Badanie ochronnego wpływu platykodyny D na niealkoholową stłuszczeniową chorobę wątroby w modelu in vitro indukowanym kwasem palmitynowym

Metoda ta demonstruje zastosowanie komórek AML-12, które pozwolą na budowę modelu i zbadanie ochronnego wpływu platykodyny D na NAFLD. Nadmierne poleganie na wykorzystaniu modeli zwierzęcych zwiększa obciążenie związane z opracowywaniem leków terapeutycznych. Wykorzystanie modeli komórkowych na wczesnym etapie opracowywania leków na NAFLD jest bardziej praktyczne i opłacalne.

Ten model TCM może pomóc w lepszym zrozumieniu biologicznej funkcji platykodyny D i pomóc w badaniu zastosowania innych TCM w leczeniu NAFLD. Zacznij od wysiewu jednego mililitra komórek AML-12 na studzienkę na płytkach 12-dołkowych. Następnie podziel 12-dołkową płytkę na cztery różne grupy leczenia i oznacz je jako kontrolną, leczoną PD, leczoną PA i grupę leczoną PA plus PD.

Dodaj jeden mililitr normalnej pożywki do hodowli komórkowej na basenie do grupy kontrolnej i grupy leczonej PD. Dodaj jeden mililitr normalnej pożywki do hodowli komórkowej uzupełnionej 300 mikromolowym kwasem palmitynowym do grupy traktowanej PA i PA plus PD. Po 24 godzinach inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną z komórek, a następnie dwukrotnie przemyć komórki jednym mililitrem pożywki bez surowicy.

Następnie dodaj jeden mililitr normalnej pożywki do hodowli komórkowej uzupełnionej nośnikiem do grupy kontrolnej i jeden mililitr normalnej pożywki do hodowli komórkowej uzupełnionej jedną mikromolową platykodyną D do grupy leczonej PD. Dodaj jeden mililitr normalnej pożywki do hodowli komórkowej uzupełnionej 300 mikromolowym kwasem palmitynowym do grupy traktowanej PA i jeden mililitr normalnej pożywki do hodowli komórkowej uzupełnionej 300 mikromolowym kwasem palmitynowym i jedną mikromolową platykodyną D do grupy leczonej PA plus PD. Po traktowaniu komórek przez 24 godziny, umyj komórki jednym mililitrem 1X PBS na studzienkę trzy razy.

Następnie wybarwić komórki 100 mikrolitrami 10 mikromolowych DCFH-DA na studzienkę. Inkubuj komórki w ciemności przez 30 minut. Po inkubacji umyj komórki trzykrotnie 1X PBS i dodaj jeden mililitr 1X PBS do każdej studzienki.

Umieść 12-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu i użyj obiektywu 20X, aby obserwować morfologię komórek w 200-krotnym powiększeniu. Aby zmierzyć potencjał błony mitochondrialnej, należy przemyć przygotowane wcześniej komórki poddane działaniu środka jednym mililitrem 1X PBS na studzienkę trzy razy. Następnie wybarwić komórki 100 mikrolitrami po pięć mikrogramów na mililitr roztworu roboczego JC-1 i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności.

Następnie umyj komórki trzykrotnie 1X PBS i dodaj jeden mililitr 1X PBS do każdej studzienki. Umieść 12-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu i użyj obiektywu 20X, aby obserwować morfologię komórek w 200-krotnym powiększeniu. Poddać lizie leczone komórki i zebrać lizat komórkowy do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych.

Odwirować probówki o stężeniu 12 000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodaj bufor ładujący 5 próbek SDS-PAGE do supernatantu lizatu komórkowego w stosunku objętościowym od jednego do czterech. Następnie umieść przygotowany żel 12%SDS-PAGE z 12 dołkami w zbiorniku do elektroforezy i dodaj 1X SDS do buforu próbki rozcieńczonego ultraczystą wodą do zalecanego limitu wysokości.

Po elektroforezie SDS-PAGE należy przeprowadzić elektrotransfer białek do membrany PVDF o grubości 0,45 mikrona. Inkubować błonę w pięciu mililitrach pierwszorzędowych przeciwciał rozcieńczonych w buforze blokującym. Użyj przeciwciał specyficznych dla LC-III, p62 i beta-aktyny.

Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie inkubować błonę PVDF z króliczym przeciwciałem drugorzędowym przeciwko mysim LGG HRP rozcieńczonym od 1 do 10 000 w buforze blokującym. Inkubować membranę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem przez dwie godziny.

Po inkubacji umieść membranę PVDF na folii plastikowej. Dodać odpowiednią ilość roztworu roboczego ECL i inkubować przez dwie minuty. Następnie usuń roztwór roboczy ECL i naświetl membranę PVDF w systemie obrazowania w celu wywołania obrazu.

Barwienie DCFH-DA wykazało, że platykodyna D może znacznie obniżyć poziom wewnątrzkomórkowych ROS w komórkach ALM-12, co wskazuje, że leczenie to może zmniejszyć komórkowy stres oksydacyjny. Co więcej, zielona fluorescencja reprezentująca monomery JC-1 lub zdepolaryzowane mitochondria była wyższa w komórkach traktowanych kwasem palmitynowym niż w komórkach nieleczonych, podczas gdy czerwona fluorescencja reprezentująca dimery JC-1 lub spolaryzowane mitochondria była niższa w komórkach traktowanych kwasem palmitynowym niż w komórkach nieleczonych, co wskazuje na depolaryzację MMP wywołaną kwasem palmitynowym. Ponadto, w porównaniu z grupą modelową, stosunek monomerów JC-1 do dimerów zmniejszył się w grupie leczonej platykodyną D, co wskazuje, że może ona złagodzić MMP indukowany kwasem palmitynowym.

Poziomy ekspresji białek związanych z autofagią LC-III i p62 badano za pomocą western blot. Stosunek LC-32 do LC-31 znacznie się zmniejszył, a poziom ekspresji białka p62 wzrósł po potraktowaniu kwasem palmitynowym. Z drugiej strony, platykodyna D znacząco zmniejszyła poziom ekspresji białka p62 i zwiększyła stosunek LC-32 do LC-31, co wskazuje na przywrócenie strumienia autofagicznego indukowanego przez kwas palmitynowy.

Jeśli wartość fluorescencji komórek w ujemnej grupie kontrolnej jest stosunkowo wysoka, stężenia robocze sond fluorescencyjnych można dostosować w razie potrzeby.