Wizualizacja wczesnych miejsc infekcji choroby ryżu (Magnaporthe oryzae) na jęczmieniu (Hordeum vulgare) za pomocą podstawowego mikroskopu i smartfona
March 17th, 2023
To jest prosty protokół badania pochwy liści jęczmienia przy użyciu minimalnej ilości odczynników i zwykłego sprzętu laboratoryjnego (w tym podstawowego smartfona). Celem jest wizualizacja wczesnego procesu infekcji blastyczną w laboratoriach bez dostępu do zaawansowanego sprzętu mikroskopowego.
Nasz protokół jest uproszczoną metodą, która pozwala naukowcom na wizualizację wczesnych etapów infekcji dzikiego typu i genetycznych mutantów grzybów bez użycia drogiego sprzętu. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie podstawowych materiałów laboratoryjnych do udzielania odpowiedzi na złożone pytania biologiczne oraz do szybkiego badania przesiewowego mutantów grzybów w celu dalszej analizy. Trudną częścią tej techniki jest obróbka pochewki.
Osłonka to cienka warstwa komórek, którą można łatwo uszkodzić, dlatego ostrożne obchodzenie się z nią jest niezbędne do udanego eksperymentu. Na początek wybierz jęczmień uprawiany do fazy drugiego liścia. I za pomocą sterylnych nożyczek pokrój jęczmień tuż nad linią gleby.
Za pomocą kleszczy i skalpela ostrożnie odetnij pochwę pierwszego liścia, który jest otwarty wzdłużnie. I za pomocą kleszczy usuń go z podstawy drugiego liścia. Za pomocą skalpela odetnij większość pierwszego liścia od pochwy, pozostawiając tylko 0,5 cala tkanki liścia do zamontowania.
Umieść pierwszy liść płasko na sterylnej 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej mokry ręcznik papierowy, aby utrzymać wilgotność wewnątrz płytki. Przyklej tkankę liścia do dna szalki Petriego. Wybierz dziewięcio- do 12-dniową płytkę hodowlaną Magnaporthe oryzae i dodaj do niej od 0,5 do dwóch mililitrów sterylnej wody.
Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, delikatnie zeskrob grzybnię, aby uwolnić przyczepione konidia. Ostrożnie odpipetować zawiesinę konidialną do probówki mikrowirówki zawierającej mały kawałek gazy serowej, aby odfiltrować wszelkie duże kawałki grzybni z zawiesiny konidialnej. W razie potrzeby rozcieńczyć stężenie zarodników sterylną wodą do pięć razy 10 do czwartego zarodnika na mililitr, ponieważ zbyt wysokie stężenie utrudnia obrazowanie poszczególnych miejsc infekcji.
W zależności od rozmiaru osłony, ostrożnie odpipetować od 25 do 50 mikrolitrów zawiesiny konidialnej wewnątrz zwiniętej osłonki liściowej. Następnie napełnij cztery lub pięć 500-mililitrowych zlewek podwójnie destylowaną wodą i podgrzewaj, aż zacznie gotować na parze. Przytrzymaj pokrywkę szalki Petriego nad jedną z parujących zlewek, aby zatrzymać wilgoć wewnątrz płytki.
Ułóż zainfekowane płytki pochwy liściowej i otocz je pozostałymi gorącymi zlewkami, ponieważ tworzy to wilgotne, wilgotne środowisko do kiełkowania zarodników. Chroń tę konfigurację przed światłem, przykrywając ją solidnym kolorowym gumowym lub plastikowym pudełkiem i pozostawiając w spokoju przez 48 godzin lub żądany punkt czasowy do obrazowania. Przygotuj plamę, mieszając świeżo rozcieńczony 45% kwas octowy i 0,1% błękit trypanowy.
Porcję jednego mililitra roztworu barwnika do probówek mikrowirówek. Za pomocą skalpela ostrożnie odetnij osłonę liścia od taśmy. Za pomocą kleszczy umieść osłonę w probówce mikrowirówki i upewnij się, że jest całkowicie zanurzona w roztworze barwnika.
Pozostaw probówki na dwie godziny w bloku grzewczym o temperaturze 40 stopni Celsjusza lub łaźni wodnej, aby barwnik wniknął w liść. Następnie ostrożnie opłucz pochwy liści trzy razy w 60% świeżym glicerolu, aby usunąć nadmiar barwnika. Trzymaj osłonę w glicerolu do momentu, gdy będzie gotowa do zamontowania na szkiełkach.
Umieść osłonę na czystym szkiełku podstawowym i dodaj kilka kropli 60% glicerolu. Używając mikroskopu preparacyjnego i dwóch par kleszczy, ostrożnie rozwiń osłonę, pozostawiając zaszczepiony środek skierowany do góry. Trzymając osłonę otwartą za pomocą kleszczyków, umieść szkiełko nakrywkowe na górze, aby zapobiec zwijaniu się osłonki i blokowaniu miejsca infekcji.
Uszczelnij szkiełko nakrywkowe za pomocą lakieru do paznokci do długotrwałego przechowywania lub taśmy do krótkotrwałego przechowywania. Obserwuj szkiełka pod złożonym mikroskopem świetlnym. Wykonuj podstawowe zdjęcia za pomocą smartfona, montując adapter do telefonu komórkowego do mikroskopu.
W przypadku urządzeń z systemem Android dostosuj ustawienia aplikacji aparatu, aby wyłączyć lampę błyskową, wyłączyć zdjęcie z góry, wyłączyć automatyczną regulację jasności i cieni oraz ustawić rozdzielczość zdjęcia na pełną. Po zamontowaniu telefonu komórkowego zrób zdjęcie mikrometru ze skalą z żądanym celem uzyskania danych. Dostosuj powiększenie telefonu do 2,5x i utrzymuj je na stałym poziomie, aby zachować stały rozmiar pikseli.
W środku pochewki znajduje się największe skupisko zarodników i infekujących appressorii. Dlatego staraj się uzyskać od dziewięciu do 12 obrazów każdej osłony, aby uzyskać znaczące liczby do analizy statystycznej. Miejsca infekcji osłonki zostały zobrazowane za pomocą smartfona i adaptera mikroskopu do smartfona po zabarwieniu błękitem trypanowym.
Ciepło i kwas octowy w procedurze barwienia delikatnie zmiękczają tkankę liścia. Płukanie po barwieniu w 60% glicerolu nie tylko usuwa nadmiar plam, ale także pomaga zmniejszyć rozpraszanie światła spowodowane przez liść i poprawić jakość obrazu. Odchylenia od protokołu barwienia mogą skutkować nieoptymalnymi wynikami, jak pokazano poniżej.
Jęczmień zakażony dzikim typem 4091 wytworzył pomyślnie zainfekowane komórki identyfikowane na podstawie obecności zakażonych strzępek w tkance pochwy liścia. W przypadku zmutowanej infekcji J99A zauważono pomyślny rozwój kołków apresorii i penetracji, ale nie wytworzył on inwazyjnych strzępek. Czas jest ważny w przypadku testów opartych na infekcjach.
Odpowiednio dojrzałe rośliny i zarodniki grzybów są niezbędne do osiągnięcia sukcesu. W tym badaniu przyjrzeliśmy się obecności lub brakowi struktur infekcyjnych. Dodatkowe eksperymenty mogą odpowiedzieć na pytania dotyczące fenotypu struktury infekcji i inwazyjnych strzępek.
Nasza metodologia nie jest nowa, ale jest uproszczoną, dostępną wersją bardziej złożonego i kosztownego eksperymentu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje uproszczoną metodę badania pochwy liści jęczmienia, aby wizualizować wczesny proces infekcji chorobą fytoftorozy. Wykorzystuje minimalne reagenty i podstawowe wyposażenie laboratorium, co sprawia, że jest dostępna dla laboratoriów bez zaawansowanej mikroskopi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Patologia roślin
- Genetyka grzybów
- Biologia infekcji
Tło
- Test koncentruje się na wczesnych etapach infekcji grzybowej.
- Umożliwia badanie dzikiego typu i genetycznych mutantów grzybów.
- Podstawowe zaopatrzenie laboratoryjne jest wystarczające dla tej techniki.
- Opiekuncze obchodzenie się z pochwy jęczmienia jest kluczowe dla sukcesu.
Cel badania
- Wizualizacja wczesnych etapów infekcji w roślinach jęczmienia.
- Ułatwienie szybkiego przesiewania mutantów grzybowych.
- Dostarczenie dostępnej metody dla laboratoriów o ograniczonych zasobach.
Stosowane metody
- Selekcja roślin jęczmienia na drugim etapie liściowym.
- Użycie sterylnych nożyczek do cięcia rośliny jęczmienia.
- Opiekuncze traktowanie pochwy liściowej, aby uniknąć uszkodzeń.
- Obserwacja procesów infekcji bez zaawansowanego sprzętu.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja wczesnych etapów infekcji.
- Demonstracja efektywności techniki przy minimalnym wykorzystaniu zasobów.
- Wgląd w proces infekcji mutantów grzybowych.
- Możliwość dalszej analizy genetyki grzybów.
Wnioski
- Protokół jest skuteczny w badaniu choroby fytoftorozy u jęczmienia.
- Oferuje kosztowo efektywną alternatywę dla zaawansowanej mikroskopi.
- Zachęca do badań genetyki grzybów w środowisku laboratoryjnym.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid, accessible visualization of early plant-pathogen interactions is critical for de-risking agricultural trait discovery and supporting translational pipeline decisions in crop protection R&D. This simplified barley leaf sheath assay enables high-throughput screening of fungal mutants and infection phenotypes using only basic laboratory infrastructure. The approach supports predictive confidence in target validation and accelerates the triage of candidate resistance traits for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of infection phenotypes in wild type and mutant fungal strains.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets in a controlled, reproducible system.
- Facilitates rapid hypothesis testing for genetic determinants of pathogenicity and resistance.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, scalable assay for screening fungal mutants and host responses.
- Delivers quantitative, image-based outputs suitable for comparative analysis across conditions.
- Reduces technical barriers for assay adoption and cross-lab reproducibility by using basic equipment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early infection phenotyping with downstream trait validation in disease-relevant crop systems.
- Enables continuity from discovery to preclinical assessment of resistance mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate genes or chemistries for crop protection pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This assay bridges early discovery and lead identification by providing a rapid, reproducible platform for infection phenotype analysis in barley. It is positioned for integration into trait discovery, genetic screening, and translational validation workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of host-pathogen interactions and mechanistic de-risking.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative infection site measurements for mutant and wild type comparisons.
- Analytics: Enables statistical analysis of infection frequency and structure development using image-based data.
- Translational Research: Facilitates alignment of early phenotypes with preclinical trait validation in relevant crop models.
- Enterprise Reuse: Offers a low-cost, scalable assay adaptable across fungal and plant systems for broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes infection phenotyping with minimal resource requirements and high reproducibility.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for trait advancement and improves capital efficiency in crop protection R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate resistance traits and genetic targets.
Implementation Considerations
- Requires basic plant pathology expertise and careful handling of delicate leaf sheath tissues.
- Needs only standard laboratory tools, compound microscope, and smartphone imaging adapter.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging parameters for reproducibility.
- Adaptable to other monocot hosts and fungal pathogens with protocol optimization.
- Imaging and staining quality are sensitive to protocol deviations and sample age.
