Testowanie skuteczności in vitro i in vivo nanocząstek mRNA-lipidów powstałych metodą mieszania mikroprzepływowego

Protokół ten można wykorzystać do sformułowania spójnych nanocząstek lipidowych zawierających MRA. Parametry preparatu można dostosować, a różne nanocząstki lipidowe można ocenić pod kątem ich siły działania i biodystrybucji. Ustandaryzowany protokół formułowania nanocząstek lipidowych oraz testów in vitro i in vivo może być wykorzystany do sformułowania spójnych nanocząstek lipidowych, które można ze sobą porównywać.

Istnieje wiele drobnych szczegółów, o których należy pamiętać podczas formułowania i oceny siły działania nanocząstek, ale które szczegóły zostały uwzględnione? Przygotowanie preparatu nie powinno być trudne. Zacznij od napełnienia czystej, czterolitrowej zlewki 200 do 300 mililitrami świeżego 10X PBS i rozcieńczenia go do 1X ultraczystą wodą.

Upewnij się, że końcowa objętość PBS wynosi od dwóch do trzech litrów. Umieścić kasety dializacyjne o pojemności odpowiedniej dla nanocząstki lipidowej lub preparatu LNP w zlewce polowej. Wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenie 100-milimolowego buforu kwasu cytrynowego przy użyciu ultraczystej wody, aby utworzyć 10-milimolowy bufor kwasu cytrynowego do rozcieńczenia mRNA.

Następnie przygotuj C 12 200 jonizowalnych roztworów podstawowych PEG lub lipidów zakotwiczonych w lipidach, cholesterolach i lipidach C 12 200, rozpuszczając każdy lipid w 100% etanolu. Upewnij się, że roztwory podstawowe są całkowicie rozpuszczone przez podgrzanie i zmieszanie ich w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Połącz obliczone objętości różnych składników lipidowych w stożkowej probówce.

Rozcieńczyć lipidy 100% etanolem do końcowej objętości V, co stanowi 25% końcowej objętości LNP. Obliczyć ilość mRNA wymaganą do formulacji na podstawie stosunku masy jonizowalnego lipidu do mRNA i całkowitej objętości mRNA-LNP. Następnie rozmrozić lucyferazy świetlika kodującej mRNA na lodzie.

Następnie rozcieńczyć mRNA do końcowej objętości trzykrotnie większej niż faza organiczna za pomocą 10-milimolowego buforu kwasu cytrynowego. Spryskaj delikatną chusteczkę zadaniową powierzchniowym środkiem odkażającym pod kątem RNA i DNA, a następnie dokładnie wytrzyj wnętrze instrumentu mikroprzepływowego. Następnie otwórz nowy wkład mikroprzepływowy i włóż go kanałami wlotowymi skierowanymi w dół i na zewnątrz.

Ułóż dwie sterylne stożkowe probówki o pojemności 15 mililitrów na uchwycie ze zdjętymi nakrętkami. Po zakończeniu napełnij pięciomililitrową strzykawkę roztworem mRNA zawierającym mRNA rozcieńczonym w 10-milimolowym buforze kwasu cytrynowego. Następnie napełnij trzymililitrową strzykawkę roztworem lipidów zawierającym lipidy rozcieńczone w 100% etanolu.

Upewnić się, że strzykawki zostały usunięte z powietrza. Następnie bez igły włóż pięciomililitrową strzykawkę zawierającą roztwór mRNA do lewego wlotu wkładu, a trzymililitrową strzykawkę zawierającą roztwór lipidów włóż do prawego wlotu wkładu. Włącz przyrząd mikroprzepływowy i wybierz szybki bieg.

Po wybraniu odpowiednich typów strzykawek dla włożonych strzykawek o pojemności pięciu i trzech mililitrów, wprowadź parametry preparatu LNP w stosunku natężenia przepływu wody do organicznej trzy do jednego, przed naciśnięciem przycisku start w celu sformułowania mRNA-LNP. Załadować mRNA-LNP zebrane w prawej stożkowej probówce do uprzednio uwodnionych kaset dializacyjnych za pomocą strzykawki bez nakłuwania lub dotykania membrany kasety, umieścić kasety dializacyjne zawierające mRNA-LNP z powrotem w zlewce zawierającej PBS i pozostawić do dializacji przez co najmniej dwie godziny. Po dializie należy przenieść kasety dializacyjne zawierające mRNA-LNP do sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego i usunąć mRNA-LNP za pomocą strzykawki z igłą.

Sterylnie przefiltruj mRNA-LNP za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,22 mikrometra i zbierz je w sterylnej stożkowej probówce. Następnie umieść 65 mikrolitrów roztworu mRNA-LNP w mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra w celu scharakteryzowania. Płytka 5 000 komórek HepG2 w białej ścianie, przezroczyste dno, 96-dołkowa płytka w 100 mikrolitrach kompletnej pożywki do hodowli komórkowych i inkubacja komórek przez noc w kontrolowanym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza zawierającej 5% dwutlenku węgla.

Przed poddaniem komórek działaniu mRNA-LNP należy usunąć całe podłoże z dołków. Następnie potraktuj komórki 100 mikrolitrami mRNA-LNP rozcieńczonymi w kompletnej pożywce do hodowli komórkowych w pożądanych dawkach lub 100 mikrolitrami kompletnej pożywki przed 24-godzinną inkubacją. Po inkubacji usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z 96-dołkowej płytki, dodać 20 mikrolitrów buforu do lizy do każdego dołka, a następnie 100 mikrolitrów odczynników do oznaczania lucyferazy.

Chroń płytkę przed światłem i umieść ją w czytniku płytek, aby zmierzyć sygnał bioluminescencyjny. Rozcieńczyć roztwór mRNA-LNP za pomocą sterylnego PBS tak, aby dwa mikrogramy całkowitego mRNA były obecne w 100 mikrolitrach objętości iniekcji żyły ogonowej. Napełnij strzykawkę insulinową o rozmiarze 29 100 mikrolitrami mRNA-LNP lub 100 mikrolitrami PBS i usuń wszelkie pęcherzyki ze strzykawki.

Włóż igłę skosem skierowanym do góry do bocznej żyły ogonowej myszy i powoli wstrzyknij 100 mikrolitrów mRNA-LNP lub PBS. Sześć godzin po wstrzyknięciu należy przygotować 15 miligramów na mililitr roztworu podstawowego soli potasowej D-Lucyferyny w sterylnym PBS. W oprogramowaniu do obrazowania dla systemu obrazowania in vivo (IVIS) zaznacz pole obok luminescencji przed naciśnięciem przycisku inicjalizuj, aby przygotować instrument do akwizycji danych.

Następnie podaj 200 mikrolitrów D-Lucyferyny dootrzewnowo wcześniej leczonym myszom i odczekaj 10 minut, aż sygnał lucyferazy ustabilizuje się przed znieczuleniem myszy. Przenieś znieczulone myszy do stożków nosowych wewnątrz systemu obrazowania in vivo, upewniając się, że leżą na plecach z odsłoniętymi brzuchami, przed zamknięciem drzwi komory. W oprogramowaniu do obrazowania upewnij się, że wybrano właściwe pole view i ustaw czas ekspozycji na automatyczny, kliknij przycisk pobierania w oprogramowaniu, aby uzyskać obrazy bioluminescencyjne.

Skuteczność enkapsulacji mRNA-LNP określono na 92,3% przy użyciu zmodyfikowanego testu fluorescencji i równania pokazanego tutaj. Zwiększenie bioluminescencji zaobserwowano po potraktowaniu 5 000 komórek HepG2 zwiększającymi się dawkami mRNA-LNP. Ekspresję lucyferazy można było łatwo wykryć przy najniższej dawce w tym badaniu, wynoszącej pięć nanogramów na studzienkę.

Silny sygnał bioluminescencyjny zaobserwowano w górnej części brzucha myszy leczonych sformułowanymi LNP. Obszary zainteresowania narysowano wokół sygnałów wątrobowych, aby obliczyć całkowity strumień luminescencyjny. Całkowity strumień luminescencyjny wynosił około pięć razy 10 do 9.

Zawsze utrzymuj stosunek masy jonizowalnych lipidów do kwasów nukleinowych podczas formułowania LNP. Każda objętość fazy organicznej powinna zawierać jonizowalny lipid odpowiadający mRNA w trzech objętościach fazy wodnej.