Name: Testowanie skuteczności in vitro i in vivo nanocząstek mRNA-lipidów powstałych metodą mieszania mikroprzepływowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj metodę formułowania nanocząstek lipidowych z mRNA metodą mikroprzepływową oraz ich testowanie in vitro w komórkach HepG2 i in vivo w myszach C57BL/6. Protokół umożliwia ocenę skuteczności dostarczania mRNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.J.M. dziękuje za wsparcie od Dyrektora Nowych Innowatorów Amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) (DP2 TR002776), Burroughs Wellcome Fund Career Award na Scientific Interface (CASI), nagrody CAREER przyznanej przez amerykańską National Science Foundation (CBET-2145491) oraz dodatkowych funduszy od National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 i NIDDK R01 DK123049).

UWAGA: Zawsze utrzymuj warunki wolne od RNaz podczas formułowania mRNA-LNP, przecierając powierzchnie i sprzęt środkiem odkażającym powierzchnię pod kątem RNaz i DNA. Używaj tylko końcówek i odczynników wolnych od RNaz.
Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych na Uniwersytecie Pensylwanii oraz protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Pensylwanii.
1. Przygotowanie preparatu
<ol>
	<li>Napełnij czystą 4-litrową zlewkę 200-300 ml świeżej soli fizjologicznej buforowanej 10 x fosforanami (PBS).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 10x PBS w zlewce 10-krotnie ultraczystą wodą, aby uzyskać zlewkę z 1x PBS. Upewnij się, że końcowa objętość 1x PBS wynosi od 2 do 3 l.</li>
		<li>Umieścić kasety dializacyjne (odcięta masa cząsteczkowa 20 kDa [MWCO]) o pojemności odpowiedniej dla preparatu LNP w napełnionej zlewce w celu ich uwodnienia. 
		UWAGA: Kasety do dializy wymagają co najmniej 2 minut na nawodnienie przed użyciem.</li>
		<li>Umieść mieszadło w zlewce i przykryj ją folią aluminiową.</li>
		<li>Umieść przykrytą zlewkę na magnetycznej płytce mieszającej. Włącz płytkę mieszającą i ustaw ją tak, aby obracała się z prędkością 300-400 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć 100 mM bufor buforowy kwasu cytrynowego (pH 3) 10-krotnie ultraczystą wodą, aby utworzyć 10 mM bufor kwasu cytrynowego używany do rozcieńczania mRNA.</li>
	<li>Przygotuj jonizowalne roztwory lipidowe, lipidowe pomocnicze, cholesterolowe i podstawowe PEG (lipid-PEG) zakotwiczone w lipidach C12-200, rozpuszczając każdy lipid w 100% etanolu. Stężenia składników lipidowych są wyszczególnione w Tabeli 1.
	<ol>
		<li>Podgrzać i wymieszać roztwory podstawowe w temperaturze 37 °C, aby upewnić się, że są całkowicie rozpuszczone.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie mieszanin lipidów i kwasów nukleinowych
<ol>
	<li>Oblicz wymagane objętości jonizowalnego lipidu, lipidu pomocniczego, cholesterolu i lipid-PEG w oparciu o pożądany stosunek molowy i stosunek masy jonizowalnego lipidu do mRNA (Tabela 1). Przygotować 10% dodatkowej objętości fazy organicznej, aby uwzględnić martwą objętość w strzykawkach podczas formułowania.
	<ol>
		<li>Połącz obliczone objętości różnych składników lipidowych w stożkowej probówce.</li>
		<li>Rozcieńczyć lipidy 100% etanolem do końcowej objętości V, która stanowi 25% końcowej objętości LNP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć ilość mRNA wymaganą do formulacji na podstawie stosunku masy jonizowalnego lipidu do mRNA i całkowitej objętości potrzebnego mRNA-LNP (Tabela 1).
	<ol>
		<li>Rozmrozić mRNA kodujące lucyferazy świetlika na lodzie.</li>
		<li>Rozcieńczyć mRNA do końcowej objętości, 3V, trzykrotności objętości fazy organicznej, w 10 mM buforze kwasu cytrynowego. 
		UWAGA: Każda objętość lipidu, V, musi zawierać wystarczającą ilość jonizowalnego lipidu dla mRNA rozcieńczonego w 3V. Odpowiada to pożądanemu stosunkowi masy lipidów do mRNA, który można zjonizować.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mikroprzepływowy preparat mRNA-LNP
<ol>
	<li>Spryskaj delikatną chusteczkę zadaniową środkiem odkażającym powierzchnię pod kątem RNaz i DNA, a następnie dokładnie wytrzyj wnętrze instrumentu mikroprzepływowego.
	<ol>
		<li>Otwórz nowy wkład mikroprzepływowy i włóż go kanałami wlotowymi skierowanymi w dół i na zewnątrz.</li>
		<li>Upewnij się, że stożkowe ramię probówki mieści dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml i znajduje się w pozycji najbardziej wysuniętej na prawo.</li>
		<li>Skonfiguruj dwie sterylne stożkowe probówki o pojemności 15 ml na uchwycie ze zdjętymi nakrętkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml roztworem mRNA, który zawiera mRNA rozcieńczony w 10 mM buforze kwasu cytrynowego.
	<ol>
		<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml roztworem lipidów, który zawiera lipidy rozcieńczone w czystym 100% etanolu.</li>
		<li>Podnieś uchwyt wkładu na urządzeniu mikroprzepływowym.</li>
		<li>Włożyć strzykawkę o pojemności 5 ml bez igły zawierającą mRNA do lewego wlotu wkładu.</li>
		<li>Włożyć strzykawkę o pojemności 3 ml bez igły zawierającej lipidy do prawego wlotu wkładu.</li>
		<li>Odchyl uchwyt wkładu z powrotem w dół i zamknij pokrywę przyrządu mikroprzepływowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz przyrząd mikroprzepływowy za pomocą przełącznika znajdującego się z tyłu przyrządu.
	<ol>
		<li>Wybierz opcję Szybki bieg.</li>
		<li>Należy wybrać odpowiednie typy strzykawek dla wprowadzonych strzykawek o pojemności 5 ml i 3 ml.</li>
		<li>Wprowadzić parametry do formulacji mRNA-LNP przy stosunku natężenia przepływu wody do substancji organicznych 3:1, jak opisano w tabeli 2.</li>
		<li>Naciśnij przycisk Dalej, aby przejść do następnego ekranu.</li>
		<li>Upewnij się, że zostały wprowadzone poprawne parametry.</li>
		<li>Naciśnij przycisk Start, aby sformułować mRNA-LNPs.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie i charakterystyka mRNA-LNP po formulacji
<ol>
	<li>Załaduj mRNA-LNP zebrane w prawej stożkowej probówce do uprzednio uwodnionych kaset dializacyjnych. 
	UWAGA: Nie przekłuwać ani nie uszkadzać membrany kasety podczas ładowania mRNA-LNPs. Jeśli membrana zostanie uszkodzona, mRNA-LNP zostaną utracone po załadowaniu.
	<ol>
		<li>Umieść kasety dializacyjne zawierające mRNA-LNP z powrotem w zlewce zawierającej 1x PBS i pozostaw je do dializacji przez co najmniej 2 godziny.</li>
		<li>Po dializie należy przenieść kasety dializacyjne zawierające mRNA-LNP do sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego i usunąć mRNA-LNP za pomocą strzykawki z igłą.</li>
		<li>Przefiltruj sterylnie mRNA-LNP za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm i zbierz je w sterylnej stożkowej probówce.</li>
		<li>Umieścić 65 μl roztworu mRNA-LNP w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml w celu scharakteryzowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć 10 μl mRNA-LNPs 1:100 w 990 μL 1x PBS w kuwecie w celu pomiaru wielkości hydrodynamicznej i wskaźnika polidyspersyjności przy użyciu dynamicznego rozpraszania światła.</li>
	<li>Oceń stężenie i skuteczność enkapsulacji mRNA-LNP za pomocą testu fluorescencyjnego (tj. RiboGreen).
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 1x buforu TE, rozcieńczając 20x bufor TE wodą z biologii molekularnej.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 1% buforu Triton X-100, rozcieńczając Triton X-100 1x buforem TE.</li>
		<li>Przygotować odczynnik fluorescencyjny, rozcieńczając podstawowy odczynnik w stosunku 1:200 z 1x buforem TE.</li>
		<li>Rozcieńczyć mRNA-LNP w stosunku 1:100 w 1x buforze TE i 1% buforze Triton X-100 w 96-dołkowej płytce o czarnych ściankach w 100 μl.</li>
		<li>Przygotuj krzywą wzorcową niskiego zakresu, rozcieńczając wzorzec RNA zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie umieść krzywą wzorcową na płytce 96-dołkowej.</li>
		<li>Dodać 100 μl rozcieńczonego odczynnika fluorescencyjnego do każdej studzienki zawierającej rozcieńczony mRNA-LNP lub rozcieńczony wzorzec.</li>
		<li>Umieścić 96-dołkową płytkę w czytniku płytek i wstrząsać przez 1 minutę, a następnie odczekać 4 minuty.</li>
		<li>Zmierzyć intensywność fluorescencji każdej studzienki zgodnie z protokołem producenta przy wzbudzeniu/emisji 480 nm/520 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj krzywej standardowej, aby przeliczyć wartości fluorescencji na stężenia.
	<ol>
		<li>Obliczyć skuteczność enkapsulacji, odejmując wartość uzyskaną z rozcieńczenia LNP w buforze TE (niekapsułkowane mRNA) od wartości otrzymanej z rozcieńczenia LNP w 1% Triton X-100 (całkowite mRNA) i dzieląc przez wartość otrzymaną z rozcieńczenia LNP w 1% Triton X-100, zgodnie z równaniem 4.4.</li>
		<li>Obliczyć stężenie mRNA-LNP stosowane w badaniach komórkowych i zwierzęcych, odejmując wartość uzyskaną z rozcieńczenia LNP w buforze TE (niekapsułkowane mRNA) od wartości uzyskanej z rozcieńczenia LNP w 1% Triton X-100 (całkowite mRNA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz pKa mRNA-LNP, wykonując test chlorku 6-(p-toluidyn)-2-naftalenosulfonylu (TNS).
	<ol>
		<li>Przygotować odczynnik TNS, tworząc 0,16 mM roztwór TNS w ultraczystej wodzie. 
		UWAGA: Podczas używania odczynnika należy trzymać go na lodzie i z dala od światła, aby uniknąć degradacji.</li>
		<li>Przygotować buforowe roztwory 150 mM chlorku sodu, 20 mM fosforanu sodu, 25 mM cytrynianu amonu i 20 mM octanu amonu dostosowane do różnych wartości pH w zakresie od 2 do 12 w krokach co 0,5.</li>
		<li>Dodać 2,5 μl LNP do każdego roztworu buforowego o dostosowanym pH w 96-dołkowej płytce o czarnych ściankach.</li>
		<li>Dodaj odczynnik TNS do każdego dołka, tak aby końcowe stężenie TNS wynosiło 6 μM.</li>
		<li>Inkubować 96-dołkową płytkę w ciemnym miejscu przez 5 minut.</li>
		<li>Zmierzyć fluorescencję przy wzbudzeniu/emisji 322 nm/431 nm za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych.</li>
		<li>Dopasuj dane do krzywej sigmoidalnej i oblicz pKa, korzystając z dopasowanego równania, aby znaleźć pH, przy którym zaobserwowano 50% maksymalnej intensywności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reprezentatywne wyniki dla wielkości hydrodynamicznej mRNA-LNP, PDI, skuteczności enkapsulacji i pKa przedstawiono w tabeli 3.</li>
</ol>
5. Transfekcja in vitro komórek HepG2
UWAGA: Różne inne linie komórkowe, takie jak komórki HeLa lub komórki HEK-293T, mogą być używane do oceny efektywności transfekcji LNP in vitro. Wszystkie komórki powinny mieć ujemny wynik testu na obecność mykoplazmy przed badaniami transfekcji LNP.
<ol>
	<li>Umieścić 5 000 komórek HepG2 w każdym dołku 96-dołkowej płytki o przezroczystych ściankach o białych ściankach w 100 μl kompletnej pożywki do hodowli komórkowych (DMEM uzupełniony 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny)
	<ol>
		<li>Pozostawić komórki do przylegania na noc w kontrolowanym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć mRNA-LNP w kompletnej pożywce do hodowli komórkowych tak, aby całkowita dawka została dostarczona w 100 μl.
	<ol>
		<li>Usuń całe podłoże z dołków.</li>
		<li>Poddać komórki działaniu mRNA-LNP rozcieńczonych w kompletnej pożywce do hodowli komórkowej w pożądanych dawkach lub pełnej pożywce (kontrola).</li>
		<li>Umieścić 96-dołkową płytkę zawierającą leczone komórki z powrotem w kontrolowanym inkubatorze CO2 na 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń skuteczność transfekcji, wykonując test lucyferazy.
	<ol>
		<li>Przygotuj odczynnik lucyferazy i 1x bufor do lizy komórek zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Wyjąć z inkubatora 96-dołkową płytkę zawierającą komórki i umieścić ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z każdego dołka płytki 96-dołkowej.</li>
		<li>Dodać 20 μl 1x buforu do lizy do każdej studzienki, a następnie 100 μl wcześniej przygotowanego odczynnika do oznaczania lucyferazy.</li>
		<li>Chroń płytkę przed światłem i umieść płytkę w czytniku płytek, aby zmierzyć sygnał bioluminescencyjny każdej studzienki. 
		UWAGA: Reprezentatywne wyniki pokazujące traktowanie komórek HepG2 wcześniej sformułowanymi C12-200 mRNA-LNP są pokazane na <silna klasa = "xfig">Rysunek 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Ocena in vivo mRNA-LNP u myszy po wstrzyknięciu do żyły ogonowej
<ol>
	<li>Rozcieńczyć roztwór mRNA-LNP sterylnym 1x PBS tak, aby 2 μg całkowitego mRNA było obecne w 100 μl objętości iniekcji do żyły ogonowej, co odpowiada dawce około 0,1 mg/kg masy ciała dla myszy 20 g.</li>
	<li>Unieruchomij każdą mysz zatwierdzoną metodą i przetrzyj ogon podkładką zwilżoną 70% alkoholem.
	<ol>
		<li>Napełnij strzykawkę insulinową 29 G 100 μl mRNA-LNP (2 μg) lub 100 μL 1x PBS. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki.</li>
		<li>Włóż igłę skosem skierowanym do góry do bocznej żyły ogonowej myszy i powoli wstrzyknij 100 μl mRNA-LNP lub 1x PBS.</li>
		<li>Wyjąć igłę i uciskać, aż do uzyskania hemostazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 15 mg/ml soli potasowej d-lucyferyny w sterylnym 1x PBS 6 godzin po wstrzyknięciu.
	<ol>
		<li>Włącz system obrazowania in vivo (IVIS) i otwórz oprogramowanie do obrazowania.</li>
		<li>Naciśnij przycisk Inicjalizuj, aby przygotować instrument do akwizycji danych.</li>
		<li>Zaznacz pole obok luminescencji i ustaw czas ekspozycji na automatyczny. Upewnij się, że wybrano właściwe pole view dla liczby obrazowanych myszy.</li>
		<li>Podaj 200 μl d-lucyferyny dootrzewnowo (150 mg lucyferyny na kg masy ciała) wcześniej leczonym myszom.</li>
		<li>Umieść myszy w komorze anestezjologicznej ustawionej na 2,5% izofluranu i natężenie przepływu tlenu 2,0 l/min.</li>
		<li>Odczekaj 10 minut, aż sygnał lucyferazy ustabilizuje się przed obrazowaniem myszy leczonych mRNA-LNP.</li>
		<li>Upewnij się, że myszy są w pełni znieczulone i przekieruj linię anestezjologiczną, aby podać izofluran przez stożki nosowe wewnątrz komory obrazowania.</li>
		<li>Przenieś myszy do stożków nosowych i upewnij się, że leżą na plecach z odsłoniętymi brzuchami.</li>
		<li>Zamknij drzwi komory i kliknij przycisk Acquire w oprogramowaniu, aby uzyskać obrazy bioluminescencji. 
		UWAGA: Reprezentatywne wyniki obrazowania całego ciała myszy po leczeniu mRNA-LNP lub 1X PBS przedstawiono na <silna klasa="xfig">Rysunek 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+organ+targeting+%28SORT%29+nanoparticles+for+tissue-specific+mRNA+delivery+and+CRISPR-Cas+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li>
<li>Wood, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+approves+patisiran+to+treat+hereditary+transthyretin+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509(2018).</li>
<li>Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+of+patisiran%2C+the+first+approved+RNA+interference+therapy+in+patients+With+hereditary+transthyretin-mediated+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis.</a> Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).</li>
<li>Shepherd, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+mRNA+and+siRNA+lipid+nanoparticle+production+using+a+parallelized+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device.</a> Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).</li>
<li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li>
<li>Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery%3A+Applications+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).</li>
<li>Akhtar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+siRNA+and+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides.</a> Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).</li>
<li>Guimaraes, P. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizable+lipid+nanoparticles+encapsulating+barcoded+mRNA+for+accelerated+in+vivo+delivery+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening.</a> Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).</li>
<li>Qiu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticle-mediated+codelivery+of+Cas9+mRNA+and+single-guide+RNA+achieves+liver-specific+in+vivo+genome+editing+of+Angptl3%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118(2021).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper+lipid+structure+influences+protein+adsorption+and+delivery+of+lipid+nanoparticles+to+spleen+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver.</a> Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).</li>
<li>El-Mayta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nanoparticle+platform+for+accelerated+in+vivo+oral+delivery+screening+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids.</a> Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111(2021).</li>
<li>Patel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally-occurring+cholesterol+analogues+in+lipid+nanoparticles+induce+polymorphic+shape+and+enhance+intracellular+delivery+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA.</a> Nature Communications. 11, 983(2020).</li>
<li>Kulkarni, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+lipid+nanoparticles+for+in+vitro+and+in+vivo+delivery+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).</li>
<li>Cheng, X., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticles+%28LNPs%29+designed+for+oligonucleotide+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).</li>
<li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).</li>
<li>Granot, Y., Peer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+the+right+message%3A+Challenges+and+opportunities+in+lipid+nanoparticles-mediated+modified+mRNA+therapeutics-An+innate+immune+system+standpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint.</a> Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).</li>
<li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+containing+constrained+phospholipids+deliver+mRNA+to+liver+immune+cells+in+vivo+without+targeting+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161(2020).</li>
<li>Patel, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxycholesterol+substitution+in+ionizable+lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery+to+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells.</a> Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).</li>
<li>Robinson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticle-delivered+chemically+modified+mRNA+restores+chloride+secretion+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis.</a> Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).</li>
<li>Love, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-like+materials+for+low-dose%2C+in+vivo+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li>
<li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizable+lipid+nanoparticle-mediated+mRNA+delivery+for+human+CAR+T+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering.</a> Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).</li>
<li>Ramaswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+factor+IX+messenger+RNA+for+protein+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).</li>
<li>Leung, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+containing+siRNA+synthesized+by+microfluidic+mixing+exhibit+an+electron-dense+nanostructured+core%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core.</a> Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).</li>
<li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+design+of+experiments+for+optimization+of+lipid+nanoparticles+for+mRNA+engineering+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells.</a> Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).</li>
<li>Khalil, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+administration+of+D-luciferin+is+an+effective+alternative+to+intraperitoneal+injection+in+bioluminescence+imaging+of+xenograft+tumors+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice.</a> ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279(2013).</li>
<li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD+peptide-based+lipids+for+targeted+mRNA+delivery+and+gene+editing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications.</a> RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).</li>
<li>Pardi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+kinetics+of+nucleoside-modified+mRNA+delivered+in+lipid+nanoparticles+to+mice+by+various+routes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes.</a> Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).</li>
<li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+administration+of+CRISPR%2FCas9+lipid+nanoparticles+achieves+robust+and+persistent+in+vivo+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li>
<li>Truong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticle-targeted+mRNA+therapy+as+a+treatment+for+the+inherited+metabolic+liver+disorder+arginase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).</li>
<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimer-based+lipid+nanoparticles+deliver+therapeutic+FAH+mRNA+to+normalize+liver+function+and+extend+survival+in+a+mouse+model+of+hepatorenal+tyrosinemia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I.</a> Advanced Materials. 30 (52), 1805308(2018).</li>
<li>Sedic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+evaluation+of+lipid+nanoparticle-formulated+modified+mRNA+in+the+Sprague-Dawley+rat+and+cynomolgus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey.</a> Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).</li>
<li>Veiga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+specific+delivery+of+modified+mRNA+expressing+therapeutic+proteins+to+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 4493(2018).</li>
<li>Pattipeiluhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anionic+lipid+nanoparticles+preferentially+deliver+mRNA+to+the+hepatic+reticuloendothelial+system%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system.</a> Advanced Materials. 34 (16), 2201095(2022).</li>
<li>Rosenblum, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+editing+using+targeted+lipid+nanoparticles+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy.</a> Science Advances. 6 (47), (2020).</li>
<li>Fenton, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+alkenyl+amino+alcohol+ionizable+lipid+materials+for+highly+potent+in+vivo+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery.</a> Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li>
<li>Tombácz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CD4%2B+T+cell+targeting+and+genetic+recombination+using+engineered+CD4%2B+cell-homing+mRNA-LNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+lipid+nanoparticles+for+enhanced+intracellular+delivery+of+mRNA+through+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano%22%5BJournal%5D)">Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation.</a> Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).</li>
<li>Bevers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-LNP+vaccines+tuned+for+systemic+immunization+induce+strong+antitumor+immunity+by+engaging+splenic+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells.</a> Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).</li>
</ol>

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by zadeklarować.

Dzięki takiemu przepływowi pracy można formułować i testować różne mRNA-LNP pod kątem ich skuteczności in vitro i in vivo. Jonizowalne lipidy i substancje pomocnicze można wymieniać i łączyć przy różnych proporcjach molowych i różnych proporcjach masy lipidów do mRNA w celu wytworzenia mRNA-LNP o różnych właściwościach fizykochemicznych22. Tutaj opracowaliśmy C12-200 mRNA-LNP o stosunku molowym 35/16/46,5/2,5 (jonizowalny lipid:pomocnik lipid:cholesterol:lipid-PEG) przy stosunku ...

Nanocząsteczki lipidowe (LNP) okazały się bardzo obiecujące w ostatnich latach w dziedzinie niewirusowej terapii genowej. W 2018 roku Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zatwierdziła pierwszy w historii lek na interferencję RNA (RNAi), Onpattro firmy Alnylam, do leczenia dziedzicznej amyloidozy transtyretynowej1,2,3,4. Był to ważny krok naprzód w dziedzinie nanocząsteczek lipidowych i terapii opartych na RNA. Niedawno firmy Moderna i Pfizer/BioNTech otrzymały zatwierdzenia FDA dla swoich szczepionek mRNA-LNP przeciwko SARS-CoV-24,5. W każdej z tych terapii kwasami nukleinowymi opartymi na LNP, LNP służy do ochrony swojego ładunku przed degradacją przez nukleazy i ułatwia silne dostarczanie wewnątrzkomórkowe6,7. Podczas gdy LNP odniosły sukces w terapiach RNAi i zastosowaniach szczepionek, mRNA-LNP były również badane pod kątem zastosowania w terapiach zastępczych białek8, a także do jednoczesnego dostarczania mRNA Cas9 i przewodnika RNA do dostarczania systemu CRISPR-Cas9 do edycji genów9. Nie ma jednak jednej konkretnej formuły, która byłaby dobrze dopasowana do wszystkich zastosowań, a subtelne zmiany w parametrach preparatu LNP mogą znacznie wpłynąć na siłę działania i biodystrybucję in vivo8,10,11. W związku z tym należy opracować i ocenić poszczególne mRNA-LNP w celu określenia optymalnego preparatu dla każdej terapii opartej na LNP.
LNP są zwykle formułowane z czterema składnikami lipidowymi: jonizowalnym lipidem, fosfolipidem, cholesterolem i koniugatem lipidowo-glikolowym (PEG) (lipid-PEG)11,12,13. Silne dostarczanie wewnątrzkomórkowe ułatwione przez LNP opiera się częściowo na jonizowalnym składniku lipidowym12. Składnik ten jest obojętny w fizjologicznym pH, ale staje się dodatnio naładowany w kwaśnym środowisku endosome11. Uważa się, że ta zmiana ładunku jonowego jest kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do ucieczki endosomalnej12,14,15. Oprócz jonizowalnego lipidu, składnik fosfolipidowy (lipid pomocniczy) poprawia enkapsulację ładunku i pomaga w ucieczce endosomalnej, cholesterol zapewnia stabilność i wzmacnia fuzję błony, a lipid-PEG minimalizuje agregację i opsonizację LNP w krążeniu10,11,14,16. Aby sformułować LNP, te składniki lipidowe są łączone w fazie organicznej, zwykle etanolu, i mieszane z fazą wodną zawierającą ładunek kwasu nukleinowego. Proces formulacji LNP jest bardzo wszechstronny, ponieważ pozwala na łatwe podstawianie i łączenie różnych składników w różnych proporcjach molowych w celu sformułowania wielu preparatów LNP o wielu właściwościach fizykochemicznych10,17. Jednak podczas badania tej ogromnej różnorodności LNP ważne jest, aby każda formuła była oceniana przy użyciu ustandaryzowanej procedury w celu dokładnego zmierzenia różnic w charakterystyce i działaniu.
Tutaj przedstawiono kompletny proces tworzenia mRNA-LNP i oceny ich wydajności w komórkach i zwierzętach.

<table><tbody><tr><td>0,1 M Kwas solny</td><td>Sigma</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m Filtry strzykawkowe</td><td>Genesee</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 mL BD Strzykawka z końcówką ślizgową</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa) (C14-PEG2000)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880150P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (DOPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850725P</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Probówki Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki stożkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>200-proof Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Igły 23G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-6C</td><td></td></tr><tr><td>3 mL BD Jednorazowe strzykawki z końcówkami Luer-Lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>Dializa 3 ml Kasety</td><td>Thermo Scientific</td><td>A52976</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Black Wall Black Bottom Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-135</td><td></td></tr><tr><td>96 Well White/Clear Płyta dolna, TC Surface</td><td>Thermo Scientific</td><td>165306</td><td></td></tr><tr><td>octan amonu, 1 kilogram</td><td>Research Products International</td><td>&nbsp; 631-61-8</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian amonu dwuzasadowy</td><td>SIgma</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer-Lok Strzykawka sterylna, jednorazowego użytku, 5 ml</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>C12-200 Jonizowalny lipid</td><td>Cayman Chemical</td><td>36699</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap FLuc mRNA (5moU)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>L-7202</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety jednorazowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955129</td><td></td></tr><tr><td>D-Lucyferin, Sól Potasowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>L2916</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe Exel - 0,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>1484132</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hep G2 [HEPG2]</td> <td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HyPure Biologia molekularna Klasa Woda</td><td>Cytiva</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO Czytnik płytek</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum System obrazowania In Vivo</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Duże chusteczki</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-11D</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania lucyferazy</td><td>Promega</td><td>E4550</td><td></td></tr><tr><td>NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 sztuk</td><td>Precision Nanosystems</td><td>NIN0065</td><td></td></tr><tr><td>NanoAssemblr Ignite</td><td>Instrument Precision Nanosystems</td><td>NIN0001</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x) pH 7,4, bez RNaz</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermofisher Scientific 15140122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QB Bufor cytrynianowy, (cytrynian 100 mM) pH 3,0</td><td>Teknova</td><td>Q2442</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania RNA Quant-it RiboGreen</td><td>Thermo Scientific</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>Reporter Lysis 5x Bufor</td><td>Promega</td><td>E3971</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away Odkażacz powierzchniowy</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Sigma</td><td>7601-54-9</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TNS (sól sodowa kwasu 6-(p-toluidyno)-2-naftalenosulfonowego)Sigma</td><td></td> <td>T9792</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoZS</td><td></td></tr></tbody></table>

testowanie skuteczności in vitro i in vivo nanocząstek mrna-lipidów powstałych metodą mieszania mikroprzepływowego

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Nanocząsteczki lipidowe (LNP) przyciągnęły ostatnio powszechną uwagę dzięki pomyślnemu opracowaniu szczepionek mRNA COVID-19 przez Modernę i Pfizer/BioNTech. Szczepionki te wykazały skuteczność terapii mRNA-LNP i otworzyły drzwi do przyszłych zastosowań klinicznych. W systemach mRNA-LNP LNP służą jako platformy dostarczeniowe, które chronią ładunek mRNA przed degradacją przez nukleazy i pośredniczą w ich dostarczaniu wewnątrzkomórkowym. LNP składają się zazwyczaj z czterech składników: jonizowalnego lipidu, fosfolipidu, cholesterolu i koniugatu glikolu polietylenowego (PEG) zakotwiczonego w lipidach (LIPID-PEG). W tym przypadku LNP kapsułkujące mRNA kodujące lucyferazy świetlika są formułowane przez mikroprzepływowe mieszanie fazy organicznej zawierającej składniki lipidowe LNP i fazy wodnej zawierającej mRNA. Te mRNA-LNP są następnie testowane in vitro w celu oceny ich skuteczności transfekcji w komórkach HepG2 za pomocą testu opartego na płytce bioluminescencyjnej. Ponadto mRNA-LNP są oceniane in vivo u myszy C57BL / 6 po wstrzyknięciu dożylnym przez boczną żyłę ogonową. Obrazowanie bioluminescencyjne całego ciała wykonuje się przy użyciu systemu obrazowania in vivo. Przedstawiono reprezentatywne wyniki dla charakterystyki mRNA-LNP, ich skuteczności transfekcji w komórkach HepG2 oraz całkowitego strumienia luminescencyjnego u myszy C57BL/6.

mRNA-LNP sformułowano przy użyciu urządzenia mikrofluidycznego; uzyskały one średnicę hydrodynamiczną wynoszącą 76,16 nm oraz indeks polidyspersyjności 0,098. Wartość pKa dla mRNA-LNP wyniosła 5,75, co ustalono za pomocą testu TNS18. Wydajność enkapsulacji dla tych mRNA-LNP obliczono na 92,3%, wykorzystując zmodyfikowany test fluorescencyjny oraz równanie 4.4. Całkowite stężenie RNA zastosowane do traktowania komórek i podawania dawkom zwierzęcym wynosiło 40,24...

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia nanocząsteczek lipidowych (LNP), które zawierają mRNA kodujące lucyferazy świetlika. Te LNP zostały przetestowane pod kątem ich siły działania in vitro w komórkach HepG2 i in vivo u myszy C57BL / 6.

Testowanie skuteczności in vitro i in vivo nanocząstek mRNA-lipidów powstałych metodą mieszania mikroprzepływowego

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and ...

Protokół ten można wykorzystać do sformułowania spójnych nanocząstek lipidowych zawierających MRA. Parametry preparatu można dostosować, a różne nanocząstki lipidowe można ocenić pod kątem ich siły działania i biodystrybucji. Ustandaryzowany protokół formułowania nanocząstek lipidowych oraz testów in vitro i in vivo może być wykorzystany do sformułowania spójnych nanocząstek lipidowych, które można ze sobą porównywać.Istnieje wiele drobnych szczegółów, o których należy pamiętać podczas formułowania i oceny siły działania nanocząstek, ale które szczegóły zostały uwzględnione? Przygotowanie preparatu nie powinno być trudne. Zacznij od napełnienia czystej, czterolitrowej zlewki 200 do 300 mililitrami świeżego 10X PBS i rozcieńczenia go do 1X ultraczystą wodą.Upewnij się, że końcowa objętość PBS wynosi od dwóch do trzech litrów. Umieścić kasety dializacyjne o pojemności odpowiedniej dla nanocząstki lipidowej lub preparatu LNP w zlewce polowej. Wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenie 100-milimolowego buforu kwasu cytrynowego przy użyciu ultraczystej wody, aby utworzyć 10-milimolowy bufor kwasu cytrynowego do rozcieńczenia mRNA.Następnie przygotuj C 12 200 jonizowalnych roztworów podstawowych PEG lub lipidów zakotwiczonych w lipidach, cholesterolach i lipidach C 12 200, rozpuszczając każdy lipid w 100% etanolu. Upewnij się, że roztwory podstawowe są całkowicie rozpuszczone przez podgrzanie i zmieszanie ich w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Połącz obliczone objętości różnych składników lipidowych w stożkowej probówce.Rozcieńczyć lipidy 100% etanolem do końcowej objętości V, co stanowi 25% końcowej objętości LNP. Obliczyć ilość mRNA wymaganą do formulacji na podstawie stosunku masy jonizowalnego lipidu do mRNA i całkowitej objętości mRNA-LNP. Następnie rozmrozić lucyferazy świetlika kodującej mRNA na lodzie.Następnie rozcieńczyć mRNA do końcowej objętości trzykrotnie większej niż faza organiczna za pomocą 10-milimolowego buforu kwasu cytrynowego. Spryskaj delikatną chusteczkę zadaniową powierzchniowym środkiem odkażającym pod kątem RNA i DNA, a następnie dokładnie wytrzyj wnętrze instrumentu mikroprzepływowego. Następnie otwórz nowy wkład mikroprzepływowy i włóż go kanałami wlotowymi skierowanymi w dół i na zewnątrz.Ułóż dwie sterylne stożkowe probówki o pojemności 15 mililitrów na uchwycie ze zdjętymi nakrętkami. Po zakończeniu napełnij pięciomililitrową strzykawkę roztworem mRNA zawierającym mRNA rozcieńczonym w 10-milimolowym buforze kwasu cytrynowego. Następnie napełnij trzymililitrową strzykawkę roztworem lipidów zawierającym lipidy rozcieńczone w 100% etanolu.Upewnić się, że strzykawki zostały usunięte z powietrza. Następnie bez igły włóż pięciomililitrową strzykawkę zawierającą roztwór mRNA do lewego wlotu wkładu, a trzymililitrową strzykawkę zawierającą roztwór lipidów włóż do prawego wlotu wkładu. Włącz przyrząd mikroprzepływowy i wybierz szybki bieg.Po wybraniu odpowiednich typów strzykawek dla włożonych strzykawek o pojemności pięciu i trzech mililitrów, wprowadź parametry preparatu LNP w stosunku natężenia przepływu wody do organicznej trzy do jednego, przed naciśnięciem przycisku start w celu sformułowania mRNA-LNP. Załadować mRNA-LNP zebrane w prawej stożkowej probówce do uprzednio uwodnionych kaset dializacyjnych za pomocą strzykawki bez nakłuwania lub dotykania membrany kasety, umieścić kasety dializacyjne zawierające mRNA-LNP z powrotem w zlewce zawierającej PBS i pozostawić do dializacji przez co najmniej dwie godziny. Po dializie należy przenieść kasety dializacyjne zawierające mRNA-LNP do sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego i usunąć mRNA-LNP za pomocą strzykawki z igłą.Sterylnie przefiltruj mRNA-LNP za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,22 mikrometra i zbierz je w sterylnej stożkowej probówce. Następnie umieść 65 mikrolitrów roztworu mRNA-LNP w mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra w celu scharakteryzowania. Płytka 5 000 komórek HepG2 w białej ścianie, przezroczyste dno, 96-dołkowa płytka w 100 mikrolitrach kompletnej pożywki do hodowli komórkowych i inkubacja komórek przez noc w kontrolowanym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza zawierającej 5% dwutlenku węgla.Przed poddaniem komórek działaniu mRNA-LNP należy usunąć całe podłoże z dołków. Następnie potraktuj komórki 100 mikrolitrami mRNA-LNP rozcieńczonymi w kompletnej pożywce do hodowli komórkowych w pożądanych dawkach lub 100 mikrolitrami kompletnej pożywki przed 24-godzinną inkubacją. Po inkubacji usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z 96-dołkowej płytki, dodać 20 mikrolitrów buforu do lizy do każdego dołka, a następnie 100 mikrolitrów odczynników do oznaczania lucyferazy.Chroń płytkę przed światłem i umieść ją w czytniku płytek, aby zmierzyć sygnał bioluminescencyjny. Rozcieńczyć roztwór mRNA-LNP za pomocą sterylnego PBS tak, aby dwa mikrogramy całkowitego mRNA były obecne w 100 mikrolitrach objętości iniekcji żyły ogonowej. Napełnij strzykawkę insulinową o rozmiarze 29 100 mikrolitrami mRNA-LNP lub 100 mikrolitrami PBS i usuń wszelkie pęcherzyki ze strzykawki.Włóż igłę skosem skierowanym do góry do bocznej żyły ogonowej myszy i powoli wstrzyknij 100 mikrolitrów mRNA-LNP lub PBS. Sześć godzin po wstrzyknięciu należy przygotować 15 miligramów na mililitr roztworu podstawowego soli potasowej D-Lucyferyny w sterylnym PBS. W oprogramowaniu do obrazowania dla systemu obrazowania in vivo (IVIS) zaznacz pole obok luminescencji przed naciśnięciem przycisku inicjalizuj, aby przygotować instrument do akwizycji danych.Następnie podaj 200 mikrolitrów D-Lucyferyny dootrzewnowo wcześniej leczonym myszom i odczekaj 10 minut, aż sygnał lucyferazy ustabilizuje się przed znieczuleniem myszy. Przenieś znieczulone myszy do stożków nosowych wewnątrz systemu obrazowania in vivo, upewniając się, że leżą na plecach z odsłoniętymi brzuchami, przed zamknięciem drzwi komory. W oprogramowaniu do obrazowania upewnij się, że wybrano właściwe pole view i ustaw czas ekspozycji na automatyczny, kliknij przycisk pobierania w oprogramowaniu, aby uzyskać obrazy bioluminescencyjne.Skuteczność enkapsulacji mRNA-LNP określono na 92,3% przy użyciu zmodyfikowanego testu fluorescencji i równania pokazanego tutaj. Zwiększenie bioluminescencji zaobserwowano po potraktowaniu 5 000 komórek HepG2 zwiększającymi się dawkami mRNA-LNP. Ekspresję lucyferazy można było łatwo wykryć przy najniższej dawce w tym badaniu, wynoszącej pięć nanogramów na studzienkę.Silny sygnał bioluminescencyjny zaobserwowano w górnej części brzucha myszy leczonych sformułowanymi LNP. Obszary zainteresowania narysowano wokół sygnałów wątrobowych, aby obliczyć całkowity strumień luminescencyjny. Całkowity strumień luminescencyjny wynosił około pięć razy 10 do 9.Zawsze utrzymuj stosunek masy jonizowalnych lipidów do kwasów nukleinowych podczas formułowania LNP. Każda objętość fazy organicznej powinna zawierać jonizowalny lipid odpowiadający mRNA w trzech objętościach fazy wodnej.

testing-vitro-vivo-efficiency-mrna-lipid-nanoparticles-formulated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Tutaj przedstawiono ilościowy protokół oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym do określania natywnej zawartości mikro-RNA (bezwzględnej/względnej) w cząsteczkach lipoprotein. Ponadto przedstawiono metodę zwiększania poziomu mikro-RNA, a także metodę określania szybkości wychwytu komórkowego cząstek lipoprotein.

Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego

Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.

Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

Samoorganizująca się nanocząstka peptydu-poloksaminy (PP-sNp) jest rozwijana przy użyciu mikroprzepływowego urządzenia mieszającego do kapsułkowania i dostarczania in vitro transkrybowanego informacyjnego RNA. Opisane mRNA/PP-sNp może skutecznie transfekować hodowane komórki in vitro.

Wydajna transfekcja transkrybowanego mRNA in vitro w hodowanych komórkach przy użyciu nanocząstek peptydowo-poloksaminowych

Obecny protokół przygotowuje i ocenia właściwości fizyczne, odpowiedź immunologiczną i efekt ochronny in vivo nowej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym.

Ocena odpowiedzi immunologicznej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym przeciwko zakażeniu gronkowcem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

Ten protokół zapewnia podejście do optymalizacji receptur w stosunku do czynników badania mieszanego, ciągłego i kategorycznego, które minimalizuje subiektywne wybory w konstrukcji eksperymentalnego projektu. W fazie analizy stosowana jest skuteczna i łatwa w użyciu procedura modelowania dopasowania.

Przepływ pracy w celu optymalizacji formułowania nanocząstek lipidowych (LNP) przy użyciu zaprojektowanych eksperymentów z procesem mieszaniny i samozwalidowanych modeli zespołowych (SVEM)

Tutaj opisujemy metodę szybkiej homogenizacji wspomaganą separacją magnetyczną do produkcji na dużą skalę nanopęcherzyków pochodzących z endosomów jako nowy typ egzosomów naśladujących (EM), które mają to samo pochodzenie biologiczne i podobną strukturę, morfologię i skład białkowy natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Metoda szybkiej homogenizacji wspomagana separacją magnetyczną do produkcji pęcherzyków pochodzących z endosomów na dużą skalę

Szczegółowy protokół syntezy nanocząsteczek lipidowych (LNP) przy użyciu technologii mieszalnika CIJ (Limited Impinging Jet), w tym dwustrumieniowego CIJ i czterostrumieniowego mieszalnika wirowego z wieloma wlotami (μMIVM), jest zademonstrowany. Mieszalniki CIJ generują powtarzalne, turbulentne środowiska mikromieszania, co skutkuje produkcją monodyspersyjnych LNP.

Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem

Protokół ten przedstawia rozbicie Rayleigha jako łagodny proces aerozolizowania niewirusowych wektorów mRNA. Regionalna depozycja dla aerozolowanych wektorów mRNA jest oceniana za pomocą modelu Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI). Ekspresja zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) w ludzkich komórkach płuc reprezentuje utrzymanie funkcji fizykochemicznych i biologicznych wektorów mRNA po aerozoli.

Intranosowe podawanie polyplexów mRNA za pomocą aerozoli Rayleigh Breakup: metoda in vitro do osadzania nosa i testów funkcjonalnych

Poznaj metodę formułowania nanocząstek lipidowych z mRNA metodą mikroprzepływową oraz ich testowanie in vitro w komórkach HepG2 i in vivo w myszach C57BL/6. Protokół umożliwia ocenę skuteczności dostarczania mRNA.

Testowanie skuteczności in vitro i in vivo nanocząstek mRNA-lipidów powstałych metodą mieszania mikroprzepływowego

Przeglądaj więcej filmów