Zależny od napięcia zapis prądu potasu na kardiomiocytach H9C2 za pomocą techniki Whole-Cell Patch-Clamp

Protokół ten z powodzeniem rejestruje wpływ akonityny na IKv komórek H9C2. Promowanie nowych etapów badania mechanizmu kardiotoksyczności leków z perspektywy kanałów jonowych. Technika patch-clamp dla całych komórek jest złotym standardem badań kanałów jonowych o wysokiej czułości, wysokiej precyzji i wysokiej specyficzności.

Technika klamry krosowej dla całych komórek może być wykorzystana do zbadania farmakologicznych lub toksycznych mechanizmów łączenia ze sobą określonych kanałów jonowych w chorobach wieloukładowych, takich jak układ sercowo-naczyniowy i układ nerwowy. Na początek trawić komórki z 0,25% trypsyną przez 30 sekund, gdy szalka hodowlana H9C2 stanie się w 80% zlewna. Hodowla 2 razy 10 do 5 komórek na mililitr z normalną pożywką lub pożywką zawierającą lek w 35-milimetrowym naczyniu wyłożonym szklanymi płytkami przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w atmosferze 5% dwutlenku węgla i wilgotności względnej 70 do 80%.

Włącz ściągacz do mikropipet i podgrzewaj przez 30 minut. Następnie umieść kapilę ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem na ściągaczu do mikropipet. Wybierz program i kliknij enter na panelu sterowania.

Kliknij program rampy w prawym górnym rogu, aby określić wartość cieplną szklanej kapilary. Napisz program do wyciągania elektrody zgodnie z wartością określoną przez test rampy i kliknij ciągnij, aby rozpocząć wytwarzanie pipet. Włącz cyfrowy przetwornik analogowy, wzmacniacz sygnału, mikromanipulator, mikroskop i kamerę.

Otwórz kolejno aplikację do obrazowania, oprogramowanie wzmacniacza sygnału i oprogramowanie do akwizycji danych. Kliknij na acquire (Pobieraj) i wybierz opcję edit protocol (edytuj protokół) w oprogramowaniu do akwizycji danych. Edytuj program w interfejsie przebiegu.

Wprowadź wartości dla pierwszego poziomu, poziomu delta, pierwszego czasu trwania i czasu trwania delta dla epoki A, epoki B i epoki C. Następnie kliknij interfejs szybkości trybu i ustaw dane hierarchii próbnej. Następnie kliknij edytuj protokół, aby wybrać przycisk bodźca i ustaw program odejmowania wycieku w oknie dialogowym Odejmowanie wycieku PM. Aby ustalić ścieżkę przechowywania danych, kliknij plik i wybierz ustaw nazwy plików danych w oprogramowaniu do akwizycji danych.

Następnie otwórz ustalony protokół lKv, wybierając opcję Pobieranie i klikając Otwórz protokół w oprogramowaniu do akwizycji danych. Na koniec kliknij opcję narzędzi i wybierz test membranowy, aby rozpocząć uruchamianie protokołu. Dodać roztwór zewnątrzkomórkowy do kąpieli komórkowej na aparacie do klamry krosowej dla całych komórek i umieścić szkiełko przykrywkowe do góry z komórkami H9C2 w kąpieli.

Napełnij 30% pipety roztworem zewnątrzkomórkowym i zainstaluj go na uchwycie elektrody rejestrującej zintegrowanym z aparatem do zaciskania krosowego. Dokręcić pipetę z uchwytem elektrody rejestrującej. Następnie wrzuć pipetę do kąpieli z mikromanipulatorem.

Kliknij interfejs przesunięcia pipet w oprogramowaniu wzmacniacza sygnału, aby utrzymać linię bazową prądu lKv na poziomie zero pikoamperów. Dostarczyć odpowiednie nadciśnienie ręcznie za pomocą strzykawki o pojemności 1,0 mililitra, podłączonej do uchwytu elektrody rejestrującej, przez plastikową rurkę. Lekko przesuń pipetę, manipulując mikromanipulatorem w trzech wymiarach, aby zetknąć się z celą.

Gdy test membranowy przeprowadzi testy, fala prostokątna spadnie o jedną trzecią do połowy po tym, jak pipeta dotknie błony komórkowej, usuń nadciśnienie i ręcznie dostarcz odpowiednie podciśnienie. Następnie kliknij interfejs łatki oprogramowania do akwizycji danych, aby utworzyć gigaseal. Użyj oprogramowania do szybkiej kompensacji pojemności i wzmacniacza wolnego sygnału kompensacji pojemności podczas sufitu ogniwa, aby skompensować szybką i wolną pojemność.

Zastosuj krótkie impulsy podciśnienia, aby rozerwać fragment błony komórkowej. Wykonaj kompensację pojemności błony całej komórki, klikając przycisk całej komórki w oprogramowaniu wzmacniacza sygnału. Na koniec zapisz i zapisz dane, klikając przycisk nagrywania danych.

Otwórz zapisane dane lKv za pomocą oprogramowania do analizy danych. Zapisz aktualne zależności napięcia. Kliknij Analizuj, aby wybrać statystyki.

Wybierz zakres jako Kursory 1 2 do analizy danych, kliknij przyciski amplitudy piku i średniej, a następnie kliknij OK, aby wyświetlić dane na stronie wyników. Na koniec skopiuj kolumnę danych średnich lKv do oprogramowania do rysowania funkcji w celu dalszej analizy. Zapisz reprezentatywne ślady prądu lKv.

Kliknij edytuj, aby wybrać ślady transferu, a następnie wybierz pełny ślad w regionie do przeniesienia. Następnie kliknij wybierz w zaznaczeniu śladu i wybierz IN 0 w sygnałach. Na koniec kliknij OK, aby wyświetlić dane na stronie wyników i skopiować całkowite dane do oprogramowania do rysowania funkcji, aby narysować bieżące ślady.

Zapisz protokół lKv. Kliknij edytuj, aby wybrać utwórz sygnał fali bodźcowej i wybierz w porządku. Następnie powtórz krok, aby narysować bieżące ścieżki bez wybierania sygnału.

lKv zostało wyzwolone przez 150 milisekund depolaryzującego bodźca impulsowego od minus 40 do plus 60 miliwoltów przy potencjale podtrzymania minus 60 miliwoltów. lKv kardiomiocytów szczura H9C2 najpierw pojawiło się około minus 20 miliwoltów, a następnie amplituda wzrosła wraz z dalszą depolaryzacją. W porównaniu z grupą kontrolną, amplituda lKv była zauważalnie zmniejszona po pięciu minutach leczenia 1,5 milimolowym 4-AP.

Dodatkowo, lKv znacznie zmniejszyło się przy potencjałach błonowych od 10 do 60 miliwoltów w sposób zależny od dawki, po 24-godzinnym leczeniu prądem przemiennym. Pojedyncza komórka po zarejestrowaniu kanału jonowego może być wykorzystana do dalszej oceny omiki pojedynczej komórki, takiej jak genomika pojedynczej komórki, transkryptomika, proteomika i metabolomika.