Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Ten łatwy i powtarzalny protokół został z powodzeniem wykorzystany do wyizolowania wysokiej jakości jąder ze zdrowych i chorych mysich modelowych wątrób, a także wątrob od naczelnych i innych niż ludzie. Ta metoda wymaga jedynie niewielkiej ilości zamrożonego materiału tkankowego. Ponadto wirowanie w gradiacji gęstości daje bardzo czystą zawiesinę jądrową, w której wszystkie główne typy komórek w wątrobie są zachowane w końcowym przygotowaniu jądrowym.

Ta metoda ekstrakcji jąder może być stosowana w bioarchiwizowanych próbkach ludzkiej wątroby, które są przechowywane w biobankach. Homogenizację tkanek należy rozpocząć od wycięcia kawałka o grubości 20-30 miligramów lub 5 mm³ z tkanki wątroby umieszczonej na szalce Petriego na suchym lodzie za pomocą wstępnie schłodzonego skalpela. Natychmiast przenieść szalkę Petriego na mokry lód i dodać jeden mililitr buforu homogenizacyjnego.

Używając zimnego skalpela, zmiel tkankę tak bardzo, jak to możliwe, pozwalając jej zassać końcówką kryzy o szerokości jednego mililitra. Zebrać zawiesinę tkankową i przenieść ją do wstępnie schłodzonego homogenizatora o pojemności dwóch mililitrów szklanego. Umyj szalkę Petriego dodatkowym 0,5 do 1 mililitra buforu homogenizacyjnego i zbierz wszystkie pozostałe kawałki tkanki, trzymając wszystko na lodzie.

Powoli i ostrożnie wykonaj pięć uderzeń luźnym tłuczkiem A na lodzie, nie tworząc bąbelków. Upewnij się, że tłuczek przesuwa się ostrożnie od góry do dołu homogenizatora przy każdym pociągnięciu. Następnie wykonaj od 10 do 15 powolnych pociągnięć ciasnym tłuczkiem B na lodzie, nie tworząc bąbelków.

Po zakończeniu przefiltruj homogenat przez sitko o średnicy 50 mikrometrów, przenosząc go do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Używaj więcej niż jednego filtra lub rurki do homogenatów zawierających dużą ilość grudek tkanki łącznej. Przepłukać homogenizator i filtry dodatkowym 0,5 do 1 mililitra buforu homogenizacyjnego, aby dokładnie zebrać wszystkie homogenaty tkanek przed wirowaniem w gradiacji gęstości.

W przypadku wirowania w gradiencie gęstości odwirować przefiltrowany homogenat we wstępnie schłodzonej wirówce o stałym kącie natężenia 1000 G przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podczas odwirowywania próbki należy przygotować probówkę o pojemności 1,5 mililitra zawierającą 250 mikrolitrów 50% roztworu jodoksanolu i jedną dwumililitrową probówkę zawierającą 500 mikrolitrów rozcieńczenia 29% jodiksanolu. Umieść obie probówki na lodzie.

Następnie z zawiesiny wirówki odessać supernatant bez naruszania osadu za pomocą pompy próżniowej. Ponownie zawiesić osad w 250 mikrolitrach buforu homogenizacyjnego za pomocą końcówki pipety z kryzą o szerokości jednego mililitra. Następnie przenieś 250 mikrolitrów zawiesiny jąder do wstępnie schłodzonej 1,5 mililitrowej probówki zawierającej 250 mikrolitrów 50% jodiksanolu i delikatnie i dokładnie wymieszaj, aby wytworzyć 25% zawiesinę jąder jodu.

Następnie przenieść 500 mikrolitrów zawiesiny jąder 25% jodiksanolu do wstępnie schłodzonej probówki mililitrowej zawierającej 500 mikrolitrów rozcieńczenia 29% jodu. Odwirować probówkę w wstępnie schłodzonej, wahadłowej wirówce kubełkowej o stężeniu 12 500 G przez 20 minut, z wyłączoną przerwą. Tuż przed zakończeniem etapu wirowania dodaj inhibitory RNA do bufora magazynującego jądra lub NSB, przechodząc do potoków sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra.

Po zakończeniu wirowania odessać supernatant bez naruszania osadu za pomocą pompy próżniowej. Delikatnie ponownie zawiesić osad w 100 do 300 mikrolitrach NSB za pomocą końcówki pipety z otworem o szerokości jednego mililitra i przenieść zawiesinę jąder do czystej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Policz jądra za pomocą roztworu błękitu trypanowego za pomocą ręcznego hemocytometru i natychmiast użyj otrzymanej zawiesiny jąder do testu genomicznego pojedynczego jądra.

W przypadku sortowania komórek na podstawie cytometrii przepływowej należy przefiltrować zawiesinę jąder przez filtr o średnicy 50 mikrometrów do wstępnie schłodzonej pięciomililitrowej probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją lub FACS. Użyj sortownika do cytometrii przepływowej wyposażonego w dyszę o średnicy 100 mikrometrów i załaduj probówkę FACS do sortera przed wyświetleniem podglądu próbki. Ustaw strategię bramkowania dla sortowania jąder, zaczynając od bramki rozproszenia, wykreślając obszar rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia bocznego, następnie wysokość Hoechsta w stosunku do obszaru Hoechsta, a następnie szerokość Hoechsta w stosunku do obszaru Hoechsta

Wizualizacja profilu ploidalności jąder na histogramie obszaru Hoechsta. W przypadku sortowania na płytki 96- lub 384-dołkowe należy ustawić opóźnienie kropli i zoptymalizować wyrównanie płytki za pomocą metody kolorometrycznej. Ustawić chłodzenie próbki i uchwyt płytki na cztery stopnie Celsjusza przy włączonym obrocie próbki przy 300 obr./min.

Sortuj pojedyncze jądra przy stężeniu próbki około 1 x 10⁵ jąder na mililitr z natężeniem przepływu od 200 do 500 zdarzeń na sekundę. Badanie mikroskopowe jąder wyekstrahowanych z zamrożonych wątrob wykazało, że etap wirowania w gradionym gradiencie gęstości znacznie ułatwił usunięcie niepożądanych resztek komórkowych i tkankowych. Metodologia ta zachowała wszystkie poziomy ploidalności, które zostały zweryfikowane i określone ilościowo za pomocą analizy cytometrycznej.

Wysoką jakość metryk zaobserwowano na podstawie danych uzyskanych za pomocą ekstrakcji jąder. Jednorodne przybliżenie i projekcja rozmaitości reprezentowały liczbę zliczeń we wszystkich jądrach i głównych typach komórek, które można z pewnością zidentyfikować tylko za pomocą transkryptomu jądrowego i stosunkowo płytkiego sekwencjonowania. Podejście to pozwoliło na zbadanie specyficznych dla wątroby czynników transkrypcyjnych i genów docelowych biorących udział w metabolizmie ksenobiotyków.

Komplementarny wzór charakterystycznych genów, takich jak percentral Cyp2e1 i periportal Cyp2f2, wykazał, że wyekstrahowane jądra zachowały krytyczne informacje o strefowości wątroby. Biblioteka ekspresji genów RNA została zsekwencjonowana do głębokości 44 600 odczytów na jądro, a biblioteka ATAC do głębokości 43 500 odczytów na jądro. Ważona analiza najbliższego sąsiada przeprowadzona dla wielu pomiarów obu modalności, RNA i ATAC, przy użyciu pakietów Seurat i Signac, pozwoliła na identyfikację i adnotację głównych i drugorzędnych typów komórek wątroby bez widocznych odchyleń spowodowanych wielkością komórki lub kruchością jądra.

W tej metodzie wykryto również wcześniejsze regulatory transkrypcji i geny charakterystyczne dla strefowania wątroby. Ważne jest, aby podczas homogenizacji odbijającej się nie tworzyć zbyt wielu pęcherzyków podczas przesuwania tłuczków w górę iw dół oraz trzymać się liczby uderzeń wskazanej w protokole.