Analizy ekspresji genów w ludzkich pęcherzykach

Protokół ten opisuje skuteczną metodę izolowania pęcherzyków jajnikowych z otaczających komórek zrębu w celu oceny analiz ekspresji genów na tych komórkach rozrodczych. Technika ta, wykorzystująca kontrolowane izolacje enzymatyczne i mechaniczne, pozwala na pobranie mieszków włosowych przy zachowaniu ich integralności. Postępując zgodnie z tym protokołem, badacz może ocenić określone ekspresje genów z tych komórek.

Technika ta może być wykorzystana do lepszego zrozumienia deficytu ekspresji genów w pęcherzykach związanych z chorobami wpływającymi na czynność jajników lub po ekspozycji na czynniki toksyczne. Przygotowanie płytki sześciodołkowej należy rozpocząć od dodania pięciu mililitrów roztworu krioprotektantu do pierwszego dołka i pięciu mililitrów pożywki Leibovitz 15 ze zmniejszającymi się stężeniami krioprotektantu do kolejnych czterech studzienek. Wyjąć fiolkę zawierającą fragment kory jajnika z ciekłego azotu zgodnie z zasadami bezpieczeństwa.

Po 30 sekundach w temperaturze pokojowej lub RT zanurzyć fiolkę w podwójnie destylowanej wodzie na dwie minuty. Wewnątrz pionowego kaptura delikatnie zamieszaj i otwórz fiolkę z fragmentem kory jajnika przed przeniesieniem zawartości do pierwszego dołka sześciodołkowej płytki umieszczonej na lodzie. Następnie przenieść fragment kory jajnikowej w pierwszym dołku kolejno do każdego dołka sześciodołkowej płytki zawierającej malejące stężenie krioprotektantu w pięciu mililitrach pożywki Leibovitz 15.

Delikatnie mieszaj tkankę w każdym pożywce przez pięć minut. W celu izolacji pęcherzyków przenieś rozmrożoną tkankę jajnika na dwumilimetrową siatkową szalkę Petriego wypełnioną 10 mililitrami pożywki preparcyjnej, 30 mikrogramami na mililitr penicyliny G i 50 mikrogramami na mililitr streptomycyny. W razie potrzeby dostosuj rozmiar tkanki za pomocą skalpela.

Ułóż trzy kawałki krajalnicy do tkanek i umieść fragment jajnika między dwoma blokami. Przetnij fragment na pół za pomocą ostrza, przesuwając się po blokach, aby uzyskać dwa fragmenty o grubości 0,5 milimetra. Pokrój tkankę za pomocą rozdrabniacza do tkanek, aby uzyskać mniejsze kawałki.

W razie potrzeby odetnij pozostałe kawałki ręcznie skalpelem, aż tkanka zostanie zmiażdżona. Po rozbiciu tkanki przenieś rozdrobnioną tkankę na siatkową szalkę Petriego wypełnioną siedmioma mililitrami pożywki wytrawiającej przed umieszczeniem szalki w inkubatorze w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza. Wyjmuj szalkę Petriego z inkubatora co 10 minut.

Przepłukać tkankę, pipetując pożywkę wytrawiającą w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Po 45 minutach inkubacji w pożywce wytrawiającej umieścić naczynie pod mikroskopem stereoskopowym o zakresie powiększenia od pięciu do 6,3 razy i pobrać pęcherzyki za pomocą mikropipety kapilarnej. Wybierz interesujące Cię pęcherzyki i wyizoluj je, zasysając je pipetą doustną.

Jeśli pęcherzyki pozostają zablokowane w kawałku kory, odizoluj je mechanicznie za pomocą dwóch strzykawek o rozmiarze 27, odrywając korę końcówką strzykawek i uwalniając pęcherzyki ze zrębu. Za pomocą mikrokapilary przenieś izolowane pęcherzyki na czterodołkową płytkę zawierającą 15 mikrolitrów skalibrowanej pożywki hodowlanej pokrytej 500 mikrolitrami kultury olejowej. Po przeniesieniu jednego do 10 mieszków włosowych przepłucz je dwa razy w dwóch kroplach po 15 mikrolitrów PBS pokrytych 500 mikrolitrami kultury olejowej przez pięć sekund każda.

Za pomocą pipety doustnej zbierz 20 pęcherzyków z minimalną ilością PBS w pustej probówce i trzymaj probówkę na lodzie. Po 90 minutach inkubacji w pożywce wytrawiającej należy zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając roztwór blokujący zimno. Pod kapturem chemicznym zawiesić izolowane pęcherzyki w 100 mikrolitrach roztworu do lizy dostarczonego z zestawem do ekstrakcji RNA.

Wiruj izolowane pęcherzyki z prędkością 2500 obr./min na minutę, aby rozbić ich strukturę, a następnie dodaj 50 mikrolitrów 100% etanolu do probówki. I krótko zawiruj rurkę z dużą prędkością. Po wirowaniu przenieś całkowitą objętość rurki do zespołu wkładu mikrofiltra, składającego się z kolumny i rurki zbiorczej.

I odwirować zespół przez 10 sekund w temperaturze 16, 363 g w czterech stopniach Celsjusza. Przemyć kolumnę 180 mikrolitrami roztworu płuczącego 1 dostarczonego z zestawem przed odwirowaniem probówki przez 10 sekund. Po dwukrotnym przepłukaniu kolumny 180 mikrolitrami roztworu płuczącego 2, 3, należy wysuszyć filtr, odwirowując probówkę po raz ostatni i umieścić nową probówkę zbiorczą pod wkładem.

Aby przeprowadzić elucję kwasów nukleinowych, najpierw dodaj osiem mikrolitrów roztworu elucji o temperaturze 75 stopni Celsjusza do zespołu filtra. Po minucie odwiruj zestaw przez 30 sekund. Powtórz ten krok z siedmioma mikrolitrami roztworu elucyjnego.

Po zakończeniu dodaj dwie jednostki międzynarodowe DNazy i bufor DNazy do probówki i inkubuj probówkę przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zablokować aktywność enzymatyczną za pomocą odczynnika inaktywującego DNazę o wymiarach jeden na 10 na dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować probówkę przez 1,5 minuty w temperaturze 16, 363 g w czterech stopniach Celsjusza i przenieść zawiesinę zawierającą RNA do nowej probówki.

Za pomocą spektrofotometru ocenić ilość RNA w próbce. Użyj jednego mikrolitra roztworu elucyjnego jako ślepej próby i jednego mikrolitrowego roztworu RNA wyekstrahowanego z izolowanych pęcherzyków. Sprawdź, czy stosunek 260/280 wynosi około 2,0 dla czystości RNA.

I przechowuj próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub bezpośrednio poddaj ją retrotranskrypcji w celu przeprowadzenia RT-qPCR. Korzystając z tego protokołu, dwa homogenizowane fragmenty jajnika o wymiarach 4x2x1 milimetr od tej samej pacjentki zostały przetworzone w celu wyizolowania pęcherzyków. Kwantyfikacja RNA wykazała, że 4,8 nanograma na mikrolitr całkowitego RNA zostało wyekstrahowane z pęcherzyków o wielkości mniejszej niż 75 mikrometrów o współczynniku czystości 1,89.

Z pęcherzyków o wielkości mniejszej niż 200 mikrometrów wyekstrahowano 10,5 nanograma na mikrolitr całkowitego RNA przy współczynniku czystości 1,74. Wartości liczby integralności RNA lub RIN wynosiły odpowiednio 7,1 i 7,9 w probówkach pierwszej i drugiej, potwierdzając jakość RNA z naszych próbek. Po przeprowadzeniu standardowego cyklu w systemie PCR w czasie rzeczywistym, uzyskane progi cyklu lub CT wynosiły 30,87 i 29,56 dla HPRT, 33,5 i 31,77 dla liganda zestawu oraz 30,71 i 30,57 dla GDF9.

Enzymatyczne trawienie tkanki jest punktem krytycznym. Eksperymentator musi stale oceniać i zapewniać integralność pęcherzyków podczas reakcji, zatrzymując ją w razie potrzeby. Oprócz analiz ekspresji genów, izolowane pęcherzyki są wykorzystywane do opracowywania eksperymentalnych systemów zachowania płodności pacjentów z rakiem, takich jak hodowla pęcherzyków in vitro lub sztuczny jajnik.

Technika izolacji wymagała krzywej uczenia się w celu odzyskania dużej liczby nienaruszonych mieszków włosowych. Naukowcy powinni upewnić się, że tkanka jest dobrze rozbita przed trawieniem.