Name: Wykrywanie i oznaczanie ilościowe peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) w osoczu ludzkim przy użyciu zmodyfikowanego testu immunoenzymatycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Naucz się zmodyfikowanego protokołu ELISA do wykrywania i oznaczania ilościowego peptydu CGRP w osoczu ludzkim. Ta metoda umożliwia standaryzację badań nad CGRP jako potencjalnym biomarkerem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Robertowi N. Cole'owi, Lauren R. DeVine i Marcosowi Iglesiasowi za ich pomocne dyskusje na temat tego protokołu. Było to częściowo wspierane przez fundusze z Amerykańskiego Towarzystwa Otologicznego (Fellowship Grant, PSK), American Hearing Research Foundation (90066548/90072266, JPC) oraz National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), składnika National Institutes of Health (NIH), oraz Mapa drogowa NIH dla badań medycznych (UL1 TR003098, NSF). Wyłączną odpowiedzialność za treść publikacji ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne stanowisko Johns Hopkins ICTR, NCATS lub NIH.

Ten protokół został opracowany przy użyciu próbek ludzkiego osocza od osób, które wyraziły na to zgodę, za zgodą Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491).
1. Pobieranie i przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Zebrać 5 ml krwi pełnej z żyły łokciowej za pomocą standardowych metod nakłucia żyły34 do probówki o pojemności 6 ml z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) o pojemności 6 ml.</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml konkurencyjnego inhibitora proteazy serynowej aprotyniny (10 000 KIU/ml) do probówki po pobraniu, aby zablokować lizę docelowego peptydu. Odwróć probówkę 10 razy, aby aprotynina odpowiednio wymieszała się z krwią. Następnie przechowuj probówki na lodzie do następnego kroku.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 604 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C w ciągu 60 minut od pobrania krwi.</li>
	<li>Pobrać frakcję osocza za pomocą pipety i przenieść do 2 ml sterylnych kriowiali okrągłodennych.</li>
	<li>Kriowiale należy natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 2 tygodni.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek osocza
<ol>
	<li>Umieścić wkład ekstrakcyjny w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w taki sposób, aby zewnętrzne grzbiety wkładu były wsparte na zewnętrznych grzbietach probówki.</li>
	<li>Aktywuj wkład, przepuszczając przez niego najpierw 5 ml 100% metanolu, a następnie 10 ml ultraczystej wody.
	<ol>
		<li>Gdy płyn przepływa przez wkład za pomocą przepływu napędzanego grawitacją, gromadzi się w rurce.</li>
		<li>Wylej nadmiar płynu, gdy się gromadzi, aby upewnić się, że płyn nie pochłonie wkładu.</li>
		<li>Upewnij się, że wkład nie wyschnie w trakcie eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć 250 μl osocza 750 μl 4% kwasu octowego.</li>
	<li>Przepuścić powoli 1 ml roztworu osocza i kwasu octowego przez wkład. 
	UWAGA: Ten krok powinien zająć około 30 s przy przepływie grawitacyjnym na każdy przepuszczony mililitr.</li>
	<li>Umyj wkład 10 ml 4% kwasu octowego. Tak jak poprzednio, wylej nadmiar płynu, gdy się gromadzi, aby upewnić się, że płyn nie pochłonie wkładu.</li>
	<li>Po uwolnieniu ostatniej kropli kwasu octowego z wkładu wyjmij wkład z probówki i umieść go w nowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przygotuj roztwór 10:1 100% metanolu i 4% kwasu octowego, mieszając 2,7 ml 4% kwasu octowego i 0,3 ml 100% metanolu. Użyj tego do elucji CGRP, przepuszczając ten roztwór przez wkład po 1 ml na raz. Przerwa na 25 minut między każdym mililitrem roztworu. NIE wyrzucaj eluentu.</li>
	<li>Probówka będzie zawierała 3 ml eluowanego płynu 25 minut po upływie ostatniego mililitra roztworu metanolu i kwasu octowego. Umieścić każdy 1 ml eluentu w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. 
	UWAGA: Powinno to dać trzy probówki do mikrowirówek z każdego wkładu.</li>
	<li>Umieść każdą probówkę w mini wirówce na 1 s, aby upewnić się, że cały eluent znajduje się na dnie każdej probówki.</li>
	<li>Wysuszyć wszystkie próbki przez odwirowanie próżniowe w temperaturze 4 °C (ustawione na funkcję koncentratora, dla roztworów wodnych, przy 1 400 obr./min; siła g zmienia się w zależności od położenia probówek i dlatego waha się od 130 do 250 x g). 
	UWAGA: Czas potrzebny na wysuszenie próbek przez wirówkę próżniową będzie zależał od rodzaju użytej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Bezpośrednio przed przystąpieniem do procedury oznaczania (etap 4.1) należy rozpuścić uprzednio wysuszoną próbkę w buforze testu immunoenzymatycznego (EIA) (patrz tabela materiałów) rozmrożoną do temperatury pokojowej (RT) lub 20 °C. 
	UWAGA: Objętość bufora EIA użytego do odtworzenia wysuszonej próbki powinna być równa pierwotnej objętości próbki, czyli 250 μl.</li>
</ol>
3. Przygotowanie płytki ELISA - blokowanie w celu ograniczenia niespecyficznego wiązania
<ol>
	<li>Dodać 250 μl soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS)/buforu blokującego żelatynę rybną do każdego dołka na płytce.</li>
	<li>Umieścić arkusz przykrywający na płytce i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zdejmij pokrywę i opróżnij płytkę przez odwrócenie lub zassanie za pomocą pipety wielokanałowej. Następnie osusz talerz ręcznikiem papierowym, aby usunąć wszelkie ślady płynu.</li>
	<li>Wysuszyć płytkę, pozostawiając ją w okapie z przepływem laminarnym na 10 minut.</li>
	<li>Po widocznym wyschnięciu płytki umieścić ją w szczelnie zamkniętej torebce foliowej z saszetką ze środkiem osuszającym z żelem krzemionkowym i przechowywać torebkę w temperaturze -20 °C przez 24 godziny 
	UWAGA: Płytki należy zużyć w ciągu 4 tygodni od inkubacji płytki.</li>
</ol>
4. Przed procedurą testową
<ol>
	<li>Przygotuj odczynniki (bufor EIA, wzorzec CGRP, kontrola jakości CGRP, znacznik CGRP, bufor do płukania) zgodnie z instrukcją zestawu. Odczynnik Ellmana należy przygotować dopiero po zakończeniu 16-20 godzinnego okresu inkubacji.</li>
	<li>Rozmrozić wszystkie próbki i odczynniki do RT przed wykonaniem pozostałej części protokołu.</li>
</ol>
5. Procedura testowa
<ol>
	<li>Przepłukać każdą studzienkę w zablokowanej płytce pięć razy za pomocą dostarczonego w zestawie buforu do płukania (300 μl/studzienkę). Przy każdym płukaniu należy zrobić przerwę 30 s po umieszczeniu buforu płuczącego w studzienkach, a następnie wylać płyn lub odessać za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu należy usunąć cały bufor z dołków przez odwrócenie (odwrócenie płytki w celu usunięcia cieczy z dołków) lub aspirację za pomocą pipety wielokanałowej. Ostatnie krople zetrzyj na ręczniku papierowym i postukaj w odwróconą płytkę, aż cały płyn zostanie widocznie usunięty z dołków.</li>
	<li>Odłóż na bok co najmniej dwie studzienki bez odczynników lub buforu, które będą znane jako studzienki "ślepe". Następnie odłóż na bok co najmniej dwie inne studzienki do niespecyficznego wiązania (NSB).</li>
	<li>Dozować 100 μl buforu EIA do każdej studzienki NSB.</li>
	<li>Dozować 100 μl wzorców CGRP w dwóch egzemplarzach do odpowiednich studzienek.</li>
	<li>Dozować 100 μl próbek (rozpuszczonych w buforze OOŚ) i przeprowadzić kontrolę jakości w dwóch egzemplarzach do odpowiednich studzienek.</li>
	<li>Dozuj 100 μl znacznika CGRP (przeciwciało anty-CGRP przyłączone do acetylocholinoesterazy) do każdej studzienki zawierającej NSB, wzorce CGRP, próbki i kontrolę jakości. Nie dozuj znacznika do "pustych" studzienek.</li>
	<li>Przykryć płytkę przezroczystą pokrywą, uszczelniając każdą studzienkę w taki sposób, aby próbki i odczynniki w każdym studzienku nie uległy znacznemu odparowaniu. Inkubować płytkę przez 16-20 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji rozpuść odczynnik Ellmana zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu.</li>
	<li>Odwróć płytkę, aby usunąć cały płyn. Przepłukać każdą studzienkę (jak opisano powyżej) trzykrotnie 300 μl buforu do płukania.</li>
	<li>Po trzecim płukaniu usuń płyn z płytek, umieść płytkę na płycie wytrząsającej i potrząsaj z prędkością 120 obr./min przez 2 minuty.</li>
	<li>Umyj talerz dodatkowo trzy razy. Po ostatnim płukaniu usunąć cały bufor ze studzienek przez odwrócenie lub aspirację za pomocą pipety wielokanałowej. Ostatnie krople płynu wytrzyj na ręczniku papierowym i postukaj w odwróconą płytkę, aż cały płyn zostanie widocznie usunięty z dołków. 
	UWAGA: Dodatkowe trzy płukania opisane na tym etapie mogą nie być konieczne w przypadku korzystania z myjki do mikropłytek ELISA.</li>
	<li>Dozować 200 μl odczynnika Ellmana do każdej studzienki (nie licząc studzienek "ślepej").</li>
	<li>Przykryj płytkę nową folią ochronną i zawiń ją w folię aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Upewnij się, że na odwrocie płytki nie ma płynu, który mógłby zakłócić odczyt spektrofotometru, wycierając tylną stronę suchym ręcznikiem papierowym.</li>
	<li>Odczytać płytkę pod kątem absorbancji przy 405 nm (kolor żółty).</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Obliczyć średnią absorbancję dla każdej "ślepej próby", NSB, wzorca, kontroli jakości i próbek.</li>
	<li>Odejmij średnie wartości absorbancji NSB od wartości absorbancji wzorca, kontroli jakości i próbki .</li>
	<li>Wykreślić absorbancję na osi y i stężenie na osi x. Skonstruuj krzywą standardową przy użyciu czteroparametrowego modelu regresji logistycznej.</li>
	<li>Po skonstruowaniu krzywej należy użyć równania krzywej, aby określić interpolowane stężenia do kontroli jakości i próbek, które można odczytać na osi x. 
	UWAGA: Krzywa wzorcowa jest walidowana tylko wtedy, gdy obliczone stężenie interpolowane do kontroli jakości mieści się w zakresie 25% oczekiwanego stężenia (zwykle 125 pg/ml, ale patrz etykieta fiolki kontroli jakości).</li>
</ol>

<ol><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li>
<li>Brain, S. D., Grant, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+actions+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+adrenomedullin%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin.</a> Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).</li>
<li>Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide+and+cerebral+blood+vessels%3A+distribution+and+vasomotor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).</li>
<li>Donnerer, J., Stein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+increase+in+the+release+of+CGRP+from+sensory+nerves+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).</li>
<li>Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+vasoactive+peptides+in+the+extracerebral+circulation+of+humans+and+the+cat+during+activation+of+the+trigeminovascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system.</a> Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).</li>
<li>Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenically+mediated+leakage+of+plasma+protein+occurs+from+blood+vessels+in+dura+mater+but+not+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).</li>
<li>Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ergot+alkaloids+block+neurogenic+extravasation+in+dura+mater%3A+proposed+action+in+vascular+headaches%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches.</a> Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).</li>
<li>Lassen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CGRP+may+play+a+causative+role+in+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22Cephalalgia%22%5BJournal%5D)">CGRP may play a causative role in migraine.</a> Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).</li>
<li>Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+saliva+calcitonin+gene-related+peptide+levels+during+acute+migraine+predict+therapeutic+response+to+rizatriptan%5BTitle%5D)+AND+%22Headache%22%5BJournal%5D)">Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan.</a> Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).</li>
<li>Cernuda-Morollón, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interictal+increase+of+CGRP+levels+in+peripheral+blood+as+a+biomarker+for+chronic+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine.</a> Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).</li>
<li>Messlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+big+CGRP+flood-sources%2C+sinks+and+signalling+sites+in+the+trigeminovascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Headache+and+Pain%22%5BJournal%5D)">The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system.</a> The Journal of Headache and Pain. 19, 22(2018).</li>
<li>Ochoa-Callejero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+levels+of+calcitonin+gene-related+peptide+are+lower+in+COVID-19+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Endocrine+Society%22%5BJournal%5D)">Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients.</a> Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).</li>
<li>Rizzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CGRP+plasma+levels+correlate+with+the+clinical+evolution+and+prognosis+of+hospitalized+acute+COVID-19+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients.</a> Viruses. 14 (10), 2123(2022).</li>
<li>Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasoactive+peptide+release+in+the+extracerebral+circulation+of+humans+during+migraine+headache%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache.</a> Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).</li>
<li>Sarchielli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-biochemical+correlates+of+migraine+attacks+in+rizatriptan+responders+and+non-responders%5BTitle%5D)+AND+%22Cephalalgia%22%5BJournal%5D)">Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders.</a> Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).</li>
<li>Greco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+CGRP+and+expression+of+specific+microRNAs+in+blood+cells+of+episodic+and+chronic+migraine+subjects%3A+towards+the+identification+of+a+panel+of+peripheral+biomarkers+of+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Headache+and+Pain%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine.</a> The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122(2020).</li>
<li>Tvedskov, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+increase+of+calcitonin+gene-related+peptide+in+jugular+blood+during+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine.</a> Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).</li>
<li>Pellesi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+CGRP+during+a+2-h+infusion+of+VIP+in+healthy+volunteers+and+patients+with+migraine%3A+An+exploratory+study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study.</a> Frontiers in Neurology. 13, 871176(2022).</li>
<li>Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide+%28CGRP%29+levels+during+glyceryl+trinitrate+%28GTN%29-induced+headache+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Cephalalgia%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers.</a> Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).</li>
<li>Kraenzlin, M. E., Ch'ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+a+novel+peptide%2C+calcitonin+gene-related+peptide+%28CGRP%29+in+man.+Pharmacokinetics+and+effects+on+gastric+acid+secretion+and+on+gastrointestinal+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Regulatory+Peptides%22%5BJournal%5D)">Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones.</a> Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).</li>
<li>Brain, S. D., Williams, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P+regulates+the+vasodilator+activity+of+calcitonin+gene-related+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide.</a> Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).</li>
<li>Kim, Y. -G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidomics+approach+to+elucidate+the+proteolytic+regulation+of+bioactive+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).</li>
<li>Katayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catabolism+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P+by+neutral+endopeptidase%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase.</a> Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).</li>
<li>Hartopo, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-converting+enzyme-1+gene+ablation+attenuates+pulmonary+fibrosis+via+CGRP-cAMP%2FEPAC1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).</li>
<li>Mair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+CGRP+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Plasma CGRP in acute myocardial infarction.</a> Lancet. 335 (8682), 168(1990).</li>
<li>Antúnez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide+modulates+interleukin-13+in+circulating+cutaneous+lymphocyte-associated+antigen-positive+T+cells+in+patients+with+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis.</a> The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).</li>
<li>Gangula, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnancy+and+steroid+hormones+enhance+the+vasodilation+responses+to+CGRP+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats.</a> The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).</li>
<li>Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+calcitonin+gene-related+peptide%2C+neuropeptide+Y%2C+substance+P%2C+and+vasoactive+intestinal+peptide+on+interleukin-1beta%2C+interleukin-6+and+tumor+necrosis+factor-alpha+production+by+peripheral+whole+blood+cells+from+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Regulatory+Peptides%22%5BJournal%5D)">Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients.</a> Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).</li>
<li>Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+neural+regulation+of+inflammatory+synovial+cell+functions+by+secreting+calcitonin+gene-related+peptide+and+vasoactive+intestinal+peptide+in+patients+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).</li>
<li>Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surgical+denervation+on+substance+P+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+adjuvant+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis.</a> Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).</li>
<li>Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide+is+involved+in+the+spinal+processing+of+mechanosensory+input+from+the+rat%27s+knee+joint+and+in+the+generation+and+maintenance+of+hyperexcitability+of+dorsal+horn-neurons+during+development+of+acute+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat's knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation.</a> Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).</li>
<li>Wang, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+levels+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P+are+decreased+in+patients+with+diabetes+mellitus+and+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+International+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease.</a> The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).</li>
<li>Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide in human obesity.</a> Peptides. 12 (4), 861-863 (1991).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+Guidelines+on+Drawing+Blood%3A+Best+Practices+in+Phlebotomy.+3%2C+Blood-sampling+systems%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems.</a> World Health Organization. , Geneva. (2010).</li>
<li>Raffaelli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+calcitonin+gene-related+peptide+%28CGRP%29+in+migraine+and+endometriosis+during+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Translational+Neurology%22%5BJournal%5D)">Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).</li>
<li>Andreasson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+immunoassay+method+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">A practical guide to immunoassay method validation.</a> Frontiers in Neurology. 6, 179(2015).</li>
<li>Messlinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CGRP+measurements+in+human+plasma-a+methodological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cephalalgia%3A+An+International+Journal+of+Headache%22%5BJournal%5D)">CGRP measurements in human plasma-a methodological study.</a> Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).</li>
<li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+the+quantitative%2Fqualitative+analysis+of+plant+secondary+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Medicines%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites.</a> Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).</li>
<li>Lee, J. -E., Kim, S. Y., Shin, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+repeated+freezing+and+thawing+on+biomarker+stability+in+plasma+and+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Osong+Public+Health+and+Research+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples.</a> Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).</li>
<li>Fan, P. -C., Kuo, P. -H., Lee, M. T., Chang, S. -H., Chiou, L. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+calcitonin+gene-related+peptide%3A+A+potential+biomarker+for+diagnosis+and+therapeutic+responses+in+pediatric+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine.</a> Frontiers in Neurology. 10, 10(2019).</li>
<li>Raffaelli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Change+of+CGRP+plasma+concentrations+in+migraine+after+discontinuation+of+CGRP-%28receptor%29+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies.</a> Pharmaceutics. 15 (1), 293(2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic więcej do dodania.

W artykule opisano zwalidowany protokół pozwalający na wykrywanie i ilościowe oznaczanie CGRP w osoczu ludzkim. Protokół ten został zsyntetyzowany po tym, jak stwierdzono, że komercyjne zestawy CGRP ELISA nie określają dokładnie ilościowo tej cząsteczki. Po ustaleniu protokołu przygotowania próbki i prawidłowej krzywej wzorcowej, eksperymenty z nagłym wzrostem i odzyskiem oraz liniowością rozcieńczania wykazały, że odsetek odzysku był znacznie niższy niż oczekiwano. Podobne wyniki uzyskano przy użyciu innego komercyjnego...

Peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP) to 37-aminokwasowy neuropeptyd, który jest obecny we włóknach neuronalnych o lokalizacji okołonaczyniowej, jak również w tkankach nieneuronalnych. Dwie formy CGRP, α- i β-CGRP, mają ponad 90% homologii i dzielą funkcje fizjologiczne; jednak αCGRP znajduje się w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym, podczas gdy βCGRP znajduje się w jelitowym układzie nerwowym1,2. Po aktywacji nocyceptora i egzocytozie zależnej od wapnia, CGRP jest uwalniany z neuronów, wywołując sterylne zapalenie neurogenne obejmujące rozszerzenie naczyń krwionośnych tętnic i wynaczynienie białek osocza3,4,5,6,7. Stąd CGRP pojawia się w naczyniach pozakapilarnych i może być biomarkerem chorób powodujących aferentną aktywację nocyceptywną, takich jak migrena8,9,10,11. Warto zauważyć, że CGRP jest również związany z COVID-19 poprzez swoją rolę w angiogenezie i modulacji immunologicznej i może przewidywać niekorzystną ewolucję choroby12,13. W związku z tym protokół dokładnej kwantyfikacji CGRP w ludzkim osoczu może mieć szeroką wartość.
Być może najwięcej uwagi poświęcono roli CGRP w migrenie. Na podstawie badań przedklinicznych i klinicznych CGRP został przedstawiony jako możliwy biomarker migreny i jako cel leczenia3,4,5,6,7,8,9,10. Niektóre badania wykazały wzrost CGRP w kohortach z epizodyczną migreną w porównaniu z uczestnikami kontrolnymi10,14,15. Sukces inhibitorów CGRP w badaniach klinicznych w leczeniu migrenowego bólu głowy wydaje się sugerować podwyższony CGRP jako czynnik przyczynowy migrenowych bólów głowy. Jednak nie wszyscy badacze potwierdzili te wyniki16,17,18,19. Co więcej, rola CGRP w objawach migreny innych niż ból głowy nie została jeszcze wyjaśniona; Obecne prace były motywowane chęcią zrozumienia roli CGRP w przedsionkowych objawach migreny.
Niespójne dane z testów immunologicznych CGRP w literaturze mogą wynikać z kilku powodów. Po pierwsze, okres półtrwania CGRP w naczyniach obwodowych wynosi 6,9 min20, ze względu na aktywność proteaz serynowych21, enzymów rozkładających insulinę i innych metaloproteaz22, neutralne endopeptydazy23, oraz enzym konwertujący endotelinę-124. Po drugie, zmienne szczegóły techniczne testów immunologicznych stosowanych do ilościowego oznaczania CGRP nie są w pełni opisane w takich badaniach. Wreszcie, brak standaryzacji metodologii testów immunologicznych jeszcze bardziej komplikuje obraz.
Ten artykuł opisuje zmodyfikowany protokół testu immunoenzymatycznego (ELISA), który pozwala na oczyszczanie i dokładne oznaczanie ilościowe α- i βCGRP w ludzkim osoczu. Przeciwciała zestawu nie reagują krzyżowo z amyliną, kalcytoniną lub substancją P. Protokół ten został poddany niezbędnym eksperymentom walidacyjnym, takim jak skok i odzysk oraz liniowość rozcieńczenia, dla których dane przedstawiono tutaj. Taki protokół CGRP ELISA, który został poddany walidacji, nie został wcześniej w pełni opisany w literaturze. Protokół ten może być wykorzystany do ilościowego określenia CGRP w ludzkim osoczu w kontekście migreny, a także kardiologicznego2,25, dermatologic26, położnicza27, reumatologiczna28,29, mięśniowo-szkieletowa30,31, endocrine32,33, oraz choroby wirusowe12,13, w które zamieszany jest CGRP.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml probówka do mikrowirówek Safeseal</td><td>Sorenson Bioscience, Inc.</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>99% metanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L13255.0F</td><td></td></tr><tr><td>15 mL stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Falcon</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL sterylne kriowiale okrągłodenne</td><td>CRYO. S</td><td>122263</td><td></td></tr><tr><td>4% kwas octowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>035572.K2</td><td></td></tr><tr><td>6,0 ml Vacutainer EDTA probówka zbiorcza</td><td>BD</td><td>367863</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 64R</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>367586</tr><tr><td>Aprotynina</td><td>VWR</td><td>76344-814</td><td></td></tr><tr><td>CGRP (człowiek) Zestaw ELISA</td><td>Odczynnik Bertin</td><td>A05481</td><td></td></tr><tr><td>Zapas CGRP</td><td>Bioodczynnik</td><td></td><td></td>Bertin</tr><tr><td>Bufor EIA</td><td>Bioreagent Bertin</td><td>A07000</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Ellmana</td><td>Odczynnik Bertin</td><td>Pipety wielokanałowe A09000_49+1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4661180N</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 3 cc Vac Wkłady</td><td>Wody</td><td>WAT094226</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Bellco</td><td>7744-01010</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety precyzyjne</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F144055MG</td><td></td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik mikropłytek SpectraMax serii M</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Numer katalogowy M2</td><td></td></tr><tr><td>TBS/ Żelatyna rybna</td><td>Bioworld, od Fischer Scientific</td><td>50-199-167</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda ELISA Grade</td><td>Bertin Bioreagent</td><td>A07001</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge plus - Koncentrator wirówek</td><td>Eppendorf</td><td>22820109</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do płukania</td><td>Bertin Bioreagent</td><td>A17000</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie i oznaczanie ilościowe peptydu związanego z genem kalcytoniny (cgrp) w osoczu ludzkim przy użyciu zmodyfikowanego testu immunoenzymatycznego

Detection and Quantification of Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) in Human Plasma Using a Modified Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP) to neuropeptyd wazoaktywny, który odgrywa przypuszczalną rolę w patofizjologii migrenowych bólów głowy i może być kandydatem do statusu biomarkera. CGRP jest uwalniany z włókien neuronalnych po aktywacji i indukuje sterylne zapalenie neurogenne i rozszerzenie naczyń tętniczych w układzie krwionośnym, który otrzymuje unerwienie odprowadzające nerwu trójdzielnego. Obecność CGRP w obwodowym układzie naczyniowym pobudziła badania mające na celu wykrycie i ilościowe określenie tego neuropeptydu w ludzkim osoczu za pomocą testów proteomicznych, takich jak test immunoenzymatyczny (ELISA). Jednak jego okres półtrwania wynoszący 6,9 minuty i zmienność szczegółów technicznych protokołów testów, które często nie są w pełni opisane, przyniosły niespójne dane CGRP ELISA w literaturze. W tym miejscu przedstawiono zmodyfikowany protokół ELISA do oczyszczania i oznaczania ilościowego CGRP w osoczu człowieka. Etapy procedury obejmują pobranie i przygotowanie próbki, ekstrakcję przy użyciu sorbentu polarnego jako środka oczyszczania, dodatkowe etapy blokowania niespecyficznego wiązania oraz oznaczanie ilościowe za pomocą testu ELISA. Co więcej, protokół został zweryfikowany za pomocą eksperymentów ze skokami i odzyskiem oraz liniowością rozcieńczeń. Ten zwalidowany protokół może być teoretycznie wykorzystany do ilościowego określenia stężeń CGRP w osoczu osób nie tylko z migreną, ale także z innymi chorobami, w których CGRP może odgrywać rolę.

W protokole należy wyróżnić kilka kluczowych etapów. Po pierwsze, do próbek krwi pełnej bezpośrednio po pobraniu należy dodać aprotininę, inhibitor serynowych proteaz, aby zapobiec dalszej degradacji enzymatycznej CGRP. Wykazano, że serynowe proteazy odgrywają rolę w metabolizmie CGRP, a w poprzednim badaniu aprotinina była również stosowana przy oznaczaniu ilościowym CGRP u ludzi21,35. Jeśli nie zostaną użyte inhibitory proteaz, a przygotowanie próbki zajmie wię...

Opublikowane dane dotyczące stężeń peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) w ludzkim osoczu są niespójne. Niespójności te mogą wynikać z braku znormalizowanej, zwalidowanej metodologii ilościowego oznaczania tego neuropeptydu. W tym miejscu opisujemy zwalidowany protokół testu immunoenzymatycznego (ELISA) w celu oczyszczenia i ilościowego określenia CGRP w ludzkim osoczu.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) w osoczu ludzkim przy użyciu zmodyfikowanego testu immunoenzymatycznego

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) is a vasoactive neuropeptide that plays a putative role in the pathophysiology of migraine headaches and may be a ...

Ten zmodyfikowany protokół ELISA pozwala na oczyszczenie i dokładne określenie ilościowe CGRP w ludzkim osoczu. Został on poddany niezbędnym eksperymentom walidacyjnym i może posłużyć do standaryzacji przyszłych metodologii kwantyfikacji. Protokół ten ma zalety polegające na włączeniu przetwarzania próbki przed znaczną degradacją proteazy, oczyszczaniu poprzez ekstrakcję do fazy stałej oraz ograniczeniu niespecyficznego wiązania poprzez zastosowanie buforu blokującego na płytki mikromiareczkowe.CGRP odgrywa karzącą rolę w patofizjologii migreny i może być kandydatem do statusu biomarkera. Jest również zaangażowany w procesy chorobowe kardiologiczne, dermatologiczne, wirusowe, a nawet związane z COVID-19. Na początek zbierz 5 mililitrów pełnej krwi z żyły łokciowej za pomocą standardowych metod nakłucia żyły do 6-mililitrowej probówki EDTA z podciśnieniem.Aby zablokować lizę docelowego peptydu, dodaj 0,5 mililitra konkurencyjnego inhibitora proteazy serynowej aprotyniny. Odwróć rurkę 10 razy i przechowuj ją na lodzie do następnego kroku. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 600 4 g przez cztery minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza.I przenieś frakcję osocza do sterylnej kriofiolki o pojemności 2 mililitrów z okrągłym dnem. Fiolkę kriograficzną należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez okres do dwóch tygodni. Aby wyekstrahować próbkę osocza, umieść wkład ekstrakcyjny w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.Przepuść 5 mililitrów 100% metanolu, a następnie 10 mililitrów ultraczystej wody przez wkład, aby go aktywować. Płyn zostanie zebrany w rurce, gdy przejdzie przez wkład przez przepływ napędzany grawitacyjnie. Nadmiar nagromadzonego płynu należy wyrzucić, aby zapobiec jego pochłonięciu przez wkład i upewnić się, że nie wyschnie on podczas eksperymentu.Rozcieńczyć 250 mikrolitrów osocza w 750 mikrolitrach 4% kwasu octowego i powoli przepuścić go przez wkład. Następnie umyj wkład 10 mililitrami kwasu octowego. Po usunięciu nadmiaru płynu przenieś wkład do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.Przygotuj 3 mililitry roztworu kwasu octowego metanolu do elucji peptydu związanego z genem kalcytoniny lub CGRP. Przepuść 1 mililitr przez wkład i odczekaj 25 minut między każdą elucją. Po ostatniej elucji probówka zawiera 3 mililitry całkowitego eluantu.Przenieś 1 mililitr eluantu do mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,7 mililitra i wiruj w mini wirówce przez jedną sekundę, aby osadzić eluant. Następnie wysuszyć próbkę w wirówce próżniowej przy prędkości 1 400 obr./min i 4 stopniach Celsjusza. Bezpośrednio przed badaniem należy rozpuścić wysuszoną próbkę za pomocą rozmrożonego testu immunoenzymatycznego lub buforu EIA.W celu zablokowania płytki dodaj 250 mikrolitrów buforu blokującego żelatynę rybną TBS do każdej studzienki. Umieścić arkusz przykrywający na płytce i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji zdjąć arkusz pokrywy i opróżnić płytkę, odwracając ją.Następnie osusz talerz na ręczniku papierowym, aby wyrzucić wszelkie śladowe ilości płynu i wysusz go w okapie z przepływem laminarnym przez 10 minut. Gdy płytka jest widocznie sucha, umieść ją w szczelnie zamkniętej torebce foliowej z saszetką ze środkiem osuszającym z żelem krzemionkowym. Przechowuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Przed wykonaniem testu należy rozmrozić wszystkie próbki i przygotowane odczynniki w temperaturze pokojowej. Aby przepłukać dołki płyty blokowej, dodaj 300 mikrolitrów buforu do płukania i pozostaw na 30 sekund. Następnie wyrzuć bufor do płukania i powtórz płukanie pięć razy.Po ostatnim płukaniu osusz płytkę, jak pokazano wcześniej. Następnie należy dozować 100 mikrolitrów buforu EIA do dedykowanych dwóch niespecyficznych studzienek wiążących lub NSB. Dodać 100 mikrolitrów wzorców CGRP, a następnie odtworzyć próbkę i przeprowadzić kontrolę jakości w dwóch egzemplarzach do odpowiednich studzienek.Dodaj 100 mikrolitrów znacznika CGRP do każdego dołka, z wyjątkiem studzienek ślepych. Na koniec należy uszczelnić płytkę za pomocą przezroczystej pokrywy, upewniając się, że próbki i odczynniki nie odparują, a następnie inkubować płytkę przez 16 do 20 godzin w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po zakończeniu okresu inkubacji przygotuj odczynnik Ellmana zgodnie z instrukcjami producenta.Po zdekantacji płytki umyj każdą studzienkę trzy razy, jak pokazano wcześniej. Po ostatnim płukaniu potrząsaj płytką z prędkością 120 obr./min przez dwie minuty. Ponownie trzykrotnie opłucz talerz i osusz go.Postukaj w odwróconą płytkę, aż płyn zostanie widocznie usunięty z dołków. Następnie dodaj 200 mikrolitrów odczynnika Ellmana do każdej studzienki z wyjątkiem studzienek ślepych. Po przykryciu płytki zawiń ją w folię aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło, i inkubuj ją w ciemności w temperaturze pokojowej przez godzinę przed zapisaniem absorbancji.Niniejsze badanie wykazało, że dodanie etapu blokującego, wskaźniki odzysku w każdej próbce skoku CGRP mieściły się w dopuszczalnym zakresie. Jednakże, gdy etap blokowania został wykluczony, niespecyficzne wiązanie spowodowało przekroczenie górnej granicy 125%Ważne jest, aby dodać aprotyninę do przechowywania próbek krwi wkrótce po pobraniu, aby ograniczyć degradację CGRP. Dodatkowo, bufor blokujący powinien zostać dodany do płytki mikromiareczkowej przed testem ELISA, aby jeszcze bardziej ograniczyć niespecyficzne wiązanie.Tak więc protokół ten można wykorzystać do zbadania kandydatury CGRP jako biomarkera migreny przedsionkowej poprzez ilościowe określenie poziomów CGRP u pacjentów z migreną i migreną przedsionkową w osoczu w porównaniu z grupą kontrolną.

detection-quantification-calcitonin-gene-related-peptide-cgrp-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Pomiar biomarkerów w złożonych próbkach biologicznych coraz częściej pomaga w podejmowaniu decyzji klinicznych. Opisujemy wysoce czułą metodę jednoczesnego pomiaru białka C wiążącego miozynę sercową, kinazy kreatynowej MB i troponiny sercowej I w próbkach surowicy od osób z zawałem mięśnia sercowego i zdrowych osób z grupy kontrolnej.

Czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego

Homeostaza wapniowa retikulum endoplazmatycznego jest zaburzona w różnych patologiach.  Reporter wydzielanego białka monitorującego wapń ER (SERCaMP) może być używany do wykrywania zakłóceń w magazynie wapnia ER.   Protokół ten opisuje zastosowanie Gaussia lucyferazy SERCaMP do badania homeostazy wapnia ER in vitro i in vivo.

Monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP

Proponowana praca ocenia potencjał diagnostyczny testów bezpośredniego i wzmocnionego powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPRi), szczególnie do wykrywania rekombinowanego ludzkiego hormonu wzrostu w wzbogaconej ludzkiej surowicy, poprzez bezpośrednie porównanie wyników SPRi z dostępnym na rynku zestawem do testów immunoenzymatycznych (ELISA).

Analiza porównawcza ludzkiego hormonu wzrostu w surowicy przy użyciu testów SPRi, Nano-SPRi i ELISA

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Test immunologiczny elektrochemiluminescencji (ECLIA) to nowatorskie podejście do ilościowego wykrywania endogennych i egzogennie stosowanych wariantów białka MeCP2, które daje wysoce ilościowe, dokładne i powtarzalne pomiary z niskim błędem wewnątrz- i międzytestowym w szerokim zakresie roboczym. W tym miejscu opisano protokół dla MeCP2-ECLIA w formacie 96-dołkowym.

Test oparty na elektrochemiluminescencji dla wariantów białka MeCP2

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji przestrzennej korelacji peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) - immunoreaktywnych włókien nerwowych i naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki za pomocą immunofluorescencji i histochemii fluorescencyjnej odpowiednio z CGRP i falloidyną. Ponadto pochodzenie tych włókien nerwowych zostało prześledzone wstecznie za pomocą fluorescencyjnego znacznika neuronowego.

Wizualizacja immunoreaktywnego unerwienia peptydu związanego z genem kalcytoniny opony twardej czaszki szczura z immunofluorescencją i śledzeniem neuronalnym

Obecny protokół opisuje model uwalniania peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) ex vivo oraz strategię ilościowego określania wpływu środków farmakologicznych na ilość CGRP uwalnianego z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni.

Ex vivo Uwalnianie peptydu związanego z genem kalcytoniny z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Prezentujemy zwalidowany test ELISA z użyciem nowych przeciwciał monoklonalnych anty-HER2. Test ten umożliwia precyzyjne określenie ilościowe związanego z komórkami i uwolnionego białka HER2 z komórek hodowanych in vitro i innych próbek, w tym krwi i tkanek.

Zwalidowany test immunochemiczny do kompleksowego określenia receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 uwalnianego z komórek i związanego z komórkami

Protokół ten mierzy stężenia cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP) w tkankach stałych za pomocą konkurencyjnego testu immunoenzymatycznego (ELISA). Protokół opisuje, w jaki sposób przetwarzać tkankę stałą, przeprowadzać konkurencyjny test ELISA, przeliczać absorbancję na stężenia cGMP w pikomolach na mililitr i obliczać końcowe stężenia jako nanomole cGMP na gram tkanki.

Pomiar cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP) w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego testu immunoenzymatycznego (ELISA)

Naucz się zmodyfikowanego protokołu ELISA do wykrywania i oznaczania ilościowego peptydu CGRP w osoczu ludzkim. Ta metoda umożliwia standaryzację badań nad CGRP jako potencjalnym biomarkerem.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) w osoczu ludzkim przy użyciu zmodyfikowanego testu immunoenzymatycznego (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) w osoczu ludzkim przy użyciu zmodyfikowanego testu immunoenzymatycznego

Przeglądaj więcej filmów