Name: Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Naucz się izolacji jąder z zamrożonej tkanki wątroby myszy, człowieka i naczelnych do multiomiki jednokomórkowej. Metoda wykorzystuje gradient gęstościowy do uzyskania czystego zawiesiny jąder z zachowaniem ploidii i różnorodności typów komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Helmholtz Pioneer Campus (M.S., K.Y., C.P.M.-J.) oraz Instytut Biologii Obliczeniowej (C. T.-L.). Badania te były również wspierane przez AMED w ramach grantu o numerze JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). Dziękujemy Core Genomics w HMGU (I. de la Rosa) i Bioinformatics (T. Walzthoeni), a w szczególności Xavierowi Pastorowi za szkolenia i wskazówki. Dziękujemy A. Feuchtingerowi, U. Buchholzowi, J. Bushe'owi i wszystkim pozostałym pracownikom Głównego Ośrodka Patologii i Analizy Tkanek HMGU za ich wsparcie techniczne i naukowe, a także J. Zornowi, R. Erdelenowi, D. Würzingerowi, pracownikom E-Streifen, a także głównej placówce Laboratory Animal Services za ich ciągłe wsparcie naukowe i dyskusję. Jesteśmy wdzięczni Core Facility Cell Analysis w TranslaTUM (R. Mishra) oraz Luminex, A DiaSorin Company (P. Rein). Dziękujemy Dr. I Deligiannisowi za wsparcie techniczne. Dr M. Hartman, dr A. Schröder i pani A. Barden (Helmholtz Pioneer Campus) odegrali kluczową rolę w ich wsparciu prawnym, zarządczym i administracyjnym.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim ustawodawstwem dotyczącym dobrostanu zwierząt i przepisami rządu Górnej Bawarii. Pomieszczenia inwentarskie zostały zatwierdzone zgodnie z § 11 niemieckiej ustawy o dobrostanie zwierząt i prowadzone zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE.
1. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Ofiaruj 3-miesięcznego do 22-miesięcznego samca myszy C57BL/6J przez zwichnięcie szyjki macicy. Połóż zwierzę na desce sekcyjnej, zabezpiecz kończyny szpilkami i zdezynfekuj brzuch 70% etanolem.</li>
	<li>Przeprowadzić sekcję zwłok zgodnie z zaleceniami Treuting et al.16.
	<ol>
		<li>Otwórz brzuch aż do klatki piersiowej, wizualizuj wątrobę i użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć wątrobę bez przebijania zrazików.</li>
		<li>Wyciągnij nienaruszoną wątrobę, przytrzymując przeponę kleszczami i usuwając tkankę łączącą nożyczkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj narząd w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), osusz go czystym ręcznikiem papierowym i pokrój zraziki wątroby na kilka części do różnych celów: FF do izolacji pojedynczego jądra i multiomiki; utrwalony paraformaldehydem (10% PFA) do zatapiania parafiny; i/lub osadzony w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do dalszych analiz histologicznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Porcje wątroby rozmieścić w kriowialach lub probówkach z nakrętką o pojemności 5 ml i natychmiast błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie. Przechowuj zamrożone próbki wątroby w temperaturze -80 °C do dalszych eksperymentów multiomicznych jednojądrowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B, C). 
	UWAGA: Kriokonserwowana tkanka może być bezpiecznie przechowywana w temperaturze -80 °C przez kilka lat i zawsze powinna być transportowana na suchym lodzie w temperaturze -80 °C przed użyciem.</li>
</ol>
2. Izolacja jąder
<ol>
	<li>Czyszczenie blatów stołowych i przygotowanie i materiałów eksploatacyjnych
	<ol>
		<li>Wyczyść blaty robocze i pipety 70% etanolem i roztworem do odkażania RNazy lub użyj dedykowanych blatów i materiałów wolnych od RNaz.</li>
		<li>Schłodź wstępnie zarówno wahadłowe wiadro, jak i wirówki o stałym kącie nachylenia, probówki 1,5 ml/2 ml i płytki wielodołkowe do temperatury 4 °C, jak opisano poniżej.</li>
		<li>Bez-RNazową, jednorazową pęsetę używaną do pracy z chusteczkami, jednorazowy sterylny skalpel i szalkę Petriego schłodzić na suchym lodzie (-60 °C).</li>
		<li>Schłodź wstępnie homogenizator szklany Dounce i tłuczki na lodzie (4 °C). Umieść każdy tłuczek (A i B) w probówce o pojemności 5 ml, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z lodem i potencjalnego zanieczyszczenia RNazą.</li>
		<li>Przygotować rozcieńczalnik pożywki jodiksanolowej (IDM) (tabela 1A) i użyć go do rozcieńczenia 50% i 29% pożywki o gradiencie gęstości 60% jodiksanolu (odpowiednio tabela 1B i tabela 1C).</li>
		<li>Wstępnie schłodzić wszystkie rurki. Dla każdej próbki, która ma być przetworzona, należy przygotować następujące probówki:
		<ol>
			<li>Przygotować trzy probówki wiążące o niskiej zawartości DNA o pojemności 1,5 ml (jedna do przefiltrowanego homogenatu tkankowego, druga zawierająca 250 μl 50% rozcieńczonego roztworu jodiksanolu i trzecia do czystej zawiesiny jąder).</li>
			<li>Przygotować jedną probówkę okrągłodenną o pojemności 2 ml zawierającą 500 μl roztworu jodiksanolu o 29% rozcieńczeniu do rozdzielania w gradinie gęstości.</li>
			<li>Przygotować jedną stożkową probówkę o pojemności 15 ml do izolacji jąder-2 (NIM-2) i buforu homogenizacyjnego (HB).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować pożywkę do izolacji jąder-1 (NIM-1) (tabela 1D) i użyć jej do wytworzenia NIM-2 (tabela 1E), a następnie HB (tabela 1F). Dodaj oba inhibitory RNAzy tuż przed użyciem, jak opisano poniżej w protokole.</li>
		<li>Przygotować bufor do przechowywania jąder (NSB) zgodnie z opisem w tabeli 1G. Dodaj rekombinowany inhibitor RNAzy tuż przed użyciem. Dodaj inhibitor RNAzy na bazie białka do NSB przed użyciem do sortowania FACS (opcjonalnie).</li>
		<li>Przygotuj zlewkę o pojemności 500 ml ze sterylną wodą, aby namoczyć homogenizatory i tłuczki Dounce po homogenizacji tkanek w celu optymalnego czyszczenia i konserwacji homogenizatorów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogenizacja tkanek
	<ol>
		<li>Pokrój kawałek tkanki o grubości 20-30 mg (lub 5 mm3) za pomocą schłodzonego skalpela wewnątrz szalki Petriego na suchym lodzie. Następnie natychmiast przenieść szalkę Petriego do mokrego lodu (4 °C). Dodaj 1 ml HB i za pomocą zimnego skalpela zmiel tkankę tak bardzo, jak to możliwe, aby można ją było łatwo zassać końcówką o szerokim otworze o pojemności 1 ml. 
		UWAGA: Zawsze używaj końcówek z szerokimi otworami do wszystkich transferów tkanek/jąder. Alternatywnie, końcówki o pojemności 1 ml można przeciąć sterylnym skalpelem na sterylnej plastikowej osłonie, aby uzyskać szerokie otwory (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Zebrać zawiesinę tkankową i przenieść ją do wstępnie schłodzonego szklanego homogenizatora Dounce o pojemności 2 ml (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2B).</li>
		<li>Umyj szalkę Petriego dodatkowymi 0,5-1 ml HB i zbierz wszystkie pozostałe kawałki tkanki, trzymając wszystko na lodzie.</li>
		<li>Powoli i ostrożnie wykonaj pięć uderzeń luźnym tłuczkiem A na lodzie. Unikaj tworzenia bąbelków, używając ruchów skręcających tłuczek podczas ciągnięcia go w górę iw dół. Upewnij się, że tłuczek przesuwa się ostrożnie od góry do dołu homogenizatora przy każdym pociągnięciu.</li>
		<li>Następnie wykonaj 10-15 powolnych pociągnięć ciasnym tłuczkiem B na lodzie. Unikaj tworzenia bąbelków. 
		UWAGA: Zaleca się wzrokowe sprawdzenie jąder pod mikroskopem po 10 pociągnięciach tłuczkiem B, aby upewnić się, czy potrzebne są dalsze pociągnięcia. W tym celu należy zastosować barwienie błękitem trypanowym (stosunek trypana do próbki wynoszący 1:1) i hemocytometru ręcznego (np. zmieszać 10 μl błękitu trypanowego z 10 μl zawiesiny jąder i użyć 10 μl mieszaniny do badania pod mikroskopem; <silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
		<li>Przefiltrować homogenat przez sitko o pojemności 50 μm, przenosząc go do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. Stosować więcej niż jeden filtr i/lub rurkę w przypadku homogenatów zawierających dużą ilość grudek tkanki łącznej.</li>
		<li>Przepłucz homogenizator i użyte filtry dodatkowymi 0,5-1 ml HB, aby dokładnie zebrać cały homogenat tkankowy. Przejdź do wirowania w gradimencie gęstości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirowanie w gradiacji gęstości
	<ol>
		<li>Przefiltrowany homogenat należy odwirować w wstępnie schłodzonej wirówce o stałym kącie nachylenia 1 000 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Podczas wirowania próbki przygotuj probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą 250 μl 50% roztworu jodiksanolu i jedną probówkę o pojemności 2 ml zawierającą 500 μl roztworu jodiksanolu o stężeniu 29%. Trzymaj obie probówki na lodzie.</li>
		<li>Po odwirowaniu odessać supernatant bez naruszania osadu za pomocą pompy próżniowej. 
		UWAGA: Ręczne pipetowanie może mieć negatywny wpływ na jakość końcowej zawiesiny jąder.</li>
		<li>Dodać 250 μl HB do granulki za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml z szeroką kryzą i bardzo powoli zawiesić.</li>
		<li>Przenieść 250 μl zawiesiny jąder do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 250 μl 50% roztworu jodiksanolu i delikatnie, ale dokładnie wymieszać w celu uzyskania 25% zawiesiny jodiksanolu/jąder.</li>
		<li>Przenieść 500 μl 25% zawiesiny jodiksanolu/jąder do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 2 ml zawierającej 500 μl roztworu 29% jodiksanolu. 
		UWAGA: 500 μl 25% zawiesiny jodiksanolu/jąder należy delikatnie nałożyć na 500 μl 29% roztworu jodiksanolu, tak aby mieszaniny 25%/29% jodiksanolu wykazywały wyraźną separację faz. Użyj boku ścianki probówki z końcówką pipety umieszczoną pod kątem 45°, aby utworzyć ten gradientowy interfejs. Od tego momentu z rurką należy obchodzić się delikatnie, aby nie zaburzyć tego gradientu.</li>
		<li>Odwirować probówkę w wirówce z kubełkiem wahadłowym ze schłodzonym stężeniem 12 500 g przez 20 minut z hamulcem ustawionym w pozycji OFF.</li>
		<li>Tuż przed zakończeniem etapu wirowania dodaj inhibitory RNAzy do bufora NSB, przechodząc do rurociągów scRNA-seq (patrz Tabela 1G).</li>
		<li>Po odwirowaniu odessać supernatant bez naruszania osadu za pomocą pompy próżniowej. 
		UWAGA: Ręczne pipetowanie może mieć negatywny wpływ na jakość końcowej zawiesiny jąder.</li>
		<li>Używając końcówki pipety o pojemności 1 ml z szeroką kryzą, delikatnie zawiesić osad w 100-300 μl NSB i przenieść zawiesinę jąder do czystej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Policzyć jądra za pomocą roztworu błękitu trypanowego (stosunek trypana do próbki 1:1) i hemocytometru ręcznego (np. zmieszać 10 μl błękitu trypanowego z 10 μl zawiesiny jąder i użyć 10 μl mieszaniny do liczenia; <silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
		<li>Otrzymaną zawiesinę jąder należy natychmiast wykorzystać do testu genomiki jednojądrowej. 
		UWAGA: Zawiesina jąder w NSB może być przechowywana w lodówce w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia w celu dalszej analizy za pomocą cytometrii przepływowej i/lub obrazowej cytometrii przepływowej, ale nie w przypadku sekwencji snRNA lub sekwencji snATAC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sortowanie jąder w celu profilowania ploidalności hepatocytów lub dobrze opartych metod sekwencjonowania
<ol>
	<li>W przypadku sortowania komórek na podstawie cytometrii przepływowej należy przefiltrować zawiesinę jąder przez filtr 50 μm do wstępnie schłodzonej probówki FACS o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Użyj sortera do cytometrii przepływowej wyposażonego w dyszę 100 μm. Załaduj probówkę FACS do sortera i wyświetl podgląd próbki.</li>
	<li>Ustaw strategię bramkowania dla sortowania jąder, zaczynając od bramki rozproszenia, wykreślając obszar rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia bocznego (FSC-A/SSC-A), następnie Wysokość Hoechsta w stosunku do Obszaru Hoechsta (bramka jąder), a następnie Szerokość Hoechsta w stosunku do obszaru Hoechsta (bramka pojezdna). Wizualizacja profilu ploidalności jąder na histogramie obszaru Hoechsta. 
	UWAGA: Aby uzyskać lepszą rozdzielczość szczytową, zwizualizuj kanał Hoechsta (450/50) na skali liniowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>W przypadku sortowania na płytki 96-/384-dołkowe należy ustawić opóźnienie kropli i zoptymalizować wyrównanie płytki za pomocą metody kolorymetrycznej z substratem benzydyny-peroksydazą chrzanową (TMB-HRP), jak opisano wcześniej6.</li>
	<li>Ustawić chłodzenie próbki i uchwyt płytki na schładzanie w temperaturze 4 °C, przy włączonym obrocie próbki przy 300 obr./min.</li>
	<li>Sortować pojedyncze jądra przy stężeniu próbki ~1 x 105 jąder/ml i przy natężeniu przepływu 200-500 zdarzeń/s.</li>
</ol>
4. Oględziny i kwantyfikacja parametrów jądrowych za pomocą cytometrii obrazowej (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Załadować probówkę o pojemności 0,5 ml zawierającą 50 μl zawiesiny jąder o stężeniu 2 × 107 jąder/ml.</li>
	<li>Ustaw bramkę wszystkich zdarzeń w oparciu o współczynnik proporcji w stosunku do kanału fluorescencji Hoechsta, aby zobrazować profil ploidalności jąder (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B).</li>
	<li>Pobrać próbkę w 40-krotnym powiększeniu za pomocą jasnego pola (BF) i kanału fluorescencyjnego Hoechsta.</li>
	<li>Zbadaj i określ ilościowo jądra 2n i 4n za pomocą pomiaru jasnego pola i intensywności fluorescencji Hoechsta za pomocą oprogramowania do cytometrii obrazowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C).</li>
</ol>
5. Budowa i sekwencjonowanie jednojądrowych RNA, ATAC-seq lub wieloomowych bibliotek
<ol>
	<li>W przypadku podejść sekwencyjnych opartych na kropelkach, należy załadować oczyszczoną zawiesinę jąder bezpośrednio do urządzenia mikroprzepływowego w celu automatycznego partycjonowania równoległego i molekularnego kodowania kreskowego17.</li>
	<li>Po zakończeniu przebiegu mikroprzepływowego w urządzeniu do partycjonowania pojedynczych komórek, zbierz jądra otoczone kulkami żelowymi, inkubuj i oczyść, jak opisano wcześniej w wytycznych producenta17.</li>
	<li>Wykonać 11 cykli reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) dla wstępnej amplifikacji cDNA przy użyciu następującego programu: 3 min w 98 °C, (15 s w 98 °C, 20 s w 63 °C i 1 min w 72 °C) x 11, 1 min w 72 °C i utrzymać w temperaturze 4 °C. Kontynuować naprawę końca i etap A-tailing oraz podwiązanie adaptera, Zgodnie z zaleceniami producenta17. W celu późniejszej ostatecznej konstrukcji biblioteki ekspresji genów należy wykonać 10 cykli PCR przy użyciu następującego programu: 45 s w 98 °C (20 s w 98 °C, 30 s w 54 °C, 20 s w 72 °C) x 10, 1 min w 72 °C i utrzymać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Sekwencjonuj uzyskane biblioteki do głębokości odczytu ~ 20 000-50 000 średnich odczytów na jądro.</li>
	<li>W przypadku sekwencjonowania kropelkowego w multiomice stawów (RNA + ATAC) należy inkubować jądra wątroby w buforze do lizy przez 5 minut, a następnie znakować je przez 1 godzinę, jak opisano wcześniej18.</li>
	<li>Załaduj oznakowane jądra bezpośrednio do urządzenia mikroprzepływowego w celu automatycznego partycjonowania równoległego i molekularnego kodowania kreskowego.</li>
	<li>Po zakończeniu przebiegu mikroprzepływowego zbierz jądra otoczone kulkami żelu, inkubuj i wyczyść zgodnie z opisem producenta18.</li>
	<li>Wykonać sześć cykli PCR dla etapu wstępnej amplifikacji cDNA przy użyciu następującego programu: 5 min w 72 °C, 3 min w 98 °C, (20 s w 98 °C, 30 s w 63 °C, 1 min w 72 °C) x 6, 1 min w 72 °C i utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Pobrać 35 μl wstępnie amplifikowanej próbki i przeprowadzić amplifikację cDNA w następujący sposób: 3 min w temperaturze 98 °C (15 s w 98 °C, 20 s w 63 °C, 1 min w 72 °C) x 6, 1 min w temperaturze 72 °C i utrzymać w temperaturze 4 °C. Kontynuować naprawę końcową i etap A-tailing oraz podwiązanie adaptera, Zgodnie z zaleceniami producenta18 . W celu przeprowadzenia kolejnej fazy PCR z indeksacją próbki końcowej należy wykonać 15 cykli PCR w następujący sposób: 45 s w temperaturze 98 °C (20 s w temperaturze 98 °C, 30 s w temperaturze 54 °C, 20 s w temperaturze 72 °C) x 15, 1 min w temperaturze 72 °C i utrzymać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Do budowy bibliotek ATAC należy użyć 40 μl i amplifikować przez sześć cykli PCR w celu indeksowania próbki za pomocą następującego programu: 45 s w 98 °C, (20 s w 98 °C, 30 s w 67 °C, 20 s w 72 °C) x 6, 1 min w 72 °C i utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Sekwencjonuj uzyskane biblioteki ekspresji genów multiomu do minimalnej głębokości odczytu 20 000 par odczytu na jądro, a biblioteki multiomu ATAC do minimalnej głębokości odczytu 25 000 par odczytu na komórkę, zgodnie z zaleceniami producenta18.</li>
</ol>

<ol><li>Kamies, R., Martinez-Jimenez, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+of+single-cell+genomics+and+epigenomics+in+human+disease%3A+where+are+we+now%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Advances of single-cell genomics and epigenomics in human disease: where are we now.</a> Mamm Genome. 31 (5-6), 170-180 (2020).</li>
<li>Ramachandran, P., Matchett, K. P., Dobie, R., Wilson-Kanamori, J. R., Henderson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+in+hepatology%3A+New+insights+into+liver+biology+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies in hepatology: New insights into liver biology and disease pathogenesis.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 17 (8), 457-472 (2020).</li>
<li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+fibrotic+niche+of+human+liver+cirrhosis+at+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level.</a> Nature. 575 (7783), 512-518 (2019).</li>
<li>Andrews, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell%2C+single-nucleus%2C+and+spatial+RNA+sequencing+of+the+human+liver+identifies+cholangiocyte+and+mesenchymal+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell, single-nucleus, and spatial RNA sequencing of the human liver identifies cholangiocyte and mesenchymal heterogeneity.</a> Hepatology Communications. 6 (4), 821-840 (2022).</li>
<li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+intercellular+crosstalk+in+healthy+and+NASH+liver+revealed+by+single-cell+secretome+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Landscape of intercellular crosstalk in healthy and NASH liver revealed by single-cell secretome gene analysis.</a> Molecular Cell. 75 (3), 644-660 (2019).</li>
<li>Richter, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-seq2+reveals+functional+crosstalk+between+liver+zonation+and+ploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-seq2 reveals functional crosstalk between liver zonation and ploidy.</a> Nature Communications. 12 (1), 4264(2021).</li>
<li>Matsumoto, T., Wakefield, L., Tarlow, B. D., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+lineage+tracing+of+polyploid+hepatocytes+reveals+extensive+proliferation+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo lineage tracing of polyploid hepatocytes reveals extensive proliferation during liver regeneration.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 34-47 (2020).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+distribution+of+hepatocyte+proliferation+in+liver+homeostasis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Broad distribution of hepatocyte proliferation in liver homeostasis and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 27-33 (2020).</li>
<li>Donne, R., Saroul-Ainama, M., Cordier, P., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+in+liver+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Polyploidy in liver development, homeostasis and disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (7), 391-405 (2020).</li>
<li>Lengefeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+is+a+determinant+of+stem+cell+potential+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Cell size is a determinant of stem cell potential during aging.</a> Science Advances. 7 (46), 0271(2021).</li>
<li>Lanz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+cell+size+remodels+the+proteome+and+promotes+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Increasing cell size remodels the proteome and promotes senescence.</a> Mol Cell. 82 (17), 3255-3269 (2022).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIDDosome-SCAP+crosstalk+controls+high-fructose-diet-dependent+transition+from+simple+steatosis+to+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">PIDDosome-SCAP crosstalk controls high-fructose-diet-dependent transition from simple steatosis to steatohepatitis.</a> Cell Metabolism. 34 (10), 1548-1560 (2022).</li>
<li>Padovan-Merhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mammalian+cells+compensate+for+differences+in+cellular+volume+and+DNA+copy+number+through+independent+global+transcriptional+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Single mammalian cells compensate for differences in cellular volume and DNA copy number through independent global transcriptional mechanisms.</a> Molecular Cell. 58 (2), 339-352 (2015).</li>
<li>Miettinen, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+transcriptional+and+metabolic+programs+related+to+mammalian+cell+size%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of transcriptional and metabolic programs related to mammalian cell size.</a> Current Biology. 24 (6), 598-608 (2014).</li>
<li>Vargas-Garcia, C. A., Ghusinga, K. R., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+control+and+gene+expression+homeostasis+in+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell size control and gene expression homeostasis in single-cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 8, 109-116 (2018).</li>
<li>Knoblaugh, S. E., Randolph-Habecker, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnoblaugh%2C+SE+%22Necropsy+and+histology.+In+Comparative+Anatomy+and+Histology%3A+A+Mouse%2C+Rat%2C+and+Human+Atlas+%28Second+Edition%29%22">Necropsy and histology. In Comparative Anatomy and Histology: A Mouse, Rat, and Human Atlas (Second Edition)</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 3 (2018).</li>
<li>Chromium Next GEM Single Cell 3 Reagent Kits v3.1 User Guide. Document number CG000204 (Rev D). 10x Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2019).</li>
<li>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide. Document number CG000338 (Rev D). 10x Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide</a> (2021).</li>
<li>MacParland, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+RNA+sequencing+of+human+liver+reveals+distinct+intrahepatic+macrophage+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations.</a> Nature Communications. 9 (1), 4383(2018).</li>
<li>Martinez-Jimenez, C. P., Kyrmizi, I., Cardot, P., Gonzalez, F. J., Talianidis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+nuclear+factor+4alpha+coordinates+a+transcription+factor+network+regulating+hepatic+fatty+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte nuclear factor 4alpha coordinates a transcription factor network regulating hepatic fatty acid metabolism.</a> Molecular and Cell Biology. 30 (3), 565-577 (2010).</li>
<li>Schmidt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-vertebrate+ChIP-seq+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+transcription+factor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Five-vertebrate ChIP-seq reveals the evolutionary dynamics of transcription factor binding.</a> Science. 328 (5981), 1036-1040 (2010).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).</li>
<li>Stuart, T., Srivastava, A., Madad, S., Lareau, C. A., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+state+analysis+with+Signac%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin state analysis with Signac.</a> Nature Methods. 18 (11), 1333-1341 (2021).</li>
<li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocyte+organoids+can+repair+bile+ducts+after+transplantation+in+the+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver.</a> Science. 371 (6531), 839-846 (2021).</li>
<li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocytes+as+a+tool+for+studying+toxicity+and+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Human hepatocytes as a tool for studying toxicity and drug metabolism.</a> Current Drug Metabolism. 4 (4), 292-312 (2003).</li>
<li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocytes+in+primary+culture%3A+The+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Human hepatocytes in primary culture: The choice to investigate drug metabolism in man.</a> Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).</li>
<li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Nault, R., Fader, K. A., Bhattacharya, S., Zacharewski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nuclei+RNA+sequencing+assessment+of+the+hepatic+effects+of+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Single-nuclei RNA sequencing assessment of the hepatic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (1), 147-159 (2021).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+as+a+mechanism+for+stress-induced+liver+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy as a mechanism for stress-induced liver adaptation.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (9), 3307-3315 (2012).</li>
<li>Kreutz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+ploidy+is+a+diversity+factor+for+liver+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte ploidy is a diversity factor for liver homeostasis.</a> Frontiers in Physiology. 8, 862(2017).</li>
<li>Hunt, N. J., Kang, S. W. S., Lockwood, G. P., Le Couteur, D. G., Cogger, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+aging+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of aging in the liver.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 1151-1161 (2019).</li>
<li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+spectrum%3A+a+new+marker+in+HCC+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. 69 (2), 355-364 (2019).</li>
<li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li>
<li>Schwartz-Arad, D., Zajicek, G., Bartfeld, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+streaming+liver+IV%3A+DNA+content+of+the+hepatocyte+increases+with+its+age%5BTitle%5D)+AND+%22Liver%22%5BJournal%5D)">The streaming liver IV: DNA content of the hepatocyte increases with its age.</a> Liver. 9 (2), 93-99 (1989).</li>
<li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+B%2C+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (6), 387-393 (1993).</li>
<li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li>
<li>Granja, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ArchR+is+a+scalable+software+package+for+integrative+single-cell+chromatin+accessibility+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">ArchR is a scalable software package for integrative single-cell chromatin accessibility analysis.</a> Nature Genetics. 53 (3), 403-411 (2021).</li>
<li>Bredikhin, D., Kats, I., Stegle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUON%3A+Multimodal+omics+analysis+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">MUON: Multimodal omics analysis framework.</a> Genome Biology. 23 (1), 42(2022).</li>
<li>Velten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+temporal+and+spatial+patterns+of+variation+from+multimodal+data+using+MEFISTO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Identifying temporal and spatial patterns of variation from multimodal data using MEFISTO.</a> Nature Methods. 19 (2), 179-186 (2022).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Analiza składu komórkowego wątroby za pomocą sekwencji RNA pojedynczej komórki lub pojedynczego jądra zapewnia głębsze zrozumienie rozwoju i progresji choroby wątroby 3,4,5,24. Izolacja pojedynczych komórek z wątroby jest czasochłonna i wymaga protokołów, które obejmują ostrą dysocjację mechaniczną lub enzymatyczną 25,26,27. Powszechnie przyjmuje się, że każda tkanka wymaga systematycznej oceny w celu określenia optymalnego protokołu dysocjacji tkanek, a także odpowiedniej metody przechowywania w celu wychwycenia delikatnych typów komórek lub jąder28. W zależności od dostępności tkanki, choroby będącej przedmiotem zainteresowania, stadium rozwoju lub organizmu modelowego, przygotowanie zawiesiny jednojądrowej do dalszego przetwarzania może być bardziej odpowiednią metodologią niż stosowanie zawiesin jednokomórkowych. Co ważne, w wątrobie scRNA-seq i snRNA-seq wykazały wysoką korelację między jądrowym i cytoplazmatycznym mRNA, co sugeruje, że oba podejścia prezentują komplementarną informację 2,3,4,6,29.
Niniejszy artykuł zawiera znormalizowaną, solidną i powtarzalną izolację pojedynczego jądra z zamrożonych, zarchiwizowanych próbek wątroby myszy i innych gatunków, w tym ludzi i makaków. Metoda ta może być stosowana u myszy typu dzikiego karmionych karmą i dietą wysokotłuszczową (HFD) oraz u myszy z modelami zwłóknienia wątroby przy użyciu podejść genomicznych jednojądrowych opartych zarówno na płytkich studzienkowych, jak i kropelkowych6. Metoda ta opiera się na protokole opisanym pierwotnie dla tkanki mózgowej przez Krishnaswamiego i wsp.30 z dodatkowymi modyfikacjami dostosowanymi do błyskawicznie mrożonej wątroby. Optymalna homogenizacja uwalnia większość jąder z tkanki bez negatywnego wpływu na integralność błony jądrowej. Nadmierne dozowanie może jednak uszkodzić delikatne jądra i obniżyć ich ogólną jakość. Młode i/lub stłuszczone wątroby zwykle wymagają tylko 5 uderzeń tłuczkiem A i 10 uderzeń tłuczkiem B, podczas gdy stare i/lub zwłóknieniowe wątroby mogą wymagać 15 uderzeń tłuczkiem B , ale nie więcej. W związku z tym nie zaleca się wykonywania większej liczby uderzeń poza wskazane tutaj liczby. Nadmierne dozowanie może negatywnie wpłynąć na jakość zawiesiny jednojądrowej i zwiększyć ilość RNA w otoczeniu. W związku z tym może to prowadzić do konieczności wykonania dodatkowych kroków filtrowania obliczeniowego podczas dalszych analiz danych.
Przedstawiony tutaj protokół jest wszechstronny i można go dostosować do różnych schorzeń wątroby u młodych (3 miesiące) i starych (24 miesiące) myszy. Ponieważ stwierdziliśmy, że większa część wątroby jest niezbędna dla starych, HFD i zwłóknieniowych tkanek, rozmiar tkanki dostępnej do przetwarzania może stanowić ograniczenie dla niektórych użytkowników z mniejszymi ilościami wyjściowego materiału biologicznego. Jednak oczyszczanie gradientowe jest wysoce zalecane do natychmiastowego przetwarzania próbki za pomocą kropelkowych testów genomowych. Jeśli jądra muszą być posortowane metodą FACS na płytki 96-/384-dołkowe do dobrze opartych testów, można pominąć oczyszczanie gradientowe. Zachęcamy użytkowników do przeprowadzenia oczyszczania gradientowego, jeśli próbka tkanki jest wystarczająca do uzyskania zalecanego stężenia jąder do sortowania FACS (tj. ~1 × 105 jąder / ml).
Wątroba charakteryzuje się poliploidalnym charakterem hepatocytów9, ale rola ploidalności hepatocytów w normalnej fizjologii i chorobie nie jest jeszcze jasna. Istnieje coraz więcej dowodów wskazujących na to, że ploidalność zapewnia zmienność genomu31, a dobrze wiadomo, że ploidalność wzrasta wraz z wiekiem32,33. Wzbogacenie monojądrzastych tetraploidalnych hepatocytów jest jednak klinicznie związane ze złym rokowaniem w ludzkim raku wątrobowokomórkowym (HCC)34. Podobnie, zmiany w poziomach ploidalności hepatocytów są związane z przewlekłymi chorobami wątroby związanymi ze starzeniem się, takimi jak niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD)35,36,37. Ploidalność to stan posiadania więcej niż dwóch kopii genomu, który można zbadać, barwiąc zawartość genomu barwnikiem DNA, takim jak Hoechst38. Barwnik Hoechst, który jest dodawany do HB przed ekstrakcją, znakuje wszystkie jądra podczas protokołu izolacji. Pozwala to na rozróżnienie jąder diploidalnych i poliploidalnych na podstawie zawartości ich DNA po wzbudzeniu laserem UV (350 nm) lub fioletowym (450 nm) na przyrządzie do cytometrii przepływowej. Dzięki zaprezentowanej strategii bramkowania można badać 2n, 4n, 8n i wyższe poziomy ploidalności hepatocytów w zamrożonych, zarchiwizowanych wątrobach, aby lepiej zrozumieć rolę heterogeniczności komórkowej w funkcji tkanek1 (Figura 3A). Ponadto morfologię jądra, w tym rozmiar i objętość, można określić ilościowo za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej w celu skorelowania zmian wielkości jądra ze zmianami całkowitej liczby zliczeń lub liczby genów w zależności od poziomu ploidalności (ryc. 3B, C).
Multimodalne pomiary omiczne dają możliwość jednoczesnego badania kilku warstw organizacji genomu. Podejście multiomiczne oparte na wspólnym RNA + ATAC pozwala na badanie regulatorów i genów metabolicznych w dół, zapewniając kompleksowe podejście do badania sieci transkrypcyjnych i architektury chromatyny związanej z funkcją wątroby w rozdzielczości pojedynczej komórki. Co więcej, dzięki postępom w metodach obliczeniowych, które mogą wyjaśnić rzadkość danych i zmniejszenie kosztów sekwencjonowania, multiomika jednokomórkowa jest pionierem w ocenie wielu modalności z tej samej komórki. Ten protokół izolacji pojedynczego jądra jest zgodny z indywidualną i wspólną oceną zestawów danych dotyczących ekspresji i chromatyny. Użyliśmy standardowych potoków ustanowionych przez Stuarta i wsp.23 (pakiet Signac), aby zilustrować jakość danych, podczas gdy kilka dostępnych i alternatywnych metod obliczeniowych można łatwo zastosować do dalszych analiz 23,39,40,41.
Ogólnie rzecz biorąc, multiomika jednojądrowa umożliwia badanie bioarchiwizowanych tkanek wątroby naczelnych myszy FF, ludzi i innych niż ludzie przy użyciu bardzo małej ilości materiału próbki wyjściowej poprzez wdrożenie przedstawionego tutaj protokołu ekstrakcji jądra. To nieocenione narzędzie umożliwi biologom zajmującym się wątrobą badanie zarówno ekspresji genów, jak i dostępności chromatyny w kontekście różnych patologii wątroby. Dodatkowo, różne poziomy ploidalności hepatocytów i wynikające z tego dostosowanie ekspresji genów w zależności od ich lokalizacji w zraziku wątroby mogą ujawnić ich rolę w patologiach wątroby. Dlatego przewidujemy, że badanie heterogeniczności komórkowej stworzy nowe możliwości dla rozwoju medycyny precyzyjnej i ukierunkowanych interwencji przeciwko chorobom takim jak HCC i NAFLD.

Genomika pojedynczej komórki szybko staje się podstawową metodologią do badania funkcji wątroby i oceny wpływu heterogeniczności komórkowej na zdrowie i warunki chorobowe1. Szybki rozwój "multiomiki" do jednoczesnego pomiaru różnych warstw informacji i równoległa ekspansja solidnych potoków obliczeniowych toruje drogę do odkrycia nieznanych wcześniej typów i podtypów komórek w prawidłowej i chorej wątrobie2.
Możliwość eksploracji biobanków i archiwalnych zamrożonych próbek znacznie zwiększyła możliwości ponownego przyjrzenia się i odkrycia roli komórek niemiąższowych3,4,5 i zbadania roli poliploidalnych hepatocytów podczas starzenia się i w chorobach przewlekłych6,7,8,9. Dlatego ten artykuł opisuje solidny i powtarzalny protokół izolacji pojedynczego jądra dla zarchiwizowanych wątrób zamrożonych błyskawicznie (FF), który jest kompatybilny z sekwencjonowaniem RNA pojedynczego jądra i sekwencjonowaniem ATAC, a także z multimodalną omiką (joint RNA-seq i ATAC-seq) (Rysunek 1).
Ten przepływ pracy pozwala na badanie transkryptomu i dostępności chromatyny wszystkich typów komórek w wątrobie, niezależnie od wielkości komórki lub kruchości, w protokołach dysocjacji enzymatycznej. Można go wykonać z małymi skrawkami tkanek (15-30 mg lub 5-10 mm3) z cennych próbek ludzkich lub myszy transgenicznych. Określenie wysokiej czystości izolacji jąder obejmuje kwantyfikację i pomiar wielkości jądra, co może korelować ze zwiększonym rozmiarem komórki i starzeniem się10,11, a czystość ta jest istotna dla analizy zarówno ploidy hepatocytów12 jak i mechanizmów transkrypcyjnych zależnych od wielkości komórki11,13,14,15. Dodatkowo jądra wyizolowane z zamrożonej wątroby zachowują cenne informacje na temat strefowości wątroby. Przebieg pracy i pobieranie tkanek pozwalają na walidację danych genomicznych pojedynczych komórek lub dalsze analizy uzupełniające, takie jak immunohistochemia lub transkryptomika przestrzenna z tej samej tkanki i tej samej osoby. Dlatego podejście to może być systematycznie i niezawodnie stosowane do wielu chorób wątroby i organizmów modelowych.

<table><tbody><tr><td>10% Tween 20 - 5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizator Instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepna folia PCR</td><td>Bioanalizator Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Analiza DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Dotykowy termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>Sortownik</td><td></td><td></td> komórek <td>Do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS); np. sorter komórek BD FACSAria.</td></tr><tr><td>Wirówka 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000619</td><td>Stosować schłodzona w temperaturze 4 & st; C</td></tr><tr><td>Kontroler chromu i Następny Zestaw akcesoriów GEM</td><td>10X Genomics</td><td>1000204</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip G Zestaw pojedynczych komórek</td><td>10X Genomics</td><td>1000127</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip J Zestaw pojedynczych komórek, 16 reakcji</td><td>10X Genomics</td><td>1000230</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1, 4 reakcje</td><td>10X Genomics</td><td>1000269</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reakcje</td><td>10X Genomics</td><td>1000285</td><td></td></tr><tr><td>cOmpete, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT) 1 M roztwór</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td>Przygotuj 1 mM roztwór podstawowy i użyj przy 1 &mikro; M stężenie końcowe.</td></tr><tr><td>DNA AWAY Odkażacz powierzchni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10223471</td><td>Wytrzyj powierzchnie i pipety przed rozpoczęciem eksperymentu</td></tr><tr><td>Probówki DNA LoBind, 1,5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16628742</td><td></td></tr><tr><td>Probówki DNA LoBind, 2,0 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16638742</td><td></td></tr><tr><td>Bufor elucyjny (EB) - 250 ml</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13527550</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C Akcesorium: Smartblock</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13518470</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absolutny (200 proof), klasa biologii molekularnej - 100 mL&nbsp;</td>Filtry <td>do 10517694</td><td></td> <td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>50 i mikro; m, sterylne&nbsp; &nbsp;</td><td>SYSMEX PARTEC - CELLTRICS</td><td>04-004-2327</td><td>Dostosuj średnicę filtra do rozmiaru tkanki i jąder</td></tr><tr><td>Gliceryna (glicerol), 50% (v/v) - 1 L</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-32</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell, 384-dołkowe płytki PCR, cienkościenne, listwowe, przezroczyste/białe</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP3905</td><td></td></tr><tr><td>Herenz Heinz Kleszcze ABS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1131884</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzian, 10 mg/ml roztwór w wodzie</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>światłoczuły</td></tr><tr><td>obrazujący cytometr</td><td></td><td></td> przepływowy <td>do obrazowania Do obrazowej analizy cytometrii przepływowej, np. Luminex Amnis ImageStream</td></tr><tr><td>Invitrogen TE Buffer - 100 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11568846</td><td></td></tr><tr><td>KCl (2 M), bez RNaz, 100 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (1 M), 100 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 8-Cap Strip, przezroczyste 300 pasków</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10209104</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 8-rurkowe paski, 0,2 mL-125 pasków</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10733087</td><td></td></tr><tr><td>M&ouml; rser 2 mL DOUNCE</td><td>Wagner & Munz GmbH</td><td>9651632</td><td>RNase zap i spłucz MillQ przed użyciem</td></tr><tr><td>MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td>Lub dowolna inna mini wirówka paskowo-probówkowa</td></tr><tr><td>Hemocytometr Neubauera</td><td>OMNILAB&nbsp; LABORZENTRUM</td><td>5435293</td><td>Wizualizacja i liczenie jąder pod mikroskopem</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet RT LTS 1000 &micro; L, Wide-O</td><td>Mettler Toledo</td><td>30389218</td><td></td></tr><tr><td>Pistill "A" 2 ml</td><td>Wagner & Munz GmbH&nbsp;</td><td>9651621</td><td>przed użyciem zap RNazę i spłucz MillQ Pistill</td></tr><tr><td>"B" 2 ml</td><td>Wagner & Munz GmbH</td><td>9651627</td><td>RNazę i spłucz MillQ przed użyciem</td></tr><tr><td>Polipropylenowa probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10579691</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowa szalka Petriego, 60 mm x 15 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10634141</td><td></td></tr><tr><td>Polistyren Okrągłodenny 5 ml Probówki FACS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10100151</td><td></td></tr><tr><td>Protector - 2,000 U</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3335399001</td><td>Trzymaj się -20 &deg; C do użycia</td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy na bazie białka SUPERaza i byk; W (20 U/&mu; L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2696</td><td>Przechowywać w -20 & stopni; C do czasu użycia</td></tr><tr><td>Rekombinowany inhibitor RNazy</td><td>Clontech Takara</td><td>2313B</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza; C do czasu użycia</td></tr><tr><td>probówki do mikrofuge wolne od RNAzy - 0,5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Dekontaminacja Roztwór</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td>Wytrzyj powierzchnie i pipety przed rozpoczęciem eksperymentu</td></tr><tr><td>SPRIselect - 60 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23318</td><td>Podwielokrotność i przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Sacharoza, 500 g</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td>Przygotuj 1 M roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Swann-Morton Sterylne jednorazowe skalpele ze stali nierdzewnej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11798343</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCI (1M), pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, 98%, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10671652</td><td>Przygotuj 10% roztwór podstawowy. Trzymaj się 4 stopni; C i chronić przed światłem.</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11538886</td><td></td></tr><tr><td>Vortex- Mieszalnik</td><td>VWR</td><td>444-1372</td><td>Lub dowolny inny rodzaj wiru</td></tr></tbody></table>

izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

Wątroba jest złożoną i niejednorodną tkanką odpowiedzialną za wykonywanie wielu kluczowych funkcji fizjologicznych, takich jak między innymi utrzymanie homeostazy energetycznej i metabolizm ksenobiotyków. Zadania te są wykonywane poprzez ścisłą koordynację między komórkami miąższowymi wątroby i niemiąższowymi. Dodatkowo, różne czynności metaboliczne są ograniczone do określonych obszarów zrazika wątroby - zjawisko zwane strefą wątroby. Niedawne postępy w technologiach sekwencjonowania pojedynczych komórek umożliwiły naukowcom zbadanie niejednorodności tkanek w rozdzielczości pojedynczej komórki. W wielu złożonych tkankach, w tym w wątrobie, ostre protokoły dysocjacji enzymatycznej i/lub mechanicznej mogą negatywnie wpływać na żywotność lub jakość zawiesin jednokomórkowych potrzebnych do kompleksowego scharakteryzowania tego narządu w zdrowiu i chorobie.
Ten artykuł opisuje solidny i powtarzalny protokół izolowania jąder z zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby. Metoda ta pozwala uzyskać wysokiej jakości jądra, które są kompatybilne z dalszymi podejściami omicznymi do pojedynczych komórek, w tym sekwencją RNA pojedynczego jądra, testem chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ATAC-seq), a także multimodalnym omicznym (joint RNA-seq i ATAC-seq). Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do izolacji jąder od zdrowych i chorych próbek wątroby od ludzi, myszy i naczelnych. Takie podejście pozwala na bezstronną izolację wszystkich głównych typów komórek w wątrobie, a zatem oferuje solidną metodologię badania wątroby w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Ten łatwy i powtarzalny protokół został z powodzeniem wykorzystany do wyizolowania wysokiej jakości jąder ze zdrowych i chorych mysich modelowych wątrób, a także wątrob od naczelnych i innych niż ludzie. Ta metoda wymaga jedynie niewielkiej ilości zamrożonego materiału tkankowego. Ponadto wirowanie w gradiacji gęstości daje bardzo czystą zawiesinę jądrową, w której wszystkie główne typy komórek w wątrobie są zachowane w końcowym przygotowaniu jądrowym.Ta metoda ekstrakcji jąder może być stosowana w bioarchiwizowanych próbkach ludzkiej wątroby, które są przechowywane w biobankach. Homogenizację tkanek należy rozpocząć od wycięcia kawałka o grubości 20-30 miligramów lub 5 mm3 z tkanki wątroby umieszczonej na szalce Petriego na suchym lodzie za pomocą wstępnie schłodzonego skalpela. Natychmiast przenieść szalkę Petriego na mokry lód i dodać jeden mililitr buforu homogenizacyjnego.Używając zimnego skalpela, zmiel tkankę tak bardzo, jak to możliwe, pozwalając jej zassać końcówką kryzy o szerokości jednego mililitra. Zebrać zawiesinę tkankową i przenieść ją do wstępnie schłodzonego homogenizatora o pojemności dwóch mililitrów szklanego. Umyj szalkę Petriego dodatkowym 0,5 do 1 mililitra buforu homogenizacyjnego i zbierz wszystkie pozostałe kawałki tkanki, trzymając wszystko na lodzie.Powoli i ostrożnie wykonaj pięć uderzeń luźnym tłuczkiem A na lodzie, nie tworząc bąbelków. Upewnij się, że tłuczek przesuwa się ostrożnie od góry do dołu homogenizatora przy każdym pociągnięciu. Następnie wykonaj od 10 do 15 powolnych pociągnięć ciasnym tłuczkiem B na lodzie, nie tworząc bąbelków.Po zakończeniu przefiltruj homogenat przez sitko o średnicy 50 mikrometrów, przenosząc go do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Używaj więcej niż jednego filtra lub rurki do homogenatów zawierających dużą ilość grudek tkanki łącznej. Przepłukać homogenizator i filtry dodatkowym 0,5 do 1 mililitra buforu homogenizacyjnego, aby dokładnie zebrać wszystkie homogenaty tkanek przed wirowaniem w gradiacji gęstości.W przypadku wirowania w gradiencie gęstości odwirować przefiltrowany homogenat we wstępnie schłodzonej wirówce o stałym kącie natężenia 1000 G przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podczas odwirowywania próbki należy przygotować probówkę o pojemności 1,5 mililitra zawierającą 250 mikrolitrów 50% roztworu jodoksanolu i jedną dwumililitrową probówkę zawierającą 500 mikrolitrów rozcieńczenia 29% jodiksanolu. Umieść obie probówki na lodzie.Następnie z zawiesiny wirówki odessać supernatant bez naruszania osadu za pomocą pompy próżniowej. Ponownie zawiesić osad w 250 mikrolitrach buforu homogenizacyjnego za pomocą końcówki pipety z kryzą o szerokości jednego mililitra. Następnie przenieś 250 mikrolitrów zawiesiny jąder do wstępnie schłodzonej 1,5 mililitrowej probówki zawierającej 250 mikrolitrów 50% jodiksanolu i delikatnie i dokładnie wymieszaj, aby wytworzyć 25% zawiesinę jąder jodu.Następnie przenieść 500 mikrolitrów zawiesiny jąder 25% jodiksanolu do wstępnie schłodzonej probówki mililitrowej zawierającej 500 mikrolitrów rozcieńczenia 29% jodu. Odwirować probówkę w wstępnie schłodzonej, wahadłowej wirówce kubełkowej o stężeniu 12 500 G przez 20 minut, z wyłączoną przerwą. Tuż przed zakończeniem etapu wirowania dodaj inhibitory RNA do bufora magazynującego jądra lub NSB, przechodząc do potoków sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra.Po zakończeniu wirowania odessać supernatant bez naruszania osadu za pomocą pompy próżniowej. Delikatnie ponownie zawiesić osad w 100 do 300 mikrolitrach NSB za pomocą końcówki pipety z otworem o szerokości jednego mililitra i przenieść zawiesinę jąder do czystej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Policz jądra za pomocą roztworu błękitu trypanowego za pomocą ręcznego hemocytometru i natychmiast użyj otrzymanej zawiesiny jąder do testu genomicznego pojedynczego jądra.W przypadku sortowania komórek na podstawie cytometrii przepływowej należy przefiltrować zawiesinę jąder przez filtr o średnicy 50 mikrometrów do wstępnie schłodzonej pięciomililitrowej probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją lub FACS. Użyj sortownika do cytometrii przepływowej wyposażonego w dyszę o średnicy 100 mikrometrów i załaduj probówkę FACS do sortera przed wyświetleniem podglądu próbki. Ustaw strategię bramkowania dla sortowania jąder, zaczynając od bramki rozproszenia, wykreślając obszar rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia bocznego, następnie wysokość Hoechsta w stosunku do obszaru Hoechsta, a następnie szerokość Hoechsta w stosunku do obszaru Hoechsta.Wizualizacja profilu ploidalności jąder na histogramie obszaru Hoechsta. W przypadku sortowania na płytki 96- lub 384-dołkowe należy ustawić opóźnienie kropli i zoptymalizować wyrównanie płytki za pomocą metody kolorometrycznej. Ustawić chłodzenie próbki i uchwyt płytki na cztery stopnie Celsjusza przy włączonym obrocie próbki przy 300 obr./min.Sortuj pojedyncze jądra przy stężeniu próbki około 1 x 105 jąder na mililitr z natężeniem przepływu od 200 do 500 zdarzeń na sekundę. Badanie mikroskopowe jąder wyekstrahowanych z zamrożonych wątrob wykazało, że etap wirowania w gradionym gradiencie gęstości znacznie ułatwił usunięcie niepożądanych resztek komórkowych i tkankowych. Metodologia ta zachowała wszystkie poziomy ploidalności, które zostały zweryfikowane i określone ilościowo za pomocą analizy cytometrycznej.Wysoką jakość metryk zaobserwowano na podstawie danych uzyskanych za pomocą ekstrakcji jąder. Jednorodne przybliżenie i projekcja rozmaitości reprezentowały liczbę zliczeń we wszystkich jądrach i głównych typach komórek, które można z pewnością zidentyfikować tylko za pomocą transkryptomu jądrowego i stosunkowo płytkiego sekwencjonowania. Podejście to pozwoliło na zbadanie specyficznych dla wątroby czynników transkrypcyjnych i genów docelowych biorących udział w metabolizmie ksenobiotyków.Komplementarny wzór charakterystycznych genów, takich jak percentral Cyp2e1 i periportal Cyp2f2, wykazał, że wyekstrahowane jądra zachowały krytyczne informacje o strefowości wątroby. Biblioteka ekspresji genów RNA została zsekwencjonowana do głębokości 44 600 odczytów na jądro, a biblioteka ATAC do głębokości 43 500 odczytów na jądro. Ważona analiza najbliższego sąsiada przeprowadzona dla wielu pomiarów obu modalności, RNA i ATAC, przy użyciu pakietów Seurat i Signac, pozwoliła na identyfikację i adnotację głównych i drugorzędnych typów komórek wątroby bez widocznych odchyleń spowodowanych wielkością komórki lub kruchością jądra.W tej metodzie wykryto również wcześniejsze regulatory transkrypcji i geny charakterystyczne dla strefowania wątroby. Ważne jest, aby podczas homogenizacji odbijającej się nie tworzyć zbyt wielu pęcherzyków podczas przesuwania tłuczków w górę iw dół oraz trzymać się liczby uderzeń wskazanej w protokole.

isolation-nuclei-from-flash-frozen-liver-tissue-for-single-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje protokół izolacji pojedynczych jąder ze świeżo zamrożonej tkanki glejaka. Wyizolowane pojedyncze jądra mogą być wykorzystane jako próbki do technik sekwencjonowania, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA) i test pojedynczych jąder do sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (snATAC) w celu uzyskania głębszego wglądu w niejednorodność między- i wewnątrznowotworową obserwowaną w glejaku ośrodkowych tkanek nerwowych.

Izolacja jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka: metoda uzyskiwania nienaruszonych jąder z próbek guza glejaka

Ta publikacja opisuje protokół izolacji jąder z dojrzałych adipocytów, oczyszczania przez sortowanie aktywowane fluorescencją oraz transkryptomiki na poziomie pojedynczej komórki.

Izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Niejednorodność wewnątrznowotworowa jest nieodłączną cechą nowotworów, w tym glejaków. Opracowaliśmy prosty i wydajny protokół, który wykorzystuje kombinację i wirowania gradientowego do izolowania pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka do badań sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i ATAC.

Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC

Tutaj prezentujemy protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych nerek myszy, który poprawia reprezentację typów komórek rdzeniastych nerek i pozwala uniknąć artefaktów ekspresji genów spowodowanych dysocjacją enzymatyczną tkanki.

Izolacja jąder z nerki dorosłej myszy w celu sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Protokół zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy 10x Genomics, w tym zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin pojedynczych komórek i oceny izolowanych jąder.

Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego

Opisujemy protokół ekstrakcji wysokiej jakości jąder z indukowanych kriokonserwowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących ze zrębu/śródbłonka i komórek krwi, aby wspierać analizy sekwencjonowania nowej generacji pojedynczego jądra. Wytwarzanie wysokiej jakości, nienaruszonych jąder jest niezbędne w eksperymentach multiomicznych, ale dla niektórych laboratoriów może stanowić barierę wejścia w tę dziedzinę.

Izolacja jądrowa z kriokonserwowanych komórek krwi pochodzących z in vitro

Naucz się izolacji jąder z zamrożonej tkanki wątroby myszy, człowieka i naczelnych do multiomiki jednokomórkowej. Metoda wykorzystuje gradient gęstościowy do uzyskania czystego zawiesiny jąder z zachowaniem ploidii i różnorodności typów komórkowych.

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Przeglądaj więcej filmów