Name: Zależny od napięcia zapis prądu potasu na kardiomiocytach H9C2 za pomocą techniki Whole-Cell Patch-Clamp (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj technikę całokomórkowej zaciski patch-clamp do rejestracji prądów kanałów potasu w kardiomiocytach H9C2. Metoda umożliwia badanie mechanizmów kardiotoksyczności leków z perspektywy kanałów jonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy wsparcie finansowe od Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82130113) oraz Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy i Transformacyjny Departamentu Nauki i Technologii Prowincji Qinghai (2020-SF-C33).

Komercyjnie uzyskane kardiomiocyty szczurów H9c2 (patrz Tabela Materiałów) były inkubowane w DMEM zawierającym 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w 5% wilgotnościowej atmosferzeCO2. Następnie zastosowano technikę patch-clamp całokomórkowych do wykrycia zmian w IKv w normalnych komórkach H9c2 i komórkach traktowanych 4-AP lub AC (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2).
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych DMEM zawierającą 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotować 1,5 M roztwór 4-AP, dodając 14,1165 mg 4-AP do 100 μl roztworu DMSO (patrz tabela materiałów). Rozcieńczyć 1,5 M 4-AP do 1,5 mM, dodając roztwór zewnątrzkomórkowy (krok 1.5).</li>
	<li>Przygotować 400 mM AC, dodając 5 mg AC do 19,36 μl roztworu DMSO (patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Wszystkie powyższe roztwory były przechowywane w lodówce o temperaturze 4 °C, a końcowe stężenie DMSO nie może przekraczać 0,1% (v/v).</li>
	<li>Przygotować 50 ml roztworu wewnątrzkomórkowego, dodając 0,4100 g KCl (110,0 mM), 0,0120 g MgCl2 (1,2 mM), 0,1270 g Na2 ATP (5,0 mM), 0,1190 g HEPES (10,0 mM) i 0,1900 g EGTA (10,0 mM) do 50 ml podwójnie destylowanej wody (patrz Tabela 1 i Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Wartość pH roztworu wewnątrzkomórkowego dostosowano do 7,2 przy użyciu 1 M KOH i podzielono na małe objętości (1,5-2 ml) i przechowywano w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml roztworu zewnątrzkomórkowego, dodając 0,0185 g KCl (5,0 mM), 0,3945 g NaCl (135,0 mM), 0,0203 g MgCl2·6H2O (2,0 mM), 0,0595 g HEPES (5,0 mM) i 0,0990 g D-glukozy (10,0 mM) do 50 ml podwójnie destylowanej wody (patrz Tabela 1 i Tabela materiałów). 
	UWAGA: Roztwór zewnątrzkomórkowy należy przygotować do natychmiastowego użycia, a jego wartość pH należy dostosować do 7,4 za pomocą 1 M NaOH.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Gdy naczynie hodowlane H9c2 stanie się w 80% zlewne, traw komórki 0,25% trypsyny przez 30 sekund.</li>
	<li>Hodowla 2 x 105 komórek/ml z normalną pożywką lub pożywką zawierającą lek (25 μM, 50 μM, 100 μM i 200 μM AC) w naczyniu o średnicy 35 mm wyłożonym szklanymi płytkami przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 i wilgotności względnej 70% do 80% (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
3. Produkcja mikropipet
<ol>
	<li>Włącz ściągacz do mikropipet (patrz Tabela materiałów) i podgrzewaj przez 30 minut.</li>
	<li>Umieść kapilarnę ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm, 10 cm długości) na ściągaczu do mikropipet. Wybierz program ustawiony w kroku 3.3 i kliknij Enter na panelu sterowania. Kliknij program Ramp w prawym górnym rogu, aby określić wartość "Ciepła" szklanej kapilary.</li>
	<li>Napisz program do ciągnięcia elektrody zgodnie z wartością określoną w teście "Rampa" i wykonaj następujące czynności: wartość "Ciepło" = wartość "Rama", Ciągnięcie = 0, Vel = prędkość ruchu pręta ciągnącego, Czas = 200-250. Kliknij przycisk Pull, aby rozpocząć produkcję pipet. 
	UWAGA: Przed użyciem należy zwrócić uwagę na kolor środków osuszających w szczelnie zamkniętym pojemniku ściągacza do mikropipet. Jeśli kolor zmieni się z niebieskiego na różowy, środki osuszające należy wymienić. Aby zapobiec zanieczyszczeniu końcówki elektrody, staraj się nie dotykać środkowej części szklanej kapilary podczas przygotowywania pipet. Następnie ostrożnie wyjmij wyprodukowane pipety i umieść je w zamkniętym i szczelnym pojemniku.</li>
</ol>
4. Konfiguracja instrumentu
<ol>
	<li>Włącz odpowiednie instrumenty w następującej kolejności: przetwornik cyfrowo-analogowy, wzmacniacz sygnału, mikromanipulator, mikroskop i kamerę (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Otwórz kolejno aplikację do obrazowania, oprogramowanie wzmacniacza sygnału i oprogramowanie do akwizycji danych (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Przyrząd musi być włączany sekwencyjnie; w przeciwnym razie po otwarciu oprogramowania pojawi się stan "Demo Digitizer".</li>
</ol>
5. Ustawienie parametru IKv
<ol>
	<li>Edytuj protokół nagrywania IKv, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Kliknij Edytuj i wybierz Edytuj protokół w oprogramowaniu do akwizycji danych (patrz Spis materiałów).</li>
		<li>Edytuj program w interfejsie "Przebieg": Epoka A (Pierwszy poziom = −60 mV, poziom Delta = 0 mV, Pierwszy czas trwania = 20 ms i Czas trwania Delta = 0 ms); Epoka B (Pierwszy poziom = −40 mV, poziom Delta = 10 mV, Pierwszy czas trwania = 150 ms i czas trwania Delta = 0 ms) oraz Epoka C (Pierwszy poziom = −60 mV, poziom Delta = 0 mV, Pierwszy czas trwania = 30 ms i czas trwania Delta = 0 ms).</li>
		<li>Następnie kliknij interfejs Mode/Rate i ustaw dane "Trial Hierarchy": Opóźnienie próby = 0 s, Przebiegi = 1, Przemiatanie = 11 i Czas trwania przemiatania = 0,22 s22,23. 
		UWAGA: Prądy kanału IKv należy uzyskać, stosując kroki depolaryzacji 150 ms od -40 mV do +60 mV z przyrostem 10 mV przy potencjale podtrzymania -60 mV w warunkach kontrolnych. Całkowity czas protokołu musi być większy niż czas ustawiony w programie "Waveform".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Edytuj program odejmowania nieszczelności P/N: kliknij Edytuj protokół, aby wybrać przycisk Stimulus i ustaw program odejmowania nieszczelności w oknie dialogowym P/N Leak Subtraction: liczba Subsweeps = 2-8 (4 w tym badaniu), Czas ustalania = 100-1,000 ms (200 w tym badaniu), "Polaryzacja" = "Przeciwnie do kształtu fali", poziom podtrzymania = −80 mV. 
UWAGA: Odejmowanie nieszczelności P/N musi mieć poziom zatrzymania niższy niż "Pierwsze trzymanie" (−60 mV).</li>
</ol>
6. Zapis całego ogniwa krosowego I Kv w trybie zacisku napięciowego
<ol>
	<li>Ustal ścieżkę przechowywania danych: kliknij Plik i wybierz Ustaw nazwy plików danych w oprogramowaniu do akwizycji danych. Otwórz ustalony protokół IKv (krok 5.1), wybierając Edytuj i klikając Otwórz protokół w oprogramowaniu do akwizycji danych. Na koniec kliknij opcję Narzędzia i wybierz Test membranowy, aby rozpocząć uruchamianie protokołu.</li>
	<li>Dodać roztwór zewnątrzkomórkowy (krok 1.5) do kąpieli komórkowej na aparacie do krosowania całych komórek (patrz tabela materiałów) i umieścić szkiełko nakrywkowe w górę z komórkami H9c2 (hodowanymi w kroku 2.1) w kąpieli.</li>
	<li>Napełnij 30% pipety (wytworzonej w kroku 3) roztworem zewnątrzkomórkowym i zainstaluj ją na uchwycie elektrody rejestrującej zintegrowanej z aparatem do zacisku krosowego. Dokręć pipetę za pomocą gumowej uszczelki o-ring i plastikowej podkładki. Następnie wrzuć pipetę do kąpieli z mikromanipulatorem. Kliknij interfejs przesunięcia pipet w oprogramowaniu wzmacniacza sygnału (patrz tabela materiałów), aby utrzymać linię bazową prądu IKv na poziomie 0 pA. 
	UWAGA: Roztwór wewnątrzkomórkowy (krok 1.4) musi stykać się z częścią AgCl/Ag srebrnego drutu, a srebrny drut nie może znajdować się blisko wewnętrznej ścianki pipety. Rezystancja pipety musi wynosić 2-6 MΩ. Aby uniknąć niedrożności końcówki pipety, do pipety należy dostarczać ciągłe nadciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 1,0 ml połączonej z uchwytem elektrody rejestrującej za pomocą plastikowej rurki Rurka 24.</li>
	<li>Dostarczyć odpowiednie nadciśnienie ręcznie za pomocą strzykawki o pojemności 1,0 ml podłączonej do uchwytu elektrody rejestrującej za pomocą plastikowej rurki. Lekko przesuń pipetę, manipulując mikromanipulatorem w trzech wymiarach, aby zetknąć się z celą.</li>
	<li>Gdy fala prostokątna testu membranowego spadnie o 1/3 do 1/2 po dotknięciu błony komórkowej pipetą, usuń nadciśnienie i ręcznie dostarcz odpowiednie podciśnienie. Następnie kliknij interfejs Patch w oprogramowaniu do akwizycji danych, aby utworzyć pieczęć GΩ. Użyj oprogramowania wzmacniacza sygnału "Cp Fast" i "Cp Slow" podczas uszczelniania ogniw, aby skompensować szybką i wolną pojemność. 
	UWAGA: Gdy test membranowy wynosi ≥1 GΩ, między końcówką pipety a kuwetą tworzy się konfiguracja podłączona do ogniwa.</li>
	<li>Zastosuj krótkie impulsy podciśnienia, aby rozerwać fragment błony komórkowej. 
	UWAGA: Gwałtowne zmniejszenie oporności błony charakteryzuje udany wzorzec zapisu całej komórki. Jeśli rezystancja dostępu(Ra) ≥30 MΩ, ogniwa należy ponownie wybrać dla kroków 6.3-6.6. Aby zapewnić dokładność zarejestrowanych danych IKv, podciśnienie musi zostać usunięte po zerwaniu błony komórkowej.</li>
	<li>Wykonaj kompensację pojemności błony całej komórki, klikając przycisk Cała komórka w oprogramowaniu wzmacniacza sygnału. Na koniec zapisz i zapisz dane, klikając przycisk Rejestrowanie danych.</li>
	<li>Otwórz zapisane dane IKv za pomocą oprogramowania do analizy danych. Zapisz zależności prąd-napięcie (I−V): kliknij Analizuj, aby wybrać Statystyki, aby wykonać następujące czynności: wybierz Zakres jako Kousory 1,2 do analizy danych; kliknij przyciski Amplituda szczytowa i Średnia, a następnie kliknij OK, aby wyświetlić dane na stronie Wyniki. Na koniec skopiuj kolumnę danych średnich IKv do oprogramowania do rysowania funkcji (patrz tabela materiałów) w celu dalszej analizy.</li>
	<li>Zapisz reprezentatywne ślady bieżące IKv: kliknij Edytuj, aby wybrać Przenieś ślady; następnie wybierz Pełny ślad w Regionie do przesłania; następnie kliknij Wybierz w Zaznaczeniu śledzenia i wybierz IN 0 (pA) w Sygnały; na koniec kliknij OK , aby wyświetlić dane na stronie "Wyniki" i skopiować łączne dane do oprogramowania do rysowania funkcji, aby narysować bieżące ślady.</li>
	<li>Zapisz protokół IKv: kliknij Edytuj, aby wybrać Utwórz sygnał fali bodźca, a następnie wybierz OK. Następnie powtórz krok 6.9 z wyjątkiem wybrania A0 # 0 (mA) w "Sygnały".</li>
</ol>

<ol><li>Luan, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+transport+and+ion+channels+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Scientiarum+Naturalium+Universitatis+Intramongoljcae%22%5BJournal%5D)">Passive transport and ion channels in biofilms.</a> Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).</li>
<li>Lei, M., Sun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+mechanism+of+arrhythmia+induced+by+sodium+channel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease.</a> Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).</li>
<li>Varró, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+transmembrane+ion+channels+and+action+potentials%3A+Cellular+physiology+and+arrhythmogenic+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior.</a> Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).</li>
<li>Campuzano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+autopsy+and+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Negative autopsy and sudden cardiac death.</a> International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).</li>
<li>Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sodium+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflu%CC%88gers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac sodium channelopathies.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).</li>
<li>Benitah, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+gated+Ca2%2B+currents+in+the+human+pathophysiologic+heart%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review.</a> Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).</li>
<li>Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+dissection+of+multiple+ionic+currents+in+single+cardiac+myocytes+under+action+potential-clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).</li>
<li>Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+functional+myocardial+potassium+channel+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+Electrophysiology+Clinics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity.</a> Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).</li>
<li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li>
<li>Olson, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv1.5+channelopathy+due+to+KCNA5+loss-of-function+mutation+causes+human+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation.</a> Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).</li>
<li>Christophersen, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+KCNA5%3A+impact+on+the+atrial-specific+potassium+current+IKur+in+patients+with+lone+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation.</a> European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).</li>
<li>Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+knockout+of+the+transient+outward+current%2C+long-QT+syndrome%2C+and+cardiac+remodeling+in+mice+expressing+a+dominant-negative+Kv4+alpha+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit.</a> Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).</li>
<li>Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+ancillary+subunits+on+ventricular+repolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electrocardiology%22%5BJournal%5D)">Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization.</a> Journal of Electrocardiology. 40, 6 Suppl 42-46 (2007).</li>
<li>Jia, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+studies+on+the+application+of+patch-clamp+technique+in+cellular+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Engineering+of+Chinese+Universities%22%5BJournal%5D)">Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology.</a> Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).</li>
<li>Leuthardt, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+electrocorticographic+speech+network+to+control+a+brain-computer+interface+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans.</a> Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).</li>
<li>Tian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+applying+progress+of+patch-clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Jilin+Medical+University%22%5BJournal%5D)">The applying progress of patch-clamp technique.</a> Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).</li>
<li>Wang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+shensong+yangxin+capsule+on+c-type+Kv1.4+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel.</a> Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).</li>
<li>Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+resveratrol+on+Kv2.1+potassium+channels+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Cardiac+Pacing+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes.</a> Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neferine+on+Kv4.3+channels+expressed+in+HEK293+cells+and+ex+vivo+electrophysiology+of+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aconitine%3A+A+review+of+its+pharmacokinetics%2C+pharmacology%2C+toxicology+and+detoxification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification.</a> Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270(2022).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+efficacy+and+toxicity+of+aconitine%3A+A+new+frontier+for+the+ancient+poison%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison.</a> Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).</li>
<li>An, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+tegaserod%2C+a+gastrokinetic+agent%2C+on+voltage-gated+K%2B+channels+in+rabbit+coronary+arterial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells.</a> Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).</li>
<li>Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+Kv2.1+by+BACE1+decreases+potassium+current+and+reduces+neuronal+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis.</a> Neurochemistry International. 155, 105310(2022).</li>
<li>Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+and+multi-electrode+array+electrophysiological+analysis+in+acute+mouse+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100442(2021).</li>
<li>Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+pressure-clamped+patch-clamp+recording+at+the+node+of+Ranvier+of+rat+myelinated+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100266(2021).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li>
<li>Yoshimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+vivo+patch-clamp+technique+to+pharmacological+analysis+of+synaptic+transmission+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon+Yakurigaku+Zasshi.+Folia+Pharmacologica+Japonica%22%5BJournal%5D)">Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS.</a> Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).</li>
<li>Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+and+perforated+patch-clamp+recordings+from+acutely-isolated+murine+sinoatrial+node+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells.</a> Bio-protocol. 10 (1), 3478(2020).</li>
<li>Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+problems+with+in+vitro+screening+of+drugs+for+QT+interval+prolongation+using+HERG+K%2B+channels+expressed+in+mammalian+cell+lines+and+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).</li>
<li>Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+whole-cell+patch-clamp+configuration+on+the+pharmacological+assessment+of+the+hERG+channel%3A+Trazodone+as+a+case+example%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).</li>
<li>Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+in+vivo+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Remedies+%26+Clinics%22%5BJournal%5D)">The development of in vivo patch clamp technique.</a> Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).</li>
<li>Lin, Y. F., Ouyang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+and+application+of+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Strait+Pharmaceutical+Journal%22%5BJournal%5D)">Research progress and application of patch clamp technique.</a> Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+current+advances+on+pharmacology%2C+pharmacokinetics%2C+toxicity+and+detoxification+of+aconitine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115(2022).</li>
<li>Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chinese+herbal+medicines+revisited%3A+A+Hong+Kong+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective.</a> Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).</li>
<li>Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+meta-analysis+based+on+the+preclinical+evidence+of+mechanism+of+aconitine-induced+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 900842(2022).</li>
<li>Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Shenyang+Pharmaceutical+University%22">Shenyang Pharmaceutical University</a>. , Shenyang, China. Master's thesis (2007).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aconitine+blocks+HERG+and+Kv1.5+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels.</a> Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).</li>
<li>Campbell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+kinetics+and+selectivity+of+sodium+channels+in+frog+skeletal+muscle+fibers+treated+with+aconitine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine.</a> The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).</li>
<li>Huang, X. Y., Ying, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+specific+protein+1+on+Kv2.1+potassium+channel+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electrocardiology+and+Circulation%22%5BJournal%5D)">The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes.</a> Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).</li>
<li>Cao, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Yuncheng+University%22%5BJournal%5D)">Development and application of patch clamp technique.</a> Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Technika elektrofizjologiczna patch-clamp jest stosowana głównie do rejestrowania i odzwierciedlania aktywności elektrycznej i cech funkcjonalnych kanałów jonowych na błonie komórkowej25. Obecnie główne metody nagrywania w technice patch-clamp obejmują zapis jednokanałowy i zapis całej komórki26. W trybie całokomórkowym szklana mikroelektroda i podciśnienie są używane do tworzenia uszczelnienia o wysokiej rezystancji między małym obszarem błony komórkowej a końcówką pipety<...

Kanały jonowe to specjalne zintegrowane białka osadzone w dwuwarstwie lipidowej błony komórkowej. W obecności aktywatorów, centra takich specjalnych zintegrowanych białek tworzą wysoce selektywne pory hydrofilowe, umożliwiając przejście jonów o odpowiedniej wielkości i ładunku w sposób transportu pasywnego1. Kanały jonowe są podstawą pobudliwości komórek i bioelektryczności oraz odgrywają kluczową rolę w różnych aktywnościach komórkowych2. Serce dostarcza krew do innych narządów poprzez regularne skurcze wynikające z procesu sprzężonego z pobudzeniem, skurczem zainicjowanego przez potencjały czynnościowe3. Wcześniejsze badania potwierdziły, że generowanie potencjałów czynnościowych w kardiomiocytach jest spowodowane zmianą wewnątrzkomórkowego stężenia jonów, a aktywacja i inaktywacja kanałów jonowych Na+, Ca2+ i K+ w ludzkich kardiomiocytach prowadzi do powstania potencjałów czynnościowych w określonej sekwencji4,5,6. Zaburzone prądy kanału potasowego (Kv) bramkowane napięciem (IKv) mogą zmieniać normalny rytm serca, prowadząc do arytmii, która jest jedną z głównych przyczyn zgonów. Dlatego rejestracja IKv ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów leków stosowanych w leczeniu zagrażających życiu zaburzeń rytmu serca7.
Kanał Kv jest ważnym składnikiem kanału potasowego. Funkcja koordynacyjna kanału Kv odgrywa ważną rolę w aktywności elektrycznej i kurczliwości mięśnia sercowego u ssaków8,9,10. W kardiomiocytach amplituda i czas trwania potencjałów czynnościowych zależą od współprzewodzenia zewnętrznych prądów K+ przez wiele podtypów kanału Kv11. Regulacja funkcji kanału Kv jest bardzo ważna dla prawidłowej repolaryzacji potencjału czynnościowego serca. Nawet najmniejsza zmiana przewodnictwa Kv ma duży wpływ na repolaryzację serca i zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia arytmii12,13.
Stanowiąc fundamentalną metodę w badaniach elektrofizjologicznych komórek, można uzyskać uszczelnienie o wysokiej wytrzymałości między małym obszarem błony komórkowej a końcówką pipety do rejestracji zacisku krosowego całej komórki poprzez zastosowanie podciśnienia. Ciągłe podciśnienie sprawia, że błona komórkowa styka się z końcówką pipety i przykleja się do wewnętrznej ścianki pipety. Powstały w ten sposób kompletny obwód elektryczny pozwala na rejestrację dowolnego pojedynczego prądu kanału jonowego na powierzchni błony komórkowej14. Technika ta ma bardzo wysoką czułość na prąd kanału jonowego błony komórkowej i może być używana do wykrywania prądów we wszystkich kanałach jonowych, a zastosowania są niezwykle szerokie15. Co więcej, w porównaniu z etykietowaniem fluorescencyjnym i radioaktywnym, patch-clamp ma wyższy autorytet i dokładność16. Obecnie technika patch-clamp całokomórkowych jest używana do wykrywania składników tradycyjnej medycyny chińskiej działających na prądy kanału Kv17,18,19. Na przykład Wang i in. zastosowali technikę patch-clamp dla całych komórek i potwierdzili, że efektywny składnik nasion lotosu może osiągnąć hamowanie kanału Kv4.3 poprzez blokowanie aktywowanych kanałów stanu19. Tojad (AC) jest jednym ze skutecznych i aktywnych składników gatunków tojadu, takich jak tojad carmichaeli Debx i tojad wahadłowy Busch. Liczne badania wykazały, że przedawkowanie AC może powodować zaburzenia rytmu serca, a nawet zatrzymanie akcji serca20. Interakcja między kanałami jonowymi bramkowanymi napięciem AC i napięciem prowadzi do zakłócenia wewnątrzkomórkowej homeostazy jonów, która jest kluczowym mechanizmem kardiotoksyczności21. Dlatego w tym badaniu stosuje się technikę całokomórkowego patch-clamp w celu określenia wpływu AC na IKv kardiomiocytów.

<table><tbody><tr><td>4-aminopirydyna</td><td>Sigma</td><td>MKCJ2184</td><td></td></tr><tr><td>tojad</td><td>Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd</td><td>DSTDW000602</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Axon Instrument</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Sartorius</td><td>124S-CW</td><td></td></tr><tr><td>ATP Na2</td><td>Solarbio</td><td>416O022</td><td></td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe z żarnikiem (średnica zewnętrzna: 1,5 mm, średnica wewnętrzna: 1,10 mm, długość 10 cm)&nbsp;</td><td>Instrument Sutter</td><td>163225-5</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych (100 mm)</td><td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>1192022</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych (35 mm)</td><td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>3012022</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Clampex</td><td>Molecular Devices, LLC.</td><td>Wersja 10. 5</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Clampfit</td><td>Molecular Devices, LLC.</td><td>Wersja 10. 6. 0. 13</td><td>oprogramowanie do pozyskiwania danych</td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>Rhawn</td><td>RH289133</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Axon Instrument</td><td>Axon digidata 1550B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany nośnik orła Dulbecco (1x)</td><td>Gibco</td><td>8121587</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Biofroxx</td><td>EZ6789D115</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>2166090RP</td><td></td></tr><tr><td>Płonący/brązowy ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>Model P-1000</td><td></td></tr><tr><td>H9c2 komórki</td><td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td><td>CL0111</td><td></td></tr><tr><td>HCImageLive</td><td>Hamamatsu</td><td>4.5.0.0</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>2106081</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd</td><td>20210221</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2020082501</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2020112601</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute</td><td>20160408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2021020101</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe mikroskopu (20 & razy; 20 mm)</td><td>Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co., Ltd</td><td>80340-0630</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd</td><td>Sterownik Milli-Q IQ 7005</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>Oprogramowanie wzmacniacza sygnału Axon Instrument</td><td>MultiClamp commander 2.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie OriginPro 8</td><td>OriginLab Corporation</td><td>v8.0724(B724)</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (100x)</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>17C18B16</td><td></td></tr><tr><td>PH&nbsp; metr&nbsp;</td><td>METTLER Toledo</td><td>S201K</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (1x)</td><td>Gibco</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0,25% (1x)</td><td>HyClone</td><td>J210045</td><td></td></tr></tbody></table>

zależny od napięcia zapis prądu potasu na kardiomiocytach h9c2 za pomocą techniki whole-cell patch-clamp

Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique

Kanały potasowe na błonie komórkowej mięśnia sercowego odgrywają ważną rolę w regulacji aktywności elektrofizjologicznej komórki. Będąc jednym z głównych kanałów jonowych, kanały potasowe bramkowane napięciem (Kv) są ściśle związane z niektórymi poważnymi chorobami serca, takimi jak uszkodzenie mięśnia sercowego wywołane lekami i zawał mięśnia sercowego. W niniejszym badaniu zastosowano technikę patch-clamp całokomórkowych w celu określenia wpływu 1,5 mM 4-aminoopirydyny (4-AP, inhibitor kanału potasowego o szerokim spektrum działania) i akonityny (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM i 200 μM) na prąd kanału Kv (IKv) w kardiomiocytach H9c2. Stwierdzono, że 4-AP hamował IKv o około 54%, podczas gdy hamujący wpływ AC na IKv wykazywał tendencję zależną od dawki (brak wpływu dla 25 μM, 30% wskaźnik hamujący dla 50 μM, 46% wskaźnik hamujący dla 100 μM i 54% wskaźnik hamujący dla 200 μM). Ze względu na charakterystykę większej czułości i precyzji, technika ta będzie sprzyjać badaniu kardiotoksyczności i farmakologicznych efektów etnomedycyny ukierunkowanej na kanały jonowe.

Protokół ten umożliwił rejestrację prądu IKv zgodnie z parametrami ustalonymi dla techniki patch-clamp w konfiguracji whole-cell. Prąd IKv był wywoływany 150 ms impulsem depolaryzującym od −40 do +60 mV przy potencjale spoczynkowym −60 mV (Rysunek 3A). Prąd IKv kardiomiocytów szczura H9c2 pojawiał się najpierw około −20 mV, a następnie jego amplituda wzrastała wraz z dalszą depolaryzacją. Średnią zależność między IKv a potencjałem błonowym obliczon...

Obecny protokół opisuje efektywną metodę dynamicznego pozyskiwania prądów kanału potasowego (Kv) w czasie rzeczywistym w kardiomiocytach H9c2 za pomocą techniki patch-clamp dla całych komórek.

Zależny od napięcia zapis prądu potasu na kardiomiocytach H9C2 za pomocą techniki Whole-Cell Patch-Clamp

Potassium channels on the myocardial cell membrane play an important role in the regulation of cell electrophysiological activities. Being one of the main ...

Protokół ten z powodzeniem rejestruje wpływ akonityny na IKv komórek H9C2. Promowanie nowych etapów badania mechanizmu kardiotoksyczności leków z perspektywy kanałów jonowych. Technika patch-clamp dla całych komórek jest złotym standardem badań kanałów jonowych o wysokiej czułości, wysokiej precyzji i wysokiej specyficzności.Technika klamry krosowej dla całych komórek może być wykorzystana do zbadania farmakologicznych lub toksycznych mechanizmów łączenia ze sobą określonych kanałów jonowych w chorobach wieloukładowych, takich jak układ sercowo-naczyniowy i układ nerwowy. Na początek trawić komórki z 0,25% trypsyną przez 30 sekund, gdy szalka hodowlana H9C2 stanie się w 80% zlewna. Hodowla 2 razy 10 do 5 komórek na mililitr z normalną pożywką lub pożywką zawierającą lek w 35-milimetrowym naczyniu wyłożonym szklanymi płytkami przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w atmosferze 5% dwutlenku węgla i wilgotności względnej 70 do 80%.Włącz ściągacz do mikropipet i podgrzewaj przez 30 minut. Następnie umieść kapilę ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem na ściągaczu do mikropipet. Wybierz program i kliknij enter na panelu sterowania.Kliknij program rampy w prawym górnym rogu, aby określić wartość cieplną szklanej kapilary. Napisz program do wyciągania elektrody zgodnie z wartością określoną przez test rampy i kliknij ciągnij, aby rozpocząć wytwarzanie pipet. Włącz cyfrowy przetwornik analogowy, wzmacniacz sygnału, mikromanipulator, mikroskop i kamerę.Otwórz kolejno aplikację do obrazowania, oprogramowanie wzmacniacza sygnału i oprogramowanie do akwizycji danych. Kliknij na acquire (Pobieraj) i wybierz opcję edit protocol (edytuj protokół) w oprogramowaniu do akwizycji danych. Edytuj program w interfejsie przebiegu.Wprowadź wartości dla pierwszego poziomu, poziomu delta, pierwszego czasu trwania i czasu trwania delta dla epoki A, epoki B i epoki C. Następnie kliknij interfejs szybkości trybu i ustaw dane hierarchii próbnej. Następnie kliknij edytuj protokół, aby wybrać przycisk bodźca i ustaw program odejmowania wycieku w oknie dialogowym Odejmowanie wycieku PM. Aby ustalić ścieżkę przechowywania danych, kliknij plik i wybierz ustaw nazwy plików danych w oprogramowaniu do akwizycji danych.Następnie otwórz ustalony protokół lKv, wybierając opcję Pobieranie i klikając Otwórz protokół w oprogramowaniu do akwizycji danych. Na koniec kliknij opcję narzędzi i wybierz test membranowy, aby rozpocząć uruchamianie protokołu. Dodać roztwór zewnątrzkomórkowy do kąpieli komórkowej na aparacie do klamry krosowej dla całych komórek i umieścić szkiełko przykrywkowe do góry z komórkami H9C2 w kąpieli.Napełnij 30% pipety roztworem zewnątrzkomórkowym i zainstaluj go na uchwycie elektrody rejestrującej zintegrowanym z aparatem do zaciskania krosowego. Dokręcić pipetę z uchwytem elektrody rejestrującej. Następnie wrzuć pipetę do kąpieli z mikromanipulatorem.Kliknij interfejs przesunięcia pipet w oprogramowaniu wzmacniacza sygnału, aby utrzymać linię bazową prądu lKv na poziomie zero pikoamperów. Dostarczyć odpowiednie nadciśnienie ręcznie za pomocą strzykawki o pojemności 1,0 mililitra, podłączonej do uchwytu elektrody rejestrującej, przez plastikową rurkę. Lekko przesuń pipetę, manipulując mikromanipulatorem w trzech wymiarach, aby zetknąć się z celą.Gdy test membranowy przeprowadzi testy, fala prostokątna spadnie o jedną trzecią do połowy po tym, jak pipeta dotknie błony komórkowej, usuń nadciśnienie i ręcznie dostarcz odpowiednie podciśnienie. Następnie kliknij interfejs łatki oprogramowania do akwizycji danych, aby utworzyć gigaseal. Użyj oprogramowania do szybkiej kompensacji pojemności i wzmacniacza wolnego sygnału kompensacji pojemności podczas sufitu ogniwa, aby skompensować szybką i wolną pojemność.Zastosuj krótkie impulsy podciśnienia, aby rozerwać fragment błony komórkowej. Wykonaj kompensację pojemności błony całej komórki, klikając przycisk całej komórki w oprogramowaniu wzmacniacza sygnału. Na koniec zapisz i zapisz dane, klikając przycisk nagrywania danych.Otwórz zapisane dane lKv za pomocą oprogramowania do analizy danych. Zapisz aktualne zależności napięcia. Kliknij Analizuj, aby wybrać statystyki.Wybierz zakres jako Kursory 1 2 do analizy danych, kliknij przyciski amplitudy piku i średniej, a następnie kliknij OK, aby wyświetlić dane na stronie wyników. Na koniec skopiuj kolumnę danych średnich lKv do oprogramowania do rysowania funkcji w celu dalszej analizy. Zapisz reprezentatywne ślady prądu lKv.Kliknij edytuj, aby wybrać ślady transferu, a następnie wybierz pełny ślad w regionie do przeniesienia. Następnie kliknij wybierz w zaznaczeniu śladu i wybierz IN 0 w sygnałach. Na koniec kliknij OK, aby wyświetlić dane na stronie wyników i skopiować całkowite dane do oprogramowania do rysowania funkcji, aby narysować bieżące ślady.Zapisz protokół lKv. Kliknij edytuj, aby wybrać utwórz sygnał fali bodźcowej i wybierz w porządku. Następnie powtórz krok, aby narysować bieżące ścieżki bez wybierania sygnału.lKv zostało wyzwolone przez 150 milisekund depolaryzującego bodźca impulsowego od minus 40 do plus 60 miliwoltów przy potencjale podtrzymania minus 60 miliwoltów. lKv kardiomiocytów szczura H9C2 najpierw pojawiło się około minus 20 miliwoltów, a następnie amplituda wzrosła wraz z dalszą depolaryzacją. W porównaniu z grupą kontrolną, amplituda lKv była zauważalnie zmniejszona po pięciu minutach leczenia 1,5 milimolowym 4-AP.Dodatkowo, lKv znacznie zmniejszyło się przy potencjałach błonowych od 10 do 60 miliwoltów w sposób zależny od dawki, po 24-godzinnym leczeniu prądem przemiennym. Pojedyncza komórka po zarejestrowaniu kanału jonowego może być wykorzystana do dalszej oceny omiki pojedynczej komórki, takiej jak genomika pojedynczej komórki, transkryptomika, proteomika i metabolomika.

voltage-dependent-potassium-current-recording-on-h9c2-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Pomiary aktywności kanałów potasowych Kv7 (KCNQ) w izolowanych miocytach tętniczych (przy użyciu technik elektrofizjologicznych patch clamp) równolegle z pomiarami odpowiedzi skurczowych/rozkurczowych (przy użyciu myografii ciśnieniowej) mogą dostarczyć istotnych informacji na temat roli kanałów Kv7 w fizjologii i farmakologii mięśni gładkich naczyń krwionośnych.

Badanie funkcji kanałów potasowych Kv7 w mięśniach gładkich tętnic z wykorzystaniem elektrofizjologii patch-clamp i myografii ciśnieniowej

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Dysfunkcja kanału Kv jest związana z zaburzeniami rytmu serca. W celu zbadania mechanizmów molekularnych, które prowadzą do takich arytmii, stosujemy systematyczny protokół izolacji kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych od myszy z nokautem podjednostki pomocniczej kanału Kv. Wyizolowane kardiomiocyty można następnie natychmiast wykorzystać do komórkowych badań elektrofizjologicznych, testów biochemicznych lub immunofluorescencyjnych (IF).

Izolacja i zapisy kanału Kv w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych myszy

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Przedstawiamy protokół oceny elektromechanicznych efektów aktywacji GtACR1 w kardiomiocytach królików. Dostarczamy szczegółowych informacji na temat izolacji komórek, hodowli i transdukcji adenowirusa oraz na temat eksperymentów funkcjonalnych z użyciem technik patch-clamp i włókna węglowego.

Elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) okazały się obiecującym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM.

Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Ten protokół opisuje szybką i skuteczną metodę izolowania komórek mięśni gładkich od tętnicy podstawnej szczura i rejestrowania do wewnątrz korygujących prądów kanału potasowego w tych komórkach za pomocą techniki zacisku krosowego dla całych komórek. Stanowi on nowatorskie podejście dla naukowców badających tętnicę podstawną i kanały jonowe.

Rejestracja wewnętrznych prądów prostowniczych K+ w świeżo wyizolowanych komórkach mięśni gładkich tętnicy podstawnej techniką patch clamp

Poznaj technikę całokomórkowej zaciski patch-clamp do rejestracji prądów kanałów potasu w kardiomiocytach H9C2. Metoda umożliwia badanie mechanizmów kardiotoksyczności leków z perspektywy kanałów jonowych.

Zależny od napięcia zapis prądu potasu na kardiomiocytach H9C2 za pomocą techniki Whole-Cell Patch-Clamp

Przeglądaj więcej filmów