe opakowanie i włóż je do środka. Za każdym razem, gdy rękawice wyschną, ponownie spryskaj je etanolem.Podczas pracy z przylegającą linią komórkową należy używać autoklawowanych szklanych pipet lub jednorazowych sterylnych plastikowych pipet do zasysania pożywki lub roztworów myjących. Ostrożnie zdejmij metalową nakrętkę z pojemnika do przechowywania. Odizoluj jedną szklaną pipetę, delikatnie potrząsając pojemnikiem pod kątem.Sięgając do pojemnika, unikaj dotykania innych pipet. Z wybraną pipetą należy obchodzić się tylko z jednym końcem. Szybko wymień nakrętki na butelki i kolby tak szybko, jak to możliwe.Umieść zaślepki na powierzchni roboczej do góry nogami, tak aby obręcz nie dotykała powierzchni roboczej. Nie chwytaj za nasadkę od góry ani od dołu. Zamiast tego dotknij zaślepek z boków.Podczas zasysania cieczy należy użyć termospiratora umieszczonego na zewnątrz szafki w dodatkowym pojemniku na podłodze. Podczas pracy wewnątrz szafy powstaną odpady. Ponieważ zbyt częste wkładanie i wysuwanie rąk z szafki spowoduje przerwanie przepływu powietrza, można tymczasowo pozostawić wszelkie odpady wewnątrz szafki.Odłóż go na bok, aby nie przeszkadzał w pracy. Obficie spryskaj rękawice 70% etanolem za każdym razem, gdy wyschną. Pocieraj o siebie dłonie, aby nie ociekały wodą.Krótka uwaga na temat pipet serologicznych. Jeśli przypadkowo dotkną czegoś innego w masce, nie wahaj się ich wyrzucić. Najlepiej zacząć od nowa, używając czystej pipety serologicznej, zamiast używać takiej, która może być zanieczyszczona.Przed umieszczeniem komórek w inkubatorze sprawdź, jak wyglądają pod mikroskopem. Należy obserwować pojedyncze komórki. Oznacza to, że komórki zostały dokładnie zawieszone.Nie mów, nie kichaj, nie kaszl ani nie oddychaj ciężko do inkubatorów. Szybkie otwieranie i zamykanie drzwi inkubatora. Pozostawienie ich otwartych dłużej niż jest to konieczne może spowodować przedostanie się zanieczyszczeń obecnych w powietrzu do inkubatorów.Upewnij się, że nakrętki wszystkich butelek są dokładnie zamknięte przed wyjęciem ich z szafki. Nośnik jest światłoczuły. Powinien być przechowywany w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza, gdy nie jest używany.Po zakończeniu prac nad hodowlą komórkową ponownie spryskaj wnętrze szafki 70% etanolem i wytrzyj powierzchnię do sucha ręcznikiem papierowym. Opróżnij worek na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Powtórz ten proces i załóż rękawiczki podczas przełączania na inną linię komórkową.Podczas pracy z kulturami zawiesinowymi hodowanymi w szklanych kolbach upewnij się, że rękawice są mokre. Dotknij folii aluminiowej mokrymi rękawicami, a następnie spryskaj tylko dno kolby przed umieszczeniem jej w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Pobierając próbkę do zliczania komórek, należy wyjąć z pojemnika tylko jedną probówkę o pojemności 1,5 ml.Nie dotykaj żadnej z pozostałych rurek. Umieść nasadkę do góry nogami na powierzchni roboczej. Nie dotykaj wewnętrznej krawędzi.Obchodź się z nim ostrożnie z boków i wymień, gdy skończysz. Podczas pracy z komorami zawiesinowymi i kolbami szklanymi należy ostrożnie usunąć podwójnie złożony kawałek folii aluminiowej, który pokrywa całą szyjkę kolby. Delikatnie pociągnij za wszystkie cztery rogi i połóż folię do góry nogami na powierzchni roboczej.Szklaną kolbę należy obsługiwać tylko od dołu. Nie dotykaj go od szyi po zdjęciu folii. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 1 ml pobrać próbkę do zliczenia komórek.Nie pozwól, aby nośnik spływał po bokach kolb. Jeśli tak się stanie, spryskaj ręcznik papierowy 70% etanolem i natychmiast go posprzątaj. Upewnij się, że nakrętki lub folia aluminiowa są dokręcone przed wyjęciem butelek lub kolb z szaf bezpieczeństwa biologicznego.Używaj oddzielnych inkubatorów dla różnych typów komórek. Zapobiegnie to zanieczyszczeniu krzyżowemu różnych typów komórek. Zaleca się umieszczenie termosu do zbierania odpadów płynnych na zewnątrz szafy na podłodze w pojemniku wtórnym oznaczonym jako odpady.Wąż jest podłączony do filtra, który jest wymieniany co miesiąc. Wąż wchodzi przez bok szafki. Usuń śmieci stanowiące zagrożenie biologiczne po zakończeniu pracy.Trzymaj protokół mycia szkła na ścianie przy zlewie. Najpierw namocz wyrzucone komórki w 10% wybielaczu przez około pięć minut. Następnie wyrzucić mieszaninę wybielacza i dokładnie spłukać kolbę wodą.Dodaj mydło z wodą, bardzo dobrze wyszoruj szczotką, spłucz większą ilością wody. Ostatnim krokiem jest spłukanie szkła wodą DI na kranie po prawej stronie. Umyj szklane kolby tak szybko, jak to możliwe, dobrze wyszoruj szkło.Komórki Sf9 opuszczą tę krawędź martwych komórek, jeśli nie zostaną odpowiednio wyszorowane. Używaj tych kolb tylko do hodowli komórkowych, autoklaw szklane naczynia do hodowli komórkowych zamiast wysyłać je do myjni szkła. Użyj cyklu próżniowego w autoklawie przez 40 minut sterylizacji i 40 minut czasu schnięcia.Trzymaj go oddzielnie od naczyń szklanych w głównej części laboratorium. Zorganizuj pomieszczenie do hodowli komórkowych w taki sposób, aby wszystkie materiały znajdowały się w jednym obszarze, minimalizując w ten sposób potrzebę opuszczania pomieszczenia do hodowli komórkowych przez członków laboratorium w poszukiwaniu zapasów. Oznacz wszystkie plastikowe butelki używane do pobierania komórek i ponownie wykorzystane w hodowli komórkowej po ich zakończeniu, wyłącznie do użytku w hodowli komórkowej.Używaj wyznaczonych butelek do hodowli komórkowych dla jednego określonego typu komórek. Przechowuj te butelki w pomieszczeniu do hodowli komórkowych, aby mieć do nich łatwy dostęp. W przypadku kultur uprawianych w zawiesinie pleśń zostanie rozpoznana jako pływające kulki w pożywce.Jeśli chodzi o zanieczyszczenie bakteryjne, zmieni ono kolor podłoża na biały i mętny. Podobnie w przypadku komórek przylegających zanieczyszczenie pleśnią można łatwo rozpoznać jako rozmyte plamy. Zanieczyszczenie bakteryjne zmieni kolor podłoża na normalnie klarowne, białe i mętne.Wiele gatunków mykoplazmy można wiarygodnie zidentyfikować za pomocą testu opartego na PCR. Pasmo po lewej stronie pokazuje wzorce masy cząsteczkowej DNA. Cztery pasma po prawej stronie to kontrole pozytywne.Pod badanymi typami komórek nie pojawiają się prążki, ponieważ mykoplazma nie została wykryta. Pożywki do hodowli komórkowych zmienią kolor z czerwonego na żółty, jeśli obecne są wskaźniki pH. Żółty kolor oznacza, że pH jest niskie i należy wymienić pożywkę.Jeśli podczas liczenia komórek zaobserwuje się inne narośla lub kształty komórek pod mikroskopem świetlnym, może to być wskaźnikiem zanieczyszczenia. Należy pamiętać, że dokładne oczyszczenie hemocytometru powinno być wykonane przed liczeniem komórek, ponieważ tego typu zanieczyszczenia mogą być obecne tylko na hemocytometrze, a nie w samej kulturze komórkowej. Chociaż zanieczyszczenie jest jednym z głównych problemów podczas wykonywania prac związanych z hodowlą komórkową, ryzyko to można złagodzić, postępując zgodnie z praktykami i technikami przedstawionymi w tym filmie.Jeśli comiesięczny test na obecność mykoplazmy jest wykonywany co miesiąc, personel laboratoryjny jest szkolony co roku, a praktyki te są ściśle przestrzegane, twoje komórki pozostaną zdrowe i wolne od zanieczyszczeń. Pomoże to również obniżyć koszty związane z zakupem drogich pożywek do hodowli komórkowych, zakupem nowych komórek, a także skróci czas przestoju w odkażaniu inkubatora. Pamiętaj, że kluczem do udanej hodowli komórkowej jest wczesne działanie, aby przede wszystkim zapobiec zakażeniu.

cell-culture-techniques-practices-to-avoid-contamination-fungi

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W momencie gdy komórki osiągają konfluencję, należy je poddać subkulturze lub pasażowaniu. Niniejszy film zaprezentuje procedurę subkultury komórek adherentnych oraz zawiesinowych.

Trypsynizacja i pasażowanie komórek ssaczych

Podczas pracy w laboratorium niezbędne jest zminimalizowanie źródeł kontaminacji. Technika aseptyczna odnosi się do procedur umożliwiających przenoszenie kultur i odczynników przy jednoczesnym unikaniu kontaktu z powierzchniami nieszterylnymi. Pipety serologiczne i mikropipety są wykorzystywane do odmierzania precyzyjnych objętości bez naruszania sterylności roztworów stosowanych w eksperymentach.

Aseptyczne techniki laboratoryjne: przenoszenie objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipet

Podczas pracy z pożywkami i odczynnikami używanymi do hodowli mikroorganizmów, należy stosować technikę aseptyczną, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Do izolacji, namnażania lub oznaczania liczby bakterii i fagów rutynowo stosuje się różne metody posiewu, z których wszystkie obejmują procedury utrzymujące sterylność materiałów eksperymentalnych.

Aseptyczne techniki laboratoryjne: metody galwanizacji

Tutaj prezentujemy protokół do rozmnażania komórek Homalodisca vitripennis i HoCV-1 in vitro. Pożywkę usunięto z kultur dodatnich w stosunku do HoCV-1 i ekstrahowano RNA co 24 godziny przez 168 godzin. Przeżywalność komórek określono ilościowo za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Całe cząsteczki wirusa zostały wyekstrahowane po zakażeniu. Wyekstrahowany RNA oznaczono ilościowo metodą qRT-PCR.

Namnażanie wirusa Homalodisca coagulata-01 za pośrednictwem hodowli komórkowej Homalodisca vitripennis

Oto protokół do hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) i nerwowych komórek macierzystych (NSC) w zamkniętym systemie hodowli komórek, który pozwala na maksymalną sterylność i odtwarzalność, zastępując tradycyjną komorę bezpieczeństwa biologicznego i inkubator. To urządzenie spełnia wytyczne dobrej klinicznej praktyki produkcyjnej (cGMP) i dobrej praktyki klinicznej (cGLP).

Hodowla ludzkich pluripotencjalnych i nerwowych komórek macierzystych w zamkniętym systemie hodowli komórek do badań podstawowych i przedklinicznych

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół przygotowania wspólnej hodowli komórek kryptokokowych i ameb, która jest badana przy użyciu nieruchomych, fluorescencyjnych obrazów i obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego o wysokiej rozdzielczości. Zilustrowano tutaj, w jaki sposób dane ilościowe mogą uzupełniać takie informacje jakościowe.

Komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Protokół podsumowuje najlepsze praktyki mające na celu zminimalizowanie obciążenia biologicznego mikroorganizmów w środowisku pomieszczeń czystych i zawiera strategie, takie jak monitorowanie środowiska, monitorowanie procesów i testowanie sterylności produktu. Jest to istotne dla zakładów produkcyjnych i badawczych, które są zobowiązane do spełniania aktualnych standardów dobrej praktyki tkankowej i aktualnych standardów dobrej praktyki wytwarzania.

Strategie kontroli i monitorowania mikrobiologicznego w pomieszczeniach czystych i terapiach komórkowych

Tutaj pokazujemy, jak w naszym laboratorium rozpoczyna odcienie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych kultury linii mrożonych ręki.

Człowieka komórek ES: Kultura Od mrożone komórki

Tytuł: Enkapsulacja komórek w kropelkach

Poznaj techniki hodowli komórkowej zapobiegające zanieczyszczeniu grzybami, bakteriami i mykoplazmą w laboratorium badawczym. Stosowanie czystych praktyk laboratoryjnych zapewnia zdrowie i żywotność komórek.

Techniki i praktyki hodowli komórkowych w celu uniknięcia zanieczyszczenia grzybami i bakteriami w laboratorium badawczym hodowli komórkowych (Wideo) | JoVE Journal

Techniki i praktyki hodowli komórkowych w celu uniknięcia zanieczyszczenia grzybami i bakteriami w laboratorium badawczym hodowli komórkowych

Przeglądaj więcej filmów