Wykrywanie i oznaczanie ilościowe peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) w osoczu ludzkim przy użyciu zmodyfikowanego testu immunoenzymatycznego

Ten zmodyfikowany protokół ELISA pozwala na oczyszczenie i dokładne określenie ilościowe CGRP w ludzkim osoczu. Został on poddany niezbędnym eksperymentom walidacyjnym i może posłużyć do standaryzacji przyszłych metodologii kwantyfikacji. Protokół ten ma zalety polegające na włączeniu przetwarzania próbki przed znaczną degradacją proteazy, oczyszczaniu poprzez ekstrakcję do fazy stałej oraz ograniczeniu niespecyficznego wiązania poprzez zastosowanie buforu blokującego na płytki mikromiareczkowe.

CGRP odgrywa karzącą rolę w patofizjologii migreny i może być kandydatem do statusu biomarkera. Jest również zaangażowany w procesy chorobowe kardiologiczne, dermatologiczne, wirusowe, a nawet związane z COVID-19. Na początek zbierz 5 mililitrów pełnej krwi z żyły łokciowej za pomocą standardowych metod nakłucia żyły do 6-mililitrowej probówki EDTA z podciśnieniem.

Aby zablokować lizę docelowego peptydu, dodaj 0,5 mililitra konkurencyjnego inhibitora proteazy serynowej aprotyniny. Odwróć rurkę 10 razy i przechowuj ją na lodzie do następnego kroku. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 600 4 g przez cztery minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

I przenieś frakcję osocza do sterylnej kriofiolki o pojemności 2 mililitrów z okrągłym dnem. Fiolkę kriograficzną należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez okres do dwóch tygodni. Aby wyekstrahować próbkę osocza, umieść wkład ekstrakcyjny w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.

Przepuść 5 mililitrów 100% metanolu, a następnie 10 mililitrów ultraczystej wody przez wkład, aby go aktywować. Płyn zostanie zebrany w rurce, gdy przejdzie przez wkład przez przepływ napędzany grawitacyjnie. Nadmiar nagromadzonego płynu należy wyrzucić, aby zapobiec jego pochłonięciu przez wkład i upewnić się, że nie wyschnie on podczas eksperymentu.

Rozcieńczyć 250 mikrolitrów osocza w 750 mikrolitrach 4% kwasu octowego i powoli przepuścić go przez wkład. Następnie umyj wkład 10 mililitrami kwasu octowego. Po usunięciu nadmiaru płynu przenieś wkład do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.

Przygotuj 3 mililitry roztworu kwasu octowego metanolu do elucji peptydu związanego z genem kalcytoniny lub CGRP. Przepuść 1 mililitr przez wkład i odczekaj 25 minut między każdą elucją. Po ostatniej elucji probówka zawiera 3 mililitry całkowitego eluantu.

Przenieś 1 mililitr eluantu do mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,7 mililitra i wiruj w mini wirówce przez jedną sekundę, aby osadzić eluant. Następnie wysuszyć próbkę w wirówce próżniowej przy prędkości 1 400 obr./min i 4 stopniach Celsjusza. Bezpośrednio przed badaniem należy rozpuścić wysuszoną próbkę za pomocą rozmrożonego testu immunoenzymatycznego lub buforu EIA.

W celu zablokowania płytki dodaj 250 mikrolitrów buforu blokującego żelatynę rybną TBS do każdej studzienki. Umieścić arkusz przykrywający na płytce i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji zdjąć arkusz pokrywy i opróżnić płytkę, odwracając ją.

Następnie osusz talerz na ręczniku papierowym, aby wyrzucić wszelkie śladowe ilości płynu i wysusz go w okapie z przepływem laminarnym przez 10 minut. Gdy płytka jest widocznie sucha, umieść ją w szczelnie zamkniętej torebce foliowej z saszetką ze środkiem osuszającym z żelem krzemionkowym. Przechowuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Przed wykonaniem testu należy rozmrozić wszystkie próbki i przygotowane odczynniki w temperaturze pokojowej. Aby przepłukać dołki płyty blokowej, dodaj 300 mikrolitrów buforu do płukania i pozostaw na 30 sekund. Następnie wyrzuć bufor do płukania i powtórz płukanie pięć razy.

Po ostatnim płukaniu osusz płytkę, jak pokazano wcześniej. Następnie należy dozować 100 mikrolitrów buforu EIA do dedykowanych dwóch niespecyficznych studzienek wiążących lub NSB. Dodać 100 mikrolitrów wzorców CGRP, a następnie odtworzyć próbkę i przeprowadzić kontrolę jakości w dwóch egzemplarzach do odpowiednich studzienek.

Dodaj 100 mikrolitrów znacznika CGRP do każdego dołka, z wyjątkiem studzienek ślepych. Na koniec należy uszczelnić płytkę za pomocą przezroczystej pokrywy, upewniając się, że próbki i odczynniki nie odparują, a następnie inkubować płytkę przez 16 do 20 godzin w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po zakończeniu okresu inkubacji przygotuj odczynnik Ellmana zgodnie z instrukcjami producenta.

Po zdekantacji płytki umyj każdą studzienkę trzy razy, jak pokazano wcześniej. Po ostatnim płukaniu potrząsaj płytką z prędkością 120 obr./min przez dwie minuty. Ponownie trzykrotnie opłucz talerz i osusz go.

Postukaj w odwróconą płytkę, aż płyn zostanie widocznie usunięty z dołków. Następnie dodaj 200 mikrolitrów odczynnika Ellmana do każdej studzienki z wyjątkiem studzienek ślepych. Po przykryciu płytki zawiń ją w folię aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło, i inkubuj ją w ciemności w temperaturze pokojowej przez godzinę przed zapisaniem absorbancji.

Niniejsze badanie wykazało, że dodanie etapu blokującego, wskaźniki odzysku w każdej próbce skoku CGRP mieściły się w dopuszczalnym zakresie. Jednakże, gdy etap blokowania został wykluczony, niespecyficzne wiązanie spowodowało przekroczenie górnej granicy 125%Ważne jest, aby dodać aprotyninę do przechowywania próbek krwi wkrótce po pobraniu, aby ograniczyć degradację CGRP. Dodatkowo, bufor blokujący powinien zostać dodany do płytki mikromiareczkowej przed testem ELISA, aby jeszcze bardziej ograniczyć niespecyficzne wiązanie.

Tak więc protokół ten można wykorzystać do zbadania kandydatury CGRP jako biomarkera migreny przedsionkowej poprzez ilościowe określenie poziomów CGRP u pacjentów z migreną i migreną przedsionkową w osoczu w porównaniu z grupą kontrolną.