Name: Wizualizacja wczesnych miejsc infekcji choroby ryżu (Magnaporthe oryzae) na jęczmieniu (Hordeum vulgare) za pomocą podstawowego mikroskopu i smartfona (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę wizualizacji wczesnych etapów infekcji Magnaporthe oryzae na jęczmieniu przy użyciu podstawowego mikroskopu i smartfona. Ta technika umożliwia badanie dzikich szczepów oraz mutantów grzybowych bez kosztownego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za finansowanie z nagrody USDA-NIFA 2016-67013-24816.

1. Przygotowanie materiałów doświadczalnych
<ol>
	<li>Przygotuj agar z płatków owsianych (OMA), mieszając płatki owsiane, aż staną się drobnym proszkiem. Dodać 25 g płatków owsianych w proszku i 15 g agaru do 500 ml ddH2O i autoklawować w cyklu pożywki (alternatywnie doprowadzić do wrzenia przez 20 minut). Wlać pożywkę do sterylnych szalek Petriego o średnicy 60 mm. 
	UWAGA: Inne typy pożywek, które indukują zarodnikowanie, takie jak agar V8, są dopuszczalne dla tego protokołu.</li>
	<li>Płytka M. oryzae przefiltrować bulion bezpośrednio na płytki OMA za pomocą sterylnych kleszczyków i pozwolić im pokryć całą płytkę (9-12 dni). Umieścić płytki w inkubatorze wzrostu w temperaturze 25 °C w cyklach dzień-noc o godzinie 12:12, aby pomóc w wywołaniu zarodnikowania. 
	UWAGA: Niektóre mutanty rosną wolniej i wymagają dodatkowej opieki (np. najpierw kompletna pożywka, a następnie przeniesienie do OMA) i mogą potrzebować dodatkowego tygodnia, aby wyprodukować wystarczającą ilość konidiów.</li>
	<li>Posadź nasiona jęczmienia (Hordeum vulgare Lacey) bezpośrednio w wilgotnym podłożu (np. Bezglebowym podłożu doniczkowym) z 10-15 nasionami na 6-calową doniczkę. Umieść doniczki na tacach z 1-2 calami wody.</li>
	<li>Ustaw warunki w komorze wzrostu jęczmienia na 22 °C przez 12 godzin (światło dzienne) i 19 °C przez 12 godzin (ciemno) przy wilgotności względnej 60%. Kontynuuj podlewanie od dołu, aby nie przeszkadzać nasionom.</li>
	<li>Uprawiaj jęczmień do fazy drugiego liścia, około 14 dni. Za pomocą sterylnych nożyczek przytnij jęczmień tuż nad linią gleby. Za pomocą kleszczy i brzytwy/skalpela ostrożnie odetnij pochewkę pierwszego liścia, która jest otwarta wzdłużnie, a następnie za pomocą kleszczy usuń ją z podstawy drugiego liścia. 
	UWAGA: Wyczyść narzędzia (kleszcze, skalpel itp.) przed użyciem 75%-80% etanolu. Pochewka to cienka warstwa naskórka, która zapewnia przyczepienie od pierwszego do drugiego liścia (od drugiego do trzeciego liścia itd.; patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Umieść pierwszy liść płasko na sterylnej szalce Petriego o średnicy 60 mm, zawierającej mokry ręcznik papierowy, aby utrzymać wilgotność wewnątrz płytki. Za pomocą skalpela odetnij większość pierwszego liścia od pochwy, pozostawiając tylko 0,5 cala tkanki liścia do zamontowania.</li>
	<li>Przyklej tkankę liścia do dolnej części płytki Petriego. 
	UWAGA: Pochwa zwija się, ale jest to dopuszczalne, ponieważ zwinięta osłona łatwiej utrzymuje kroplę konidialną.</li>
	<li>Zbierz 9-12-dniowe płytki M. oryzae i dodaj do nich 0,5-2 ml sterylnej wody. Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, delikatnie zeskrob grzybnię, aby uwolnić przyczepione konidia. Ostrożnie odpipetować zawiesinę konidialną do probówki mikrowirówkowej zawierającej mały kawałek gazy, aby odfiltrować wszelkie duże kawałki grzybni z zawiesiny konidialnej. 
	UWAGA: Zarodniki można zbierać już po 7 dniach, jeśli wzrost i zarodnikowanie są wystarczające do osiągnięcia pożądanego stężenia zarodników. Pobranie może być opóźnione nie więcej niż 14 dni w przypadku pracy z wolno rosnącym mutantem genetycznym</li>
	<li>Pożądane stężenie zarodników wynosi 5 x 104 zarodników na ml, ale dopuszczalny jest zakres (1 x 104-1 x 105). Zbyt wysokie stężenie sprawia, że obrazowanie poszczególnych miejsc infekcji jest trudne; W razie potrzeby rozcieńczyć stężenie zarodników sterylną wodą.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować zawiesinę konidialną wewnątrz zwiniętej osłonki liściowej. Zacznij od 25 μl (wielkość kropli można zwiększyć w zależności od wielkości osłonki, do 50 μl). 
	UWAGA: Zaleca się wykonanie od trzech do pięciu powtórzeń każdego zmutowanego szczepu lub linii jęczmienia. Często zdarza się, że podczas procesu barwienia dochodzi do uszkodzeń, dlatego zaleca się dodatkowe powtórzenia osłony.</li>
	<li>Napełnij cztery lub pięć zlewek o pojemności 500 ml ddH2O i podgrzewaj do momentu gotowania na parze (za pomocą kuchenki mikrofalowej lub płyty grzejnej). Zachowaj ostrożność podczas przenoszenia zlewek z gorącą wodą. Przytrzymaj pokrywkę szalki Petriego nad jedną z parujących zlewek, aby zatrzymać wilgoć wewnątrz płytki.</li>
	<li>Ułóż zainfekowane płytki pochwy liściowej i otocz je pozostałymi gorącymi zlewkami. W ten sposób powstaje wilgotne, wilgotne środowisko, niezbędne do kiełkowania zarodników. 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas gotowania pokrywek na parze, aby upewnić się, że gorąca woda lub para nie dotykają osłon.</li>
	<li>Chroń osłony liści przed światłem, przykryj gumowym lub plastikowym pudełkiem w jednolitym kolorze (preferowanym w kolorze czarnym) i pozostaw na 48 godzin lub w żądanym momencie obrazowania. 
	UWAGA: Pudełko kartonowe nie jest odpowiednie, ponieważ nie zatrzymuje wilgoci i pochłania parę ze zlewek z gorącą wodą. Zamykana, plastikowa wanna dobrze sprawdza się w zatrzymywaniu wilgoci i może być przykryta czarną tkaniną lub większym ciemnym pojemnikiem, aby zablokować światło.</li>
</ol>
2. Proces barwienia
<ol>
	<li>Przygotuj plamę w następujący sposób: przygotuj świeże rozcieńczenie 45% kwasu octowego i dodaj 0,1% v/v błękitu trypanowego. Podaniec 1 ml roztworu barwnika do probówek do mikrowirówek. Ustawić blok grzewczy lub łaźnię wodną na 40 °C.</li>
	<li>Ostrożnie, za pomocą brzytwy lub skalpela, odetnij osłonę liścia od taśmy. Za pomocą kleszczy umieść osłonę w probówce mikrowirówki i upewnij się, że jest całkowicie zanurzona w roztworze barwnika. Odczekaj 2 godziny, aż barwnik wniknie w liść. Podczas procesu barwienia próbki należy podgrzać w temperaturze 40 °C w bloku grzewczym lub łaźni wodnej w celu zwiększenia penetracji barwnika. 
	UWAGA: Osłony próbują unosić się w probówce mikrowirówki; Aby zapobiec powstawaniu niepoplamionych kieszeni tkanki liściowej, napełnij rurki, zanurz osłonki i zamknij rurkę. Nie umieszczaj wielu osłon w tej samej probówce do mikrowirówki.</li>
	<li>Ostrożnie opłucz pochwy liści w 60% glicerolu, aby usunąć nadmiar barwnika. Na ogół wystarczą trzy płukania (każde w świeżym glicerolu). Trzymaj osłonę w glicerolu do momentu, gdy będzie gotowa do zamontowania na szkiełkach.</li>
</ol>
3. Proces montażu i obrazowania
<ol>
	<li>Umieść osłonę na czystym szkiełku podstawowym i dodaj kilka kropli 60% glicerolu. Używając mikroskopu preparacyjnego i dwóch par kleszczy, ostrożnie rozwiń osłonę, pozostawiając zaszczepiony środek skierowany do góry. Przytrzymaj osłonkę otwartą kleszczami i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu, aby zapobiec zwijaniu się pochewki i blokowaniu miejsca infekcji. 
	UWAGA: Pochwa liścia jest bardzo delikatna i te czynności należy wykonywać ostrożnie, aby zapobiec uszkodzeniu pochwy.</li>
	<li>Uszczelnij szkiełko nakrywkowe za pomocą lakieru do paznokci do długotrwałego przechowywania lub taśmy do krótkotrwałego przechowywania. Obserwuj szkiełka pod złożonym mikroskopem świetlnym.</li>
	<li>Rób podstawowe zdjęcia za pomocą mikroskopu i telefonu komórkowego. Tutaj zdjęcia zostały zrobione za pomocą uchwytu do telefonu komórkowego i smartfona. W przypadku urządzeń z systemem Android dostosuj aplikację aparatu do następujących ustawień: wyłącz lampę błyskową, wyłącz Top Shot, wyłącz automatyczną regulację jasności i cieni oraz ustaw rozdzielczość zdjęcia na pełną. 
	UWAGA: Korzystanie z aplikacji aparatu w telefonie skraca żywotność baterii szybciej niż zwykle, dlatego zalecane jest korzystanie z zewnętrznego zasilania.</li>
	<li>Po zamontowaniu telefonu komórkowego na mikroskopie zrób zdjęcie mikrometru w skali z obiektywem, który będzie używany do pozyskiwania danych. Dane w tym badaniu zostały pozyskane przy obiektywie powietrznym 40x 0,65 NA, a adapter telefoniczny został zamontowany na 10-krotnym okularze. Dostosuj powiększenie telefonu do 2,5x i utrzymuj je na stałym poziomie, aby utrzymać stały rozmiar piksela.</li>
	<li>W środku osłonki znajduje się największa koncentracja zarodników i infekujących apresorii, dlatego należy dążyć do 9-12 obrazów każdej osłonki, aby uzyskać znaczące liczby do analizy statystycznej. Liczba zarodników i appressorii różni się w zależności od stężenia zastosowanych zarodników.</li>
</ol>
4. Ocena i liczenie obrazów za pomocą ImageJ (FIJI)
<ol>
	<li>Prześlij obrazy do komputera z uruchomionym programem ImageJ (FIJI). Aby otworzyć obrazy, przeciągnij i upuść pliki na pasek ImageJ.</li>
	<li>Ustaw skalę obrazów, wczytując obraz mikrometru stołu montażowego i rysując linię prostą między dwoma oznaczeniami skali. Otwórz okno Ustaw skalę, wpisz znaną odległość dla mierzonej linii, a następnie wpisz jednostkę skali. Na mikrometrze, w tym przykładzie, najmniejsza linia wynosiła 10 μm. Zaznacz pole Ustaw globalne i naciśnij OK. Wszystkie kolejne załadowane obrazy będą miały tę samą skalę.</li>
	<li>Aby policzyć appressoria, zarodniki lub inne obiekty, wybierz narzędzie Punkt. Następnie otwórz Menedżera ROI. Kliknij T na klawiaturze, aby dodać punkty do listy. Te obszary zainteresowania można zapisać w razie potrzeby i ponownie załadować na ten sam obraz.</li>
	<li>W zależności od celów eksperymentu wykonaj dodatkowe pomiary, takie jak długość zarodników, wielkość apresorii i długość rurki zarodkowej.</li>
</ol>

<ol><li>Roy, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+barley+blast+caused+by+Magnaporthe+oryzae+pathotype+Triticum+%28MoT%29+in+Bangladesh%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh.</a> Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).</li>
<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li>
<li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li>
<li>Wilson, R. A., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Under+pressure%3A+investigating+the+biology+of+plant+infection+by+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).</li>
<li>Giraldo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+secretion+systems+facilitate+tissue+invasion+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Nature Communications. 4, 1996(2013).</li>
<li>Islam, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+wheat+blast+in+Bangladesh+was+caused+by+a+SouthAmerican+lineage+of+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae.</a> BMC Biology. 14 (1), 84(2016).</li>
<li>Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLangridge%2C+P+%22The+Barley+Genome.+Compendium+of+Plant+Genomes%22">The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes</a>. , Springer. Cham. 1-10 (2018).</li>
<li>Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+two+strains+of+Magnaporthe+grisea+with+rice%2C+goosegrass%2C+and+weeping+lovegrass%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass.</a> Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).</li>
<li>Gowda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+analysis+of+rice-blast+fungus+Magnaporthe+oryzae+field+isolates+from+southern+India%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Data%22%5BJournal%5D)">Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India.</a> Genomics Data. 5, 284-291 (2015).</li>
<li>Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+reporters+for+functional+analysis+in+rice+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Direct%22%5BJournal%5D)">Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves.</a> Plant Direct. 4 (2), 00188(2020).</li>
<li>Fernandez, J., Wilson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+no+feeding+frenzy%3F+Mechanisms+of+nutrient+acquisition+and+utilization+during+infection+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).</li>
<li>Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Delaware%22">University of Delaware</a>. , Doctoral dissertation (2022).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((al.The+plant+infection+test%3A+Spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675(2018).</li>
<li>Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inoculation+method+of+Magnaporthe+grisea+for+cytological+observation+of+the+infection+process+using+intact+leaf+sheaths+of+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).</li>
<li>Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+surface+attachment+in+spores+of+a+plant+pathogenic+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus.</a> Science. 239 (4837), 288-290 (1988).</li>
<li>Khang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+of+Magnaporthe+oryzae+effectors+into+rice+cells+and+their+subsequent+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement.</a> The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostępnych jest wiele powszechnie stosowanych testów do testowania szczepów M. oryzae, które zapewniają obraz na poziomie makroskopowym zgodnej lub niezgodnej odpowiedzi na infekcję, takie jak szczepienia opryskowe lub kropelkowe, oraz zastosowanie systemów oceny do ilościowego określania wielkości zmian13,14. Innym powszechnym testem na M. oryzae jest testowanie zdolności patogenu do tworzenia wyspecjalizowanej struktury penetracyjnej, apppress...

Magnaporthe oryzae, grzyb wywołujący podmuch ryżu, infekuje różne rodzaje zbóż, w tym jęczmień, pszenicę i ryż1. Patogen ten powoduje wyniszczające choroby i stanowi ogólnoświatowe zagrożenie dla tych cennych upraw, powodując całkowitą utratę plonów, jeśli nie jest kontrolowany. Wiele laboratoriów na całym świecie skupia się na chorobie zarażenia ryżem ze względu na jej globalne zagrożenie i atrybuty jako doskonałego modelu interakcji roślina-grzyby2. Został w pełni zsekwencjonowany, a genetyka jego cyklu infekcyjnego, w szczególności wczesnych wydarzeń, została ustalona3,4. Cykl życiowy rozpoczyna się od wykiełkowania zarodnika na powierzchni liścia, tworząc wyspecjalizowaną strukturę penetracyjną zwaną appressorium. Appressorium wnika w tkankę liścia, a infekcja trwa dalej wraz z rozwojem zmian, które rozpoczynają proces zarodnikowania i rozprzestrzeniają chorobę4. Zapobieżenie któremukolwiek z tych wczesnych zdarzeń drastycznie zahamowałoby tę wyniszczającą chorobę. W związku z tym większość obecnych badań nad chorobą blastyczną koncentruje się na wczesnych etapach infekcji, od kiełkujących konidiów tworzących appressorium do rozwoju inwazyjnych strzępek i biotroficznego kompleksu międzyfazowego (BIC)5.
Przeprowadzono ogromną ilość badań nad chorobą blastyczną ryżu, mimo że M. oryzae jest znaczącym patogenem dla różnych upraw, a nowo wyewoluowane szczepy stają się globalnym zagrożeniem dla pszenicy6. Podczas gdy ryż jest jedną z trzech najważniejszych podstawowych upraw wykorzystywanych do wyżywienia ludności, wraz z pszenicą i kukurydzą, jęczmień jest czwartym zbożem pod względem paszy dla zwierząt gospodarskich i produkcji piwa7. Wraz z rozwojem branży piwa rzemieślniczego rośnie wartość ekonomiczna jęczmienia. Istnieją wyraźne zalety stosowania M. oryzae i jęczmienia jako patosystemu do badania choroby blastycznej. Po pierwsze, istnieją szczepy M. oryzae, które infekują tylko jęczmień, a także szczepy, które mogą infekować wiele gatunków traw. Na przykład 4091-5-8 infekuje przede wszystkim jęczmień, podczas gdy Guy11 i 70-15 mogą infekować zarówno jęczmień, jak i ryż8. Szczepy te są genetycznie podobne, a proces infekcji jest porównywalny9. Po drugie, w standardowych warunkach laboratoryjnych i szklarniowych jęczmień jest łatwiejszy w uprawie, ponieważ nie ma skomplikowanych wymagań ryżu (zwięzła kontrola temperatury, wysoka wilgotność, specyficzne widmo światła). Istnieją również wyzwania związane z obrazowaniem ryżu ze względu na hydrofobowość powierzchni liści, której jęczmień nie wykazuje10.
Ten protokół przedstawia prostą metodę izolowania i efektywnego wykorzystania osłonek liści jęczmienia do mikroskopowej analizy wielu etapów infekcji, przy użyciu zwykłych materiałów laboratoryjnych i smartfona do zbierania danych. Ta metoda oznaczania pochwy liści jęczmienia jest możliwa do dostosowania przez laboratoria na całym świecie, ponieważ wymaga minimalnych zapasów, a mimo to zapewnia jasny obraz mikroskopijnej interakcji między patogenem a kilkoma pierwszymi komórkami, które infekuje. Podczas gdy testy chorobotwórczości, takie jak inokulacja w sprayu lub kropelkach, mogą zapewnić makro obraz zdolności patogenu do tworzenia zmian chorobowych, ten test pozwala badaczowi na wizualizację określonych etapów wczesnej infekcji, od zdarzeń poprzedzających penetrację do kolonizacji komórek naskórka. Co więcej, naukowcy mogą łatwo porównać zakażenie grzybem typu dzikiego z zakażeniem mutantem o zmniejszonej zjadliwości.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Telefon komórkowy&nbsp;</td><td>Google&nbsp;</td><td>Pixel 4A</td><td>Wystarczy dowolny smartfon z tylną kamerą, którą można zamontować w uchwycie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Adapter do mikroskopu do telefonu komórkowego</td><td>Vankey</td><td>B01788LT3S</td><td>https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63& sr=8-2 -spons& psc=1& spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DD0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BMbr/ DD0YmZW5jnlwdGVkQWRJZD1BMbr/ DD0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BMbr/ DD0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BMbr/ DD3MDMxNjhBRFYxQTMzNk9Ebr/ M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BMbr/ DD0YmZW5jnlwdGVkQWR/ qxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>AmScope</td><td>FM690TC</td><td>40x&ndash; 2500x Trójokularowy pionowy mikroskop epi-fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Płatki owsiane staromodne płatki owsiane</td><td>Quaker</td><td>N/A</td><td>https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 & hvadid=312253390021& hvpos= & hvnetw=g& hvrand=98212627704 6839544& hvpone=& hvptwo=& hvq mt=& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9007494& hvtargid =PLA-568492637928& psc=1</td></tr><tr><td>ProMix BX</td><td>ProMix</td><td>1038500RG</td><td></td></tr><tr><td>Prostokątna szklanka nakrywkowa</td><td>Corning</td><td>CLS2975245</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka, mikroskop</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Mikrometr stołowy&nbsp;</td><td>OMAX</td><td>A36CALM7</td><td>0,1 mm i 0,01 mm Szkiełko kalibracyjne do mikroskopu</td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja wczesnych miejsc infekcji choroby ryżu (magnaporthe oryzae) na jęczmieniu (hordeum vulgare) za pomocą podstawowego mikroskopu i smartfona

Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease (Magnaporthe oryzae) on Barley (Hordeum vulgare) Using a Basic Microscope and a Smartphone

Zrozumienie, jak rośliny i patogeny oddziałują na siebie i czy ta interakcja kończy się obroną czy chorobą, jest niezbędne do opracowania silniejszych i bardziej zrównoważonych strategii dla zdrowia roślin. Postępy w metodach, które skuteczniej obrazują próbki patogenów roślinnych podczas infekcji i kolonizacji, zaowocowały narzędziami, takimi jak test pochwy liści ryżu, który okazał się przydatny w monitorowaniu infekcji i wczesnych zdarzeń kolonizacji między ryżem a patogenem grzybowym, Magnaporthe oryzae. Ten hemi-biotroficzny patogen powoduje poważną utratę chorób w ryżu i pokrewnych roślinach jednoliściennych, w tym w prosie, żyto, jęczmieniu, a ostatnio także w pszenicy. Test pochwy liściowej, jeśli zostanie wykonany prawidłowo, daje optycznie czysty przekrój rośliny o grubości kilku warstw, co pozwala naukowcom na wykonanie obrazowania żywych komórek podczas ataku patogenu lub wygenerowanie utrwalonych próbek barwionych pod kątem określonych cech. Szczegółowe badania komórkowe nad interakcją jęczmienia z M. oryzae pozostają w tyle za tymi dotyczącymi gospodarza ryżu, pomimo rosnącego znaczenia tego ziarna jako źródła pożywienia dla zwierząt i ludzi oraz jako napojów fermentowanych. Doniesiono o opracowaniu testu pochwy liścia jęczmienia do skomplikowanych badań interakcji M. oryzae w ciągu pierwszych 48 godzin po inokulacji. Test pochwy liściowej, niezależnie od tego, który gatunek jest badany, jest delikatny; Dostarczony jest protokół, który obejmuje wszystko, od warunków wzrostu jęczmienia i uzyskania pochwy liściowej, po inokulację, inkubację i obrazowanie patogenu na liściach roślin. Protokół ten można zoptymalizować pod kątem wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu czegoś tak prostego, jak smartfon do celów obrazowania.

Schemat początkowego przebiegu prac dla tej techniki przedstawiono na Rysunku 1. Pochwy liści pobrano z 14-dniowych podatnych roślin jęczmienia „Lacey” (H. vulgare). Konidia zebrano z 10-dniowych sporulujących płyt OMA z M. oryzae, a zawiesinę konidialną przygotowano przy użyciu sterylnej ddH2O, aby uzyskać końcowe stężenie 5 x 104 zarodników na mL. Zawiesinę inokulacyjną naniesiono bezpośrednio na pochwy liści, które przymocowano do sterylnych szalek ...

To jest prosty protokół badania pochwy liści jęczmienia przy użyciu minimalnej ilości odczynników i zwykłego sprzętu laboratoryjnego (w tym podstawowego smartfona). Celem jest wizualizacja wczesnego procesu infekcji blastyczną w laboratoriach bez dostępu do zaawansowanego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja wczesnych miejsc infekcji choroby ryżu (Magnaporthe oryzae) na jęczmieniu (Hordeum vulgare) za pomocą podstawowego mikroskopu i smartfona

Understanding how plants and pathogens interact, and whether that interaction culminates in defense or disease, is required to develop stronger and more ...

Nasz protokół jest uproszczoną metodą, która pozwala naukowcom na wizualizację wczesnych etapów infekcji dzikiego typu i genetycznych mutantów grzybów bez użycia drogiego sprzętu. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie podstawowych materiałów laboratoryjnych do udzielania odpowiedzi na złożone pytania biologiczne oraz do szybkiego badania przesiewowego mutantów grzybów w celu dalszej analizy. Trudną częścią tej techniki jest obróbka pochewki.Osłonka to cienka warstwa komórek, którą można łatwo uszkodzić, dlatego ostrożne obchodzenie się z nią jest niezbędne do udanego eksperymentu. Na początek wybierz jęczmień uprawiany do fazy drugiego liścia. I za pomocą sterylnych nożyczek pokrój jęczmień tuż nad linią gleby.Za pomocą kleszczy i skalpela ostrożnie odetnij pochwę pierwszego liścia, który jest otwarty wzdłużnie. I za pomocą kleszczy usuń go z podstawy drugiego liścia. Za pomocą skalpela odetnij większość pierwszego liścia od pochwy, pozostawiając tylko 0,5 cala tkanki liścia do zamontowania.Umieść pierwszy liść płasko na sterylnej 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej mokry ręcznik papierowy, aby utrzymać wilgotność wewnątrz płytki. Przyklej tkankę liścia do dna szalki Petriego. Wybierz dziewięcio- do 12-dniową płytkę hodowlaną Magnaporthe oryzae i dodaj do niej od 0,5 do dwóch mililitrów sterylnej wody.Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, delikatnie zeskrob grzybnię, aby uwolnić przyczepione konidia. Ostrożnie odpipetować zawiesinę konidialną do probówki mikrowirówki zawierającej mały kawałek gazy serowej, aby odfiltrować wszelkie duże kawałki grzybni z zawiesiny konidialnej. W razie potrzeby rozcieńczyć stężenie zarodników sterylną wodą do pięć razy 10 do czwartego zarodnika na mililitr, ponieważ zbyt wysokie stężenie utrudnia obrazowanie poszczególnych miejsc infekcji.W zależności od rozmiaru osłony, ostrożnie odpipetować od 25 do 50 mikrolitrów zawiesiny konidialnej wewnątrz zwiniętej osłonki liściowej. Następnie napełnij cztery lub pięć 500-mililitrowych zlewek podwójnie destylowaną wodą i podgrzewaj, aż zacznie gotować na parze. Przytrzymaj pokrywkę szalki Petriego nad jedną z parujących zlewek, aby zatrzymać wilgoć wewnątrz płytki.Ułóż zainfekowane płytki pochwy liściowej i otocz je pozostałymi gorącymi zlewkami, ponieważ tworzy to wilgotne, wilgotne środowisko do kiełkowania zarodników. Chroń tę konfigurację przed światłem, przykrywając ją solidnym kolorowym gumowym lub plastikowym pudełkiem i pozostawiając w spokoju przez 48 godzin lub żądany punkt czasowy do obrazowania. Przygotuj plamę, mieszając świeżo rozcieńczony 45% kwas octowy i 0,1% błękit trypanowy.Porcję jednego mililitra roztworu barwnika do probówek mikrowirówek. Za pomocą skalpela ostrożnie odetnij osłonę liścia od taśmy. Za pomocą kleszczy umieść osłonę w probówce mikrowirówki i upewnij się, że jest całkowicie zanurzona w roztworze barwnika.Pozostaw probówki na dwie godziny w bloku grzewczym o temperaturze 40 stopni Celsjusza lub łaźni wodnej, aby barwnik wniknął w liść. Następnie ostrożnie opłucz pochwy liści trzy razy w 60% świeżym glicerolu, aby usunąć nadmiar barwnika. Trzymaj osłonę w glicerolu do momentu, gdy będzie gotowa do zamontowania na szkiełkach.Umieść osłonę na czystym szkiełku podstawowym i dodaj kilka kropli 60% glicerolu. Używając mikroskopu preparacyjnego i dwóch par kleszczy, ostrożnie rozwiń osłonę, pozostawiając zaszczepiony środek skierowany do góry. Trzymając osłonę otwartą za pomocą kleszczyków, umieść szkiełko nakrywkowe na górze, aby zapobiec zwijaniu się osłonki i blokowaniu miejsca infekcji.Uszczelnij szkiełko nakrywkowe za pomocą lakieru do paznokci do długotrwałego przechowywania lub taśmy do krótkotrwałego przechowywania. Obserwuj szkiełka pod złożonym mikroskopem świetlnym. Wykonuj podstawowe zdjęcia za pomocą smartfona, montując adapter do telefonu komórkowego do mikroskopu.W przypadku urządzeń z systemem Android dostosuj ustawienia aplikacji aparatu, aby wyłączyć lampę błyskową, wyłączyć zdjęcie z góry, wyłączyć automatyczną regulację jasności i cieni oraz ustawić rozdzielczość zdjęcia na pełną. Po zamontowaniu telefonu komórkowego zrób zdjęcie mikrometru ze skalą z żądanym celem uzyskania danych. Dostosuj powiększenie telefonu do 2,5x i utrzymuj je na stałym poziomie, aby zachować stały rozmiar pikseli.W środku pochewki znajduje się największe skupisko zarodników i infekujących appressorii. Dlatego staraj się uzyskać od dziewięciu do 12 obrazów każdej osłony, aby uzyskać znaczące liczby do analizy statystycznej. Miejsca infekcji osłonki zostały zobrazowane za pomocą smartfona i adaptera mikroskopu do smartfona po zabarwieniu błękitem trypanowym.Ciepło i kwas octowy w procedurze barwienia delikatnie zmiękczają tkankę liścia. Płukanie po barwieniu w 60% glicerolu nie tylko usuwa nadmiar plam, ale także pomaga zmniejszyć rozpraszanie światła spowodowane przez liść i poprawić jakość obrazu. Odchylenia od protokołu barwienia mogą skutkować nieoptymalnymi wynikami, jak pokazano poniżej.Jęczmień zakażony dzikim typem 4091 wytworzył pomyślnie zainfekowane komórki identyfikowane na podstawie obecności zakażonych strzępek w tkance pochwy liścia. W przypadku zmutowanej infekcji J99A zauważono pomyślny rozwój kołków apresorii i penetracji, ale nie wytworzył on inwazyjnych strzępek. Czas jest ważny w przypadku testów opartych na infekcjach.Odpowiednio dojrzałe rośliny i zarodniki grzybów są niezbędne do osiągnięcia sukcesu. W tym badaniu przyjrzeliśmy się obecności lub brakowi struktur infekcyjnych. Dodatkowe eksperymenty mogą odpowiedzieć na pytania dotyczące fenotypu struktury infekcji i inwazyjnych strzępek.Nasza metodologia nie jest nowa, ale jest uproszczoną, dostępną wersją bardziej złożonego i kosztownego eksperymentu.

visualizing-early-infection-sites-rice-blast-disease-magnaporthe

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Źródło: Wen, J., Pasman, et al., Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii oświetlenia strukturalnego do uzyskania trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych, które ujawniają organizację białek kiełkujących w zarodnikach bakterii.

Wizualizacja białek kiełkujących w błonie wewnętrznej zarodników bakterii

Ten film demonstruje technikę wykrywania infekcji chorobotwórczego grzyba Magnaporthe grisea w liściach roślin ryżu. Zawiesinę konidiów grzybowych rozpyla się na odcinki liści ryżu, a postęp choroby ocenia się poprzez ocenę powstawania zmian martwiczych.

Technika inokulacji w sprayu w celu wywołania infekcji grzybiczej w liściach roślin ryżu

Ten film pokazuje zapoczątkowanie infekcji liści ryżu poprzez zranienie szczepionki grzybnią Magnaporthe grisea. Rurka zarodkowa pochodząca z zarodników grzybów przenika do warstwy naskórka, powodując infekcję tkanek i zmiany na liściach. Metoda ta wspomaga badania przesiewowe patotypów i poprawia zrozumienie odporności roślin na hodowlę molekularną.

Ustalenie infekcji liści ryżu poprzez inokulację grzybów poprzez zranienie

Tutaj prezentujemy protokół do testowania zjadliwości roślin z patogenem roślinnym Magnaporthe grisea. Raport ten przyczyni się do zakrojonych na szeroką skalę badań przesiewowych patotypów izolatów grzybów i posłuży jako doskonały punkt wyjścia do zrozumienia mechanizmów oporności roślin podczas hodowli molekularnej.

Test infekcji roślin: inokulacja w sprayu i za pośrednictwem ran patogenem roślinnym Magnaporthe Grisea

Ten protokół pozwala na przygotowanie przekrojów nasion zbóż (np. ryżu) do analizy morfologii bielma i granulek skrobi za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.

Przekroje poprzeczne dojrzałego ryżu (Oryza sativa L.) Ziarna do obrazowania w skaningowej mikroskopii elektronowej z wykorzystaniem końcówek do pipet jako wspomagania immobilizacji

Ta praca opisuje użycie technologii edycji genomu CRISPR-Cas9 do wyeliminowania endogennego genu OsABCG15, a następnie zmodyfikowanego protokołu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium w celu wytworzenia stabilnej męsko-sterylnej linii w ryżu.

Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium, produkcja transgeniczna i jej zastosowanie w badaniach nad rozwojem rozrodczym mężczyzn w ryżu

Obecny protokół opisuje technikę oczyszczania pędów ryżu, które są trudne do przygotowania do wewnętrznych obserwacji strukturalnych ze względu na twardą, grubą lub warstwową naturę tkanek. Metoda ta ułatwia ciągłe i głębokie obserwacje fluorescencyjne, nawet u dorosłych roślin ryżu.

Głęboka obserwacja fluorescencji pędów ryżowych za pomocą technologii oczyszczania

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną metodę obserwacji histologicznej galasów indukowanych przez Plasmodiophora brassicae. Skrawki wibratomu hipokotyli są oczyszczane przed obrazowaniem fluorescencyjnym w celu zbadania udziału czynników transkrypcyjnych i fitohormonów podczas progresji choroby. Protokół ten przezwycięża ograniczenia związane z zatapianiem żywicy, umożliwiając wizualizację białek fluorescencyjnych w plantach.

Połączenie mikroskopii oczyszczającej i fluorescencyjnej w celu wizualizacji zmian w ekspresji genów i reakcjach fizjologicznych na Plasmodiophora brassicae

Tutaj opisujemy metodę wykrywania w czasie rzeczywistym produkcji apoplastycznych reaktywnych form tlenu (ROS) w tkankach ryżu w odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez patogen wywołany wzorcem molekularnym. Ta metoda jest prosta, ustandaryzowana i generuje wysoce powtarzalne wyniki w kontrolowanych warunkach.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym produkcji reaktywnych form tlenu w odpowiedzi immunologicznej ryżu za pomocą testu chemiluminescencyjnego

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół inokulacji, który wykorzystuje oderwane osłonki liści kukurydzy do powtarzalnych badań cytologicznych, fizjologicznych i molekularnych interakcji kukurydzy z patogenami grzybów roślinnych. Pochwy liściowe ułatwiają obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych między żywą rośliną a grzybem w nieutrwalonych tkankach.

Oderwane osłonki kukurydzy do obrazowania żywych komórek zakażenia patogenami grzybów kukurydzy dolistnej

Ten artykuł opisuje protokół generowania inokulum grzybów mikoryzowych (AM) w celu zbadania zwiększonej przez AM tolerancji na stres solny w ryżu.

Produkcja inokulum grzybów mikoryzowych arbuskularnych (AM) i ocena fenotypowa symbiozy ryżu i AM w warunkach zasolenia

Poznaj uproszczoną metodę wizualizacji wczesnych etapów infekcji Magnaporthe oryzae na jęczmieniu przy użyciu podstawowego mikroskopu i smartfona. Ta technika umożliwia badanie dzikich szczepów oraz mutantów grzybowych bez kosztownego sprzętu.

Wizualizacja wczesnych miejsc infekcji choroby ryżu (Magnaporthe oryzae) na jęczmieniu (Hordeum vulgare) za pomocą podstawowego mikroskopu i smartfona (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja wczesnych miejsc infekcji choroby ryżu (Magnaporthe oryzae) na jęczmieniu (Hordeum vulgare) za pomocą podstawowego mikroskopu i smartfona

Przeglądaj więcej filmów