Name: Analizy ekspresji genów w ludzkich pęcherzykach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metodę izolacji ludzkich pęcherzyków jajnikowych z tkanki kory do analiz ekspresji genów. Technika enzymatyczno-mechaniczna zachowuje integralność komórek, umożliwiając badanie funkcji jajników i wpływu czynników toksycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem Excellence of Science (EOS) (ID: 30443682). I.D. jest pracownikiem naukowym w Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

Ten projekt został zatwierdzony przez Komisję Etyki Szpitala Erasme (Bruksela, Belgia). Pacjentka objęta tym protokołem została poddana kriokonserwacji tkanki jajnikowej (OTC) w celu zachowania płodności przed ekspozycją na chemioterapię w 2000 roku. Pacjentka podpisała świadomą pisemną zgodę na oddanie resztek zamrożonych tkanek do badań po zakończeniu okresu przechowywania.
1. Rozmrażanie kriokonserwowanej tkanki jajnika
<ol>
	<li>Przygotuj 6-dołkową płytkę zawierającą pięć roztworów do rozmrażania. Pierwsza studzienka zawiera 5 ml roztworu krioprotektantu składającego się z podłoża Leibovitz-15, sacharozy o sile 0,1 mol/l, dimetylosulfotlenku o stężeniu 1,5 mol/l (DMSO) i 1% albuminy surowicy ludzkiej (HSA). Kolejne studzienki zawierają 5 ml pożywki Leibovitz-15 o malejących stężeniach krioprotektantu: 1 mol/L, 0,5 mol/L i 2 x 0 mol/L DMSO, 
	UWAGA: Roztwór krioprotektantu może się różnić w zależności od protokołu stosowanego w klinice leczenia niepłodności.</li>
	<li>Wyjąć fiolkę zawierającą fragment kory jajnika z ciekłego azotu zgodnie z zasadami bezpieczeństwa (rękawice kriogeniczne, okulary ochronne i zamknięte buty) i przechowywać probówkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 s.</li>
	<li>Zanurzyć fiolkę w podwójnie destylowanej wodzie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem, a następnie otworzyć fiolkę pod pionowym kapturem i bezpośrednio przenieść ją do pierwszego dołka płytki 6-dołkowej (na lodzie).</li>
	<li>Przenieść fragment kolejno do każdej studzienki 6-dołkowej płytki, z których każda zawiera zmniejszające się stężenie krioprotektantu w 5 ml pożywki Leibovitz-15. Delikatnie mieszaj tkankę w każdym podłożu przez 5 minut (na lodzie).</li>
</ol>
2. Izolacja mieszków włosowych
UWAGA: Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane przy użyciu materiałów wolnych od RNaz i pod pionowym kapturem.
<ol>
	<li>Przenieś rozmrożoną tkankę na kratkę Petriego o średnicy 2 mm wypełnioną 10 ml pożywki preparacyjnej (pożywka Leibovitz-15, pirogronian sodu [2 mmol/L], L-glutamina [2 mmol/L], HSA [0,3%], penicylina G [30 μg/ml] i streptomycyna [50 μg/ml]). W razie potrzeby dostosuj rozmiar tkanki za pomocą skalpela. 
	UWAGA: W zależności od protokołu klinicznego rozmiar zamrożonej tkanki może wahać się od 8 mm x 4 mm x 1 mm do 4 mm x 2 mm x 1 mm. Do tego protokołu użyto dwóch pasków o wymiarach 4 mm x 2 mm x 1 mm.</li>
	<li>Ułóż trzy kawałki krajalnicy do tkanek, umieść fragment między dwoma blokami i przetnij fragment na pół za pomocą ostrza, przesuwając się po blokach, aby uzyskać dwa fragmenty o grubości 0,5 mm.</li>
	<li>Użyj rozdrabniacza do tkanek, aby pokroić fragment i uzyskać mniejsze kawałki. W razie potrzeby odetnij pozostałe kawałki ręcznie skalpelem, aż tkanka zostanie całkowicie rozbita.</li>
	<li>Przenieś rozdrobnioną tkankę na siatkowaną szalkę Petriego wypełnioną 7 ml pożywki trawiącej (pożywka hodowlana [pożywka McCoy's 5A, 3 mmol/L glutaminy, 0,1% HSA, 30 μg/ml penicyliny G, 50 μg/ml streptomycyny, 2,5 μg/ml transferyny, 4 ng/ml selenu i 50 μg/ml kwasu askorbinowego] uzupełniona 0,2% kolagenazą i 0,02% DNazą).</li>
	<li>Umieścić naczynie w inkubatorze w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C. Co 10 minut wyjmować szalkę Petriego z inkubatora i przepłukiwać tkankę, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Po 45 minutach inkubacji w pożywce wytrawiającej należy umieścić naczynie pod mikroskopem stereoskopowym o zakresie powiększenia 5x-6,3x, a pęcherzyki pobrać za pomocą pipety mikrokapilarnej. Wybierz interesujące Cię pęcherzyki i wyizoluj je, zasysając je pipetą doustną. 
	UWAGA: Pipetowanie doustne należy wykonywać ostrożnie, aby uniknąć utraty materiału do rurki i zanieczyszczenia.</li>
	<li>Jeśli mieszki włosowe utknęły w kawałku kory mózgowej, należy je odizolować mechanicznie za pomocą dwóch strzykawek 27 G, odrywając korę końcówką strzykawek, aby uwolnić pęcherzyki ze zrębu. 
	UWAGA: Nie dotykaj mieszków włosowych strzykawkami, aby uniknąć ich uszkodzenia.</li>
	<li>Przenieść mieszki włosowe z mikrokapilarą na 4-dołkową płytkę zawierającą krople 15 μl skalibrowanej pożywki hodowlanej pokrytej 500 μl kultury olejowej (1 do 10 pęcherzyków na kroplę). Ten krok utrzymuje żywotność mieszków włosowych podczas procesu pobierania. Pod koniec zabiegu przepłukać mieszki włosowe dwukrotnie przez 5 s za każdym razem do dwóch kropli po 15 μl roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanami (PBS) zalanego 500 μl kultury olejowej (na lodzie).</li>
	<li>Za pomocą pipety doustnej (maksymalnie 10 μl) zebrać 20 pęcherzyków z minimalną ilością PBS w pustej probówce i trzymać probówkę na lodzie. 
	UWAGA: Dla stabilności RNA kluczowe jest wykonanie kroku 2.8 i kroku 2.9 na lodzie. Około 20 pęcherzyków (<75 μm) jest potrzebnych do uzyskania wystarczającej ilości RNA dla standardowego RT-qPCR (SYBR Green).</li>
	<li>Po maksymalnie 90 minutach inkubacji w pożywce wytrawiającej, zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając do płytki Petriego nadmiar zimnego (4 °C) roztworu blokującego (7,5 ml) złożonego z pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). 
	UWAGA: Roztwór blokujący można dodać, gdy tylko eksperymentator zauważy mieszki włosowe przyklejające się do płytki lub uszkodzone pęcherzyki (asymetryczny kształt lub ciemniejsze pęcherzyki). Zaleca się wykonanie izolacji pęcherzyków w ciągu maksymalnie 2,5 godziny, aby uniknąć uszkodzenia pęcherzyków i wykonanie ekstrakcji RNA bezpośrednio po izolacji.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja RNA
UWAGA: Ekstrakcja RNA odbywa się zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu do ekstrakcji RNA, dostosowując objętości elucji.
<ol>
	<li>Zawiesić izolowane pęcherzyki, dodając 100 μl roztworu do lizy dostarczonego z zestawem do ekstrakcji RNA do probówki zawierającej pęcherzyki pod kapturem chemicznym i wirować z dużą prędkością (2,500 obr./min), aby złamać strukturę pęcherzyków. Dodać 50 μl etanolu (100%) do probówki i krótko wirować z dużą prędkością. 
	UWAGA: Ponieważ bufor do lizy zawiera 2-merkaptoetanol i kwas tiocyjanowy, ten krok należy wykonywać ostrożnie pod maską chemiczną.</li>
	<li>Przenieść całkowitą objętość probówki (około 160 μl) do zespołu wkładu mikrofiltra, składającego się z kolumny i probówki zbiorczej, i odwirować ją przez 10 s przy 16,363 x g w temperaturze 4 °C. Przemyć kolumnę 180 μl roztworu płuczącego 1, dostarczonego wraz z zestawem, i odwirować probówkę przez 10 s w temperaturze 16,363 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 180 μl roztworu płuczącego 2/3, dostarczonego z zestawem, do kolumny i wirować przez 10 s przy 16,363 x g w temperaturze 4 °C. Wykonać ten krok dwukrotnie. Odwiruj probówkę po raz ostatni przez 1 minutę, aby wysuszyć filtr, i umieść nową probówkę zbiorczą pod wkładem.</li>
	<li>Przeprowadź elucję kwasów nukleinowych w dwóch etapach:
	<ol>
		<li>Najpierw dodać 8 μl ciepłego roztworu elucyjnego (75 °C) do filtra, odczekać 1 minutę w temperaturze pokojowej i odwirować przez 30 s w temperaturze 16,363 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Powtórz ten krok z 7 μl roztworu elucyjnego. 
		UWAGA: Probówkę zawierającą wyluzowane kwasy nukleinowe należy przechowywać na lodzie. Aby uniknąć zanieczyszczenia DNA, zdecydowanie zaleca się dodatkowy etap degradacji DNA - krok 3.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować probówkę z 2 j.m. DNazą i 1 buforem DNazy przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Blokować aktywność enzymatyczną za pomocą odczynnika do inaktywacji 1/10 DNazy przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować probówkę przez 1,5 minuty przy 16,363 x g w temperaturze 4 °C. Na koniec zbierz zawiesinę zawierającą RNA i przenieś ją do nowej probówki.</li>
	<li>Ocenić ilość RNA obecnego w próbce za pomocą spektrofotometru (oprogramowanie NanoDrop 2000 > Nucleic Acid > RNA). Użyj 1 μl roztworu elucyjnego jako ślepej próby i zmierz ilość RNA wyekstrahowanego z izolowanych pęcherzyków za pomocą 1 μl roztworu.</li>
	<li>Sprawdź stosunek 260/280 pod kątem czystości RNA (około 2,0). Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio dokonać jej transkrypcji retrokryminalnej w celu wykonania RT-qPCR. 
	UWAGA: Aby ocenić integralność RNA, próbkę można przetworzyć za pomocą automatycznego systemu elektroforezy o wysokiej rozdzielczości przed lub po zamrożeniu w temperaturze -80 °C. W niniejszej pracy, po retrotranskrypcji, RT-qPCR wykonano w następującym cyklu: 
	Utrzymaj scenę przez 20 s w 50 °C i 10 min w temperaturze 95 °C 
	40 cykli PCR po 15 s w temperaturze 95 °C i 1 min w temperaturze 60 °C 
	Etap krzywej topnienia trwający 15 s w temperaturze 95 °C, 1 min w temperaturze 60 °C, 30 s w temperaturze 95 °C i 15 s w temperaturze 60 °C</li>
</ol>

<ol><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+follicular+development%3A+From+activation+of+resting+follicles+to+preovulatory+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+d%27Endocrinologie%22%5BJournal%5D)">Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation.</a> Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).</li>
<li>Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+human+ovarian+folliculogenesis+and+its+implications+in+assisted+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).</li>
<li>Rosewell, K. L., Curry, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ovarian+matrix+metalloproteinase+mRNAs+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization.</a> Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).</li>
<li>Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+localisation+of+c-kit+and+KITL+in+the+adult+human+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary.</a> Journal of Ovarian Research. 8, 31(2015).</li>
<li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+primordial+follicles+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue.</a> Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).</li>
<li>Bonnet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+sheep+granulosa+cells+and+oocytes+during+early+follicular+development+obtained+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection.</a> BMC Genomics. 12, 417(2011).</li>
<li>Chiti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+and+tailored+human+follicle+isolation+procedure+improves+follicle+recovery+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival.</a> Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71(2017).</li>
<li>Kim, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+follicle+isolation+methods+for+mouse+ovarian+follicle+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro.</a> Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+follicle+isolation+for+bioengineering+of+human+artificial+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary.</a> Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).</li>
<li>Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+isolation+methods+reveal+plasticity+of+granulosa+cell+steroidogenic+capacity+during+mouse+in+vitro+follicle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth.</a> Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).</li>
<li>McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+small+preantral+follicles+from+the+bovine+ovary+using+a+combination+of+fragmentation%2C+homogenization%2C+and+serial+filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration.</a> Journal of Visualized Experiments. (187), e64423(2022).</li>
<li>Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+%28IVG%29+of+human+ovarian+follicles+in+frozen+thawed+ovarian+cortex+tissue+culture+supplemented+with+follicular+fluid+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+grown+human+ovarian+follicles+from+cancer+patients+support+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth.</a> Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).</li>
<li>Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+experience+of+ovarian+tissue+cryopreservation+procedure%3A+Alternatives%2C+perspectives+and+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility.</a> Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).</li>
<li>Demeestere, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+function+and+spontaneous+pregnancy+after+combined+heterotopic+and+orthotopic+cryopreserved+ovarian+tissue+transplantation+in+a+patient+previously+treated+with+bone+marrow+transplantation%3A+Case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report.</a> Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).</li>
<li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human%3A+A+model+from+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li>
<li>Grosbois, J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+PI3K+and+Hippo+signaling+pathways+during+in+vitro+human+follicle+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation.</a> Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).</li>
<li>Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+intercellular+contact-mediated+communication+in+cultured+human+early+stage+follicles+exposed+to+mTORC1+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor.</a> Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).</li>
<li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+function+and+oocyte+retrieval+after+autologous+transplantation+of+ovarian+cortical+strips+to+the+forearm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm.</a> Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).</li>
<li>Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+cryopreservation+versus+ovarian+tissue+cryopreservation+for+adult+female+oncofertility+patients%3A+A+cost-effectiveness+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).</li>
<li>Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+follicle+health+and+development+in+cultured+cryopreserved+ovarian+cortical+tissue%3A+A+study+of+ovarian+tissue+from+patients+undergoing+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Fertility%22%5BJournal%5D)">Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation.</a> Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).</li>
<li>Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ovarian+follicle+growth%3A+A+comprehensive+analysis+of+key+protocol+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables.</a> Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).</li>
<li>Rice, S., Ojha, K., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+biopsies+as+a+viable+source+of+pre-antral+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles.</a> Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).</li>
<li>Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pre-antral+follicles+from+human+ovarian+medulla+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue.</a> Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).</li>
<li>Dong, F. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+research+on+the+isolation+methods+of+frozen-thawed+human+ovarian+preantral+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).</li>
<li>Lierman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicles+of+various+maturation+stages+react+differently+to+enzymatic+isolation%3A+a+comparison+of+different+isolation+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols.</a> Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+isolated+early+human+follicles+cultured+in+collagen+gels+for+24+hours%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours.</a> Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+study+of+fully+and+partially+isolated+early+human+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Morphological study of fully and partially isolated early human follicles.</a> Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).</li>
<li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+isolation+and+in+vitro+growth+of+preantral+and+small+antral+human+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles.</a> Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).</li>
<li>Vanacker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+isolation+of+human+primordial+and+primary+ovarian+follicles+with+Liberase+DH%3A+Protocol+for+application+in+a+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting.</a> Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).</li>
<li>Amargant, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+stiffness+increases+with+age+in+the+mammalian+ovary+and+depends+on+collagen+and+hyaluronan+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices.</a> Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Kriokonserwacja tkanki jajnikowej jest obiecującym podejściem do zachowania płodności pacjentek z rakiem. W klinice rozmrożona tkanka korowa jest przeszczepiana z powrotem do pacjentki po remisji, co pozwala na wznowienie funkcji jajników i płodności19,20. Oprócz zastosowania klinicznego, resztkowe fragmenty jajników mogą być również przekazane do badań pod koniec okresu przechowywania w celu zbadania mechanizmów regulujących folikulogenezę. Co więcej, tkanka ta ...

Jajnik to złożony organ złożony z funkcjonalnych i strukturalnych jednostek, w tym mieszków włosowych w korze i zrębu. Folikulogeneza, proces aktywacji, wzrostu i dojrzewania pęcherzyków włosowych od pierwotnego stanu spoczynku do dojrzałego pęcherzyka zdolnego do zapłodnienia i wspierania wczesnego rozwoju embrionalnego, jest szeroko badany w badaniach1. Odkrycie mechanizmów napędzających to zjawisko może poprawić opiekę nad płodnością kobiet2. Analizy utrwalonej tkanki ludzkiej pozwalają na ocenę ekspresji białek i lokalizacji genów w obrębie jednostek funkcjonalnych jajnika3,4. Potrzebne są jednak specjalne techniki dysocjacji pęcherzyków jajnikowych od otaczającej kory w celu dokładnej oceny poziomu ekspresji genów w pęcherzykach jajnikowych. W związku z tym, w poprzednim badaniu, opracowano technikę izolacji pęcherzyków, aby umożliwić analizę ekspresji genów bezpośrednio z jednostki funkcjonalnej jajnika5. Opracowano różne podejścia, takie jak trawienie enzymatyczne i/lub izolacja mechaniczna, a także mikrodysekcja wychwytywania laserowego, które umożliwiają izolację pęcherzyków w obrębie fragmentu tkanki6,7,8,9. Izolacja pęcherzyków jest szeroko stosowana, zarówno w ludzkiej tkance jajnika, jak i zwierzęcej, do oceny profili ekspresji genów pęcherzyków na wszystkich etapach rozwoju10,11,12. Jednak optymalna procedura izolacji powinna uwzględniać delikatną strukturę pęcherzyka w gęstej korze i dlatego powinna być wykonywana ostrożnie, aby uniknąć jakichkolwiek uszkodzeń7. Ten manuskrypt opisuje procedurę, zaadaptowaną z protokołu opisanego przez laboratorium Woodruffa, polegającą na izolowaniu ludzkich pęcherzyków z zamrożonej i rozmrożonej kory jajnika w celu przeprowadzenia analiz ekspresji genów13.
Pierwszym etapem izolacji pęcherzyków jajnikowych z zamrożonej tkanki ludzkiej jest procedura rozmrażania. Proces ten jest wykonywany w oparciu o protokół kliniczny stosowany do przeszczepiania kriokonserwowanej tkanki jajnika, jak opisano wcześniej14,15. Proces ten ma na celu usunięcie środków krioprotekcyjnych poprzez przepłukanie kory jajnika w zmniejszających się stężeniach pożywki. Następnie tkanka jest fragmentowana przed enzymatyczną i mechaniczną izolacją w celu pobrania mieszków włosowych. Mieszki włosowe w różnych stadiach można rozróżnić za pomocą mikroskopu stereoskopowego o dużym powiększeniu i dobrej jakości optyce, aby wyizolować te, które są interesujące. Każdy izolowany pęcherzyk jest mierzony za pomocą linijki zintegrowanej z mikroskopem, a pęcherzyki można łączyć zgodnie z ich etapem rozwoju: pęcherzyki pierwotne (30 μm), pęcherzyki pierwotne (60 μm), pęcherzyki wtórne (120-200 μm) i pęcherzyki antralne (>200 μm)<klasa sup="xref">16. Dalszą klasyfikację można przeprowadzić zgodnie z morfologią pęcherzyków: pęcherzyki pierwotne mają jedną warstwę spłaszczonych komórek ziarnistych (GC), pęcherzyki pierwotne mają jedną warstwę prostopadłościennych GC, pęcherzyki wtórne mają co najmniej dwie warstwy prostopadłościennych GC, a obecność wgłębienia wśród GC charakteryzuje stadium antralne. Po wybraniu interesujących nas pęcherzyków przeprowadza się ekstrakcję RNA. Ilość i jakość RNA są oceniane przed ilościową reakcją łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Szalka Petriego z siatką 2 mm</td><td>Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>2100 Narzędzie do bioanalizowania</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>2100 Oprogramowanie Expert</td><td>Agilent</td><td>wersja B.02.08.SI648</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 4-dołkowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6789</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Carl Roth</td><td>&nbsp; EKX5.1</td><td></td></tr><tr><td>Agilent total RNA 6000 pico kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy probówek aspiratora do pipet mikrokapilarnych</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>LifeTechnologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4527-10kU</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza GoScript</td><td>Promega</td><td>A5003</td><td></td></tr><tr><td>HSA</td><td>CAF DCF&nbsp;</td><td>LC4403-41-080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz-15</td><td>LifeTechnologies</td><td>11415-049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>McCoy' s 5A + wodorowęglan + Hepes</td><td>LifeTechnologies</td><td>12330-031</td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz do tkanek McIlwain</td><td>Stoelting</td><td>51350</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokapila RI EZ-Tips 200 &mikro; m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2200/1</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki mikrokapilarne RI EZ-Tips 75 &micro; m</td><td>Oprogramowanie operacyjne CooperSurgical</td><td>7-72-2075/1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td>ThermoFisher</td><td>wersja 1.6</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop</td><td>ThermoFisher</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>PowerTrack SYBR green master mix</td><td>ThermoFisher</td><td>A46109</td><td></td></tr><tr><td>Podkłady: GDF9</td><td></td><td></td><td>F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG</td></tr><tr><td>Podkłady: HPRT</td><td></td><td></td><td>F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACACAGAGGGCTACAA</td></tr><tr><td>Podkłady: Kit Ligand</td><td></td><td></td><td>F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT</td></tr><tr><td>QPCR W CZASIE RZECZYWISTYM Quantstudio 3</td><td>ThermoFisher</td><td>A33779</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNAqueous-micro total RNA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Selenium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1277</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Series II&nbsp; CO2&nbsp z płaszczem wodnym. inkubatory</td><td>ThermoFisher</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Krajalnica do tkanek Thomas Stadie-Riggs</td><td>Thomas Scientific</td><td>6727C10</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>10652202001</tr></tbody></table>

analizy ekspresji genów w ludzkich pęcherzykach

Gene Expression Analyses in Human Follicles

Jajnik jest niejednorodnym organem złożonym z różnych typów komórek. Aby zbadać mechanizmy molekularne zachodzące podczas folikulogenezy, lokalizację białek i ekspresję genów można przeprowadzić na tkance utrwalonej. Jednak, aby prawidłowo ocenić poziom ekspresji genów w ludzkim pęcherzyku, ta złożona i delikatna struktura musi zostać wyizolowana. W związku z tym opracowano dostosowany protokół opisany wcześniej przez laboratorium Woodruffa w celu oddzielenia pęcherzyków (oocytu i komórek ziarnistych) od otaczającego je środowiska. Tkanka korowa jajnika jest najpierw przetwarzana ręcznie w celu uzyskania małych fragmentów za pomocą dwóch narzędzi: krajalnicy do tkanek i rozdrabniacza tkanek. Tkanka jest następnie trawiona enzymatycznie z 0,2% kolagenazą i 0,02% DNazą przez co najmniej 40 minut. Ten etap mineralizacji odbywa się w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 i towarzyszy mu mechaniczne pipetowanie pożywki co 10 minut. Po inkubacji izolowane pęcherzyki pobiera się ręcznie za pomocą skalibrowanej pipety mikrokapilarnej pod mikroskopem. Jeśli mieszki włosowe są nadal obecne w kawałkach tkanki, zabieg kończy się ręczną mikrodypreparacją. Mieszki włosowe zbiera się na lodzie w pożywce hodowlanej i dwukrotnie przepłukuje się kropelkami roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanami. Ta procedura trawienia musi być dokładnie kontrolowana, aby uniknąć pogorszenia stanu pęcherzyków. Gdy tylko struktura pęcherzyków wydaje się być uszkodzona lub po maksymalnie 90 minutach, reakcję zatrzymuje się roztworem blokującym o temperaturze 4 °C zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej. Należy pobrać co najmniej 20 izolowanych pęcherzyków (o wielkości poniżej 75 μm) w celu uzyskania odpowiedniej ilości całkowitego RNA po ekstrakcji RNA do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Po ekstrakcji kwantyfikacja całkowitego RNA z 20 pęcherzyków osiąga średnią wartość 5 ng/μL. Całkowite RNA jest następnie retrotranskrybowane do cDNA, a interesujące geny są dalej analizowane za pomocą RT-qPCR.

Stosując tę procedurę izolacji, badacz może wyodrębnić pęcherzyki ze środowiska zrębowego w celu przeprowadzenia specyficznych analiz ekspresji genów. Na podstawie wielkości i morfologii pęcherzyków możliwe jest rozróżnienie poszczególnych etapów folikulogenezy. Badacz może wybrać pęcherzyki interesujące go pod kątem ich wielkości, używając przystosowanej pipety mikrokapilarnej. Stosując mikrokapilarę o maksymalnej średnicy 75 µm, można odróżnić pęcherzyki pierwotne i prymordialne od pęcherzyków wtórnych, antralnych i do...

Tutaj opisujemy protokół opisujący, jak izolować ludzkie pęcherzyki jajnikowe z zamrożonej i rozmrożonej tkanki korowej w celu przeprowadzenia analiz ekspresji genów.

Analizy ekspresji genów w ludzkich pęcherzykach

The ovary is a heterogeneous organ composed of different cell types. To study the molecular mechanisms occurring during folliculogenesis, the localization ...

Protokół ten opisuje skuteczną metodę izolowania pęcherzyków jajnikowych z otaczających komórek zrębu w celu oceny analiz ekspresji genów na tych komórkach rozrodczych. Technika ta, wykorzystująca kontrolowane izolacje enzymatyczne i mechaniczne, pozwala na pobranie mieszków włosowych przy zachowaniu ich integralności. Postępując zgodnie z tym protokołem, badacz może ocenić określone ekspresje genów z tych komórek.Technika ta może być wykorzystana do lepszego zrozumienia deficytu ekspresji genów w pęcherzykach związanych z chorobami wpływającymi na czynność jajników lub po ekspozycji na czynniki toksyczne. Przygotowanie płytki sześciodołkowej należy rozpocząć od dodania pięciu mililitrów roztworu krioprotektantu do pierwszego dołka i pięciu mililitrów pożywki Leibovitz 15 ze zmniejszającymi się stężeniami krioprotektantu do kolejnych czterech studzienek. Wyjąć fiolkę zawierającą fragment kory jajnika z ciekłego azotu zgodnie z zasadami bezpieczeństwa.Po 30 sekundach w temperaturze pokojowej lub RT zanurzyć fiolkę w podwójnie destylowanej wodzie na dwie minuty. Wewnątrz pionowego kaptura delikatnie zamieszaj i otwórz fiolkę z fragmentem kory jajnika przed przeniesieniem zawartości do pierwszego dołka sześciodołkowej płytki umieszczonej na lodzie. Następnie przenieść fragment kory jajnikowej w pierwszym dołku kolejno do każdego dołka sześciodołkowej płytki zawierającej malejące stężenie krioprotektantu w pięciu mililitrach pożywki Leibovitz 15.Delikatnie mieszaj tkankę w każdym pożywce przez pięć minut. W celu izolacji pęcherzyków przenieś rozmrożoną tkankę jajnika na dwumilimetrową siatkową szalkę Petriego wypełnioną 10 mililitrami pożywki preparcyjnej, 30 mikrogramami na mililitr penicyliny G i 50 mikrogramami na mililitr streptomycyny. W razie potrzeby dostosuj rozmiar tkanki za pomocą skalpela.Ułóż trzy kawałki krajalnicy do tkanek i umieść fragment jajnika między dwoma blokami. Przetnij fragment na pół za pomocą ostrza, przesuwając się po blokach, aby uzyskać dwa fragmenty o grubości 0,5 milimetra. Pokrój tkankę za pomocą rozdrabniacza do tkanek, aby uzyskać mniejsze kawałki.W razie potrzeby odetnij pozostałe kawałki ręcznie skalpelem, aż tkanka zostanie zmiażdżona. Po rozbiciu tkanki przenieś rozdrobnioną tkankę na siatkową szalkę Petriego wypełnioną siedmioma mililitrami pożywki wytrawiającej przed umieszczeniem szalki w inkubatorze w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza. Wyjmuj szalkę Petriego z inkubatora co 10 minut.Przepłukać tkankę, pipetując pożywkę wytrawiającą w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Po 45 minutach inkubacji w pożywce wytrawiającej umieścić naczynie pod mikroskopem stereoskopowym o zakresie powiększenia od pięciu do 6,3 razy i pobrać pęcherzyki za pomocą mikropipety kapilarnej. Wybierz interesujące Cię pęcherzyki i wyizoluj je, zasysając je pipetą doustną.Jeśli pęcherzyki pozostają zablokowane w kawałku kory, odizoluj je mechanicznie za pomocą dwóch strzykawek o rozmiarze 27, odrywając korę końcówką strzykawek i uwalniając pęcherzyki ze zrębu. Za pomocą mikrokapilary przenieś izolowane pęcherzyki na czterodołkową płytkę zawierającą 15 mikrolitrów skalibrowanej pożywki hodowlanej pokrytej 500 mikrolitrami kultury olejowej. Po przeniesieniu jednego do 10 mieszków włosowych przepłucz je dwa razy w dwóch kroplach po 15 mikrolitrów PBS pokrytych 500 mikrolitrami kultury olejowej przez pięć sekund każda.Za pomocą pipety doustnej zbierz 20 pęcherzyków z minimalną ilością PBS w pustej probówce i trzymaj probówkę na lodzie. Po 90 minutach inkubacji w pożywce wytrawiającej należy zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając roztwór blokujący zimno. Pod kapturem chemicznym zawiesić izolowane pęcherzyki w 100 mikrolitrach roztworu do lizy dostarczonego z zestawem do ekstrakcji RNA.Wiruj izolowane pęcherzyki z prędkością 2500 obr./min na minutę, aby rozbić ich strukturę, a następnie dodaj 50 mikrolitrów 100% etanolu do probówki. I krótko zawiruj rurkę z dużą prędkością. Po wirowaniu przenieś całkowitą objętość rurki do zespołu wkładu mikrofiltra, składającego się z kolumny i rurki zbiorczej.I odwirować zespół przez 10 sekund w temperaturze 16, 363 g w czterech stopniach Celsjusza. Przemyć kolumnę 180 mikrolitrami roztworu płuczącego 1 dostarczonego z zestawem przed odwirowaniem probówki przez 10 sekund. Po dwukrotnym przepłukaniu kolumny 180 mikrolitrami roztworu płuczącego 2, 3, należy wysuszyć filtr, odwirowując probówkę po raz ostatni i umieścić nową probówkę zbiorczą pod wkładem.Aby przeprowadzić elucję kwasów nukleinowych, najpierw dodaj osiem mikrolitrów roztworu elucji o temperaturze 75 stopni Celsjusza do zespołu filtra. Po minucie odwiruj zestaw przez 30 sekund. Powtórz ten krok z siedmioma mikrolitrami roztworu elucyjnego.Po zakończeniu dodaj dwie jednostki międzynarodowe DNazy i bufor DNazy do probówki i inkubuj probówkę przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zablokować aktywność enzymatyczną za pomocą odczynnika inaktywującego DNazę o wymiarach jeden na 10 na dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować probówkę przez 1,5 minuty w temperaturze 16, 363 g w czterech stopniach Celsjusza i przenieść zawiesinę zawierającą RNA do nowej probówki.Za pomocą spektrofotometru ocenić ilość RNA w próbce. Użyj jednego mikrolitra roztworu elucyjnego jako ślepej próby i jednego mikrolitrowego roztworu RNA wyekstrahowanego z izolowanych pęcherzyków. Sprawdź, czy stosunek 260/280 wynosi około 2,0 dla czystości RNA.I przechowuj próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub bezpośrednio poddaj ją retrotranskrypcji w celu przeprowadzenia RT-qPCR. Korzystając z tego protokołu, dwa homogenizowane fragmenty jajnika o wymiarach 4x2x1 milimetr od tej samej pacjentki zostały przetworzone w celu wyizolowania pęcherzyków. Kwantyfikacja RNA wykazała, że 4,8 nanograma na mikrolitr całkowitego RNA zostało wyekstrahowane z pęcherzyków o wielkości mniejszej niż 75 mikrometrów o współczynniku czystości 1,89.Z pęcherzyków o wielkości mniejszej niż 200 mikrometrów wyekstrahowano 10,5 nanograma na mikrolitr całkowitego RNA przy współczynniku czystości 1,74. Wartości liczby integralności RNA lub RIN wynosiły odpowiednio 7,1 i 7,9 w probówkach pierwszej i drugiej, potwierdzając jakość RNA z naszych próbek. Po przeprowadzeniu standardowego cyklu w systemie PCR w czasie rzeczywistym, uzyskane progi cyklu lub CT wynosiły 30,87 i 29,56 dla HPRT, 33,5 i 31,77 dla liganda zestawu oraz 30,71 i 30,57 dla GDF9.Enzymatyczne trawienie tkanki jest punktem krytycznym. Eksperymentator musi stale oceniać i zapewniać integralność pęcherzyków podczas reakcji, zatrzymując ją w razie potrzeby. Oprócz analiz ekspresji genów, izolowane pęcherzyki są wykorzystywane do opracowywania eksperymentalnych systemów zachowania płodności pacjentów z rakiem, takich jak hodowla pęcherzyków in vitro lub sztuczny jajnik.Technika izolacji wymagała krzywej uczenia się w celu odzyskania dużej liczby nienaruszonych mieszków włosowych. Naukowcy powinni upewnić się, że tkanka jest dobrze rozbita przed trawieniem.

gene-expression-analyses-in-human-follicles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten protokół opisuje pierwotną hodowlę/kokulturę tkanki jajnikowej myszy, używając jajników od noworodków myszy i indywidualnych pęcherzyków jajnikowych od myszy przed okresem dojrzewania. Techniki hodowli wspomagają rozwój w wysoce fizjologiczny sposób, umożliwiając badanie wpływu czynników zewnętrznych na jajnik oraz interakcji między pęcherzykami jajnikowymi.

Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalne podejście do morfologicznego i biochemicznego charakterystyki oocytów koni. W szczególności niniejsza praca ilustruje, w jaki sposób zbierać niedojrzałe i dojrzałe oocyty koni za pomocą ultrasonograficznego pobierania komórek jajowych (OPU) oraz jak badać segregację chromosomów, morfologię wrzeciona, globalną acetylację histonów i ekspresję mRNA.

Analiza segregacji chromosomów, acetylacji histonów i morfologii wrzeciona w oocytach koni

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) to metoda dokładnego ilościowego określania poziomów i lokalizacji określonych RNA na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy nasze zatwierdzone protokoły laboratoryjne dotyczące przetwarzania na mokrym stole, obrazowania i analizy obrazu w celu ilościowego oznaczania pojedynczych komórek określonych RNA.

Analiza pojedynczych komórek alleli aktywnych transkrypcyjnie za pomocą pojedynczej cząsteczki FISH

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji i oczyszczania komórek jajnika z pęcherzyków antralnych. Omawiamy metody przetwarzania całych jajników w celu kriokonserwacji pasków korowych, a także zbierania nienaruszonych pęcherzyków antralnych, które są traktowane enzymatycznie w celu uwolnienia wielu typów komórek rezydujących w pęcherzykach, w tym ziarnistości, osłonki, śródbłonka, komórek krwiotwórczych i zrębowych.

Ekstrakcja, znakowanie i oczyszczanie komórek specyficznych dla linii z ludzkich pęcherzyków antralnych

Postęp w badaniach nad folikulogenezą preantralną wymaga skutecznych metod izolacji pęcherzyków z pojedynczych jajników. Przedstawiono uproszczony, mechaniczny protokół izolacji pęcherzyków z jajników bydlęcych za pomocą rozdrabniacza tkanek i homogenizatora. Metoda ta pozwala na pobranie dużej liczby żywotnych pęcherzyków przedantralnych z jednego jajnika.

Izolacja małych pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu kombinacji fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej

W tym protokole, metoda oczyszczania powinowactwa do rybosomów (TRAP) i izolacja jąder oznaczonych określonymi typami komórek (INTACT) zostały zoptymalizowane pod kątem sparowanego przesłuchania specyficznego dla komórki transkryptomu i epigenomu jajnika przy użyciu mysiego modelu NuTRAP skrzyżowanego z myszą linią Cyp17a1-Cre.

Specyficzne dla komórki sparowane badanie epigenomu jajnika myszy i transkryptomu

W artykule przedstawiono model kohodowli komórek osłonki bydlęcej i komórek ziarnistych. Metoda ta może potencjalnie służyć jako wiarygodna podstawa do analiz skoncentrowanych na badaniu komunikacji parakrynnej i transportu substratu między komórkami somatycznymi w obrębie pęcherzyka.

Zmodyfikowany system kohodowli w celu zrozumienia interakcji komórek ziarnisto-osłonkowych w jajniku bydła

Protokół ten określa ustandaryzowane metody izolacji i przetwarzania płynu pęcherzykowego, komórek somatycznych oraz niedojrzałych oocytów z procedur IVF, umożliwiając wysokiej jakości analizy molekularne i komórkowe. Te podejścia wspierają badania translacyjne dotyczące płodności, starzenia się reprodukcyjnego i dysfunkcji jajników, wykorzystując materiały zwykle odrzucane w opiece klinicznej.

Pobieranie ludzkiego płynu pęcherzykowego, komórek somatycznych mieszków mieszkowych oraz niedojrzałych oocytów od osób poddawanych zapłodnieniu in vitro

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Poznaj metodę izolacji ludzkich pęcherzyków jajnikowych z tkanki kory do analiz ekspresji genów. Technika enzymatyczno-mechaniczna zachowuje integralność komórek, umożliwiając badanie funkcji jajników i wpływu czynników toksycznych.

Analizy ekspresji genów w ludzkich pęcherzykach

Przeglądaj więcej filmów