Techniki i praktyki hodowli komórkowych w celu uniknięcia zanieczyszczenia grzybami i bakteriami w laboratorium badawczym hodowli komórkowych

Hodowla komórkowa to delikatna umiejętność niezbędna do hodowli różnego rodzaju komórek i tkanek w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Podstawowym problemem podczas wykonywania prac związanych z hodowlą komórkową jest zanieczyszczenie. Zanieczyszczenie to może mieć postać bakterii, pleśni lub mykoplazmy.

Techniki i praktyki przedstawione w tym filmie zapewnią, że Twoje komórki pozostaną żywotne, zdrowe i wolne od zanieczyszczeń. Praktyki te powinny być ściśle przestrzegane, a cały personel laboratoryjny powinien przechodzić szkolenie co najmniej raz w roku. Przed rozpoczęciem pracy należy założyć czysty fartuch laboratoryjny przeznaczony wyłącznie do użytku w pomieszczeniu do hodowli komórkowych.

Nosić nowe rękawice, które nie dotykały żadnych innych powierzchni. Upewnij się, że rękawice są dobrze dopasowane. Najlepsze są rękawice bezpudrowe nitrylowe.

Fartuch laboratoryjny i rękawice nie muszą być sterylne. Aby przygotować się do pracy, spryskaj rękawice, rękawy fartucha laboratoryjnego i wnętrze szafy bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem. Spryskaj powierzchnię roboczą, boki, tył, wszelkie przedmioty w szafce i przedni szklany panel, zarówno od wewnątrz, jak i od zewnątrz.

Wytrzyj powierzchnię roboczą i szklany panel do sucha niestrzępiącym się ręcznikiem papierowym. Poświęć trochę czasu na zaaranżowanie przestrzeni roboczej wewnątrz szafki. Utrzymuj kąpiele wodne w pomieszczeniu do hodowli komórkowych i używaj ich wyłącznie do celów hodowli komórkowych, takich jak podgrzewanie pożywki lub rozmrażanie komórek.

Kąpiele wodne należy opróżniać i myć raz w tygodniu. Ogranicz ilość przedmiotów wnoszonych do szafy i nie przerywaj przepływu powietrza wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego poprzez blokowanie przedniej lub tylnej kratki. Spryskaj wszystkie przedmioty umieszczone w szafce 70% etanolem i wytrzyj je do sucha.

Zacznij od spryskania górnej części butelki z pożywką i schodź w dół. Za pomocą czystego ręcznika papierowego zacznij od góry butelki z mediami, aby wytrzeć ją do sucha, stopniowo kierując się ku dołowi. Nie wracaj w kierunku nasadki.

Sposób działania tych szafek polega na tym, że wyciągają powietrze z pomieszczenia i samej szafki przez przednie i tylne kratki. Powietrze kieruje się w stronę tylnej części szafki i do góry. Tam zanieczyszczone powietrze przechodzi przez stertę filtrów, a część przefiltrowanego czystego powietrza jest spychana na obszar roboczy w szafie.

Jeśli szafka jest wystarczająco duża, aby pomieścić pipety serologiczne, można je umieścić w środku, w przeciwnym razie można je przechowywać w pojemniku zamontowanym na zewnątrz szafy. Dobrą praktyką jest sprawdzenie, czy po obu stronach zamkniętej pipety nie ma, rozdarć lub przebić w opakowaniu przed użyciem. Nie zrywaj opakowania.

Zamiast tego delikatnie obierz końce opakowania. Włożyć pipetę serologiczną do przystawki do pipet i jednym ruchem płynu usunąć opakowanie. Nie najeżdżaj kursorem na otwarte butelki lub kolby.

Nie zaleca się sięgania nad otwartą butelką lub kolbą, ani pracy nad otwartymi kolbami. Przepływ powietrza wewnątrz szafek napiera na wszystko, co się w nich znajduje. Sięganie do góry pozwoli rękawowi lub rękawicy znaleźć się na przedmiotach, które mogą potencjalnie zepchnąć wszelkie zanieczyszczenia znajdujące się na rękawie, na przykład, do kultury komórkowej.

Jeśli to możliwe, nie nalewaj płynów. Zamiast tego dodaj je za pomocą pipety serologicznej. Dokładnie wymieszaj zawartość i parafuj butelkę.

Zapisz, czym media są uzupełnione. Jeśli pracujesz z przylegającymi kulturami i potrzebujesz plastikowej kolby, spryskaj całe opakowanie i włóż je do środka. Za każdym razem, gdy rękawice wyschną, ponownie spryskaj je etanolem.

Podczas pracy z przylegającą linią komórkową należy używać autoklawowanych szklanych pipet lub jednorazowych sterylnych plastikowych pipet do zasysania pożywki lub roztworów myjących. Ostrożnie zdejmij metalową nakrętkę z pojemnika do przechowywania. Odizoluj jedną szklaną pipetę, delikatnie potrząsając pojemnikiem pod kątem.

Sięgając do pojemnika, unikaj dotykania innych pipet. Z wybraną pipetą należy obchodzić się tylko z jednym końcem. Szybko wymień nakrętki na butelki i kolby tak szybko, jak to możliwe.

Umieść zaślepki na powierzchni roboczej do góry nogami, tak aby obręcz nie dotykała powierzchni roboczej. Nie chwytaj za nasadkę od góry ani od dołu. Zamiast tego dotknij zaślepek z boków.

Podczas zasysania cieczy należy użyć termospiratora umieszczonego na zewnątrz szafki w dodatkowym pojemniku na podłodze. Podczas pracy wewnątrz szafy powstaną odpady. Ponieważ zbyt częste wkładanie i wysuwanie rąk z szafki spowoduje przerwanie przepływu powietrza, można tymczasowo pozostawić wszelkie odpady wewnątrz szafki.

Odłóż go na bok, aby nie przeszkadzał w pracy. Obficie spryskaj rękawice 70% etanolem za każdym razem, gdy wyschną. Pocieraj o siebie dłonie, aby nie ociekały wodą.

Krótka uwaga na temat pipet serologicznych. Jeśli przypadkowo dotkną czegoś innego w masce, nie wahaj się ich wyrzucić. Najlepiej zacząć od nowa, używając czystej pipety serologicznej, zamiast używać takiej, która może być zanieczyszczona.

Przed umieszczeniem komórek w inkubatorze sprawdź, jak wyglądają pod mikroskopem. Należy obserwować pojedyncze komórki. Oznacza to, że komórki zostały dokładnie zawieszone.

Nie mów, nie kichaj, nie kaszl ani nie oddychaj ciężko do inkubatorów. Szybkie otwieranie i zamykanie drzwi inkubatora. Pozostawienie ich otwartych dłużej niż jest to konieczne może spowodować przedostanie się zanieczyszczeń obecnych w powietrzu do inkubatorów.

Upewnij się, że nakrętki wszystkich butelek są dokładnie zamknięte przed wyjęciem ich z szafki. Nośnik jest światłoczuły. Powinien być przechowywany w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza, gdy nie jest używany.

Po zakończeniu prac nad hodowlą komórkową ponownie spryskaj wnętrze szafki 70% etanolem i wytrzyj powierzchnię do sucha ręcznikiem papierowym. Opróżnij worek na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Powtórz ten proces i załóż rękawiczki podczas przełączania na inną linię komórkową.

Podczas pracy z kulturami zawiesinowymi hodowanymi w szklanych kolbach upewnij się, że rękawice są mokre. Dotknij folii aluminiowej mokrymi rękawicami, a następnie spryskaj tylko dno kolby przed umieszczeniem jej w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Pobierając próbkę do zliczania komórek, należy wyjąć z pojemnika tylko jedną probówkę o pojemności 1,5 ml.

Nie dotykaj żadnej z pozostałych rurek. Umieść nasadkę do góry nogami na powierzchni roboczej. Nie dotykaj wewnętrznej krawędzi.

Obchodź się z nim ostrożnie z boków i wymień, gdy skończysz. Podczas pracy z komorami zawiesinowymi i kolbami szklanymi należy ostrożnie usunąć podwójnie złożony kawałek folii aluminiowej, który pokrywa całą szyjkę kolby. Delikatnie pociągnij za wszystkie cztery rogi i połóż folię do góry nogami na powierzchni roboczej.

Szklaną kolbę należy obsługiwać tylko od dołu. Nie dotykaj go od szyi po zdjęciu folii. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 1 ml pobrać próbkę do zliczenia komórek.

Nie pozwól, aby nośnik spływał po bokach kolb. Jeśli tak się stanie, spryskaj ręcznik papierowy 70% etanolem i natychmiast go posprzątaj. Upewnij się, że nakrętki lub folia aluminiowa są dokręcone przed wyjęciem butelek lub kolb z szaf bezpieczeństwa biologicznego.

Używaj oddzielnych inkubatorów dla różnych typów komórek. Zapobiegnie to zanieczyszczeniu krzyżowemu różnych typów komórek. Zaleca się umieszczenie termosu do zbierania odpadów płynnych na zewnątrz szafy na podłodze w pojemniku wtórnym oznaczonym jako odpady.

Wąż jest podłączony do filtra, który jest wymieniany co miesiąc. Wąż wchodzi przez bok szafki. Usuń śmieci stanowiące zagrożenie biologiczne po zakończeniu pracy.

Trzymaj protokół mycia szkła na ścianie przy zlewie. Najpierw namocz wyrzucone komórki w 10% wybielaczu przez około pięć minut. Następnie wyrzucić mieszaninę wybielacza i dokładnie spłukać kolbę wodą.

Dodaj mydło z wodą, bardzo dobrze wyszoruj szczotką, spłucz większą ilością wody. Ostatnim krokiem jest spłukanie szkła wodą DI na kranie po prawej stronie. Umyj szklane kolby tak szybko, jak to możliwe, dobrze wyszoruj szkło.

Komórki Sf9 opuszczą tę krawędź martwych komórek, jeśli nie zostaną odpowiednio wyszorowane. Używaj tych kolb tylko do hodowli komórkowych, autoklaw szklane naczynia do hodowli komórkowych zamiast wysyłać je do myjni szkła. Użyj cyklu próżniowego w autoklawie przez 40 minut sterylizacji i 40 minut czasu schnięcia.

Trzymaj go oddzielnie od naczyń szklanych w głównej części laboratorium. Zorganizuj pomieszczenie do hodowli komórkowych w taki sposób, aby wszystkie materiały znajdowały się w jednym obszarze, minimalizując w ten sposób potrzebę opuszczania pomieszczenia do hodowli komórkowych przez członków laboratorium w poszukiwaniu zapasów. Oznacz wszystkie plastikowe butelki używane do pobierania komórek i ponownie wykorzystane w hodowli komórkowej po ich zakończeniu, wyłącznie do użytku w hodowli komórkowej.

Używaj wyznaczonych butelek do hodowli komórkowych dla jednego określonego typu komórek. Przechowuj te butelki w pomieszczeniu do hodowli komórkowych, aby mieć do nich łatwy dostęp. W przypadku kultur uprawianych w zawiesinie pleśń zostanie rozpoznana jako pływające kulki w pożywce.

Jeśli chodzi o zanieczyszczenie bakteryjne, zmieni ono kolor podłoża na biały i mętny. Podobnie w przypadku komórek przylegających zanieczyszczenie pleśnią można łatwo rozpoznać jako rozmyte plamy. Zanieczyszczenie bakteryjne zmieni kolor podłoża na normalnie klarowne, białe i mętne.

Wiele gatunków mykoplazmy można wiarygodnie zidentyfikować za pomocą testu opartego na PCR. Pasmo po lewej stronie pokazuje wzorce masy cząsteczkowej DNA. Cztery pasma po prawej stronie to kontrole pozytywne.

Pod badanymi typami komórek nie pojawiają się prążki, ponieważ mykoplazma nie została wykryta. Pożywki do hodowli komórkowych zmienią kolor z czerwonego na żółty, jeśli obecne są wskaźniki pH. Żółty kolor oznacza, że pH jest niskie i należy wymienić pożywkę.

Jeśli podczas liczenia komórek zaobserwuje się inne narośla lub kształty komórek pod mikroskopem świetlnym, może to być wskaźnikiem zanieczyszczenia. Należy pamiętać, że dokładne oczyszczenie hemocytometru powinno być wykonane przed liczeniem komórek, ponieważ tego typu zanieczyszczenia mogą być obecne tylko na hemocytometrze, a nie w samej kulturze komórkowej. Chociaż zanieczyszczenie jest jednym z głównych problemów podczas wykonywania prac związanych z hodowlą komórkową, ryzyko to można złagodzić, postępując zgodnie z praktykami i technikami przedstawionymi w tym filmie.

Jeśli comiesięczny test na obecność mykoplazmy jest wykonywany co miesiąc, personel laboratoryjny jest szkolony co roku, a praktyki te są ściśle przestrzegane, twoje komórki pozostaną zdrowe i wolne od zanieczyszczeń. Pomoże to również obniżyć koszty związane z zakupem drogich pożywek do hodowli komórkowych, zakupem nowych komórek, a także skróci czas przestoju w odkażaniu inkubatora. Pamiętaj, że kluczem do udanej hodowli komórkowej jest wczesne działanie, aby przede wszystkim zapobiec zakażeniu.