Name: Badanie ochronnego wpływu platykodyny D na niealkoholową stłuszczeniową chorobę wątroby w modelu in vitro indukowanym kwasem palmitynowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Poznaj ochronne działanie platykodyny D na niealkoholową stłuszczeniową chorobę wątroby w modelu in vitro z komórkami AML-12. Ta metoda wspiera rozwój terapii opartych na tradycyjnej medycynie chińskiej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty z Komisji Nauki i Technologii Chongqing (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013, i jbky20210029) oraz China Postdoctoral Science Foundation (nr 2021MD703919).

Komórki AML-12 (normalna linia komórkowa hepatocytów myszy) są używane do badań na komórkach. Ogniwa są pozyskiwane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).
1. Wstępna obróbka komórek AML-12 w celu modelowania NAFLD in vitro
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki w normalnych pożywkach do hodowli komórkowych (DMEM plus F12 Ham's [1:1] zawierający 0,005 mg / ml insuliny, 5 ng / ml selenu, 0,005 mg / ml transferyny, 40 ng / ml deksametazonu i 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS], patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 .</li>
	<li>Wysiewaj komórki na 12-dołkowych płytkach (1 ml / dołek) o gęstości 2,8 x 105 komórek / dołek. 
	UWAGA: Wszystkie operacje trawienia komórek i wymiany pożywki są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia komórek.</li>
	<li>Po całonocnej inkubacji (~10 h) usunąć pożywkę hodowlaną z komórek, a następnie przemyć komórki dwa razy 1 ml pożywki bez surowicy (na dołek).</li>
	<li>Podziel 12-dołkową płytkę komórkową na cztery różne grupy leczenia od lewej do prawej, w tym (1) grupę kontrolną, (2) grupę leczoną chorobą Parkinsona, (3) grupę leczoną PA i (4) grupę traktowaną PA + PD. 
	UWAGA: Trzy powtórzenia każdej eksperymentalnej grupy badanej są ułożone od góry do dołu na tej samej 12-dołkowej płytce komórkowej.</li>
	<li>Dodaj normalne pożywki do hodowli komórkowych (1 ml / basenik) do grupy kontrolnej i grupy leczonej PD i dodaj normalne podłoża do hodowli komórkowych (1 ml / basenik) uzupełnione 300 μM PA do grupy traktowanej PA i PA + PD.</li>
	<li>Po 24 godzinach inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną z komórek, a następnie przemyć komórki 1 ml pożywki bez surowicy (na dołek) dwa razy.</li>
	<li>Dodać normalne pożywki do hodowli komórkowych (1 ml / basenik) uzupełnione nośnikiem (dimetylosulfotlenek, DMSO, 0,1% v/v) do grupy kontrolnej; dodać normalne pożywki do hodowli komórkowych (1 ml / basenik) uzupełnione 1 μM PD do grupy poddanej PD; dodać normalne podłoża do hodowli komórkowych (1 ml / basenik) uzupełnione 300 μM PA do grupy poddanej działaniu PA; dodać normalne podłoża do hodowli komórkowych (1 ml / basenik) uzupełnione 300 μM PA i 1 μ M PD do grupy leczonej PA + PD.</li>
	<li>Po inkubacji przez dodatkowe 24 godziny zbadaj ochronne działanie PD na komórki za pomocą barwienia dioctanem 2′,7′-dichloro-dihydrofluoresceiny (DCFH-DA) (etap 2), barwienia JC-1 (etap 3) i western blotting (etap 4). 
	UWAGA: Wszystkie operacje inkubacji przeprowadza się w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Pomiar zmiany w produkcji ROS
UWAGA: Wewnątrzkomórkowe poziomy ROS w komórkach są oceniane na podstawie testu barwienia DCFH-DA.
<ol>
	<li>Pod koniec okresu poddawania działaniu substancji (etap 1.8) przemyć komórki trzykrotnie 1 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami na studzienkę (1x PBS, pH 7,4), a następnie wybarwić komórki 100 μl 10 μM DCFH-DA na studzienkę (patrz Tabela Materiałów). Inkubować komórki w ciemności przez 30 min. 
	UWAGA: Jeśli po 30 minutach inkubacji nie zaobserwuje się wyraźnej zielonej fluorescencji, czas inkubacji sondy i komórek można odpowiednio wydłużyć (30-60 min). Jeśli po 30 minutach inkubacji zaobserwuje się prześwietlenie wartości zielonej fluorescencji, czas inkubacji sondy i komórek może zostać odpowiednio skrócony (15-30 min).</li>
	<li>Umyj komórki 1x PBS (1 ml / studzienkę) trzy razy. Dodaj 1 ml 1x PBS do każdej studzienki.</li>
	<li>Umieść 12-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu (patrz Tabela materiałów), a następnie użyj obiektywu 20x, aby obserwować morfologię komórek (powiększenie: 200x).</li>
	<li>Uchwyć trzy reprezentatywne obrazy fluorescencyjne (powiększenie: 200x) dla każdej studzienki na mikroskopie fluorescencyjnym za pomocą zielonego kanału fluorescencyjnego o długości fali wzbudzenia 480 nm i długości fali emisji 530 nm. 
	UWAGA: Do wykrywania DCFH-DA zalecany jest zielony kanał fluorescencyjny o długości fali wzbudzenia 480 nm i długości fali emisji 530 nm. Dodatkowo DCFH-DA można wykryć za pomocą ustawień parametrów dla GFP i FITC w mikroskopie fluorescencyjnym35,36.</li>
	<li>Na koniec przetwórz obrazy za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu (patrz tabela materiałów), a następnie użyj oprogramowania ImageJ do obliczenia średniej intensywności fluorescencji każdej grupy lub proporcji różnych grup. 
	UWAGA: Szczegóły techniczne mikroskopu fluorescencyjnego i oprogramowania Image J używanego do obrazowania zostały opisane wcześniej37,38.</li>
</ol>
3. Pomiar zmiany potencjału błony mitochondrialnej
UWAGA: Zmiany w potencjale błony mitochondrialnej są monitorowane za pomocą testu barwienia JC-1.
<ol>
	<li>Pod koniec okresu poddawania działaniu substancji (krok 1.8) przemyć komórki trzykrotnie 1 ml 1 PBS na studzienkę, a następnie zabarwić komórki 100 μl roztworu roboczego JC-1 o stężeniu 5 μg/ml (patrz Tabela materiałów) przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. 
	UWAGA: Jeśli po 30 minutach inkubacji nie zaobserwuje się wyraźnej zielonej fluorescencji, czas inkubacji sondy i komórek można odpowiednio wydłużyć (30-60 min). Jeśli po 30 minutach inkubacji zaobserwuje się prześwietlenie wartości zielonej fluorescencji, czas inkubacji sondy i komórek może zostać odpowiednio skrócony (15-30 min).</li>
	<li>Umyj komórki 1x PBS (1 ml / studzienkę) trzy razy. Dodaj 1 ml 1x PBS do każdej studzienki.</li>
	<li>Umieść 12-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu, a następnie użyj obiektywu 20x, aby obserwować morfologię komórek (powiększenie: 200x).</li>
	<li>Uchwyć trzy reprezentatywne obrazy fluorescencyjne (powiększenie: 200x) dla każdej studzienki na mikroskopie fluorescencyjnym przy użyciu zielonego kanału fluorescencyjnego o długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 nm i 535 nm oraz kanału czerwonej fluorescencji o długości fali wzbudzenia i emisji odpowiednio 550 nm i 600 nm. 
	UWAGA: Zielony kanał fluorescencyjny o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 535 nm służy do wykrywania monomeru JC-1, który jest traktowany jako zdepolaryzowane mitochondria39,40,41, a czerwony kanał fluorescencyjny o długości fali wzbudzenia 550 nm i długości fali emisji 600 nm służy do wykrywania dimera JC-1, który jest traktowany jako spolaryzowane mitochondria39,40,41.</li>
	<li>Na koniec przetwórz obrazy za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu, a następnie użyj oprogramowania Image J, aby obliczyć średnią intensywność fluorescencji każdej grupy lub proporcje różnych grup. 
	UWAGA: Szczegóły techniczne mikroskopu fluorescencyjnego i oprogramowania Image J używanego do obrazowania zostały opisane wcześniej37,38.</li>
</ol>
4. Pomiar poziomów ekspresji białek LC3-II/LC3-I i p62/SQSTM1
<ol>
	<li>Po poddaniu działaniu substancji (krok 1.8) przemyć komórki trzykrotnie 1x PBS (1 ml/studzienkę), który został wstępnie schłodzony w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać bufor do lizy RIPA (100 μl/basenik) uzupełniony proteazą i koktajlem inhibitorów fosfatazy (1x) (patrz tabela materiałów) do płytki 12-dołkowej i lizować na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Zebrać lizat komórkowy do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i wirować przy 12 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Oznaczyć stężenie białka w supernatantach metodą BCA zgodnie ze standardowymi procedurami42.</li>
	<li>Dodać bufor ładujący próbkę SDS-PAGE (5x, patrz Tabela materiałów) do supernatantów lizatu komórkowego (stosunek objętości = 1:4).</li>
	<li>Wymieszać przez wirowanie (z dużą prędkością przez ~15 s) i podgrzewać zmieszane próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut w celu denaturacji białka.</li>
	<li>Umieść 12-dobrze przygotowany 12% żel SDS-PAGE do zbiornika do elektroforezy, a następnie dodaj bufor do up-sample SDS (1x) rozcieńczony ultraczystą wodą do pozycji granicznej wysokości. 
	UWAGA: Żel SDS-PAGE przygotowuje się przy użyciu komercyjnego zestawu (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Dodać marker białkowy (5 μl/studzienkę) i próbki (20 μg/basenik) do różnych dołków żelu SDS-PAGE.</li>
	<li>Ustaw tryb stabilnego napięcia na 100 V i wykonuj elektroforezę przez 80 minut.</li>
	<li>Po elektroforezie SDS-PAGE należy przeprowadzić elektrotransfer białek do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) (0,45 μM, patrz tabela materiałów) zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami43,44.</li>
	<li>Po elektrotransferze białek przemyj membranę PVDF 10 ml TBST (1x TBS, 0,1% Tween 20) dwa razy (5 min/czas) w wytrząsarce w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zablokować błonę PVDF 5 ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA, 5%) w wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.</li>
	<li>Przemyć membranę PVDF trzykrotnie 10 ml TBST (10 min/czas). Następnie inkubować błonę PVDF w 5 ml specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w buforze blokującym dla LC3 (mysie mAb, 1:2,000), p62/SQSTM1 (zwane dalej p62, mysie mAb, 1:2,000) i β-aktyny (mysie mAb, 1:2,000) (patrz tabela materiałów) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć membranę PVDF 10 ml TBST trzykrotnie (10 min/czas) w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować błonę PVDF z drugorzędowym przeciwciałem przeciw mysim IgG (HRP) królika rozcieńczonym w buforze blokującym (1:10 000) (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej i osłoniętym przed światłem przez 2 godziny.</li>
	<li>Umyć membranę PVDF 10 ml TBST trzykrotnie (10 min/czas) w temperaturze pokojowej. Następnie umieścić membranę PVDF na folii foliowej, dodać odpowiednią ilość roztworu roboczego ECL (200 μl/membranę) (patrz Tabela Materiałów) i inkubować przez 2 minuty.</li>
	<li>Po inkubacji należy usunąć roztwór roboczy ECL i naświetlić membranę PVDF w systemie obrazowania w celu wywołania obrazu. Na koniec użyj oprogramowania Image J, aby przeanalizować wartości szarości każdego pasma. 
	UWAGA: Szczegóły techniczne oprogramowania western blotting i Image J używanego do obrazowania zostały opisane wcześniej45,46.</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Przedstaw dane z eksperymentów jako średnią ± odchylenie standardowe (SD).</li>
	<li>Przeprowadź analizę istotności za pomocą opisanego wcześniej narzędzia statystycznego47.</li>
	<li>Oblicz różnice statystyczne między dwiema grupami za pomocą testu t. Wartość P poniżej 0,05 jest uważana za statystycznie istotną: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Badania wykazały fakt, że NAFLD jest zespołem kliniczno-patologicznym, od stłuszczenia wątroby do NASH, który może przekształcić się w marskość wątroby i raka wątroby51. Dieta wysokotłuszczowa i nieaktywny tryb życia są typowymi czynnikami ryzyka NAFLD. Badano zarówno terapie niefarmakologiczne, jak i terapie farmakologiczne w leczeniu NAFLD 51,52,53. Jednak patogeneza NAFLD nie została w pełni wyjaśniona...

Platycodon grandiflorus (PG), który jest wysuszonym korzeniem Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., jest stosowany w tradycyjnej medycynie chińskiej (TCM). Jest produkowany głównie w północno-wschodnich, północnych, wschodnich, środkowych i południowo-zachodnich regionach Chin1. Składniki PG obejmują saponiny triterpenoidowe, polisacharydy, flawonoidy, polifenole, glikole polietylenowe, olejki lotne i minerały2. PG ma długą historię stosowania jako żywność i ziołolecznictwo w Azji. Tradycyjnie zioło to było używane do wytwarzania leków przeciwko chorobom płuc. Współczesna farmakologia dostarcza również dowodów na skuteczność PG w leczeniu innych chorób. Badania wykazały, że PG ma wpływ terapeutyczny na różne modele uszkodzeń wątroby wywołanych lekami. Suplementacja diety ekstraktami PG lub platykodyny może złagodzić otyłość wywołaną dietą wysokotłuszczową i związane z nią choroby metaboliczne3,4,5. Polisacharydy z PG mogą być stosowane w leczeniu ostrego uszkodzenia wątroby spowodowanego przez LPS/D-GalN u myszy6. Co więcej, saponiny z korzeni PG łagodzą wysokotłuszczowe niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby wywołane dietą (NASH)7. Co więcej, platykodyna D (PD), jeden z najważniejszych składników terapeutycznych PG, może zwiększać ekspresję receptora lipoprotein o niskiej gęstości i wychwyt lipoprotein o niskiej gęstości w ludzkich komórkach raka wątrobowokomórkowego (HepG2) 8. Co więcej, PD może również indukować apoptozę i hamować adhezję, migrację i inwazję w komórkach HepG29,10. Tak więc w tym badaniu mysie komórki hepatoma AML-12 są wykorzystywane do budowy modelu in vitro oraz do dalszego badania efektów farmakologicznych i mechanizmów leżących u podstaw PD w tym modelu.
Termin niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) odnosi się do grupy chorób wątroby, która obejmuje proste stłuszczenie, NASH, marskość wątroby i raka wątrobowokomórkowego11. Chociaż patogeneza NAFLD nie jest w pełni poznana, od klasycznej teorii "dwóch trafień" do obecnej teorii "wielokrotnych trafień", insulinooporność jest uważana za kluczową w patogenezie NAFLD12,13,14. Badania wykazały, że insulinooporność hepatocytów może prowadzić do zwiększenia ilości wolnych kwasów tłuszczowych, które tworzą trójglicerydy, które odkładają się w wątrobie i powodują otłuszczenie wątroby15,16. Nagromadzenie tłuszczu może prowadzić do lipotoksyczności, dysfunkcji mitochondriów wywołanej stresem oksydacyjnym, stresu retikulum endoplazmatycznego i uwalniania cytokin zapalnych, co skutkuje patogenezą i progresją NAFLD17,18. Ponadto autofagia odgrywa również rolę w patogenezie NAFLD, ponieważ bierze udział w regulacji komórkowej wrażliwości na insulinę, metabolizmu lipidów komórkowych, uszkodzenia hepatocytów i odporności wrodzonej19,20,21.
Ustalono różnorodność modeli zwierzęcych i komórkowych, które stanowią podstawę do badania patogenezy i potencjalnych celów terapeutycznych NAFLD22,23. Jednak pojedyncze modele zwierzęce nie są w stanie w pełni naśladować wszystkich procesów patologicznych NAFLD24. Indywidualne różnice między zwierzętami prowadzą do różnych cech patologicznych. Wykorzystanie linii komórkowych wątroby lub hepatocytów pierwotnych w badaniach in vitro NAFLD zapewnia maksymalną spójność warunków eksperymentalnych. Rozregulowanie metabolizmu lipidów w wątrobie może prowadzić do wyższych poziomów akumulacji kropelek lipidów hepatocytów w NAFLD25. Wolne kwasy tłuszczowe, takie jak kwas oleinowy i olej palmowy, zostały użyte w modelu in vitro do naśladowania NAFLD spowodowanej dietą wysokotłuszczową26,27. Ludzka linia komórkowa hepatoblastoma HepG2 jest często wykorzystywana do budowy modeli NAFLD in vitro, ale jako linia komórek nowotworowych, metabolizm komórek HepG2 znacznie różni się od metabolizmu komórek wątroby w normalnych warunkach fizjologicznych28. Dlatego użycie hepatocytów pierwotnych lub hepatocytów pierwotnych myszy do skonstruowania modelu NAFLD in vitro do badań przesiewowych leków jest korzystniejsze niż stosowanie linii komórek nowotworowych. Porównując synergiczne badanie efektów działania leków i celów terapeutycznych zarówno w modelach zwierzęcych, jak i w modelach hepatocytów in vitro, wydaje się, że wykorzystanie mysich hepatocytów do budowy modelu NAFLD in vitro ma większy potencjał aplikacyjny.
Wolne kwasy tłuszczowe dostające się do wątroby są utleniane do produkcji energii lub przechowywane jako trójglicerydy. Co istotne, wolne kwasy tłuszczowe mają pewną lipotoksyczność i mogą wywoływać dysfunkcję komórkową i apoptozę12. Kwas palmitynowy (PA) jest najobficiej występującym nasyconym kwasem tłuszczowym w ludzkim osoczu29. Gdy komórki w tkance tłuszczowej są wystawione na działanie wysokich stężeń PA przez długi czas, stymuluje to produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) i powoduje stres oksydacyjny, akumulację lipidów, a nawet apoptozę30. Dlatego wielu badaczy używa PA jako induktora stymulującego komórki wątroby do produkcji ROS, a tym samym konstruuje model stłuszczeniowej choroby wątroby in vitro i ocenia ochronne działanie niektórych substancji czynnych na komórki31,32,33,34. Badanie to wprowadza protokół badania ochronnego wpływu choroby Parkinsona na model komórkowy NAFLD indukowanej przez PA.

<table><tbody><tr><td>5% bufor blokujący BSA</td><td>Solarbio, Pekin, Chiny</td><td>SW3015</td><td></td></tr><tr><td>AML12 (alfa mysia wątroba 12) linia</td><td>komórkowa Procell Life Science& Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>AML12</td><td></td></tr><tr><td>Beyo ECL&nbsp; Plus</td><td>Beyotime, Szanghaj, Chiny</td><td>P0018S Szafa</td><td></td></tr><tr><td>bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Esco Micro Pte Ltd, Singapur</td><td>AC2-5S1 A2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus, Tokio, Japonia</td><td>1.8</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 do hodowli</td><td>Esco Micro Pte Ltd, Singapur</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Beyotime, Szanghaj, Chiny</td><td>ST125</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Solarbio, Pekin, Chiny</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon DMEM/F12</td><td>,&nbsp; Logan,&nbsp; UT,&nbsp; USA</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr>Hyklon<td>płodowej surowicy bydlęcej</td><td>, Tauranga, Nowa Zelandia</td><td>SH30406.05</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>Graphpad GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td><td>8.0</td><td></td></tr><tr><td>HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>ABclonal, Wuhan, Chiny</td><td>AS003</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobowa membrana transferowa PVDF</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, transferyna, roztwór selenu, 100 razy;</td><td>Beyotime, Szanghaj, Chiny</td><td>C0341</td><td></td></tr><tr><td>MAP LC3&beta; Przeciwciało</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td><td>SC-376404</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania potencjału błony mitochondrialnej z JC-1</td><td>Solarbio, Pekin, Chiny</td> Mikroskop odwrócony <td>M8650</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX53</td><td>Olympus, Tokio, Japonia</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>Kwas palmitynowy</td><td>Sigma, Niemcy</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny (100x)</td><td>Hyklon,&nbsp; Logan,&nbsp; UT,&nbsp; Stany Zjednoczone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Fenylometanosulfonyl&nbsp; fluorek</td><td>Beyotime, Szanghaj, Chiny</td><td>ST506</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowany fosforanem Hyklon</td><td>,&nbsp; Logan,&nbsp; UT,&nbsp; USA</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>Platycodin D</td><td>Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>CSA: 58479-68-8</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy do ogólnego użytku, 100x</td><td>Beyotime, Szanghaj, Chiny</td> Marker białkowy <td>P1005</td><td></td></tr><tr><td>Solarbio</td><td>, Pekin, Chiny</td><td>PR1910</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania reaktywnych form tlenu</td><td>Solarbio, Pekin, Chiny</td><td>CA1410</td><td></td></tr><tr><td>RIPA&nbsp; Lizacja&nbsp; Buffer</td><td>Beyotime, Szanghaj, Chiny</td><td>P0013E</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Gel Zestaw do szybkiego przygotowania</td><td>Beyotime, Szanghaj, Chińska Republika Ludowa</td><td>Bufor</td> do ładowania próbki P0012AC <td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE, 5x</td><td>Beyotime, Szanghaj, Chiny</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sigma Sigma, Niemcy</td><td>Przeciwciało 3K15</td><td></td></tr><tr><td>SQSTM1/p62</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td><td>SC-28359</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 PRO&nbsp; &nbsp;</td><td>Tecan Austria GmbH, Austria</td><td>1510002987</td><td></td></tr><tr><td>WB Transfer Buffer, 10x</td><td>Solarbio, Pekin, Chiny</td><td>D1060</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Actin Mouse mAb</td><td>ABclonal, Wuhan, Chiny</td><td>AC004</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie ochronnego wpływu platykodyny d na niealkoholową stłuszczeniową chorobę wątroby w modelu in vitro indukowanym kwasem palmitynowym

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Występowanie niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD) wzrasta w zastraszającym tempie na całym świecie. Platycodon grandiflorum jest szeroko stosowany jako tradycyjna etnomedycyna w leczeniu różnych chorób i jest typową żywnością funkcjonalną, którą można włączyć do codziennej diety. Badania sugerują, że platykodyna D (PD), jeden z głównych składników aktywnych Platycodon grandiflorum, ma wysoką biodostępność i znacznie łagodzi postęp NAFLD, ale mechanizm leżący u podstaw tego jest nadal niejasny. Badanie to ma na celu zbadanie efektu terapeutycznego PD przeciwko NAFLD in vitro. Komórki AML-12 poddano wstępnej obróbce kwasem palmitynowym (PA) o stężeniu 300 μM przez 24 godziny w celu modelowania NAFLD in vitro. Następnie komórki były albo leczone chorobą Parkinsona, albo nie otrzymywały żadnego leczenia chorobą Parkinsona przez 24 godziny. Poziomy reaktywnych form tlenu (ROS) analizowano za pomocą barwienia dioctianem 2′,7′-dichloro-dihydrofluoresceiny (DCFH-DA), a potencjał błony mitochondrialnej określono metodą barwienia JC-1. Ponadto poziomy ekspresji białek LC3-II/LC3-I i p62/SQSTM1 w lizatach komórkowych analizowano metodą western blot. Stwierdzono, że PD znacznie obniża poziomy ROS i potencjału błony mitochondrialnej w grupie leczonej PA w porównaniu z grupą kontrolną. Tymczasem PD zwiększyło poziomy LC3-II/LC3-I i zmniejszyło poziomy p62/SQSTM1 w grupie leczonej PA w porównaniu z grupą kontrolną. Wyniki wykazały, że choroba Parkinsona łagodzi NAFLD in vitro poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego i stymulację autofagii. Ten model in vitro jest użytecznym narzędziem do badania roli choroby Parkinsona w NAFLD.

Wewnątrzkomórkowe ROS w komórkach 
Komórki AML-12 indukowano 300 µM PA przez 24 h w celu stworzenia modelu komórkowego NAFLD. Następnie komórki traktowano PD przez 24 h. Komórki znakowano fluorescencyjną sondą DCFH-DA, a produkcję ROS obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wyniki barwienia DCFH-DA wewnątrzkomórkowych ROS w komórkach przedstawiono na Rysunku 1. Wyniki wykazały, że PD może znacząco obniżyć poziom wewnątrzkomórkowych ROS w komórkach inkubowanych z 300...

Ten protokół bada ochronne działanie platykodyny D na niealkoholową stłuszczeniową chorobę wątroby w modelu in vitro wywołanym kwasem palmitynowym.

Badanie ochronnego wpływu platykodyny D na niealkoholową stłuszczeniową chorobę wątroby w modelu in vitro indukowanym kwasem palmitynowym

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

Metoda ta demonstruje zastosowanie komórek AML-12, które pozwolą na budowę modelu i zbadanie ochronnego wpływu platykodyny D na NAFLD. Nadmierne poleganie na wykorzystaniu modeli zwierzęcych zwiększa obciążenie związane z opracowywaniem leków terapeutycznych. Wykorzystanie modeli komórkowych na wczesnym etapie opracowywania leków na NAFLD jest bardziej praktyczne i opłacalne.Ten model TCM może pomóc w lepszym zrozumieniu biologicznej funkcji platykodyny D i pomóc w badaniu zastosowania innych TCM w leczeniu NAFLD. Zacznij od wysiewu jednego mililitra komórek AML-12 na studzienkę na płytkach 12-dołkowych. Następnie podziel 12-dołkową płytkę na cztery różne grupy leczenia i oznacz je jako kontrolną, leczoną PD, leczoną PA i grupę leczoną PA plus PD.Dodaj jeden mililitr normalnej pożywki do hodowli komórkowej na basenie do grupy kontrolnej i grupy leczonej PD. Dodaj jeden mililitr normalnej pożywki do hodowli komórkowej uzupełnionej 300 mikromolowym kwasem palmitynowym do grupy traktowanej PA i PA plus PD. Po 24 godzinach inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną z komórek, a następnie dwukrotnie przemyć komórki jednym mililitrem pożywki bez surowicy.Następnie dodaj jeden mililitr normalnej pożywki do hodowli komórkowej uzupełnionej nośnikiem do grupy kontrolnej i jeden mililitr normalnej pożywki do hodowli komórkowej uzupełnionej jedną mikromolową platykodyną D do grupy leczonej PD. Dodaj jeden mililitr normalnej pożywki do hodowli komórkowej uzupełnionej 300 mikromolowym kwasem palmitynowym do grupy traktowanej PA i jeden mililitr normalnej pożywki do hodowli komórkowej uzupełnionej 300 mikromolowym kwasem palmitynowym i jedną mikromolową platykodyną D do grupy leczonej PA plus PD. Po traktowaniu komórek przez 24 godziny, umyj komórki jednym mililitrem 1X PBS na studzienkę trzy razy.Następnie wybarwić komórki 100 mikrolitrami 10 mikromolowych DCFH-DA na studzienkę. Inkubuj komórki w ciemności przez 30 minut. Po inkubacji umyj komórki trzykrotnie 1X PBS i dodaj jeden mililitr 1X PBS do każdej studzienki.Umieść 12-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu i użyj obiektywu 20X, aby obserwować morfologię komórek w 200-krotnym powiększeniu. Aby zmierzyć potencjał błony mitochondrialnej, należy przemyć przygotowane wcześniej komórki poddane działaniu środka jednym mililitrem 1X PBS na studzienkę trzy razy. Następnie wybarwić komórki 100 mikrolitrami po pięć mikrogramów na mililitr roztworu roboczego JC-1 i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności.Następnie umyj komórki trzykrotnie 1X PBS i dodaj jeden mililitr 1X PBS do każdej studzienki. Umieść 12-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu i użyj obiektywu 20X, aby obserwować morfologię komórek w 200-krotnym powiększeniu. Poddać lizie leczone komórki i zebrać lizat komórkowy do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych.Odwirować probówki o stężeniu 12 000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodaj bufor ładujący 5 próbek SDS-PAGE do supernatantu lizatu komórkowego w stosunku objętościowym od jednego do czterech. Następnie umieść przygotowany żel 12%SDS-PAGE z 12 dołkami w zbiorniku do elektroforezy i dodaj 1X SDS do buforu próbki rozcieńczonego ultraczystą wodą do zalecanego limitu wysokości.Po elektroforezie SDS-PAGE należy przeprowadzić elektrotransfer białek do membrany PVDF o grubości 0,45 mikrona. Inkubować błonę w pięciu mililitrach pierwszorzędowych przeciwciał rozcieńczonych w buforze blokującym. Użyj przeciwciał specyficznych dla LC-III, p62 i beta-aktyny.Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie inkubować błonę PVDF z króliczym przeciwciałem drugorzędowym przeciwko mysim LGG HRP rozcieńczonym od 1 do 10 000 w buforze blokującym. Inkubować membranę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem przez dwie godziny.Po inkubacji umieść membranę PVDF na folii plastikowej. Dodać odpowiednią ilość roztworu roboczego ECL i inkubować przez dwie minuty. Następnie usuń roztwór roboczy ECL i naświetl membranę PVDF w systemie obrazowania w celu wywołania obrazu.Barwienie DCFH-DA wykazało, że platykodyna D może znacznie obniżyć poziom wewnątrzkomórkowych ROS w komórkach ALM-12, co wskazuje, że leczenie to może zmniejszyć komórkowy stres oksydacyjny. Co więcej, zielona fluorescencja reprezentująca monomery JC-1 lub zdepolaryzowane mitochondria była wyższa w komórkach traktowanych kwasem palmitynowym niż w komórkach nieleczonych, podczas gdy czerwona fluorescencja reprezentująca dimery JC-1 lub spolaryzowane mitochondria była niższa w komórkach traktowanych kwasem palmitynowym niż w komórkach nieleczonych, co wskazuje na depolaryzację MMP wywołaną kwasem palmitynowym. Ponadto, w porównaniu z grupą modelową, stosunek monomerów JC-1 do dimerów zmniejszył się w grupie leczonej platykodyną D, co wskazuje, że może ona złagodzić MMP indukowany kwasem palmitynowym.Poziomy ekspresji białek związanych z autofagią LC-III i p62 badano za pomocą western blot. Stosunek LC-32 do LC-31 znacznie się zmniejszył, a poziom ekspresji białka p62 wzrósł po potraktowaniu kwasem palmitynowym. Z drugiej strony, platykodyna D znacząco zmniejszyła poziom ekspresji białka p62 i zwiększyła stosunek LC-32 do LC-31, co wskazuje na przywrócenie strumienia autofagicznego indukowanego przez kwas palmitynowy.Jeśli wartość fluorescencji komórek w ujemnej grupie kontrolnej jest stosunkowo wysoka, stężenia robocze sond fluorescencyjnych można dostosować w razie potrzeby.

investigating-protective-effects-platycodin-d-on-non-alcoholic-fatty

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Tutaj opisane są zoptymalizowane metody generowania in vivo i in vitro modeli stłuszczenia wątroby oraz analizy fenotypów stłuszczeniowych i związanych z nimi parametrów fizjologicznych.

Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

W tym badaniu opisujemy szczegółowy protokół indukowania stłuszczenia pęcherzyków wątroby w zróżnicowanych komórkach HepaRG za pomocą soli kwasu tłuszczowego oleinianu sodu i stosujemy metody wykrywania i kwantyfikacji akumulacji lipidów, w tym koherentną mikroskopię rozpraszania Ramanowskiego (CARS), analizę cytofluorymetryczną, barwienie czerwienią olejową O i qPCR.

Indukowanie i charakterystyka stłuszczenia pęcherzykowego w zróżnicowanych komórkach HepaRG

Ten protokół ma być narzędziem do badania stłuszczenia i molekularnych, biochemicznych, komórkowych zmian spowodowanych nadmierną ekspozycją hepatocytów na lipidy in vitro.

Model eksperymentalnego stłuszczenia in vitro: hodowla komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów

Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym szlakiem metabolicznym odpowiedzialnym za wytwarzanie energii w wielu różnych typach komórek, w tym w hepatocytach. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach pierwotnych przy użyciu 14znakowanych C kwasów palmitynowych.

Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy

Obecny protokół opisuje zintegrowaną strategię badania kluczowych celów i mechanizmów Fructus Phyllanthi przeciwko hiperlipidemii w oparciu o przewidywania farmakologiczne sieci i weryfikację metabolomiczną.

Sieciowa farmakologia, przewidywanie i metabolomika: walidacja mechanizmu działania Fructus Phyllanthi przeciwko hiperlipidemii

Obecny protokół opisuje, jak używać czerwonego oleju O do barwienia kropelek lipidów (LDs), obliczać wielkość i liczbę LD w modelu hepatocytów tłuszczowych indukowanych kwasami tłuszczowymi, oraz używać BODIPY 493/503 do obserwacji procesu łączenia się małych LD w duże LD za pomocą obrazowania żywych komórek.

Ocena wielkości kropelek lipidów i fuzji w komórkach wątroby bydła

Ten artykuł opisuje użycie komórek HepG2 indukowanych kwasem oleinowym jako modelu dla stłuszczeniowej choroby wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną.

Modelowanie in vitro odkładania się tłuszczu w stłuszczeniowej chorobie wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną

Opracowaliśmy model wycinka mózgu, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z uszkodzeniem mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności. Ta technika generuje żywotną dojrzałą tkankę mózgową i zmniejsza liczbę zwierząt wymaganych do eksperymentów, jednocześnie utrzymując częściowo nienaruszone obwody neuronalne, interakcje komórkowe i przedziały postsynaptyczne.

Ekscytotoksyczna stymulacja mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro

Ta metoda została opracowana w celu dostarczenia stałego roztworu leku przez tętnicę szyjną, aby ocenić farmakokinetykę nowych leków w modelach mysich.

Wlewy z tętnic szyjnych do analizy farmakokinetycznej i farmakodynamicznej taksanów u myszy

Poznaj ochronne działanie platykodyny D na niealkoholową stłuszczeniową chorobę wątroby w modelu in vitro z komórkami AML-12. Ta metoda wspiera rozwój terapii opartych na tradycyjnej medycynie chińskiej.

Badanie ochronnego wpływu platykodyny D na niealkoholową stłuszczeniową chorobę wątroby w modelu in vitro indukowanym kwasem palmitynowym (Wideo) | JoVE Journal

Badanie ochronnego wpływu platykodyny D na niealkoholową stłuszczeniową chorobę wątroby w modelu in vitro indukowanym kwasem palmitynowym

Przeglądaj więcej filmów