Name: Transformacja genetyczna babki wąskolistnej za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Poznaj protokół transformacji genetycznej babki wąskolistnej Plantago lanceolata przy użyciu Agrobacterium tumefaciens. Metoda osiąga 20% wydajność i umożliwia badanie relacji gen-fenotyp w biologii roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation (EDGE IOS-1923557 do C.Z. i Y.Z.).

UWAGA: Kroki 1.4-1.8, 2.3-2.5, 3.3-3.6, 4.1-4.6, 5.1-5.7 i 6.1-6.3 muszą być wykonywane w warunkach aseptycznych, przy użyciu czystego kaptura, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
1. Rozmnażanie materiału roślinnego w celu transformacji
<ol>
	<li>Umieść dostępne w handlu nasiona babki lancetowatej typu dzikiego (WT) (patrz tabela materiałów) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml do linii 5 ml, w zależności od pożądanej liczby roślin. 
	UWAGA: Alternatywnie można użyć probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml, gdy potrzebna jest niewielka liczba nasion, ale należy ją napełnić do objętości nie większej niż 0,1 ml, ponieważ zbyt duża liczba nasion może zmniejszyć skuteczność sterylizacji.</li>
	<li>Zanurz nasiona w 75% etanolu na 60 s.</li>
	<li>Wyrzuć etanol, a następnie zanurz nasiona w 20% podchlorynie sodu (20% NaClO, 80% sterylnej wody) na 40 minut, delikatnie odwracając probówkę, tak aby wszystkie nasiona miały kontakt z roztworem. 
	UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, roztwór podchlorynu sodu musi być świeżo przygotowany.</li>
	<li>Pod okapem z przepływem laminarnym wylej roztwór podchlorynu sodu, a następnie umyj nasiona wodą destylowaną (pięć razy). Dodaj niewielką ilość wody do nasion po ostatnim płukaniu, ponieważ może to pomóc w przemieszczaniu się roślin na talerze.</li>
	<li>Za pomocą wysterylizowanych kleszczy przenieś nasiona na wstępnie przygotowane szalki Petriego o wymiarach 95 mm x 100 mm ze stałym podłożem MS (tabela 1). Rozłóż nasiona równomiernie na powierzchni płytki, zachowując około 1 cm odstępu między każdym nasionem, aby zapobiec przepełnieniu kiełkujących sadzonek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A) .</li>
	<li>Uszczelnij płytki dwiema warstwami folii parafinowej, aby zapobiec zanieczyszczeniu, a następnie inkubuj w chłodnym białym świetle do uprawy (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej (22 °C przy 50 μmol m-2 s-1, 12 godzin dni). Nasiona kiełkują zwykle w ciągu 5-6 dni.</li>
	<li>Gdy sadzonki wykiełkują i są wystarczająco duże, aby je przenieść (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B), zwykle 2 lub 3 dni po wykiełkowaniu, użyj wysterylizowanych kleszczy, aby przenieść sadzonki do sterylnych pudełek z 50-100 ml pożywki MS (Tabela 1). Najlepiej sadzić tylko pięć sadzonek w pudełku, aby uzyskać korzenie najlepszej jakości.</li>
	<li>Uszczelnij pudełka taśmą chirurgiczną, a następnie pozwól roślinom rosnąć w chłodnym białym świetle (patrz Tabela Materiałów), w tych samych warunkach, jak w kroku 1.6. Rośliny powinny być gotowe do przemiany po około 3-4 tygodniach lub gdy główne korzenie osiągną około 2 cm długości, a korzenie boczne wydają się białe. 
	UWAGA: Przepisy na preparaty podłoża i zapasy witamin znajdują się w Tabeli 1 i Tabeli 2.</li>
</ol>
2. Budowa plazmidu i transformacja E. Coli 
UWAGA: Dokładna procedura budowy plazmidu różni się w zależności od interesującego genu. W tej procedurze enzymy restrykcyjne HindIII i SalII zostały użyte do wprowadzenia promotora 1,5 kb AtPP2 do binarnego plazmidu pBI101 (patrz tabela materiałów) z GUS, przy użyciu standardowej procedury klonowania20. AtPP2 (białko łyka 2) to gen, który ulega specyficznej ekspresji w łyku 21.
<ol>
	<li>Sklonuj promotor za pomocą par starterów 5'-AGTCAAGCTTCAAGTCCCTGTGGCTACTGAAC-3' (do przodu) i 5'-AGTCGTCGACAAACCAGTATGATGATTATTTTTG-3' (do tyłu) z Arabidopsis. Rysunek 2 przedstawia schemat binarnego wektora plazmidu z insertem AtPP2:GUS.</li>
	<li>Po zbudowaniu plazmidu przekształć plazmidy w kompetentne komórki DH5a E. coli (patrz Tabela Materiałów) za pomocą metody szoku cieplnego22, a następnie inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (150 obr./min).</li>
	<li>Pobrać 150 μl każdej kultury transformacyjnej, rozłożyć ją na płytkach z pożywką agarową LB (Tabela 1) z odpowiednim doborem (50 mg/L kanamycyny dla szczepu użytego w tym protokole; patrz Tabela materiałów), a następnie inkubować płytki przez 16-24 godzin w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Szczep bakteryjny użyty w tym badaniu to A. tumefaciens GV3101.</li>
	<li>Następnie użyj PCR kolonii, aby przebadać kolonie pod kątem dodatnich rekombinantów23. 
	UWAGA: W tym protokole do amplifikacji docelowego genu użyto następujących starterów; 5'-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3' (do przodu) i 5'-TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGCTGCC-3' (do tyłu).
	<ol>
		<li>Przeprowadzić reakcję w termocyklerze (patrz tabela materiałów) w warunkach cyklicznych trwających 3 minuty w temperaturze 95 °C, a następnie 35 cykli: 30 s w temperaturze 95 °C, 30 s w temperaturze 55 °C, 2 minuty w temperaturze 72 °C i końcowy 10-minutowy etap wydłużania w temperaturze 72 °C.</li>
		<li>Zaszczepić dodatnie kolonie w 6 ml bulionu LB (Tabela 1) odpowiednim antybiotykiem (50 mg/l kanamycyny) i rosnąć w temperaturze 37 °C przez noc, przy 200-250 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po całonocnym wzroście wyekstrahuj plazmidy z bakterii, stosując standardowe procedury24.</li>
</ol>
3. Transformacja A. tumefaciens z plazmidem
<ol>
	<li>Po ekstrakcji plazmidu użyj elektroporacji, aby przekształcić zmodyfikowany plazmid w pożądany szczep kompetentnych komórek. W zabiegu wykorzystano szczep A. tumefaciens GV3101. Postępuj zgodnie ze standardowymi metodami technik elektroporacji25.</li>
	<li>Po elektroporacji ponownie zawiesić właściwe komórki w 1 ml bulionu LB, a następnie inkubować przez 2-4 godziny w temperaturze 28 °C przy 100 obr./min.</li>
	<li>Zebrać komórki przez wirowanie przy 6 800 x g przez 3 minuty w mikrowirówce stołowej (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej (22 °C), a następnie rozprowadzić 50-100 μl na płytce agarowej LB z odpowiednim środkiem selekcyjnym (50 mg/l kanamycyny dla plazmidu użytego w tym protokole).</li>
	<li>Po inkubacji komórek przez 2 dni w temperaturze 28 °C należy zidentyfikować dodatnie kolonie zawierające gen będący przedmiotem zainteresowania za pomocą PCR kolonii. W tym protokole należy użyć starterów i warunków wymienionych w kroku 2.4.</li>
	<li>Następnie użyj dodatnich kolonii, aby pokryć płytkę podstawową pożywką agarową LB + selekcja. Płytka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Alternatywnie, w celu długotrwałego przechowywania, zaszczepić dodatnią kolonię niewielką objętością LB z odpowiednią selekcją. Wstrząsnąć zaszczepioną kulturą przez noc w temperaturze 28 °C przy 200 obr./min, a następnie przygotować wywar z glicerolem (50% w/v glicerolu w mieszance bakterii i glicerolu w proporcji 50:50), który może być przechowywany w temperaturze -80 °C przez okres do 10 lat.</li>
</ol>
4. Przygotowanie A. tumefaciens 
<ol>
	<li>Smuga A. tumefaciens zawierająca pożądany plazmid na przygotowane płytki LB o wymiarach 95 mm x 100 mm z odpowiednim środkiem selekcyjnym. W protokole tym wykorzystano szczep bakteryjny GV3101 z wstawką plazmidową AtPP2:GUS, z dodatkiem 50 mg/L kanamycyny do selekcji.</li>
	<li>Uszczelnić płytki folią parafinową, a następnie inkubować w temperaturze 28 °C przez maksymalnie 48 godzin lub do momentu, gdy bakterie osiągną wystarczająco duże rozmiary, aby można je było zbierać.</li>
	<li>Użyj końcówki pipety, aby wybrać kolonię bakterii na 2 dni przed transformacją i zaszczepić ją w 15 ml okrągłej probówce zawierającej 6 ml płynnego LB z odpowiednim doborem. Wstrząsać z prędkością 200 obr./min w wytrząsarce stołowej o temperaturze 28 °C przez noc, aż OD600 osiągnie 0,6-0,7, 
	UWAGA: Płytki i inokulację bakteryjną o pojemności 6 ml można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Gdy bakterie osiągną prawidłowy OD600, użyj pipety, aby przenieść A. tumefaciens do sterylnej kolby zawierającej 100 ml płynnego LB ze środkiem selekcyjnym. Zazwyczaj do rozmnażania nadaje się 200 μl bakterii na 100 ml LB. Wstrząsać z prędkością 200 obr./min w temperaturze 28 °C przez noc, aż OD600 osiągnie 0,6-0,7.</li>
	<li>Przenieś bakterie do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i odwiruj przy 2 200 xg przez 10 minut w temperaturze pokojowej (22 °C) w wirówce stołowej w celu zebrania bakterii.</li>
	<li>Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Zawiesić osad bakteryjny w 5 ml roztworu zawiesiny płynnej (SS) o temperaturze pokojowej (22 °C) (Tabela 1) przez pipetowanie, następnie dodać do 50 ml SS i kilkakrotnie odwrócić w celu wymieszania. Bakteria jest teraz gotowa do transformacji. 
	UWAGA: Płynny SS musi być przygotowany na świeżo, w ciągu 1 tygodnia od przemiany. 
	UWAGA: Wszystkie materiały, które mają kontakt z A. tumefaciens, należy wyrzucić do kosza na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Resztki płynów z kultur bakteryjnych można sterylizować podchlorynem sodu (wybielaczem) w stężeniu 20% lub wyższym.</li>
</ol>
5. Przemiana korzeni babki lancetowatej
<ol>
	<li>Kiedy rośliny osiągną idealny etap do transformacji (siewki mają 3 tygodnie) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C), użyj sterylnych kleszczy i nożyczek, aby oddzielić korzenie od reszty rośliny (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Wyrzuć materiał liści i łodyg.</li>
	<li>Natychmiast po ścięciu przenieś kawałki korzeni do sterylnych pudełek zawierających sterylną wodę za pomocą sterylnych kleszczy. Ten krok pozwala korzeniom pozostać nawilżonym, podczas gdy cała tkanka jest zbierana.</li>
	<li>Po odcięciu wszystkich korzeni wlać zawiesinę A. tumefaciens/SS do sterylnych jednorazowych szalek Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm. Przenieś korzenie do kultury A. tumefaciens i zaszczepiaj przez co najmniej 20 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Podczas inkubacji za pomocą sterylnego skalpela z ostrym ostrzem pokrój korzenie na 1 cm fragmenty, oddzielając korzenie pierwotne od korzeni bocznych. Wykonaj cienkie, płytkie nacięcia na powierzchni korzeni, aby bakterie mogły zainfekować roślinę. 
	UWAGA: Jeśli masz do czynienia z dużą liczbą roślin, przenieś kawałki korzeni do kultury bakteryjnej partiami, aby upewnić się, że wszystkie korzenie są zanurzone podczas inokulacji.</li>
	<li>Po inkubacji użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść kawałki korzeni na sterylne ręczniki papierowe, aby usunąć nadmiar bakterii. Unikaj suszenia korzeni przez ponad 60 sekund, ponieważ może to spowodować odwodnienie i uszkodzenie tkanki korzeniowej. Idealnie, 10-15 korzeni może być suszonych jednocześnie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
	<li>Przenieś wysuszone korzenie na przygotowane szalki Petriego o wymiarach 95 mm x 15 mm ze stałymi pożywkami do kohodowli (Tabela 1), około 10-20 korzeni na płytkę, w zależności od wielkości korzeni (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D).</li>
	<li>Uszczelnij płytki dwiema warstwami przezroczystej folii z tworzywa sztucznego, a następnie przykryj folią aluminiową. Inkubować w temperaturze pokojowej (22 °C) przez 3 dni. Ten krok daje czas bakteriom na zainfekowanie korzeni bez obecności selekcji antybiotyków (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3E).</li>
</ol>
6. Selekcja i regeneracja całej rośliny
<ol>
	<li>Po inkubacji w pożywkach do współhodowli przenieść kawałki korzeni na przygotowane szalki Petriego o wymiarach 95 mm x 15 mm z pożywką do indukcji pędów stałych (SIM) (Tabela 1) z tymentyną (500 mg/l; patrz tabela materiałów) i odpowiednim doborem antybiotyków. W tym protokole użyliśmy kanamycyny (100 mg/L). 
	UWAGA: Dno korzeni musi mieć pełny kontakt z podłożem. Korzenie, które nie dotykają powierzchni podłoża, są zbyt długie i muszą zostać przycięte, aby zapobiec wydostaniu się tkanki przed selekcją.</li>
	<li>Uszczelnij płytki dwiema warstwami przezroczystej folii z tworzywa sztucznego, a następnie uprawiaj pod światłem do uprawy przez 1 miesiąc (patrz krok 1.6, aby uzyskać odpowiednie warunki) lub do momentu, gdy zaczną pojawiać się pędy. 
	UWAGA: Zazwyczaj inicjały pędów można zaobserwować po 2 tygodniach wzrostu, a pędy są zwykle widoczne po 1 miesiącu.</li>
	<li>Gdy sadzonki osiągną długość 1,5-2,0 cm (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1D), przenieś je do przygotowanych sterylnych pudełek z solidną pożywką do indukcji korzeni (Tabela 1).</li>
	<li>Uprawiaj rośliny pod światłem do uprawy (patrz krok 1.6, aby zapoznać się z warunkami) przez kilka tygodni, aż uformują się korzenie. Korzenie można zazwyczaj zobaczyć po 1 tygodniu. 
	UWAGA: Zaleca się, aby korzenie rosły przez kilka tygodni przed przeniesieniem do gleby, ponieważ rośliny o większych systemach korzeniowych mają zwykle wyższy wskaźnik przeżywalności w glebie.</li>
</ol>
7. Przenoszenie gleby
<ol>
	<li>Gdy systemy korzeniowe staną się wystarczająco duże, aby można je było przenieść (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E), zazwyczaj po 1 miesiącu wzrostu, przenieś rośliny do 3,5 w kwadratowych doniczkach zawierających wstępnie zwilżoną glebę uniwersalną (BM7). W tym protokole zastosowano mieszankę kory BM7 (patrz Tabela Materiałów).
	<ol>
		<li>Usuń wszelkie podłoże, które przykleja się do korzeni, myjąc je delikatnie w wodzie. 
		UWAGA: Rośliny mogą być uprawiane do dojrzałości w szklarni przy 800 do 1400 μmol fotonów m-2 s-2 przy użyciu lamp o wysokim ciśnieniu sodu 600 W (patrz Tabela Materiałów) lub w komorze wzrostowej w temperaturze pokojowej (22 °C) z chłodnym białym światłem o temperaturze 50 μmol m-2 s-1, 12 h dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykryj rośliny plastikową osłoną doniczkową, a następnie przykryj je przezroczystą plastikową torbą. Ten krok pozwala roślinom pozostać w wilgotnym środowisku, gdy przystosowują się do gleby.</li>
	<li>Po około 3-5 dniach wyjmij plastikową torbę, a następnie powoli zdejmij pokrywkę, aby umożliwić aklimatyzację do środowiska zewnętrznego. 
	UWAGA: W zależności od pory roku i środowiska, do którego rośliny są przenoszone, czas, w którym rośliny muszą się przystosować, może się różnić. Zaleca się codzienne sprawdzanie roślin i dolewanie wody do doniczek w razie potrzeby.</li>
	<li>Regularnie podlewaj rośliny i w razie potrzeby dodawaj nawóz. Rośliny można również przenosić do większych doniczek w celu dalszego wzrostu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
</ol>
8. Barwienie histochemiczne β-glukuronidazy (GUS)
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór do barwienia β-glukuronidazy (GUS), zgodnie z opublikowanymi protokołami15.</li>
	<li>Gdy początki pędów osiągną około 0,5-1 cm długości, należy usunąć małą końcówkę młodego, w pełni rozwiniętego liścia (zwykle wystarcza <5 mm długości) i natychmiast przenieść do 0,5-1 ml roztworu barwiącego GUS w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 lub 2 ml. Roztwór powinien całkowicie pokryć tkankę roślinną.</li>
	<li>Otwarte probówki umieścić w eksykatorze próżniowym i odkurzać pod ciśnieniem 20-25 kPa przez 5-10 minut. Podczas procedury próżniowej w roztworze powinny być widoczne małe pęcherzyki. Dzięki temu roztwór może dostać się do komórek rośliny.</li>
	<li>Pozwól, aby powietrze przefiltrowało się z powrotem do eksykatora próżniowego. Zamknąć probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (12 godzin) lub do momentu, gdy pojawi się niebieski kolor. 
	UWAGA: W tym badaniu aktywność GUS była zlokalizowana w łyku, co oznacza, że u roślin pozytywnie przekształconych niebieskie zabarwienie powinno być widoczne tylko w tkance łyka. Rośliny bez transgenu nie doświadczają barwienia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4).</li>
	<li>Aby lepiej uwidocznić plamę, przenieś rośliny do 100% etanolu, aby usunąć chlorofil. Aby zwiększyć skuteczność procesu usuwania chlorofilu, należy inkubować probówki w temperaturze 60 °C przez 10 min. 
	UWAGA: Etanol może wymagać kilkukrotnej wymiany przed usunięciem całego chlorofilu, w zależności od wielkości barwionego liścia.</li>
</ol>

<ol><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> The Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li>
<li>Bragg, J. N., Anderton, A., Nieu, R., Vogel, J. P. Brachypodium distachyon. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBragg%2C+JN+%22Agrobacterium+Protocols%22">Agrobacterium Protocols</a>. , Springer. New York, NY. 17-33 (2015).</li>
<li>Chang, C., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+guide+to+plant+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Field guide to plant model systems.</a> Cell. 167 (2), 325-339 (2016).</li>
<li>Müller, B., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+organisms-a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Model organisms-a historical perspective.</a> Journal of Proteomics. 73 (11), 2054-2063 (2010).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+fruit-specific+promoters+drive+AtMYB12+expression+to+improve+phenylpropanoid+accumulation+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Different fruit-specific promoters drive AtMYB12 expression to improve phenylpropanoid accumulation in tomato.</a> Molecules. 27 (1), 317(2022).</li>
<li>Niedbała, G., Niazian, M., Sabbatini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+agrobacterium-mediated+gene+transformation+of+tobacco+%28Nicotiana+tabacum%29-a+model+plant+for+gene+transformation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Modeling agrobacterium-mediated gene transformation of tobacco (Nicotiana tabacum)-a model plant for gene transformation studies.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 695110(2021).</li>
<li>Kumari, D., Prasad, B., Dwivedi, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumari%2C+D+%22Genome+Editing+Platforms+in+Rice+%28Oryza+sativa+L.%29%3A+Basic+methodology+and+troubleshooting%22">Genome Editing Platforms in Rice (Oryza sativa L.): Basic methodology and troubleshooting</a>. , (2022).</li>
<li>Zhang, B. Agrobacterium-mediated transformation of cotton. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+B+%22Transgenic+Cotton%22">Transgenic Cotton</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. 31-45 (2013).</li>
<li>Tiwari, R., Singh, A. K., Rajam, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+and+reliable+plant+regeneration+and+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+in+soybean+%28Glycine+max+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crop+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved and reliable plant regeneration and Agrobacterium-mediated genetic transformation in soybean (Glycine max L).</a> Journal of Crop Science and Biotechnology. , 1-10 (2022).</li>
<li>Bakhsh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+efficient%2C+reproducible+and+stable+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+five+potato+cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Technology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of efficient, reproducible and stable Agrobacterium-mediated genetic transformation of five potato cultivars.</a> Food Technology and Biotechnology. 58 (1), 57-63 (2020).</li>
<li>Bates, R., Craze, M., Wallington, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+oilseed+rape+%28Brassica+napus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of oilseed rape (Brassica napus).</a> Current Protocols in Plant Biology. 2 (4), 287-298 (2017).</li>
<li>Hopp, H. E., Spangenberg, G., Herrera-Estrella, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Plant transformation.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 876671(2022).</li>
<li>Abdelmuhsin, A. A., Alghamdi, A. A., Ibrahim, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+phenotypic+and+genotypic+variations+of+Plantago+ciliata+in+Ha%27il+region%2C+Saudi+Arabia%5BTitle%5D)+AND+%22Entomology+and+Applied+Science+Letters%22%5BJournal%5D)">Assessing the phenotypic and genotypic variations of Plantago ciliata in Ha'il region, Saudi Arabia.</a> Entomology and Applied Science Letters. (1), 14-22 (2021).</li>
<li>Coleman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plantago+Lanceolata%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Plantago Lanceolata.</a> Botanical Bulletin. 1 (11), 45(1876).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+transcriptomic+profiling+of+Plantago+major+provides+insights+for+the+involvement+of+vasculature+in+phosphate+deficiency+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific transcriptomic profiling of Plantago major provides insights for the involvement of vasculature in phosphate deficiency responses.</a> Molecular Genetics and Genomics. 294 (1), 159-175 (2019).</li>
<li>Penczykowski, R. M., Sieg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plantago+spp.+as+models+for+studying+the+ecology+and+evolution+of+species+interactions+across+environmental+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Naturalist%22%5BJournal%5D)">Plantago spp. as models for studying the ecology and evolution of species interactions across environmental gradients.</a> The American Naturalist. 198 (1), 158-176 (2021).</li>
<li>Pommerrenig, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+plantain.+A+collection+of+expressed+sequence+tags+from+vascular+tissue+and+a+simple+and+efficient+transformation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Common plantain. A collection of expressed sequence tags from vascular tissue and a simple and efficient transformation method.</a> Plant Physiology. 142 (4), 1427-1441 (2006).</li>
<li>Bergero, R., Levsen, N., Wolff, K., Charlesworth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arms+races+with+mitochondrial+genome+soft+sweeps+in+a+gynodioecious+plant%2C+Plantago+lanceolata%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Arms races with mitochondrial genome soft sweeps in a gynodioecious plant, Plantago lanceolata.</a> Molecular Ecology. 28 (11), 2772-2785 (2019).</li>
<li>Aalto, E. A., Koelewijn, H. P., Savolainen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+male+sterility+contributes+to+hybrid+incompatibility+between+subspecies+of+Arabidopsis+lyrata%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic male sterility contributes to hybrid incompatibility between subspecies of Arabidopsis lyrata.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 3 (10), 1727-1740 (2013).</li>
<li>Bloch, K. D., Grossmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digestion+of+DNA+with+restriction+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Digestion of DNA with restriction endonucleases.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 3 (1), (1995).</li>
<li>Du, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotic+expression%2C+purification%2C+physicochemical+properties+and+antifungal+activity+analysis+of+phloem+protein+PP2-A1+from+cucumber%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Prokaryotic expression, purification, physicochemical properties and antifungal activity analysis of phloem protein PP2-A1 from cucumber.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 194, 395-401 (2022).</li>
<li>Deshmukh, S. 22, Kulkarni, R., Bose, K. Transformation and protein expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeshmukh%2C+S22+%22Textbook+on+Cloning%2C+Expression+and+Purification+of+Recombinant+Proteins%22">Textbook on Cloning, Expression and Purification of Recombinant Proteins</a>. , Springer. Singapore. 83-114 (2022).</li>
<li>Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergkessel%2C+M+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 529, Academic Press. 299-309 (2013).</li>
<li>Broehan, G., Kroeger, T., Lorenzen, M., Merzendorfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+ATP-binding+cassette+%28ABC%29+transporter+gene+family+of+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the ATP-binding cassette (ABC) transporter gene family of Tribolium castaneum.</a> BMC Genomics. 14, 6(2013).</li>
<li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+fluorescent+proteins+into+Nosema+bombycis+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of fluorescent proteins into Nosema bombycis by electroporation.</a> Parasites & Vectors. 15 (1), 141(2022).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 246(2017).</li>
<li>Manimaran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+early+and+young+callus+tissues+of+indica+rice+BPT+5204+enhances+regeneration+and+transformation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Rice+Science%22%5BJournal%5D)">Infection of early and young callus tissues of indica rice BPT 5204 enhances regeneration and transformation efficiency.</a> Rice Science. 20 (6), 415-426 (2013).</li>
<li>Wang, J., Nie, J., Pattanaik, S., Yuan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Artemisia+annua+L.+using+young+inflorescence%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology-Plant%22%5BJournal%5D)">Efficient Agrobacterium-mediated transformation of Artemisia annua L. using young inflorescence.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. 52 (2), 204-211 (2016).</li>
<li>Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+planta+hairy+root+transformation%3A+a+powerful+platform+for+functional+analysis+of+root+traits+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in soybean.</a> Plants. 11 (8), 1044(2022).</li>
<li>Geng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+root+transformation+system+for+CRISPR%2FCas9-based+analyses+of+shoot-root+communication+in+cucurbit+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">An efficient root transformation system for CRISPR/Cas9-based analyses of shoot-root communication in cucurbit crops.</a> Horticulture Research. 9, (2022).</li>
<li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+using+cotyledons%2C+hypocotyls+and+roots+of+%27Duli%27%28Pyrus+betulifolia+Bunge%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation using cotyledons, hypocotyls and roots of 'Duli'(Pyrus betulifolia Bunge).</a> Scientia Horticulturae. 296, 110906(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Brak protokołu transformacji dla roślin z rodzaju Plantago ogranicza wykorzystanie tych roślin jako modeli, szczególnie gdy naukowcy są zainteresowani badaniem funkcji genów. P. lanceolata została wybrana do opracowania protokołu transformacji genetycznej, ponieważ jest to najczęściej badana roślina z rodzaju16. Opracowany protokół zostanie prawdopodobnie wykorzystany jako narzędzie do dalszych badań związanych z biologią naczyń krwionośnych, ekologią, interakcjami między roślinami a owadami i fizjologią stresu abiotycznego.
Przedstawiony protokół jasno określa kroki, które pozwalają użytkownikowi uzyskać rośliny transgeniczne. Oprócz zdolności P. lanceolata do rozwoju w środowisku hodowli tkankowej, do sukcesu naszej metody transformacji przyczyniło się wiele czynników. Po pierwsze, zaobserwowano znaczenie stosowania do transformacji wysokiej jakości, sterylnej tkanki korzeniowej roślin. Korzenie miały najwyższe tempo transformacji, gdy zostały pobrane z 3-4 tygodniowych roślin i wydawały się zielone lub bladobiałe. Korzenie pobrane z pudełek z jakąkolwiek ilością skażenia bakteryjnego lub grzybiczego często skutkowały skażonymi kulturami strzeleckimi, a starsze korzenie, które wydawały się brązowe, nie powodowały udanej transformacji. Tkanka korzeniowa była najbardziej efektywnym typem tkanki do transformacji przy użyciu obecnej metody, ponieważ tkanka liści i ogonków liściowych nie była w stanie rozwinąć pędów.
Innym ważnym spostrzeżeniem było to, że optymalną metodą pobierania tkanki korzeniowej do transformacji jest umieszczenie świeżo ściętego materiału korzeniowego w sterylnej wodzie. Ten krok skutecznie pozwolił na nawodnienie materiału korzeniowego, podczas gdy pozostała część tkanki została zebrana, ponieważ korzenie mają tendencję do szybkiego wysychania po wyjęciu z pojemników wzrostowych. Ten krok pomógł również zwiększyć wskaźnik powodzenia transformacji, ponieważ pozwolił na inkubację większej liczby korzeni w bakteriach w tym samym czasie.
Protokół ten można zmodyfikować poprzez skrócenie czasu inkubacji tkanki korzeniowej w pożywce do 2 dni. Zaobserwowano, że 2 lub 3 dniowy okres inkubacji jest wystarczający, aby umożliwić infekcję, która prowadzi do powstania inicjałów pędów. Nie zaleca się jednak dłuższego czasu inkubacji, ponieważ zaobserwowano, że brak inhibitora antybiotyku w pożywce często powoduje przerost A. tumefaciens , który może zabić powstającą tkankę.
Ograniczeniem tego badania jest brak dostępnych danych na temat skuteczności innych metod lub gatunków A. tumefaciens w transformacji P. lanceolata dla porównania. O ile nam wiadomo, protokół ten jest nowy. Podczas początkowych prób zauważono wysoką wydajność transformacji w przypadku A. tumefaciens GV3101, a my skupiliśmy się na udoskonaleniu techniki przy użyciu tego szczepu, zamiast eksperymentować z innymi szczepami. Nasza wydajność transformacji na poziomie 20% jest stosunkowo wysoka jak na transformację roślin - wiele konwencjonalnych metod uważa, że wszystko >1% jest skuteczne 26,27,28. Jednak użycie innego szczepu A. tumefaciens, takiego jak A. rhizogenes, znanego z zastosowania w transformacji korzeni u wielu gatunków 29,30,31, może skutkować jeszcze wyższym wskaźnikiem sukcesu. Potrzebne byłyby dalsze eksperymenty, aby ocenić wpływ stosowania innych szczepów w celu promowania zwiększonej wydajności transformacji u P. lanceolata. 
Udana transformacja P. lanceolata prawdopodobnie przyniesie korzyści wielu dziedzinom nauki. Wysoka wydajność transformacji i szybki wzrost rośliny w pożywkach do hodowli tkankowych sprawiają, że P. lanceolata jest wykonalnym kandydatem do badań funkcji genów15.

Koncepcja wykorzystania gatunków modelowych do badania wielu aspektów biologii roślin pojawiła się wraz z powszechnym zastosowaniem Arabidopsis thaliana1. Arabidopsis został początkowo wybrany, ponieważ ma cechy wspólne z wieloma innymi roślinami kwitnącymi i ma wiele cech, które ułatwiają badanie w środowisku laboratoryjnym, takich jak mały rozmiar i krótki cykl pokoleniowy. Duża liczba opublikowanych prac naukowych z jego tematem, wraz z jego małym rozmiarem genomu i łatwością transformacji genetycznej2, pozwalają mu przetrwać jako szeroko stosowany organizm eksperymentalny. Jednak Arabidopsis może być ograniczony jako model dla gatunków o różnych cechach lub unikalnych cechach3. Skłoniło to do opracowania nowych systemów modelowych, takich jak kukurydza (Zea mays), ważna roślina dla genetyki rozwojowej w monocots4, oraz pomidor (Solanum lycopersicum), który jest ważnym modelem dla badań ewolucyjnych, rozwoju i produkcji owoców, a także jest dobrą reprezentacją dla upraw warzyw5. Metoda transformacji genetycznej jest warunkiem wstępnym, aby gatunek rośliny mógł służyć jako organizm modelowy2. Transformacja, w której pośredniczy Agrobacterium tumefaciens, jest niezawodnym narzędziem w biologii roślin; został wykorzystany do przekształcenia kilku gatunków modelowych i głównych upraw, w tym tytoniu (Nicotiana tabacum)6, ryżu (Oryza sativa)7, bawełny (Gossypium hirsutum)8, soi (Glycine max)9, ziemniaka (Solanum tuberosum)10 i rzepaku (Brassica napus)11. Gatunki roślin są bardzo zróżnicowane pod względem skuteczności reakcji na zakażenie A. tumefaciens, a protokoły transformacji często muszą być indywidualnie dostosowane do każdego gatunku6,12.
Rodzaj Plantago obejmuje łącznie 256 gatunków roślin, szeroko rozpowszechnionych na całym świecie13. Gatunki z tego rodzaju często mają unikalne cechy, które sprawiają, że są pożądane jako gatunki modelowe do badania genetyki, ekologii, fizjologii stresu, metabolitów wtórnych, chemii medycznej, interakcji roślina-mikroorganizm, rozwoju roślin i ewolucji. Babka lancetowata, zwana również babką wąskolistną lub babką lancetowatą, jest popularną rośliną od XIXwieku, kiedy to po raz pierwszy użyto jej do opisania zjawiska męskiej bezpłodności14. Podobnie jak inne rośliny z tego rodzaju, był używany w badaniach w różnych dziedzinach badawczych. Ostatnio został zaproponowany jako model dla biologii naczyniowej, ponieważ jego tkanka naczyniowa może być łatwo pobrana15. P. lanceolata jest najczęściej badanym gatunkiem z rodzaju Plantago; artykuł z 2021 r. informował, że w tym czasie było >1,400 publikacji zawierających lub związanych z tym gatunkiem16, a od początku 2022 r. opublikowano dodatkowe 102 artykuły, zgodnie z wyszukiwaniem PubMed przeprowadzonym 9grudnia 2022 r. Następna najczęściej badana roślina z rodzaju, P. major, jest tematem tylko 414 artykułów, gdy jest wyszukiwana przy użyciu tych samych kryteriów w tym samym dniu.
Pomimo zainteresowania badawczego P. lanceolata, badania, zwłaszcza nad charakterystyką funkcji genów, są często ograniczone przez brak zestawu narzędzi do manipulacji genetycznej dla tego gatunku. Pommerrienig et al. podjęli wysiłki w celu opracowania protokołu transformacji dla P. major przy użyciu techniki zanurzania kwiatów17. Jednak metoda ta nie może być zastosowana do P. lanceolata ze względu na męską bezpłodność charakterystyczną dla tego gatunku18,19. O ile nam wiadomo, nie istnieje żaden protokół transformacji P. lanceolata.
To badanie przedstawia prosty protokół transformacji P. lanceolata, w której pośredniczy A. tumefaciens. Celując w tkanki korzeniowe, w pełni rozwinięte rośliny transgeniczne mogą zostać wygenerowane w ciągu 3 miesięcy od transformacji.

<table><tbody><tr><td>Probówka z okrągłym dnem 14 mlA4A2:A34</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150268</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 1-naftylooctowy</td><td>Gold Biotechnology</td><td>N-780</td><td></td></tr><tr><td>3M Taśma chirurgiczna z mikroporami</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>19-027761</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki wirówkowe</td><td>Research Products International Corp.</td><td>163227LC</td><td></td></tr><tr><td>600 Watt Wysokociśnieniowe lampy sodowe</td><td>Plantmax</td><td>PX-LU600</td><td></td></tr><tr><td>6-benzyloaminopuryna (6-BAP)</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>B-110</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Agar baktowy&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Binarny plazmid pBI101</td><td>Clontech, USA&nbsp;</td><td></td><td></td>632522</tr><tr><td>Cool White Grow Light Sylvania LLC</td><td>Home Depot</td><td>315952205</td><td></td></tr><tr><td>D-biotyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DH5a E. coli&nbsp;</td><td>Invitrogen, Stany Zjednoczone&nbsp;</td><td></td><td></td>18258012</tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego, sterylne 150 x 16 mm</td><td>TermoFisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego, sterylne 95 x 15 mm</td><td></td><td></td> Nożyczki preparacyjne ThermoFisher Scientific FB0875714G <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Biosystems</td><td>38DI12044</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>Kwas foliowy</td><td>Fisher Naukowe</td><td>kleszcze BP2519-5</td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td>Biosystems</td><td>38DI18031</td><td></td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Research Products International Corp.</td><td>G35020-1000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>241261</tr><tr><td>Inkubowana wytrząsarka orbitalna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SHKE420HP</td><td></td></tr><tr><td>Kwas indolo-3-octowy (IAA)</td>Gold <td>Biotechnology</td><td>I-110</td><td></td></tr><tr><td>Kwas indolo-3-masłowy (IBA)</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Monosiarczan kanamycyny</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>K-120</td><td></td></tr><tr><td>Makrowirówka&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>Purpurowe pudełka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50255176</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet 1000 i mikro; L</td><td>Corning</td><td>4140</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet 200 i mikro; L</td><td>Corning</td><td>4138</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet 10 i mikro; L</td><td>Corning</td><td>4135</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002410</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet 0,5-10 & mikro; L</td><td>Corning</td><td>4071</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetor 100-1000 i mikro; L</td><td>Corning</td><td>4075</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetor 20-200 i mikro; L</td><td>Corning</td><td>4074</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetor 2-20 i mikro; L</td><td>Corning</td><td>4072</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skooge Basal Medium z Witaminami</td><td>PhytoTech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skooge Basal Salt Mixture</td><td>PhytoTech</td><td>M524</td><td></td></tr><tr><td>mio-inozytol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I-25</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nikotynowy</td><td>Sigma</td><td>N0761-100g</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm (film parafinowy)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>P44000</td><td></td></tr><tr><td>Pirydoksyna HCl</td><td>Sigma</td><td>P6280-10G</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść ostrza skalpela</td><td>Leica Biosystems</td><td>38DI36419</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td><td>Leica Biosystems</td><td>3802181</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, kryształ (NaCl)</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S24000</td><td></td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>Walmart</td><td>23263068401</td><td></td></tr><tr><td>Gleba-Kora Mix</td><td>Berger, USA</td><td>Doniczki kwadratowe BM7</td><td></td></tr><tr><td>(3,5 cala kwadratowego)</td> <td>Szklarnia Megastore</td><td>CN-TRK-1835</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S24060</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina HCl</td><td>Sigma</td><td>T4625-5G</td><td></td></tr><tr><td>Timentyna Tikarcylina/Klawulanian (15/1) (Tymentina)</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>T-104</td><td></td></tr><tr><td>trans-zeatyna Rybozyd (ZR)</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>Z-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Dziki typ Plantago lanceolata seeds</td><td>Outsidepride Seed Source, OR, USA</td><td>F1296</td><td>Outsidepride.com</td></tr><tr><td>Granulowany ekstrakt z drożdży</td><td>Research Products International Corp.</td><td>Y20025-1000&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

transformacja genetyczna babki wąskolistnej za pośrednictwem agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Gatunki z rodzaju Plantago mają kilka unikalnych cech, które doprowadziły do tego, że zostały zaadaptowane jako rośliny modelowe w różnych dziedzinach nauki. Jednak brak systemu manipulacji genetycznej uniemożliwia dogłębne badanie funkcji genów, co ogranicza wszechstronność tego rodzaju jako modelu. W tym miejscu przedstawiono protokół transformacji dla Plantago lanceolata, najczęściej badanego gatunku Plantago. Za pomocą transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, 3-tygodniowe korzenie asepcie uprawianych roślin P. lanceolata zostały zakażone bakteriami, inkubowane przez 2-3 dni, a następnie przeniesione na pożywkę indukcyjną pędów z odpowiednim doborem antybiotyków. Pędy zwykle wyłaniały się z podłoża po 1 miesiącu, a korzenie rozwijały się 1-4 tygodnie po przeniesieniu pędów do podłoża do indukcji korzeni. Rośliny zostały następnie zaaklimatyzowane w środowisku glebowym i przetestowane pod kątem obecności transgenu za pomocą testu reporterowego β-glukuronidazy (GUS). Wydajność transformacji obecnej metody wynosi ~20%, przy czym na 10 przekształconych tkanek korzeniowych pojawiają się dwie rośliny transgeniczne. Ustanowienie protokołu transformacji dla babki wąskolistnej ułatwi przyjęcie tej rośliny jako nowego gatunku modelowego na różnych obszarach.

W niniejszym opracowaniu przedstawiono prosty protokół otrzymywania transgenicznych *P. lanceolata* wykorzystanie roślin A. tumefaciens-transformacja za pośrednictwem. Gen reporterowy GUS (kodowanie β-glukuronidaza) ulega transformacjipod kontrolą promotora wyrażanego w floemie AtPP2do 3-tygodniowych *P. lanceolata* przenikanie korzeni przez *A. tumefaciens* szczep GV3101 (Rysunek 2). Wybrano promotor specyficzny dla łyka, ponieważ głównym celem było stworzenie systemu dla genomiki funkcjonalnej tkanek przewodzących roślin, w szczególności łyka. Metodę przetestowano w eksperymencie wstępnym na tkance korzenia, liścia i ogonka liściowego. Choć w każdym z typów tkanek udało się indukować kalus, tylko tkanka korzenia wytworzyła primordia pędów (Rysunek 5A) po 1 miesiącu w SIM; liść i ogonek liściowy zbrązowiały i obumarły (Rysunek 5B). Doprowadziło to do wniosku, że tkanka korzenia jest optymalnym typem tkanki do zastosowania w metodzie transformacji. Korzenie inkubowano w przygotowanej zawiesinie bakterii w roztworze resuspensyjnym (SS) (Tabela 1) przez minimum 20 min, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej na stałych pożywkach SS przez maksymalnie 3 dni w ciemności (Rysunek 3E). Następnie korzenie przeniesiono na pożywkę do indukcji pędów (SIM) i utrzymywano pod lampą do wzrostu roślin, w warunkach wskazanych w protokole (krok 1.6). Rysunek 1 i Rycina 3 Przedstaw reprezentatywne obrazy każdego kroku protokołu w celu odniesienia.
Rysunek 6 przedstawia postęp powstawania inicjałów pędów wyłaniających się z przekształconej tkanki, od pierwszego dnia po umieszczeniu korzeni na podłożu SIM (Rysunek 6A) aż do momentu, gdy pędy były gotowe do ukorzenienia (Rysunek 6D). Po 1 tygodniu w tkance korzenia powstał kalus (Rysunek 6B) i można było zaobserwować pierwsze inicjały pędów (Rysunek 6B1). Pędy nadal wyłaniały się w drugim i trzecim tygodniu (Rysunek 6C), a po 4 tygodniach były gotowe do przeniesienia na podłoże indukujące ukorzenienie (Rysunek 6D).
Identyfikację domniemanych roślin transgenicznych przeprowadzono za pomocą histochemicznego testu β-glukuronidazy (GUS), wykorzystując fragmenty liści pobrane, gdy pędy osiągnęły długość około 0,5 cm. Pozytywne rośliny transgeniczne wykazywały oczekiwany wzór barwienia w tkankach zlokalizowanych w łyku, co przedstawiono na Rysunku 4. Pędy wybarwione pozytywnie na GUS przeniesiono na pożywkę indukującą korzenienie, na której po 4 tygodniach rozwinęły one silne systemy korzeniowe (Rysunek 1E). Ukorzenione rośliny przeniesiono następnie do gleby. Rysunek 4 przedstawia wynik barwienia w plantago wąskolistnym przekształconym promotorem AtPP2 i genem β-glukuronidazy (GUS), a dla porównania również roślinę typu dzikiego oraz plantago wąskolistne przekształcone promotorem AtPP2 . Wszystkie wyrosłe pędy potwierdzono jako transgeniczne. Wydajność transformacji określono na średnio 20%, przy czym z każdych 10 przekształconych korzeni wyrastały około dwa pędy. Potwierdzone rośliny transgeniczne przeniesiono do większych doniczek i hodowano przez 4–8 tygodni, aż osiągnęły stadium dorosłe (Rysunek 1F).
<img alt="Oś czasu transformacji roślin; od sterylizacji nasion do testowania fenotypu; diagram; proces naukowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Oś czasu transformacji Plantago lanceolata . Reprezentatywne obrazy każdego etapu protokołu. (A) Niewykiełkowane nasiona wysiane na pożywce MS. (B) Nasiona wykiełkowane po 1 tygodniu, gotowe do przeniesienia do pojemników magenta. (C) Rośliny w pojemnikach z pożywką MS po 3 tygodniach wzrostu. Korzenie są zielone i zdrowe, w idealnym stadium do transformacji. (D) Pędy w pożywce do indukcji pędów po 4 tygodniach są gotowe do przeniesienia do pożywki ukorzeniającej. Na tym etapie można przeprowadzić histochemiczne barwienie β-glukuronidazą (GUS), jeśli jest to właściwe. (E) Rośliny w pojemnikach z pożywką do indukcji korzeni, w których korzenie uformowały się po 4 tygodniach wzrostu. (F) Rośliny transgeniczne wyhodowane do pełnej długości po 4 tygodniach wzrostu w glebie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat mapy plazmidu pBI101; cechy obejmują gen GUS, ori, KanR, miejsca EcoRI; klonowanie genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat plazmidu wektora binarnego pBI101 + β-glukuronidaza (GUS) z wstawionym promotorem specyficznym dla floemu AtPP2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Przetwarzanie korzeni roślin: wycinanie, inkubacja bakteryjna, suszenie, przenoszenie na podłoże CIM, schemat owijania folią." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Etapy transformacji. Reprezentatywne obrazy każdego etapu transformacji. (A) Oddzielanie korzeni od pędów podczas transformacji. (B) Namaczanie korzeni w zawiesinie bakterii/SS. (C) Suszenie korzeni na ręcznikach papierowych w celu usunięcia nadmiaru bakterii. (D) Korzenie wysiane na podłożu do kokultury. (E) Szalki SS owinięte folią aluminiową. Rośliny inkubowano przez 2-3 dni przed przeniesieniem na podłoże do regeneracji pędów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza struktury żyłek liścia, obraz mikroskopowy przedstawiający trzy barwione próbki do badania naczyń." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Barwienie GUS. Wyniki barwienia β-glukuronidazą (GUS) segmentów liści plantago wąskolistnej. (A) Typ dziki. (B) Plantago wąskolistna przekształcona plazmidem zawierającym promotor AtPP2 (pusty wektor). (C) Plantago wąskolistna przekształcona plazmidem zawierającym promotor AtPP2 oraz gen β-glukuronidazy (GUS). Każdy liść został zabarwiony zgodnie z protokołem histochemicznego barwienia GUS, a następnie obrazowany za pomocą kamery mikroskopowej. Obrazy (B) i (C) nie wykazują wzoru barwienia ze względu na brak genu GUS. Prawy obraz pokazuje wyraźne niebieskie barwienie w obrębie żyłek, co potwierdza, że rośliny są transgeniczne. Pasek skali reprezentuje 1 mm, a każdy segment liścia ma długość około 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza wzrostu roślin; eksperyment na szalkach Petriego; rozwój korzeni; test oporności na kanamycynę." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5Porównanie wydajności transformacji różnych typów tkanek po &gt;1-miesięczna inkubacja na pożywce do pędów. (A) Tkanki korzeniowe po ponad miesiącu wzrostu. W obrębie korzeni doszło do rozrostu kalusa i pojawiły się inicjały pędów. Nietransformowany kalus zaczął obumierać w wyniku selekcji antybiotykowej. (B) Tkanki liścia i ogonka liściowego po ponad miesiącu wzrostu. W tkankach zaobserwowano pewną ekspansję kalusa, który jednak wkrótce obumarł w odpowiedzi na działanie antybiotyku. Z żadnej z tkanek nie wyrosły pędy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Postęp wzrostu roślin w ciągu 4 tygodni; szalki Petriego, eksperyment regeneracji roślin, wyniki mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Powstawanie kalusa i pędów na tkance transformowanej. Reprezentatywne obrazy tkanek umieszczonych na pożywce pędowej po różnych okresach inkubacji. (A) Tkanki korzenia bezpośrednio po wyłożeniu na pożywkę pędową. (B) Tkanki korzenia po 1 tygodniu na pożywce pędowej. Można zaobserwować ekspansję kalusa, a (B1) pierwsze prymasa pędów zaczęły się pojawiać. (C) Tkanki korzenia po 3 tygodniach na pożywce pędowej. Pojawiło się więcej prymasów pędów. (C1) Pęd, który wyłonił się z prymasa pędu B1. (D) Tkanki korzenia po 4 tygodniach inkubacji. Tkanka nietransformowana zaczęła czernieć/brązowieć i obumierać, a wyłaniające się pędy nadal rosną. Na tym etapie pędy są gotowe do przeniesienia na pożywkę ukorzeniającą. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Przepisy na przygotowanie pożywek. Opis sposobu przygotowania pożywek do transformacji. Ilość dodanych witamin oblicza się na podstawie wskazanego stężenia roztworu zapasowego. Sposób przygotowania roztworów zapasowych witamin przedstawiono w Tabeli 2. W przypadku wszystkich pożywek należy dodać odczynniki do 900 mL dwukrotnie destylowanej H2O, dostosować pH do wskazanego poziomu, a następnie uzupełnić wodą do końcowej objętości 1 000 mL. * = dodać po sterylizacji. ** = pH korygowane 1 M KOH. *** = pH korygowane 1 M NaOH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777_Table%201_Media%20Preparation%20Recipes.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Roztwory zapasowe witamin do pożywek Plantago. Wszystkie witaminy muszą zostać wysterylizowane przez filtr i precyzyjnie oznakowane przed przechowywaniem. W miejscach wskazanych, proszki należy najpierw rozpuścić w 1 N NaOH, a następnie dopełnić do pożądanego poziomu podwójnie destylowaną H2O. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777_Table%202_Vitamin%20Stocks%20for%20Plantago%20Mediums.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ze względu na jej wszechstronne zastosowanie jako gatunku modelowego w różnych dziedzinach nauki, istnieje potrzeba stworzenia zestawu narzędzi do transformacji genetycznej u babki lancetowatej (Plantago lanceolata). Tutaj, przy użyciu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, przedstawiono protokół, w wyniku którego powstają stabilne linie transgeniczne o wydajności transformacji wynoszącej 20%.

Transformacja genetyczna babki wąskolistnej za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens

Species in the genus Plantago have several unique traits that have led to them being adapted as model plants in various fields of study. However, the lack ...

Gatunki babki lancetowatej mogą być wykorzystywane jako rośliny modelowe dla biologii naczyń krwionośnych roślin i fizjologii stresu. Ustanowienie protokołu transformacji umożliwia dogłębne badania na tych roślinach w celu zbadania relacji między genami a związanym z nimi fenotypem. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona pokarmy jako eksplantaty do przekształcania babki wąskolistnej z wysoką wydajnością.Na początek umieść dostępne w handlu nasiona Plantago lanceolata typu dzikiego w 50-mililitrowej probówce wirówkowej do znaku 5 mililitrów, w zależności od pożądanej liczby roślin. Zanurz nasiona w 75% etanolu na 60 sekund. Po wyrzuceniu etanolu zanurz nasiona w świeżo przygotowanym 20% podchlorynie sodu na 40 minut, delikatnie odwracając rurkę.Pod okapem przepływowym do laminatu wylej roztwór podchlorynu sodu, a następnie umyj nasiona pięciokrotnie wodą destylowaną. Dodaj niewielką ilość wody do nasion po ostatnim płukaniu, ponieważ może to pomóc w przemieszczaniu się roślin na talerze. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś nasiona na wcześniej przygotowaną szalkę Petriego ze stałym podłożem MS, rozprowadzając nasiona równomiernie na powierzchni płytki, około 1 centymetr między każdym nasionem, aby zapobiec przepełnieniu kiełkujących siewek.Uszczelnij płytkę dwiema warstwami folii parafinowej, aby zapobiec zanieczyszczeniu i inkubuj w chłodnym białym świetle do uprawy w temperaturze pokojowej. Gdy sadzonki wykiełkują i będą wystarczająco duże, aby można je było przenieść, zwykle po dwóch lub trzech dniach kiełkowania, użyj sterylnych kleszczy i przenieś sadzonki do sterylnych pudełek zawierających od 50 do 100 mililitrów MS Medium. Uszczelnij pudełka taśmą chirurgiczną i pozwól roślinom rosnąć w chłodnym białym świetle przez około trzy do czterech tygodni.Smugi Agrobacterium tumefaciens zawierające pożądany plazmid na przygotowaną stałą płytkę LB z odpowiednim środkiem selekcyjnym. Inkubuj zapieczętowaną parafinę płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez maksymalnie 48 godzin lub do momentu, gdy bakterie urosną wystarczająco duże, aby można je było wybrać. Po inkubacji wybierz kolonię bakterii za pomocą końcówki pipety na dwa dni przed transformacją i zaszczep ją w 15-mililitrowej probówce z okrągłym dnem zawierającej sześć mililitrów płynnego LB odpowiednim środkiem selekcyjnym.Wstrząsaj z prędkością 200 obr./min w shakerze stołowym o temperaturze 28 stopni Celsjusza przez noc, aż OD 600 osiągnie 0,6 do 0,7. Gdy bakterie osiągną wymaganą średnicę zewnętrzną, przenieś 200 mikrolitrów kultury bakteryjnej do sterylnej kolby zawierającej 100 mililitrów LB ze środkiem selekcyjnym. Wstrząsaj z prędkością 200 obr./min w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez noc.Następnie przenieś kulturę bakteryjną do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 mililitrów i odwiruj przy 2,200G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zebrać bakterie. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w pięciu mililitrach świeżo przygotowanego roztworu zawiesiny lub SS w temperaturze pokojowej przez pipetowanie. Następnie dodaj więcej SS do znaku 50 mililitrów i odwróć, aby wymieszać kilka razy.Gdy rośliny osiągną idealny etap transformacji, za około trzy tygodnie, użyj sterylnych kleszczy i nożyczek, aby oddzielić korzenie od rośliny i wyrzucić materiał liści i łodyg. Natychmiast po ścięciu aseptycznie przenieś kawałki korzeni do pudełek zawierających sterylną wodę za pomocą kleszczy, aby je nawodnić. Następnie wlej zawieszoną hodowlę bakterii Agrobacterium tumefaciens SS do sterylnych jednorazowych szalek Petriego o wymiarach 150 na 15 milimetrów.Przenieś ścięte korzenie do kultury bakteryjnej i inkubuj przez co najmniej 20 minut. Podczas inkubacji za pomocą sterylnego skalpela z ostrym ostrzem pokrój korzenie na jednocentymetrowe fragmenty oddzielające korzenie pierwotne od korzeni bocznych. Następnie wykonaj cienkie, płytkie nacięcia na powierzchni korzeni, aby bakterie mogły zainfekować roślinę.Po inkubacji przenieś kawałki korzeni na sterylne ręczniki papierowe, aby usunąć nadmiar bakterii. Następnie przenieś wysuszone korzenie na przygotowane szalki Petriego zawierające stałe pożywki do kohodowli, około 10 do 20 korzeni na płytkę, w zależności od wielkości korzeni. Uszczelnij płytki dwiema warstwami przezroczystej folii z tworzywa sztucznego, a następnie folią aluminiową, aby inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy dni.Po trzech dniach inkubacji. W pożywkach do kohodowli przenieś kawałki korzeni na przygotowane szalki Petriego z pożywką indukcyjną pędów stałych lub SIM z 500 miligramami na litr temetyny i odpowiednim doborem antybiotyków. Inkubuj przezroczyste płytki uszczelnione folią z tworzywa sztucznego pod światłem do uprawy przez miesiąc lub do momentu, gdy zaczną pojawiać się pędy.Gdy sadzonki osiągną od 1,5 do 2,0 centymetrów długości. Przełóż je do przygotowanych sterylnych pudełek. Z solidnym podłożem do indukcji korzeni.Uprawiaj rośliny pod światłem przez kilka tygodni, aż uformują się korzenie. Zazwyczaj po tygodniu, gdy systemy korzeniowe stają się wystarczająco duże, aby można je było przenieść, zwykle po miesiącu wzrostu, weź roślinę i delikatnie umyj korzenie wodą, aby usunąć wszelkie podłoże, które przykleja się do korzeni. Następnie przenieś rośliny do 3,5-calowych kwadratowych doniczek zawierających wstępnie zwilżoną uniwersalną glebę BM seven przykryj rośliny plastikową osłoną doniczkową, a następnie przezroczystą plastikową torbą, aby upewnić się, że rośliny pozostają w wilgotnym środowisku.Metoda ta została przetestowana na liściu korzeniowym i drobnych starych tkankach. We wstępnym eksperymencie, chociaż zrogowacenie można było wywołać we wszystkich typach tkanek, tylko tkanka korzeniowa wytworzyła inicjały pędów po miesiącu w SIM, liść i pedał zmieniły kolor na brązowy i obumarły. Od pierwszego dnia obserwowano progresję inicjałów pędów wyłaniających się z przekształconej tkanki.Korzenie umieszczono na karcie SIM do momentu, gdy pędy były gotowe do ukorzenienia. Po tygodniu tkanka korzeniowa utworzyła się zrogowaciały na początku pędu, można było zaobserwować zaczątki. Pędy pojawiały się nadal w drugim i trzecim tygodniu, a po czterech tygodniach pędy były gotowe do przeniesienia na podłoże do indukcji korzeni.Identyfikację karzących roślin transgenicznych przeprowadzono za pomocą beta glukuronidazy GUS Próba histochemiczna z wykorzystaniem segmentów liści pobranych, gdy pędy osiągnęły około 0,5 centymetra długości. Dziki typ w transformacji z pustymi wektorami nie wykazuje wzoru barwienia. Ze względu na brak genu GUS, transformacja z genem beta glukuronidazy GUS wykazała wyraźny niebieski wzór barwienia w żyłach, potwierdzający, że rośliny są transgeniczne Korzenie powinny być zawsze nawodnione, aby zapobiec wysychaniu podczas zabiegu, aby temu zapobiec, przenieś korzenie około 10 na raz.

agrobacterium-tumefaciens-mediated-genetic-transformation-narrowleaf

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie pokazujemy genetyczną transformację genomu ryżu za pomocą wektora binarnego Agrobacterium tumefaciens. Bakteria ta ułatwia przenoszenie obcego plazmidu DNA za pomocą białek wirulencji Agrobacterium.

Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium: metoda genetycznej transformacji genomu ryżu za pomocą genetycznie modyfikowanych Agrobacterium tumefaciens

Produkcja białka przejściowego w roślinach Nicotiana oparta na infiltracji próżniowej za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe (oparte na wirusie mozaiki tytoniu) jest szybkim i ekonomicznym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych. Uprościliśmy procedurę i poprawiliśmy akumulację celu, optymalizując warunki hodowli bakterii, dobierając gatunki gospodarzy i współwprowadzając supresory wyciszające RNA.

Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

Tutaj prezentujemy dwa protokoły przekształcania roślin ziemniaka. Transformacja Agrobacterium tumefaciens prowadzi do kompletnej rośliny transgenicznej, podczas gdy Agrobacterium rhizogenes wytwarza transgeniczne owłosione korzenie w pędach typu dzikiego, które mogą się samodzielnie rozmnażać. Następnie wykrywamy aktywność promotora poprzez barwienie GUS w przekształconych korzeniach.

Przemiana ziemniaka w ziemniaku za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes oraz aktywność promotorowa genu suberyny przez barwienie GUS

Geny morfogeniczne roślin mogą być wykorzystane do poprawy genetycznej transformacji opornych genotypów. Opisano tutaj protokół transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium (QuickCorn) dla trzech ważnych publicznych linii wsobnych kukurydzy.

Transformacja niedojrzałych zarodków opornych linii wsobnych kukurydzy za pośrednictwem Agrobacterium przy użyciu genów morfogennych

Ta praca opisuje użycie technologii edycji genomu CRISPR-Cas9 do wyeliminowania endogennego genu OsABCG15, a następnie zmodyfikowanego protokołu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium w celu wytworzenia stabilnej męsko-sterylnej linii w ryżu.

Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium, produkcja transgeniczna i jej zastosowanie w badaniach nad rozwojem rozrodczym mężczyzn w ryżu

Ten protokół opisuje wykorzystanie transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) do integracji interesujących genów z genomem jądrowym zielonej mikroalgi Chlorella vulgaris, co prowadzi do produkcji stabilnych transformantów.

Inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, Chlorella vulgaris

W tym badaniu, w bambusie opracowano nowatorską metodę ekspresji genów planta i edycji genów, w której pośredniczy Agrobacterium. Metoda ta znacznie poprawiła skuteczność walidacji funkcji genów w bambusie, co ma znaczące implikacje dla przyspieszenia procesu hodowli bambusa.

W Planta Ekspresja genów i edycja genów w liściach bambusa Moso

Tutaj prezentujemy pierwszy protokół miejscowej infiltracji próżniowej do badań in vivo genetycznej transformacji dużych roślin. Korzystając z tej metodologii, po raz pierwszy uzyskaliśmy przejściową transformację kakao za pośrednictwem Agrobacterium.

Agroinfiltracja wymuszona próżnią w celu transformacji in planta roślin opornych: kakao jako studium przypadku

Protokół opisuje indukcję owłosionych korzeni za pomocą łodyg kwiatostanu Arabidopsis i hipokotyli Brassica napus. Owłosione korzenie mogą być hodowane i wykorzystywane jako eksplantaty do regeneracji roślin transgenicznych.

Transformacja i regeneracja korzeni owłosionych u Arabidopsis thaliana i Brassica napus

Przedstawiamy prosty, skuteczny i powtarzalny protokół transformacji Phytophthora palmivora, pośredniczonego przez Agrobacterium, który jest również stosowany do P. capsici.

Uproszczona metoda transformacji Phytophthora palmivora za pośrednictwem bakterii agrobakterii

Poznaj protokół transformacji genetycznej babki wąskolistnej Plantago lanceolata przy użyciu Agrobacterium tumefaciens. Metoda osiąga 20% wydajność i umożliwia badanie relacji gen-fenotyp w biologii roślin.

Transformacja genetyczna babki wąskolistnej za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens

Przeglądaj więcej filmów