Name: Ex vivo Ekspansja i manipulacja genetyczna krwionośnych komórek macierzystych myszy w kulturach na bazie alkoholu poliwinylowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj metodę ekspansji i manipulacji genetycznej mysich krwionośnych komórek macierzystych w kulturze ex vivo na bazie alkoholu poliwinylowego. Technika umożliwia długoterminowe utrzymanie komórek i badanie hematopoezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Rdzeniowi Cytometrii Przepływowej WIMM za dostęp do cytometrii przepływowej, oraz Rdzeniowi Badań Przesiewowych Wirusów WIMM za generowanie wektorów lentiwirusowych. Praca ta została sfinansowana przez Kay Kendall Leukaemia Fund i Brytyjską Radę ds. Badań Medycznych.

Wszystkie procedury na zwierzętach, w tym hodowla i eutanazja, muszą być wykonywane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi. Eksperymenty opisane poniżej zostały zatwierdzone przez brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać listę wszystkich materiałów, odczynników i sprzętu użytego w tym protokole.
1. Przygotowanie roztworów podstawowych
<ol>
	<li>Roztwór podstawowy PVA
	<ol>
		<li>Weź 50 ml wody o jakości kultur tkankowych do małej szklanej butelki (odpowiedniej do autoklawowania). Podgrzej wodę do prawie wrzenia w kuchence mikrofalowej.</li>
		<li>Odważyć 5 g proszku PVA i dodać do wody. 
		UWAGA: Zaleca się rozpuszczenie tylko 1-5 g PVA. Rozpuszczanie większych ilości może spowodować niepełną rekonstytucję.</li>
		<li>Zamknij szczelnie pokrywkę i wstrząśnij, aby wymieszać. Następnie poluzuj pokrywę. 
		UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas ponownego otwierania, ponieważ ciśnienie może ulec zmianie ze względu na zmieniającą się temperaturę wody.</li>
		<li>Autoklaw i pozostawić do ostygnięcia. Zamknij szczelnie pokrywkę i wstrząśnij, aby wymieszać. Porcje należy przygotować w sterylnych probówkach i przechowywać do 3 miesięcy w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuścić liofilizowane cytokiny w pożywce F-12 zawierającej 1 mg/ml PVA. Rozpuść czynnik komórek macierzystych do 10 μg/ml i trombopoetynę do 100 μg/ml, aby wytworzyć zapasy w stosunku 1:1000. Porcje należy przygotować w sterylnych probówkach i przechowywać przez długi czas w temperaturze -80 °C. Alternatywnie, należy przechowywać podwielokrotności w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia. 
	UWAGA: Należy unikać rekonstytucji cytokin w albuminie surowicy bydlęcej ze względu na negatywny wpływ na ekspansję HSC u myszy.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja szpiku kostnego HSC i wzbogacenie c-Kit+
<ol>
	<li>Wypreparuj kości udowe, piszczelowe, miednice i kręgosłup świeżo poddanych eutanazji 8-12-tygodniowym myszom C57BL/6 (poprzez uduszenie CO2 i/lub zwichnięcie szyjki macicy) i umieść kości w PBS na lodzie. 
	UWAGA: Upewnij się, że powierzchnie i narzędzia są wysterylizowane 70% etanolem.</li>
	<li>Oczyść kości za pomocą niestrzępiących się, delikatnych chusteczek do ćwiczeń, usuwając mięśnie i rdzeń kręgowy, a następnie dodaj do moździerza z ~3 ml PBS. 
	UWAGA: Upewnij się, że tłuczek i moździerz są wysterylizowane 70% etanolem, a następnie raz zmyte PBS.</li>
	<li>Zmiażdż kości tłuczkiem bez mielenia, aby zminimalizować siły ścinające. Rozdrobnić duże fragmenty szpiku kostnego uwolnione do PBS za pomocą igły 19 G dołączonej do strzykawki o pojemności 5 ml. Przenieść zawiesinę komórek przez filtr 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Po przeniesieniu zawiesiny powtarzać czynności z nowym PBS, aż kości zostaną wybielone i nie będzie widać szpiku. Dąż do końcowej objętości ~30 ml na mysz i ~50 ml dla dwóch myszy.</li>
	<li>Wymieszać komórki szpiku kostnego, zebrać 10 μl komórek i policzyć za pomocą roztworu Türksa w rozcieńczeniu 1:10-1:20 za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: Oczekuje się, że jedna mysz da 2-5 × 108 całych komórek szpiku kostnego.</li>
	<li>Wirować z prędkością 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w zimnym PBS (350 μl dla jednej myszy lub 500 μl dla dwóch myszy).</li>
	<li>Dodać 0,2 μl przeciwciała anty-c-Kit allofikocyjaniny (APC) na 10 milionów komórek i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 5 ml zimnego PBS do inkubowanych komórek, aby zmyć nadmiar przeciwciał i przefiltrować przez filtr 50 μm do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Umyj oryginalną probówkę 7 ml zimnego PBS i przełóż przez filtr. Jeśli dojdzie do zatkania filtra, zarysuj powierzchnię filtra końcówką P1000.</li>
	<li>Wirować z prędkością 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w zimnym PBS (350 μl dla jednej myszy lub 500 μl dla dwóch myszy).</li>
	<li>Dodać 0,2 μl mikrogranulek anty-APC na 10 milionów komórek i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze 4 °C. Dodać 12 ml sterylnego PBS, aby zmyć nadmiar mikrogranulek.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 2 ml zimnego PBS. Podczas gdy komórki obracają się w tym kroku, przejdź do kroku 2.13.</li>
	<li>Przygotuj się do wzbogacenia kolumny, umieszczając magnetyczną kolumnę filtracyjną w magnesie magnetycznego separatora kolumnowego, z filtrem 50 μm na górze i stożkową rurką o pojemności 15 ml poniżej.</li>
	<li>Przepuścić 3 ml sterylnego PBS przez filtr 50 μm i kolumnę filtracyjną. Po przejściu PBS przepuścić zawiesinę komórek przez kolumnę, a następnie za każdym razem trzykrotnie przepłukać 3 ml zimnego PBS. Przy każdym praniu poczekaj, aż kolumna przestanie kapać przed dodaniem następnego prania.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją na świeżej probówce o pojemności 15 ml. Dodać 5 ml zimnego PBS, założyć tłok kolumny na kolumnę i wymyć komórki, naciskając tłok.</li>
	<li>Wymieszaj komórki wzbogacone w c-Kit, zbierz 10 μl komórek i policz za pomocą roztworu Türksa w rozcieńczeniu 1:2 za pomocą hemocytometru. Typowa wydajność z jednej myszy wynosi 2-5 × 106 komórek c-Kit+. 
	UWAGA: W tym momencie komórki można bezpośrednio rozsiać na pożywce HSC lub przygotować do oczyszczania HSC za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).</li>
</ol>
3. Inicjowanie hodowli komórkowych za pomocą HSPC wzbogaconych o c-Kit
<ol>
	<li>Przygotować świeżą pożywkę (Tabela 1) dla wymaganej liczby komórek/studzienek. Wysiew: 0,5-1 miliona komórek na ml dla HSPC wzbogaconych w c-Kit.</li>
	<li>Odwiruj komórki wzbogacone w c-Kit i ponownie zawieś w podłożu HSC o żądanej gęstości komórek.</li>
	<li>Przenieś komórki na płytki pokryte fibronektyną lub naładowane ujemnie powierzchniowo, w ilości 200 μl na płytkę 96-dołkową lub 1 ml na płytkę 24-dołkową.</li>
	<li>Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na temperaturę 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Inicjowanie hodowli komórkowych za pomocą oczyszczonych HSC FACS
<ol>
	<li>Przygotować odpowiednią objętość biotynylowanego barwienia przeciwciałami rodowymi: 3 μl mieszanki wzorcowej (Tabela 2) na 10 milionów komórek, rozcieńczonych w stosunku 1:100 w PBS.</li>
	<li>Odwirować komórki wzbogacone w c-Kit i ponownie zawiesić w barwieniu przeciwciał linii przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć 10 ml sterylnego PBS i odwirowywać w temperaturze 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować odpowiednią objętość świeżego barwnika przeciwciałem HSC (tabela 3): 300 μl na 10 milionów komórek. Równolegle z tym barwieniem próbki należy przygotować odpowiednie próbki kontrolne barwienia do kompensacji i bramkowania. 
	UWAGA: Pracuj w kapturze do hodowli tkankowej przy wyłączonym świetle podczas stosowania przeciwciał sprzężonych z barwnikiem.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w barwieniu przeciwciałem HSC i inkubować w temperaturze 4 °C przez 90 minut. Mieszać komórki co 20-30 minut, stukając, aby zapobiec osadzaniu się komórek.</li>
	<li>Przemyć 10 ml sterylnego PBS i odwirowywać w temperaturze 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant, przesunąć osad w celu rozbicia i ponownie zawiesić w sterylnym PBS z 0,5 μg/ml jodku propidyny (PI).</li>
	<li>Przygotować świeżą pożywkę (Tabela 1) dla wymaganej liczby dołków i umieścić na płytkach z fibronektyną lub płytkami naładowanymi ujemnie (200 μl na płytkę 96-dołkową lub 1 ml na płytkę 24-dołkową).</li>
	<li>Przygotuj maszynę FACS do sortowania i sortuj CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage- HSC bezpośrednio do studzienek zawierających pożywkę (patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 1 dla standardowej strategii bramkowania FACS stosowanej tutaj). Sortuj do 200 komórek na 96-dołkową płytkę lub do 1 000 komórek na 24-dołkową płytkę. 
	UWAGA: Maszyny FACS powinny być obsługiwane przez przeszkolonego naukowca. Zaleca się, aby użytkownicy skontaktowali się z lokalną placówką FACS w celu omówienia tej strategii sortowania, jeśli nie mają doświadczenia w izolacji FACS mysich HSC.</li>
</ol>
5. Wprowadzanie zmian w mediach
<ol>
	<li>W przypadku hodowli komórkowych zainicjowanych z komórek wzbogaconych w c-Kit należy rozpocząć zmiany pożywki po 2 dniach. W przypadku hodowli komórkowych zainicjowanych z izolowanych przez FACS HSC, należy rozpocząć zmiany pożywki po 5 dniach.</li>
	<li>Przygotować wystarczającą ilość świeżego, wstępnie ogrzanego (~37 °C) podłoża HSC (Tabela 1) dla wszystkich studzienek.</li>
	<li>Delikatnie wyjąć płytkę z inkubatora do hodowli tkankowych. 
	UWAGA: Ponieważ HSPC na płytkach naładowanych ujemnie powierzchniowo łatwiej ulega zakłóceniu niż te na fibronektynie, należy zachować szczególną ostrożność podczas zmiany pożywki na płytkach naładowanych ujemnie powierzchniowo, aby uniknąć zakłócenia hodowli komórkowych.</li>
	<li>Za pomocą pipety lub pompy próżniowej powoli usuń ~90%-95% pożywki z menisku studzienki. 
	UWAGA: Unikaj wyciągania pożywki z podstawy studzienki, w przeciwnym razie wiele komórek zostanie usuniętych.</li>
	<li>Dodać 200 μl (dla płytek 96-dołkowych; 1 ml dla płytek 24-dołkowych) świeżej pożywki do dołka.</li>
	<li>Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Powtarzać kroki 5.1-5.6 co 2-3 dni, aż do punktu końcowego eksperymentu.</li>
	<li>W przypadku kultur komórkowych zainicjowanych HSPC wzbogaconymi w c-Kit (sekcja 3), należy podzielić kultury w stosunku 1:2-1:3 po ~3 tygodniach. W przypadku kultur komórkowych zainicjowanych oczyszczonymi HSC FACS (sekcja 4), należy podzielić kultury w stosunku 1:2-1:3 po ~3 tygodniach i gdy kultury są >90% zlewne. 
	UWAGA: Dokładny harmonogram będzie zależał od zainteresowań eksperymentalnych. Kultury te były charakteryzowane przez 4-8 tygodni8, ale możliwe są dodatkowe długości hodowli.</li>
</ol>
6. Elektroporowanie hodowanych HSPC
UWAGA: Ten protokół służy do elektroporacji rybonukleoproteiny Cas9/sgRNA (RNP), ale może być dostosowany do elektroporacji mRNA lub innych rekombinowanych białek. Rozpocznij hodowle z wystarczającą liczbą komórek, aby przeprowadzić to w pożądanym punkcie czasowym eksperymentu.
<ol>
	<li>Wykonać wymianę podłoża 1 dzień przed elektroporacją, jak opisano w punkcie 5. 
	UWAGA: Zaleca się co najmniej posiew przez noc przed elektroporacją. Jednak komórki są zwykle hodowane przez 1-3 tygodnie przed transdukcją.</li>
	<li>W dniu elektroporacji ustaw nukleofektor. Włącz maszynę. Na ekranie dotykowym wybierz moduł X, a następnie używany rozmiar kuwety.</li>
	<li>Przygotować wystarczającą ilość roztworu P3 (zgodnie z instrukcjami producenta) do skali elektroporacji (100 μl na kuwetę lub 20 μl na mikrokuwetę) i pozostawić do wyrównania do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przygotować wystarczającą ilość świeżego podłoża (tabela 1) w stosunku do liczby dołków platerowanych i dodać 500 μl pożywki do 24-dołkowej płytki lub 100 μl pożywki do 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Rozmrozić sgRNA (wstępnie rozcieńczone do 2 μg/ml w wodzie wolnej od RNaz) na lodzie i wymieszać 16 μg sgRNA z 30 μg enzymu Cas9 (w stężeniu 10 μg/ml) w sterylnej probówce do PCR. Dołączyć dodatkową probówkę do PCR zawierającą tylko białko Cas9 jako kontrolę. Wymieszaj, przesuwając rurkę, a następnie krótko odwiruj. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 10 minut w termocyklerze w celu skompleksowania RNP, a następnie utrzymywać probówki na lodzie. 
	UWAGA: Można to zmniejszyć pięciokrotnie, jeśli wykonujesz elektroporację w mikrokuwetach.</li>
	<li>Wymieszać i przenieść HSPC do elektroporacji do probówki; zebrać 10 μl komórek i policzyć za pomocą roztworu Türksa w rozcieńczeniu 1:2 za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: Zaleca się elektroportowanie 1-5 milionów ogniw na 100 μl kuwety (pięciokrotnie zmniejszone w przypadku mikrokuwety).</li>
	<li>Odwirować odpowiednie komórki liczbowe w probówce o pojemności 1,5 ml o masie 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać jak najwięcej supernatantu i ponownie zawiesić 100 μl buforu nukleofekcyjnego.</li>
	<li>Natychmiast przenieś zawiesinę komórek do probówki PCR zawierającej skompleksowany RNP i powoli pipetuj w górę iw dół, aby delikatnie wymieszać i przenieść do kuwety do elektroporacji o pojemności 100 μl. Wyrzuć mieszaninę do kuwety powoli i jednym płynnym ruchem, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w kuwecie.</li>
	<li>Na elektroporatorze wybierz położenie elektroporowanych studzienek. Za pomocą ekranu dotykowego wybierz typ komórki, program CD34+, człowiek lub wpisz kod impulsu EO100. Naciśnij przycisk OK.</li>
	<li>Przenieś kuwety do elektroporatora. Naciśnij przycisk Start na ekranie dotykowym, aby rozpocząć elektroporację. Bezpośrednio po elektroporacji dodać 500 μl pożywki hodowlanej do kuwety (100 μl w przypadku użycia mikrokuwety).</li>
	<li>Delikatnie przenieś komórki na przygotowaną płytkę i wróć do inkubatora kultur tkankowych.</li>
	<li>W przypadku procedur wykorzystujących matrycę dawcy AAV6 należy dodać wektor natychmiast po przeniesieniu komórek na płytkę pokrytą fibronektyną w stężeniu 5 000 wektorów / komórkę.</li>
	<li>Po 6-18 godzinach przygotować świeżą pożywkę i dokonać wymiany pożywki zgodnie z opisem w punkcie 5. W przypadku tej zmiany podłoża usuń tylko 80%-90% podłoża. 
	UWAGA: Unikaj wyciągania pożywki z podstawy studni.</li>
	<li>Analizować komórki za pomocą cytometrii przepływowej po 2 lub więcej dniach (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 8).</li>
	<li>Kontynuuj wykonywanie zmian pożywki co 2 dni, jak opisano w sekcji 5, aż do osiągnięcia punktu końcowego doświadczenia. 
	UWAGA: Szybkość edycji CRISPR/Cas9 przy użyciu tej metody zależy w dużym stopniu od skuteczności celowania zaprojektowanego sgRNA. Szybkość edycji do 95% została zaobserwowana za pomocą wydajnego przewodnika15. Wytyczne dotyczące projektowania sgRNA zostały wcześniej szczegółowo opisane w innym miejscu19,20.</li>
</ol>
7. Przenoszenie hodowanych HSPC za pomocą wektora lentiwirusowego
UWAGA: Zainicjuj hodowle z wystarczającą liczbą komórek, aby wykonać to w pożądanym punkcie czasowym eksperymentu.
<ol>
	<li>Wygenerowanie i mianowanie wektora lentiwirusowego (w zależności od celów eksperymentalnych). Rozmrozić wektor lentiwirusowy na lodzie.</li>
	<li>Wykonać zmianę pożywki (jak w sekcji 5), a następnie wymieszać i przenieść HSPC w celu transdukcji do probówki. Zebrać 10 μl komórek i policzyć za pomocą roztworu Türksa w rozcieńczeniu 1:2 za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: Komórki mogą być transdukowane natychmiast po posiewaniu. Jednak komórki są zwykle hodowane przez 1-3 tygodnie przed transdukcją.</li>
	<li>Ponownie pokryć wymaganą dawkę komórek do transdukcji (zwykle 100 000 komórek na płytkę 96-dołkową). Oddzielnie, nietransdukowane na płytce komórki kontroli ujemnej. 
	UWAGA: Jeśli używasz płytek naładowanych ujemną powierzchnią, przenieś komórki na płytki pokryte fibronektyną w celu transdukcji wektora lentiwirusowego.</li>
	<li>Dodaj wektor lentiwirusowy do każdej studzienki komórek: dodaj 20 jednostek transdukcji na komórkę, aby osiągnąć ~ 30% wydajności transdukcji. Należy jednak określić dawkę wektora lentiwirusowego empirycznie, w zależności od wymagań doświadczalnych. 
	UWAGA: Upewnij się, że wektor lentiwirusowy jest usuwany zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
	<li>Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych na 6 godzin. Następnie wykonaj zmianę podłoża zgodnie z opisem w sekcji 5. 
	UWAGA: Supernatant zawiera żywego wirusa. Utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji.</li>
	<li>Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej (np. pod kątem ekspresji GFP) po 2 dniach lub dłużej. Szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 8.</li>
	<li>Kontynuować wykonywanie zmian pożywki co 2 dni, jak opisano w sekcji 5, aż do osiągnięcia punktu końcowego doświadczenia.</li>
</ol>
8. Analiza metodą cytometrii przepływowej kultur HSPC
<ol>
	<li>Przygotować skoncentrowaną mieszaninę przeciwciał HSC hodowanych ex vivo w PBS zawierającą 2% FBS (Tabela 4). Mieszaninę należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 1 miesiąca. 
	UWAGA: Pracuj w kapturze do hodowli tkankowej przy wyłączonym świetle w przypadku stosowania przeciwciał sprzężonych z barwnikiem.</li>
	<li>Dodać 2 μl skoncentrowanej mieszanki przeciwciał do 50 μl komórek. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Równolegle z tym barwieniem próbki należy przygotować odpowiednie próbki kontrolne barwienia do kompensacji i bramkowania.</li>
	<li>Dodać 200-1 000 μl PBS zawierającego 2% FBS i odwirować przy 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć jak najwięcej supernatantu i ponownie zawiesić w 100-500 μl PBS zawierającego 2% FBS i 0,5 μg/ml PI.</li>
	<li>Ustaw cytometr przepływowy i zapisz co najmniej 10 000 żywych komórek na próbkę. 
	UWAGA: Cytometry przepływowe powinny być obsługiwane przez przeszkolonego naukowca. Użytkownicy muszą skontaktować się z lokalną placówką FACS w celu omówienia tej analizy, jeśli nie mają doświadczenia w cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Eksportuj dane w formacie FCS i analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej. Zobacz Rysunek 2 przedstawia standardową strategię bramkowania zastosowaną tutaj.</li>
</ol>

<ol><li>Laurenti, E., Göttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li>
<li>Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells%3A+concepts%2C+definitions%2C+and+the+new+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality.</a> Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).</li>
<li>Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+haematopoietic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adult haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li>
<li>Granot, N., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+hematopoietic+cell+transplantation%3A+challenges+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress.</a> Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilizing+hematopoietic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+ex+vivo+haematopoietic-stem-cell+expansion+allows+nonconditioned+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation.</a> Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+polyvinyl+alcohol+for+chimeric+antigen+receptor+T-cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion.</a> Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).</li>
<li>Becker, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+cell+cloning+platform+for+gene+edited+functional+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+optimization+enables+maintenance+of+quiescent+hematopoietic+stem+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo.</a> Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).</li>
<li>Kobayashi, H., Takubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+method+to+maintain+quiescent+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61938(2021).</li>
<li>Aal Wilson,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li>
<li>Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conditioned+bone+marrow+chimeric+mouse+generation+using+culture-based+enrichment+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 3568(2021).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 686(2021).</li>
<li>Haney, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+in+vivo+CRISPR+screens+identify+SAGA+complex+members+as+a+key+regulators+of+HSC+lineage+commitment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Che, J. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+in+vitro+expanded+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells.</a> EMBO Reports. 23 (10), e55502(2022).</li>
<li>Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+potential+of+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+a+rare+property+only+partially+predicted+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+guide+RNA+design+guidelines+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).</li>
<li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+ex+vivo+expansion+of+mouse+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells.</a> Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).</li>
<li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Mamy nadzieję, że ten protokół stanowi użyteczne podejście do badania biologii HSC, hematopoezy i hematologii bardziej ogólnie. Od czasu początkowego opracowania metody hodowli na bazie PVA dla HSCoczyszczonych metodą FACS 8, metoda ta została rozszerzona. Na przykład wykazano, że metoda działa z c-Kit wzbogaconym o szpik kostny i z płytkami naładowanymi ujemnie14. Wykazano również jego kompatybilność z transdukcją i elektroporacją14,15<su...

Układ krwiotwórczy wspiera szereg istotnych procesów u ssaków, od dostarczania tlenu do zwalczania patogenów, poprzez wyspecjalizowane typy komórek krwi i odpornościowych. Ciągła produkcja krwi (hematopoeza) jest wymagana do utrzymania homeostazy układu krwionośnego, która jest podtrzymywana przez hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC)1. Najbardziej prymitywną komórką krwiotwórczą jest hematopoeetyczna komórka macierzysta (HSC), która ma unikalne zdolności do samoodnawiania się i różnicowania wieloliniowego2,3. Jest to rzadka populacja komórek, występująca głównie w dorosłym szpiku kostnym4, gdzie występują z częstością zaledwie około jednej na 30 000 komórek. Uważa się, że HSC wspierają hematopoezę przez całe życie i pomagają przywrócić hematopoezę po stresie hematologicznym. Zdolności te pozwalają również HSC na stabilną rekonstytucję całego układu krwiotwórczego po przeszczepieniu do napromieniowanego biorcy5. Stanowi to funkcjonalną definicję HSC, a także stanowi naukową podstawę terapii transplantacyjnej HSC, leczenia wielu chorób krwi i układu odpornościowego6. Z tych powodów HSC są głównym przedmiotem zainteresowania hematologii eksperymentalnej.
Pomimo dużego zainteresowania badaniami, nadal wyzwaniem jest stabilne rozszerzenie HSC ex vivo7. Niedawno opracowaliśmy pierwszy długoterminowy system hodowli ekspansywnej ex vivo dla myszy HSCs8. Podejście to może zwiększyć przeszczepialne HSC o 234-899 razy w ciągu 4-tygodniowej hodowli. W porównaniu z alternatywnymi podejściami, główną zmianą w protokole było usunięcie albuminy surowicy i zastąpienie jej syntetycznym polimerem. Alkohol poliwinylowy (PVA) został zidentyfikowany jako optymalny polimer dla mysich kultur HSC8, który jest obecnie używany również do hodowli innych typów komórek krwiotwórczych9. Jednak niedawno zidentyfikowano również inny polimer o nazwie Soluplus (kopolimer przeszczepu poliwinylu kaprolaktamu i glikolu polietylenowego), który wydaje się poprawiać klonalną ekspansję HSC10. Przed zastosowaniem polimerów stosowano albuminę surowicy w postaci płodowej surowicy bydlęcej, frakcji V albuminy surowicy bydlęcej lub rekombinowanej albuminy surowicy, ale miały one ograniczone wsparcie dla ekspansji HSC i wspierały tylko krótkoterminowe (~1 tydzień) hodowle ex vivo7. Należy jednak zauważyć, że protokoły hodowli HSC, które utrzymują HSC w stanie spoczynku, mogą obsługiwać dłuższy czas hodowli ex vivo11,12.
W porównaniu z innymi metodami hodowli, główną zaletą kultur opartych na PVA jest liczba komórek, które można wygenerować, oraz czas, w którym protokół może być używany do śledzenia HSC ex vivo. W ten sposób pokonuje się szereg barier w dziedzinie hematologii eksperymentalnej, takich jak niska liczba HSC możliwych do wyizolowania na mysz (tylko kilka tysięcy) oraz trudności w śledzeniu HSC w czasie in vivo. Należy jednak pamiętać, że hodowle te stymulują proliferację HSC, podczas gdy pula HSC in vivo jest przeważnie spoczynkowa w stanie ustalonym13. Ponadto, chociaż kultury są selektywne dla HSC, dodatkowe typy komórek gromadzą się wraz z kulturami w czasie, a przeszczepialne HSC reprezentują tylko około jednej na 34 komórki po 1 miesiącu. Mieloidalne hematopoetyczne komórki progenitorowe wydają się być głównym typem komórek zanieczyszczających w tych hodowlach HSC8. Niemniej jednak możemy użyć tych kultur do wzbogacenia HSC z heterogenicznych populacji komórek (np. szpik kostny c-Kit+ HSPCs14). Obsługuje również transdukcję lub elektroporację HSC do manipulacji genetycznej14,15,16. Aby pomóc w identyfikacji HSC z heterogenicznej populacji HSPC, CD201 (EPCR) został niedawno zidentyfikowany jako użyteczny marker HSC ex vivo10,17,18, z przeszczepialnymi HSC ograniczonymi do frakcji CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-.
Ten protokół opisuje metody inicjowania, utrzymywania i oceny mysich kultur ekspansji HSC opartych na PVA, a także protokoły manipulacji genetycznej w tych kulturach za pomocą elektroporacji lub transdukcji wektorów lentiwirusowych. Oczekuje się, że metody te okażą się przydatne dla wielu hematologów doświadczalnych.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td>Zestaw preparacyjny Fisher Scientific 12764416 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Appleton Woods Ltd</td><td>HC002</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek i moździerz</td><td>Scientific Laboratory Supplies Limited</td><td>X18000</td><td></td></tr><tr><td>Separator QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL strzykawka</td><td>VWR International Ltd</td><td>720-2519</td><td></td></tr><tr><td>Igła 19 G</td><td>VWR International Ltd</td><td>613-5394</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; m sitko do komórek</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2317</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech chusteczki</td><td>VWR International Ltd</td><td>115-2075</td><td></td></tr><tr><td>LS MACS</td><td>kolumna Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td><silne>odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nukleaza V3, 100 &mu; g</td><td>IDT&nbsp;</td><td></td><td></td>1081058</tr><tr><td>Czynnik rekombinowanych mysich komórek macierzystych bez zwierząt&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-250-03</td><td></td></tr><tr><td>Niezwierzęca rekombinowana trombopoetyna myszy</td><td>Peprotech</td><td>AF-315-14</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD117 APC (klon: 2B8)</td><td>ThermoFisher</td><td>17-1171-83</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD117 BV421 (klon: 2B8)</td><td>Biolegend</td><td>105828</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD127&nbsp; APC/Cy7 (klon: A7R34)</td><td>Biolegend</td><td>135040</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna przeciw myszom CD127 (klon: A7R34)</td><td>Biolegend</td><td>135006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mysz CD150 PE/Cy7 (klon: TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td>115914</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD201&nbsp; APC (klon: eBio1560)</td><td>ThermoFisher</td><td>17-2012-82</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz CD34 FITC (klon: RAM34)</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0341-85</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz CD4&nbsp; APC/Cy7 (klon: RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100526</td><td></td></tr><tr><td>Bio-mysia biotyna CD4 (klon: RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100508</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mysz CD45R&nbsp; APC/Cy7 (klon: RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103224</td><td></td></tr><tr><td>Bio-mysia biotyna CD45R (klon: RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD48 BV421 (klon: HM48-1)</td><td>Biolegend</td><td>103428</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mysia biotyna CD8 (klon: 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8a&nbsp; APC/Cy7 (klon: 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz Ly6G/Ly6C&nbsp; APC/Cy7 (klon: RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108424</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mysia biotyna Ly6G/Ly6C (klon: RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Sca1 PE (klon: D7)</td><td>Biolegend</td><td>108108</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ter119&nbsp; APC/Cy7 (klon: TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mysia biotyna Ter119 (klon: TER-119)</td><td>Płytki Biolegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND, 24-dołkowe</td> płytki <td>CellBIND Corning</td><td>3337</td><td>naładowane ujemnym ładunkiem powierzchniowym</td></tr><tr><td>, 96-dołkowe&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3330</td><td>naładowany ujemnie naładowany powierzchniowo</td></tr><tr><td>Niestandardowy syntetyczny sgRNA&nbsp;</td><td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td><td>Na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>F7524-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Płytki pokryte fibronektyną, 96-dołkowe</td><td>BD Biosciences</td><td>354409</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka składników odżywczych F-12 szynki</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen-X (100x)</td><td>Gibco</td><td>51500.056</td><td></td></tr><tr><td>Solanka solankowa buforowana fosforanami</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61196. </td><td></td>AP</tr><tr><td>Alkohol poliwinylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td><td>EXB-0018</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna APC/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>405208</td><td></td></tr><tr><td>T&uuml; rks' powiedział: rozwiązanie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>109277</td><td></td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Mettler-Toledo Ltd</td><td>95015662</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo ekspansja i manipulacja genetyczna krwionośnych komórek macierzystych myszy w kulturach na bazie alkoholu poliwinylowego

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Samoodnawiające się multipotencjalne hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są ważnym typem komórek ze względu na ich zdolność do wspierania hematopoezy przez całe życie i odtwarzania całego układu krwionośnego po przeszczepie. HSC są stosowane klinicznie w terapiach przeszczepów komórek macierzystych, które stanowią leczenie wielu chorób krwi. Istnieje duże zainteresowanie zarówno zrozumieniem mechanizmów regulujących aktywność HSC i hematopoezę, jak i opracowaniem nowych terapii opartych na HSC. Jednak stabilna hodowla i ekspansja HSC ex vivo stanowiła główną barierę w badaniu tych komórek macierzystych w wykonalnym systemie ex vivo. Niedawno opracowaliśmy system hodowli na bazie alkoholu poliwinylowego, który może wspierać długoterminową i zakrojoną na szeroką skalę ekspansję mysich HSC do przeszczepu oraz metody ich genetycznej edycji. Protokół ten opisuje metody hodowli i genetycznej manipulacji mysimi HSC poprzez elektroporację i transdukcję lentiwirusową. Oczekuje się, że protokół ten będzie przydatny dla szerokiego grona hematologów eksperymentalnych zainteresowanych biologią HSC i hematopoezą.

W przypadku oczyszczania HSC metodą FACS przewidujemy, że w obrębie szpiku kostnego wzbogaconego o c-Kit około 0,2% komórek stanowi populacja CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- u młodych (8–12-tygodniowych) myszy C57BL/6 (Rysunek 1). Jest jednak prawdopodobne, że myszy transgeniczne lub myszy w różnym wieku wykazują odmienne częstotliwości występowania HSC. Po 4 tygodniach hodowli spodziewamy się, że frakcja CD201+CD150+</sup...

Przedstawiono tutaj protokół do inicjowania, utrzymywania i analizowania hodowli mysich hematopoetycznych komórek macierzystych za pomocą ekspansji ex vivo na bazie alkoholu poliwinylowego, a także metody genetycznej manipulacji nimi za pomocą transdukcji lentiwirusowej i elektroporacji.

Ex vivo Ekspansja i manipulacja genetyczna krwionośnych komórek macierzystych myszy w kulturach na bazie alkoholu poliwinylowego

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Protokół ten pozwala na ekspansję i manipulację genetyczną funkcjonalnych krwiotwórczych komórek macierzystych myszy, umożliwiając głębsze zrozumienie biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i hematopoezy. Zaletą tej techniki jest to, że może ona wspierać hematopoetyczne komórki macierzyste w długotrwałej hodowli ex vivo i umożliwia manipulację genetyczną w celu zbadania genetyki hematopoezy. Ten system hodowli zapewnia technologię platformy dla różnych badań nad biologią hematopoetycznych komórek macierzystych i hematopoezą, w tym badań genetycznych, molekularnych i biochemicznych.Tabela rozwiązywania problemów zawiera listę przyczyn i rozwiązań typowych problemów napotykanych podczas stosowania tej techniki. O wiele łatwiej i skuteczniej jest pokazać, jak prawidłowo pobrać komórki szpiku kostnego i dokonać całkowitej zmiany podłoża, niż o tym czytać. Aby rozpocząć ekstrakcję hematopoetycznych komórek macierzystych lub HSC, użyj niestrzępiących się, delikatnych chusteczek do czyszczenia kości świeżo wyizolowanych od prawidłowo uśpionych myszy.Usuń mięśnie i rdzeń kręgowy z kości przed dodaniem ich do moździerza zawierającego około trzech mililitrów PBS. Za pomocą tłuczka zmiażdż kości bez ich mielenia, aby zminimalizować siły ścinające. Następnie, za pomocą igły o rozmiarze 19 dołączonej do 5-mililitrowej strzykawki, rozbij duże fragmenty szpiku kostnego uwolnione do PBS i przenieś zawiesinę przez filtr 70 mikronów do 50-mililitrowej stożkowej rurki.Po przeniesieniu zawiesiny należy powtórzyć proces z nowym PBS, aż kości zostaną wybielone. Celuj w objętość końcową około 30 mililitrów na mysz i 50 mililitrów na dwie myszy, aby wybielić kości, aż nie będzie widać więcej szpiku. Przygotuj się do wzbogacenia kolumny, umieszczając magnetyczną kolumnę filtracyjną w magnesie magnetycznego separatora kolumnowego z filtrem 50 mikronów na górze i 15-mililitrową stożkową rurką poniżej.Następnie, po potraktowaniu komórek przeciwciałem allofikocyjaninowym anty-c-Kit i mikrokulkami magnetycznymi allofikocyjaniny, przepuść trzy mililitry sterylnego PBS przez filtr 50 mikronów i kolumnę filtracyjną. Po przejściu PBS przepuść zawiesinę komórek przez kolumnę, a następnie za każdym razem trzykrotnie przepłucz trzema mililitrami zimnego PBS. Po każdym praniu poczekaj, aż kolumna przestanie kapać, zanim dodasz PBS do następnego prania.Następnie wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją na świeżej 15-mililitrowej rurce i dodaj pięć mililitrów zimnego PBS do kolumny przed zamontowaniem na niej tłoka kolumny i wylucjaniem komórek poprzez naciśnięcie tłoka. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w tekście, aby przygotować wystarczającą ilość pożywki HSC dla żądanej liczby komórek lub studzienek, aby zasiać od 0,5 do 1 miliona komórek na mililitr. Następnie odwirować krwiotwórcze komórki macierzyste i progenitorowe wzbogacone w c-Kit lub HSPC i ponownie zawiesić osad w świeżo przygotowanym podłożu HSC o żądanej gęstości komórek.Przenieś komórki na płytki pokryte fibronektyną lub naładowane ujemnie powierzchniowo, zachowując odpowiednią objętość. Umieść komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po delikatnym wyjęciu płytki z inkubatora do hodowli tkankowych bez naruszania kultur komórkowych, za pomocą pipety lub pompy próżniowej powoli zasysać około 90 do 95% pożywki z płynnego menisku każdej studzienki.Unikaj pobierania pożywki z podstawy studni. Następnie dodaj do studzienki jeden mililitr świeżego podłoża podgrzanego do 37 stopni Celsjusza. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych i zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni, aż będzie to wymagało eksperyment.Po ponownym zawieszeniu komórek w buforze nukleofekcji, natychmiast przenieś zawiesinę komórkową do probówki PCR zawierającej skompleksowaną rybonukleoproteinę i delikatnie wymieszaj, powoli pipetując w górę iw dół. Teraz bardzo powoli przenieś mieszaninę do kuwety do elektroporacji o odpowiedniej objętości, utrzymując ciągły ruch płynu, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza wewnątrz kuwety. Następnie na elektroporatorze wybierz położenie elektroporowanych studni.Za pomocą ekranu dotykowego wybierz program typu komórki jako CD34-dodatni człowiek lub wpisz kod impulsu EO100, a następnie naciśnij przycisk OK. Przenieś kuwetę do elektroporatora i naciśnij przycisk Start na ekranie dotykowym, aby rozpocząć elektroporację. Natychmiast po elektroporacji dodać do kuwety pięciokrotność objętości reakcyjnej pożywki hodowlanej.Teraz delikatnie przenieś komórki na przygotowaną płytkę i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych. Po wykonaniu zmiany pożywki, jak pokazano wcześniej, zbierz 10 mikrolitrów komórek i policz je za pomocą roztworu Turka w rozcieńczeniu 1:2 za pomocą hemocytometru. Ponownie pokryć wymaganą dawkę komórek na płytkach pokrytych fibronektyną w celu transdukcji i oddzielnie pokryć nietransdukowane ujemne komórki kontrolne.Następnie dodaj wektor lentiwirusowy do każdej studzienki zawierającej komórki, utrzymując dawkę 20 jednostek transdukcji na komórkę, aby osiągnąć około 30% wydajności transdukcji. Należy jednak określić dawkę wektora lentiwirusowego empirycznie w zależności od wymagań doświadczalnych. Na koniec należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych na sześć godzin.Wykonaj średnią zmianę zgodnie z wcześniejszym opisem. Aktywowane fluorescencją sortowanie komórek HSC wzbogaconych w c-Kit dało około 0,2% komórek, które były CD150-dodatnie, CD34-ujemne, c-Kit-dodatnie, Sca1-dodatnie i liniowo-ujemne. Po czterech tygodniach hodowli HSPC stwierdzono, że frakcje CD201-dodatnie, CD150-dodatnie, c-Kit-dodatnie, Sca1-dodatnie i ujemne pod względem linii wynoszą około 10% Po transdukcji wektorem lentiwirusowym wykazującym ekspresję GFP, komórki GFP-dodatnie wynosiły około 30%W przypadku zlewania oczekiwana gęstość kultur wynosiła około 2 milionów komórek na mililitr.Około 50% śmierć komórki zaobserwowano w ciągu pierwszych 24 do 48 godzin przed wykonaniem pierwszej zmiany pożywki. Jednak po tygodniu liczba komórek powróciła do 80 do 100% liczby komórek zasianych. Dokładne zmiany pożywki przy użyciu świeżych i wstępnie podgrzanych pożywek mają kluczowe znaczenie dla długoterminowej stabilności tej metody hodowli HSC.Odkąd oryginalna metoda została opublikowana w 2019 roku, dziedzina zaczęła wykorzystywać ją na różne sposoby do badania biologii HSC.

ex-vivo-expansion-genetic-manipulation-mouse-hematopoietic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Opisano trójwymiarowy (3D) system hodowli dla hematopoezy z wykorzystaniem ludzkiej krwi pępowinowej oraz komórek szpiku kostnego z białaczką. Metoda opiera się na zastosowaniu porowatego syntetycznego rusztowania z poliuretanu pokrytego białkami macierzy pozakomórkowej. Rusztowanie to można dostosować do hodowli szerokiego zakresu komórek.

Ex vivo naśladowanie prawidłowej i nieprawidłowej hematopoezy u ludzi

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

Ten protokół opisuje użycie hodowanych Aorta-Gonad-Mesonephros do analiz ekspresji, jednostek tworzących kolonie w hodowli i śledzionie oraz długoterminowej rekonstytucji w celu określenia wpływu czynników regulacyjnych i szlaków sygnałowych na rozwój hematopoetycznych komórek macierzystych. Wykazano, że jest to skuteczny system do badania biologii i funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych.

Zastosowanie systemu hodowli eksplantatów Aorta-gonad-mesonephros w hematopoezie rozwojowej

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek CD34+ naczelnych innych niż człowiek z przygotowanego szpiku kostnego, modyfikowanie genów tych komórek za pomocą wektorów lentiwirusowych oraz przygotowanie produktu do infuzji do autologicznego gospodarza. Łączna długość protokołu wynosi około 48 godzin.

Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

Tutaj opisujemy ekspansję ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z komórek CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej leczonej kombinacją koktajlu cytokin i VPA. Metoda ta prowadzi do znacznego stopnia ekspansji ex vivo prymitywnych HSC do zastosowań klinicznych lub laboratoryjnych.

Ekspansja ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej przy użyciu kwasu walproinowego

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

Tutaj ustanowiliśmy in vivo osteo-organoidy uruchamiane przez morfogenetyczne rusztowania żelatynowe z białkiem 2 w celu pobrania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych w celu odbudowy uszkodzonego układu krwiotwórczego i odpornościowego. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście może stanowić obiecujące źródło komórek w terapiach komórkowych.

Podejście osteoorganoidowe in vivo do pozyskiwania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych

Poznaj metodę ekspansji i manipulacji genetycznej mysich krwionośnych komórek macierzystych w kulturze ex vivo na bazie alkoholu poliwinylowego. Technika umożliwia długoterminowe utrzymanie komórek i badanie hematopoezy.

Ex vivo Ekspansja i manipulacja genetyczna krwionośnych komórek macierzystych myszy w kulturach na bazie alkoholu poliwinylowego (Wideo) | JoVE Journal

Ex vivo Ekspansja i manipulacja genetyczna krwionośnych komórek macierzystych myszy w kulturach na bazie alkoholu poliwinylowego

Przeglądaj więcej filmów