Name: Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Poznaj metodę DMS-MaP do analizy struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu w warunkach in vitro i w komórkach żywych. Technika ta umożliwia profilowanie mutacyjne i dostarcza wgląd w dynamikę strukturalną RNA w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, oprogramowania, odczynników, instrumentów i komórek używanych w tym protokole.
1. Specyficzny dla genu in vitro DMS-MaP
<ol>
	<li>Transkrypcja RNA in vitro
	<ol>
		<li>Uzyskaj sekwencję interesującego RNA jako dwuniciowe (ds)DNA (np. Jako fragmenty DNA, plazmidy lub PCR z wcześniej istniejącego/genomowego DNA). Jeśli sekwencja DNA zawiera promotor polimerazy, przejdź do kroku 3.</li>
		<li>Wykonaj nakładanie się PCR, aby przyłączyć promotor polimerazy RNA przed pożądanym fragmentem DNA (starter do przodu dla polimerazy T7: 5' TAATACGACTCACTATAGG + pierwsze zasady sekwencji docelowej 3').</li>
		<li>In vitro transkrybować fragment DNA na RNA. Zawsze utrzymuj RNA na lodzie.</li>
		<li>Trawić DNA za pomocą DNazy.</li>
		<li>Wyizolować RNA, stosując podejście kolumnowe (etap 2.4) lub przez wytrącanie etanolu (etap 2.5). Elutę w odpowiedniej objętości, spodziewając się plonu ~50 μg.</li>
		<li>Zapewnić integralność RNA, umieszczając go w żelu agarozowym; przed uruchomieniem denaturować RNA przez 2-3 minuty w temperaturze 70 °C. 
		UWAGA: Bufor i agaroza mogą zawierać RNazy, które degradują RNA i mogą zanieczyścić próbkę RNA. Prefabrykowane żele agarozowe były wcześniej używane w tym laboratorium; wyniki (zwłaszcza w przypadku RNA) były czasami niejednoznaczne. Najlepsze efekty uzyskano przy użyciu żeli z agarozy lub PAGE.</li>
		<li>Bezpośrednie stosowanie przechowywać RNA w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy, chyba że po rozmrożeniu widoczna jest degradacja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modyfikacja DMS in vitro (przy 105 mM DMS)
	<ol>
		<li>Przygotować wystarczającą ilość buforu do ponownego składania (0,4 M kakodylan sodu, pH 7,2, zawierający 6 mM MgCl2). 
		UWAGA: Do każdej reakcji (końcowa objętość 100 μL) dodać 89 μL buforu do ponownego fałdowania.</li>
		<li>Dla każdej reakcji przenieść 89 μl buforu do ponownego składania do wyznaczonej probówki o pojemności 1,5 ml i ogrzać w temperaturze 37 °C w wytrząsarce umieszczonej pod kapturem chemicznym. 
		UWAGA: DMS jest wysoce toksyczny i musi być zawsze przechowywany pod kapturem chemicznym do czasu ugaszenia przez środek redukujący.</li>
		<li>Eluować 1-10 pmol RNA w 10 μl wody wolnej od nukleaz (NFH2O); przenieść do probówki PCR.</li>
		<li>Inkubować w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez 1 minutę w celu denaturacji RNA.</li>
		<li>Natychmiast umieść na bloku lodu, aby uniknąć nieprawidłowego złożenia.</li>
		<li>Dodać próbkę RNA do wyznaczonej probówki z buforem do ponownego składania w temperaturze 37 °C, dobrze wymieszać i inkubować przez 10-20 minut w celu ponownego złożenia RNA. 
		UWAGA: Większość RNA składa się w kolejności od milisekund do sekund, chociaż istnieją wyjątki16.</li>
		<li>Dodać 1 μl 100% (10,5 M) DMS do próbki RNA i inkubować przez 5 minut, wytrząsając z prędkością 800-1,400 obrotów na minutę (rpm). 
		UWAGA: Wytrząsanie (lub inne sposoby mieszania) na tym etapie ma kluczowe znaczenie, ponieważ DMS jest hydrofobowy i może nie rozpuścić się całkowicie w buforze do ponownego składania. Odchylenia w czasie reakcji mogą mieć wpływ na odtwarzalność reaktywności DMS. Aby zminimalizować błąd pipetowania, DMS można rozpuścić w 100% etanolu przed dodaniem go do próbki, jeśli utrzymane jest końcowe stężenie 1% (105 mM) DMS. W przypadku nieleczonej kontroli DMS można zastąpić dimetylosulfotlenkiem (DMSO) lub wodą.</li>
		<li>Po 5 minutach reakcji schłodzić 60 μl 100% β-merkaptoetanolu (BME), dobrze wymieszać i natychmiast umieścić RNA na lodzie. 
		UWAGA: RNA można bezpiecznie usunąć z kaptura po wygaszeniu reakcji z BME w celu jego oczyszczenia. Jednak nadal należy unikać bezpośredniego narażenia BME na otoczenie ze względu na jego silny zapach i właściwości drażniące.</li>
		<li>Oczyścić RNA przez wytrącanie octanu sodu i etanolu (patrz krok 2.5) lub podejście kolumnowe (patrz krok 2.6) i eluować w 10 μl wody.</li>
		<li>Określić ilościowo RNA za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Bezpośrednie zastosowanie przechowywania zmodyfikowanego RNA w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: Należy unikać długotrwałego przechowywania, ponieważ RNA jest mniej stabilne po leczeniu DMS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Specyficzny genowo RT-PCR zmodyfikowanego RNA 
	UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla konfiguracji RT-PCR fragmentów poddanych działaniu DMS.
	<ol>
		<li>Eluować 100 ng zmodyfikowanego RNA w 10 μl H2O. Przenieść do probówki PCR.</li>
		<li>Do probówki dodać 4 μl 5x buforu pierwszej nici (FSB), 1 μl mieszanki dNTP (po 10 mM każdy), 1 μl 0,1 M ditiotreitolu (DTT) (unikać cykli zamrażania i rozmrażania), 1 μl inhibitora RNazy, 1 μL 10 μM startera odwrotnego (pojedynczy starter lub pula starterów) i 1 μL TGIRT III. 
		UWAGA: W przypadku puli starterów nie należy dodawać 1 μL z 10 μM każdego startera bezpośrednio do RT; zamiast tego najpierw wymieszaj startery i dodaj 1 μl z mieszanki (przy całkowitym stężeniu startera 10 μM).</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 57 °C przez 30 minut do 1,5 godziny (zazwyczaj 30 minut wystarcza do wytworzenia produktu o masie 500 nt) w termocyklerze.</li>
		<li>Dodać 1 μl 4 M NaOH, wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze 95 °C przez 3 minuty w celu degradacji RNA. 
		UWAGA: Ten krok jest kluczowy, ponieważ uwalnia TGIRT z cDNA poprzez degradację RNA. W przypadku pominięcia może to mieć wpływ na dalszy PCR.</li>
		<li>Oczyścić przy użyciu podejścia kolumnowego (patrz krok 2.6), które w wystarczającym stopniu usuwa startery, i eluować w 10 μl NFH 2O.</li>
		<li>Amplifikacja cDNA metodą PCR przy użyciu 1 μl produktu odwrotnej transkrypcji na 25 μl reakcji za pomocą zestawu do PCR zaprojektowanego w celu zrównoważenia wydajności i wierności. 
		UWAGA: Podkłady powinny mieć temperaturę topnienia ~60 °C.</li>
		<li>Uruchom 2 μl produktu PCR na żelu agarozowym lub prefabrykowanym żelu agarozowym, aby zweryfikować powodzenie PCR.</li>
		<li>Idealnie byłoby, gdyby po PCR pokazało się tylko jedno pasmo. Jeśli tak, oczyść reakcję, stosując podejście oparte na kolumnach. Jeśli obecne są alternatywne prążki, użyj pozostałej reakcji PCR, aby wyciąć właściwą prążek z żelu. Eluować w wystarczająco małej objętości (np. 10 μl).</li>
		<li>Określić ilościowo wyekstrahowane fragmenty za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Indeksuj fragmenty dsDNA do sekwencjonowania przy użyciu podejścia dostosowanego do pożądanej platformy sekwencjonowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64820/64820fig01.jpg"> 
Rysunek 1: Eksperymentalna konfiguracja dla RT-PCR dużych fragmentów poddanych działaniu DMS. Podczas wykonywania odwrotnej transkrypcji na zmodyfikowanym RNA, modyfikacje sekwencji, do której wyżarza się starter, nie zostaną zarejestrowane. Tak więc, gdy długość fragmentów przekracza 400-500 pz, należy zaprojektować fragmenty nakładające się na siebie w obszarach startera, jak pokazano tutaj. Długość fragmentów zależy od potrzeb sekwencjonowania. W przypadku sekwencjonowania 150 cykli sparowanych końców fragmenty nie powinny przekraczać 300 pz. Skróty: RT-PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją; DMS = siarczan dimetylu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64820/64820fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
2. Pełnogenomowy DMS-MaP z wykorzystaniem komórek zainfekowanych wirusem
UWAGA: W komórkach leczenie DMS może być również połączone z opisanym powyżej podejściem do amplifikacji specyficznym dla genu. Biblioteka całego genomu wymaga ogromnej głębokości sekwencjonowania, aby uzyskać pełne pokrycie pojedynczego genu. Jeśli jednak wirusowe RNA stanowią znaczną część rybodepleżowanego RNA po ekstrakcji, odpowiednie byłoby sekwencjonowanie całego genomu. Ponadto inne metody wzbogacania można połączyć z metodą generowania biblioteki całego genomu. 
UWAGA: Niezainfekowane komórki zostały wykorzystane do celów demonstracyjnych w protokole wideo.
<ol>
	<li>Leczenie DMS
	<ol>
		<li>Hoduj komórki zakażone wirusem aż do pożądanego etapu infekcji.</li>
		<li>Przenieść pojemnik na komórki do specjalnego dygestoria, który jest odpowiedni do obchodzenia się zarówno z wirusami na wymaganym poziomie bezpieczeństwa biologicznego, jak i z oparami chemicznymi wytwarzanymi przez czynniki takie jak DMS.</li>
		<li>Dodać 2,5% objętości DMS do pożywki hodowlanej i zamknąć pojemnik (zwykle płytkę o średnicy 10 cm) parafilmem. 
		UWAGA: Za pomocą DMS łatwo jest zmodyfikować w dół i w nadmiarze. Podczas dodawania DMS bezpośrednio do komórek bardzo ważne jest, aby dobrze wymieszać. Alternatywnie, podgrzej nową pożywkę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 37 °C i dodaj DMS bezpośrednio, energicznie wstrząsając. Zdekantować zużytą pożywkę na komórki i powoli pipetować pożywkę zawierającą DMS.</li>
		<li>Przenieść do inkubatora w temperaturze 37 °C na 5 min. 
		UWAGA: W zależności od czasu potrzebnego na obsługę DMS na zewnątrz inkubatora, możliwe jest, że 5 minut doprowadzi do nadmiernej modyfikacji. Skróć czas od dodania DMS do inkubacji do ≤1 minuty. W przypadku przeprowadzania eksperymentu po raz pierwszy zaleca się wykonanie miareczkowania DMS i zmianę czasu inkubacji (od 3 minut do 10 minut) w celu znalezienia optymalnej szybkości modyfikacji i zapewnienia, że wyniki są wiarygodne w całym zakresie stężeń.</li>
		<li>Ostrożnie odpipetować pożywkę zawierającą DMS (do odpowiednich odpadów chemicznych) i delikatnie dodać 10 ml buforu zatrzymującego (PBS z 30% BME [np. 3 ml BME i 7 ml PBS]). 
		UWAGA: Dodanie DMS i BME może podnieść komórki z płytki, jeśli komórki nie są silnie przylegające. Jeśli komórki się podnoszą, można je traktować jako komórki zawiesinowe - zamiast usuwać pożywkę zawierającą DMS, dodaj bezpośrednio bufor zatrzymujący i zeskrob komórki za pomocą DMS i BME do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 3 minuty w temperaturze 3 000 × g; upewnij się, że pozbyłeś się wszelkich resztek DMS, które mogą osadzać się pod komórkami w dużych kropelkach. Dodatkowy etap mycia w 30% BME jest zalecany, jeśli początkowo nie można usunąć medium DMS.</li>
		<li>Zeskrob komórki i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Osad przez odwirowanie w ilości 3 000 × g przez 3 min.</li>
		<li>Usunąć sklarowany osad i przemyć 2x 10 ml PBS.</li>
		<li>Ostrożnie usuń jak najwięcej resztek PBS.</li>
		<li>Rozpuścić osad w odpowiedniej ilości odczynnika do izolacji RNA (np. 3 ml dla kolby hodowlanej T75, 1 ml dla płytki 10 cm). 
		UWAGA: Niewystarczająca ilość odczynnika może mieć wpływ na wydajność RNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja RNA i zubożenie rybosomalnego RNA (rRNA)
	<ol>
		<li>Do 1 ml homogenizowanych komórek w odczynniku do izolacji RNA dodać 200 μl chloroformu, wirować przez 15-20 s do uzyskania jasnoróżowego koloru, a następnie inkubować do 3 minut, aż do widocznego rozdzielenia faz. 
		UWAGA: Różowa faza lipidowa powinna osiąść na dnie. Jeśli tak nie jest, czas wirowania był prawdopodobnie niewystarczający.</li>
		<li>Wirować z maksymalną prędkością (~ 20 000 × g) przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki.</li>
		<li>Oczyścić RNA przez wytrącanie octanu sodu i etanolu (patrz krok 2.5) lub podejście kolumnowe (patrz etap 2.6) i eluować w wystarczającej ilości NFH2O.</li>
		<li>Sprawdź integralność RNA na żelu agarozowym. Poszukaj dwóch pasm odpowiadających dwóm podjednostkom rybosomalnym.</li>
		<li>Zubożyć rRNA przy użyciu preferowanego podejścia i wymyć w odpowiedniej objętości (zwykle 20-50 μl) NF H2O. 
		UWAGA: W przypadku dalszych zastosowań sugeruje się ~500 ng całkowitego RNA w objętości 8 μL. Nierybosomalne RNA zwykle stanowią tylko 5%-10% całkowitego RNA.</li>
		<li>Określić ilościowo za pomocą spektrofotometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie biblioteki
	<ol>
		<li>Użyj specyficznego dla genu RT-PCR lub innych podejść do generowania bibliotek15. W przypadku używania losowych heksamerów do gruntowania, należy dodać etap inkubacji przy niskiej temperaturzeT m (37-42 °C), aby umożliwić wyżarzanie heksameru. 
		UWAGA: Zestawy do generowania bibliotek standardowych mogą być również używane poprzez zastąpienie enzymu RT przez TGIRT i zmianę temperatury RT na 57 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie RNA na podstawie kolumn za pomocą kolumn RNA Clean &amp; Concentrator 
	UWAGA: Wszystkie kroki należy wykonywać w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Dodać NFH2Odo probówki z próbką, aby uzyskać objętość 50 μl.</li>
		<li>Do próbki dodać 100 μl buforu wiążącego i 150 μl 100% etanolu.</li>
		<li>Wymieszaj i przenieś do kolumny wirowej.</li>
		<li>Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 30 s; wyrzucić przepływ.</li>
		<li>Dodać 400 μl buforu przygotowawczego RNA.</li>
		<li>Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 30 s; wyrzucić przepływ.</li>
		<li>Dodać 700 μl buforu do przemywania RNA.</li>
		<li>Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 30 s; wyrzucić przepływ.</li>
		<li>Dodać 400 μl buforu do przemywania RNA.</li>
		<li>Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 30 s; wyrzucić przepływ.</li>
		<li>(Opcjonalnie) Przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej i wiruj z prędkością 10 000-16 000 × g przez 2 minuty.</li>
		<li>Przenieść kolumnę do czystej probówki wolnej od RNAzy i dodać odpowiednią ilość NFH2O.</li>
		<li>Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 1 minutę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja kwasowego fenolowo-chloroformowego RNA.
	<ol>
		<li>Dodać równą objętość kwasu fenol:chloroform:alkohol izoamylowy.</li>
		<li>Dokładnie zmieszać i odwirować przy 14 000 × g przez 5 minut.</li>
		<li>Jeśli nie ma separacji faz, dodać 20 μl 2 M NaCl i powtórzyć wirowanie.</li>
		<li>Przenieś fazę wodną do nowej probówki.</li>
		<li>Dodać 500 μl izopropanolu i 2 μl współstrącacza.</li>
		<li>Mieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie inkubować w temperaturze -80 °C przez noc.</li>
		<li>Osadzać RNA przez odwirowanie z maksymalną prędkością (~ 20 000 × g) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj granulat 200 μl lodowatego 70% etanolu.</li>
		<li>Wirować z maksymalną prędkością (~ 20 000 × g) przez 5 minut; wyrzucić przepływ.</li>
		<li>Zawiesić osad w odpowiedniej ilości NFH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie cDNA w oparciu o kolumny za pomocą kolumn Oligo Clean i Koncentratora 
	UWAGA: Wszystkie kroki należy wykonywać w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Dodać NFH2Odo probówki z próbką, aby uzyskać objętość 50 μl.</li>
		<li>Dodać 100 μl buforu wiążącego i 400 μl 100% etanolu.</li>
		<li>Wymieszaj i przenieś do kolumny wirowej.</li>
		<li>Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 30 s; wyrzucić przepływ.</li>
		<li>Dodać 750 μl buforu do przemywania DNA.</li>
		<li>Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 30 s; wyrzucić przepływ.</li>
		<li>(Opcjonalnie) Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej i wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 2 minuty.</li>
		<li>Przenieść kolumnę do czystej probówki wolnej od RNAzy i dodać odpowiednią ilość NFH2O.</li>
		<li>Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 1 minutę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych sekwencjonowania
UWAGA: Aby utworzyć modele struktury drugorzędowej RNA na podstawie danych sekwencjonowania DMS-MaP, wynikowe pliki .fastq muszą być przetworzone w kilku różnych krokach. Kroki te można wykonać automatycznie za pomocą przycisku
<ol>
	<li>Przytnij sekwencje adapterów za pomocą TrimGalore lub Cutadapt.</li>
	<li>Mapuj odczyty do sekwencji referencyjnych (format .fasta) za pomocą Bowtie2.</li>
	<li>Policz odczyty za pomocą specjalistycznego oprogramowania do tworzenia struktury RNA (np. DREEM14, RNA-Framework17 lub podobne) i utwórz profile reaktywności.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Grupuj odczyty, aby znaleźć alternatywne konformacje RNA za pomocą DREEM14, DRACO17, DANCE-MaP18 lub podobnego.</li>
	<li>Przewiduj minimalną strukturę energii swobodnej na podstawie profili reaktywności za pomocą RNAStructure12, ViennaRNA lub podobnego.</li>
	<li>Wizualizacja struktury RNA11 za pomocą VARNA (https://varna.lri.fr/) lub podobnego. 
	UWAGA: Dla praktyczności, oprogramowanie takie jak DREEM (www.rnadreem.org) i RNA-Framework19 w znacznym stopniu uwzględnia kroki 1–-5 w swoich potokach, co usprawnia proces analizy. Jednak z każdym przewidywaniem struktury należy obchodzić się ostrożnie (np. weryfikując zgodność struktury z data20.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tertiary+structure+of+yeast+phenylalanine+transfer+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA.</a> Science. 185 (4149), 435-440 (1974).</li>
<li>Robertus, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+yeast+phenylalanine+tRNA+at+3+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 Å resolution.</a> Nature. 250 (467), 546-551 (1974).</li>
<li>Zaug, A. J., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+splicing+of+the+ribosomal+RNA+precursor+in+nuclei+of+Tetrahymena%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor in nuclei of Tetrahymena.</a> Cell. 19 (2), 331-338 (1980).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NONCODE+2016%3A+An+informative+and+valuable+data+source+of+long+non-coding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NONCODE 2016: An informative and valuable data source of long non-coding RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 44, D203-D208 (2016).</li>
<li>Vandivier, L. E., Anderson, S. J., Foley, S. W., Gregory, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conservation+and+function+of+RNA+secondary+structure+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The conservation and function of RNA secondary structure in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 67, 463(2016).</li>
<li>Jumper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+accurate+protein+structure+prediction+with+AlphaFold%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold.</a> Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).</li>
<li>Das, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+structure%3A+A+renaissance+begins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA structure: A renaissance begins.</a> Nature Methods. 18 (5), 439-439 (2021).</li>
<li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+2%E2%80%B2-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+%28SHAPE-MaP%29+for+direct%2C+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct, versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1643-1669 (2015).</li>
<li>Mathews, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7287-7292 (2004).</li>
<li>Zuker, M., Stiegler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+computer+folding+of+large+RNA+sequences+using+thermodynamics+and+auxiliary+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information.</a> Nucleic Acids Research. 9 (1), 133-148 (1981).</li>
<li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ViennaRNA+Package+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Algorithms+for+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ViennaRNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6, (2011).</li>
<li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAstructure%3A+Software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNAstructure: Software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, (2010).</li>
<li>Wells, S. E., Hughes, J. M. X., Igel, A. H., Ares, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dimethyl+sulfate+to+probe+RNA+structure+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of dimethyl sulfate to probe RNA structure in vivo.</a> Methods in Enzymology. , 479-493 (2000).</li>
<li>Tomezsko, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+RNA+structural+diversity+and+its+role+in+HIV-1+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Determination of RNA structural diversity and its role in HIV-1 RNA splicing.</a> Nature. 582 (7812), (2020).</li>
<li>Zubradt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMS-MaPseq+for+genome-wide+or+targeted+RNA+structure+probing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo.</a> Nature Methods. 14 (1), (2017).</li>
<li>Woodson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+intermediates+in+RNA+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Compact intermediates in RNA folding.</a> Annual Reviews in Biophysics. 39, (2010).</li>
<li>Morandi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+deconvolution+of+RNA+structure+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-scale deconvolution of RNA structure ensembles.</a> Nature Methods. 18 (3), 249-252 (2021).</li>
<li>Olson, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+large-scale%2C+cell-state-responsive+allosteric+switch+in+the+7SK+RNA+using+DANCE-MaP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Discovery of a large-scale, cell-state-responsive allosteric switch in the 7SK RNA using DANCE-MaP.</a> Molecular Cell. 82 (9), 1708-1723 (2022).</li>
<li>Incarnato, D., Morandi, E., Simon, L. M., Oliviero, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Framework%3A+An+all-in-one+toolkit+for+the+analysis+of+RNA+structures+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA Framework: An all-in-one toolkit for the analysis of RNA structures and post-transcriptional modifications.</a> Nucleic Acids Research. 46 (16), (2018).</li>
<li>Lan, T. C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+structural+ensembles+of+the+SARS-CoV-2+RNA+genome+in+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Secondary structural ensembles of the SARS-CoV-2 RNA genome in infected cells.</a> Nature Communications. 13 (1), 1128(2022).</li>
<li>Homan, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+correlated+chemical+probing+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-molecule correlated chemical probing of RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (38), 13858-13863 (2014).</li>
<li>Yang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+SARS-CoV-2+interactions+in+vivo+reveals+functional+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of SARS-CoV-2 interactions in vivo reveals functional virus-host interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5113(2021).</li>
<li>Manfredonia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+SARS-CoV-2+RNA+structures+identifies+therapeutically-relevant+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of SARS-CoV-2 RNA structures identifies therapeutically-relevant elements.</a> Nucleic Acids Research. 48 (22), 12436-12452 (2020).</li>
<li>Fischer, N. M., Polěto, M. D., Steuer, J., vander Spoel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Na%2B+and+Mg2%2B+ions+on+RNA+structures+studied+with+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Influence of Na+ and Mg2+ ions on RNA structures studied with molecular dynamics simulations.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 4872-4882 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Niniejszy protokół opisuje, jak badać RNA in vitro i w komórkach za pomocą eksperymentów z profilowaniem mutacji DMS. Ponadto podaje instrukcje, jak przygotować biblioteki do sekwencjonowania Illumina w celu generowania danych specyficznych dla genów i analizy uzyskanych plików .fastq. Ponadto można zastosować podejścia biblioteczne obejmujące cały genom. Jednak specyficzny dla genu RT-PCR daje dane najwyższej jakości i najbardziej wiarygodne. Dlatego w przypadku porównywania próbek ważne jest, aby upewnić się, że są one przygotowane przy użyciu identycznych strategii sekwencjonowania, ponieważ generowanie biblioteki powoduje pewne odchylenia. Odtwarzalność należy zawsze mierzyć przy użyciu kontrprób.
Kilka środków ostrożności RNA jest niestabilną cząsteczką, która jest wrażliwa na degradację zarówno przez podwyższone temperatury, jak i przez RNazy. Dlatego zaleca się stosowanie specjalnych środków ochrony osobistej (PPE), materiałów wolnych od RNAzów i inhibitorów RNAzy. Co najważniejsze, RNA powinno być trzymane na lodzie, gdy tylko jest to możliwe. Dotyczy to zwłaszcza metylowanego RNA, który jest jeszcze bardziej wrażliwy na wysokie temperatury.
Ważne jest, aby potwierdzić, że struktura RNA, która jest przedmiotem zainteresowania, nie jest wrażliwa na stężenie DMS i warunki buforowe. takie jak 100 mM Tris, 100 mM MOPS i 100 mM HEPES przy pH 7-7,5 dają wysoki sygnał, ale mogą nie być wystarczające do utrzymania pH podczas reakcji21. Ponieważ DMS hydrolizuje w wodzie, co obniża pH, silny bufor ma kluczowe znaczenie dla utrzymania neutralnego pH podczas reakcji modyfikacji. Wykazano, że dodatek biciny pomaga utrzymać pH jako lekko zasadowe21 , ale powoduje niską modyfikację DMS na Gs i Us, co może być pouczające, ale powinno być analizowane oddzielnie ze względu na wytwarzanie znacznie niższego sygnału niż As i Cs i nie jest dalej omawiane w tym protokole.
W specyficznym dla genu RT-PCR zmodyfikowany RNA jest odwrotnie transkrybowany do DNA i amplifikowany we fragmentach przez PCR. Chociaż rozmiar RNA może być teoretycznie nieograniczony, te fragmenty PCR nie powinny przekraczać długości 400-500 par zasad (bp), aby zapobiec stronniczości podczas reakcji odwrotnej transkrypcji. Idealnie byłoby, gdyby fragmenty znajdowały się w zakresie sekwencjonowania (tj. jeśli sekwencjonowanie jest przeprowadzane przy użyciu programu sekwencjonowania sparowanych końców w cyklu 150 x 150, pojedynczy fragment nie powinien przekraczać 300 pz). W przypadku korzystania z programów sekwencjonowania z mniejszą liczbą cykli, produkty PCR mogą być fragmentowane za pomocą dsDNazy. Ponadto, ponieważ sekwencje w sekwencjach starterowych nie zawierają żadnych informacji strukturalnych, fragmenty muszą się na siebie nakładać, gdy badany RNA składa się z >1 fragmentu. Reakcje RT mogą zawierać wiele starterów RT dla różnych fragmentów (do 10 różnych starterów RT). W zależności od sekwencji, łączenie starterów RT może sprawić, że odwrotna transkrypcja będzie mniej wydajna, ale zazwyczaj działa dobrze. Każda reakcja PCR powinna być przeprowadzana osobno.
Podczas sondowania RNA za pomocą DMS warunki eksperymentalne odgrywają dodatkową rolę, ponieważ wiele RNA jest niestabilnych termodynamicznie i zmienia swoją konformację w zależności od czynników środowiskowych, takich jak temperatura. Aby uniknąć nieprawidłowości, warunki doświadczalne powinny być utrzymywane na jak najbardziej stałym poziomie, również w odniesieniu do czasów reakcji. Warunki buforowe wydają się być do pewnego stopnia wymienne 17,20,22,23, gdy spełnione są podstawowe warunki - pojemność buforowa i obecność jonów jednowartościowych (Na) i dwuwartościowych (Mg) - w celu zapewnienia prawidłowego fałdowania RNA24.
Jeśli chodzi o przygotowanie biblioteki zmodyfikowanych RNA, należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Po pierwsze, jak wspomniano wcześniej, zmodyfikowane RNA są mniej stabilne niż ich niezmodyfikowane odpowiedniki, co oznacza, że mogą wymagać optymalizacji czasów fragmentacji w celu uzyskania optymalnego rozkładu wielkości fragmentów. Co więcej, niektóre zestawy do przygotowywania bibliotek RNA, a także wiele innych podejść RNAseq, wykorzystują losowe startery w zestawie do odwrotnej transkrypcji. Może to prowadzić do mniejszego pokrycia odniesienia, zwłaszcza w 3' genu, a ostatecznie do niewystarczającej głębokości pokrycia. Jeśli pokrycie określonego regionu jest zbyt niskie, może być konieczne usunięcie tych zasad z przewidywania struktury. Oprócz zestawów RT-PCR i RNAseq całego genomu można stosować inne podejścia do przygotowania bibliotek. Protokoły obejmujące ligację adapterów 3' i/lub 5' do RNA są korzystne w przypadku stosowania małych fragmentów RNA lub gdy należy uniknąć utraty informacji sondujących w regionach starterowych.
Wreszcie, analiza eksperymentów z sondami chemicznymi musi być zawsze interpretowana ostrożnie. Obecnie nie ma oprogramowania, które z dużą dokładnością przewiduje strukturę RNA dowolnego RNA na podstawie samej sekwencji. Chociaż ograniczenia sondowania chemicznego znacznie poprawiają dokładność, generowanie dobrych modeli dla długich RNA (>500 nt) jest nadal wyzwaniem. Modele te powinny być dalej testowane za pomocą innych podejść i/lub mutagenezy. Oprogramowanie do przewidywania RNA optymalizuje pod kątem maksymalnej liczby par zasad, co znacznie karze otwarte konformacje, które mogą nie reprezentować dokładnie fałdowania RNA5. W związku z tym uzyskany model struktury powinien zostać przetestowany poprzez ilościowe określenie zgodności prognoz z podstawowymi danymi z sond chemicznych (np. za pomocą AUROC) oraz między powtórzeniami (np. za pomocą mFMI), jak pokazano w Lan i wsp.20.
Idealnie byłoby, gdyby przeprowadzono kilka eksperymentów w różnych systemach, aby zakwestionować uzyskany model struktury, aby wzmocnić swoją hipotezę. Mogą one obejmować stosowanie metod in vitro i wewnątrzkomórkowych, mutacje kompensacyjne oraz różne linie i gatunki komórek. Co więcej, surowe reaktywności są często tak samo lub nawet bardziej pouczające niż przewidywania dotyczące struktury, ponieważ rejestrują migawkę "prawdy podstawowej" zespołu fałdowania RNA. W związku z tym reaktywności na surowo są bardzo odpowiednie i pouczające do porównywania zmian struktury w różnych warunkach. Co ważne, struktury o najniższej energii swobodnej obliczone za pomocą ograniczeń sondowania chemicznego z predykcją obliczeniową powinny być używane jedynie jako hipoteza wyjściowa w kierunku kompletnego modelu struktury.

Od czasu odkrycia, że RNA ma zarówno właściwości strukturalne1,2 i catalytic3, stopniowo odkrywane jest znaczenie RNA i jego funkcji regulacyjnej w wielu procesach biologicznych. Rzeczywiście, wpływ struktury RNA na regulację genów zyskuje coraz większą uwagę4. Podobnie jak białka, RNA ma struktury pierwszorzędowe, drugorzędowe i trzeciorzędowe, odnosząc się odpowiednio do sekwencji nukleotydów, mapowania 2D oddziaływań parowania zasad i fałdowania 3D tych sparowanych struktur zasadowych. Podczas gdy określenie struktury trzeciorzędowej jest kluczem do zrozumienia dokładnych mechanizmów stojących za procesami zależnymi od RNA, struktura drugorzędowa jest również bardzo pouczająca w odniesieniu do funkcji RNA i stanowi podstawę do dalszego składania 3D5.
Jednak określenie struktury RNA było z natury rzeczy wyzwaniem przy konwencjonalnych metodach. Podczas gdy w przypadku białek krystalografia, magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) i kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) umożliwiły określenie różnorodności motywów strukturalnych, co pozwoliło na przewidywanie struktury na podstawie samej sekwencji6, podejścia te nie mają szerokiego zastosowania do RNA. Rzeczywiście, RNA to elastyczne cząsteczki z blokami budulcowymi (nukleotydami), które mają znacznie większą swobodę konformacyjną i rotacyjną w porównaniu z ich odpowiednikami aminokwasowymi. Co więcej, interakcje poprzez parowanie zasad są bardziej dynamiczne i wszechstronne niż w przypadku reszt aminokwasowych. W rezultacie, klasyczne podejścia okazały się skuteczne tylko w przypadku stosunkowo małych RNA o dobrze zdefiniowanych, bardzo zwartych strukturach7.
Innym podejściem do określenia struktury RNA jest sondowanie chemiczne połączone z sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS). Strategia ta generuje informacje o statusie wiązania każdej zasady w sekwencji RNA (tj. jej strukturze drugorzędowej). Krótko mówiąc, zasady w cząsteczce RNA, które nie angażują się w parowanie zasad, są różnie modyfikowane przez małe związki chemiczne. Odwrotna transkrypcja tych RNA za pomocą wyspecjalizowanych odwrotnych transkryptaz (RT) obejmuje modyfikacje komplementarnego kwasu dezoksyrybonukleinowego (cDNA) jako mutacje. Te cząsteczki cDNA są następnie amplifikowane przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) i sekwencjonowane. Aby uzyskać informacje o ich "statusie" jako związanym lub niezwiązanym, częstości mutacji na każdej zasadzie w RNA będącym przedmiotem zainteresowania są obliczane i wprowadzane do oprogramowania do przewidywania struktury jako ograniczenia8. Na podstawie reguł najbliższego sąsiedztwa9 i obliczeń minimalnej energii swobodnej10, oprogramowanie to generuje modele struktur, które najlepiej pasują do uzyskanych danych eksperymentalnych11,12.
DMS-MaPseq używa DMS, który metyluje azot N1 w adenozynach i azot N3 w cytozynach na powierzchni Watsona-Cricka w bardzo specyficzny sposób13. Użycie termostabilnej odwrotnej transkryptazy intronowej grupy II (TGIIRT-III) w odwrotnej transkrypcji tworzy profile mutacyjne o niespotykanych dotąd stosunkach sygnału do szumu, umożliwiając nawet dekonwolucję nakładających się profili generowanych przez dwie lub więcej alternatywnych konformacji14,15. Co więcej, DMS może przenikać przez błony komórkowe i całe tkanki, umożliwiając sondowanie w kontekstach fizjologicznych. Generowanie dobrej jakości danych jest jednak trudne, ponieważ różnice w procedurze obsługi mogą mieć wpływ na wyniki. W związku z tym udostępniamy szczegółowy protokół zarówno dla DMS-MaPseq in vitro, jak i in cell, aby zmniejszyć stronniczość i przeprowadzić nowicjuszy w tej metodzie przez trudności, jakie mogą napotkać. Szczególnie w świetle niedawnej pandemii SARS-CoV2 wysokiej jakości dane dotyczące wirusów RNA są ważnym narzędziem do badania ekspresji genów i znajdowania możliwych środków terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>10787018</td><td>Thermo</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>M6250-250ML</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4,5</td><td>AM9720</td><td>Thermo</td><td></td></tr><tr><td>Advantage PCR</td><td>639206</td><td>Takara</td><td></td></tr><tr><td>CloneAmp HiFi PCR Premix</td><td>639298</td><td>Takara</td><td></td></tr><tr><td>DMS</td><td>D186309 &nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs 10 mM każdy</td><td>U151B</td><td>Promega</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel EX Żele agarozowe, 2%</td><td>G402022</td><td>Prefabrykowane żele agarozowe</td><td>Thermo</td></tr><tr><td>Etanol (200 proof)</td><td>E7023-4X4L</td> Probówki <td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Falcon, 15 mL, 50 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td></td><td></td><td>współstrącające</td></tr><tr><td>HCT-8 komórki&nbsp;</td><td>ATCC #CCL-244</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; MgCl2&nbsp; (1 mln)</td><td>AM9530G</td><td>fisherscientific</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>278475</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 transkrypcja</td><td>AM1334</td><td></td> Spektrofotometr <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Thermo<td>NanoDrop</td></tr><tr><td>Żele Novex TBE, 8%, 10 dołków</td><td>EC6215BOX</td><td>Thermo</td><td></td></tr><tr><td>OC43&nbsp;</td><td>ATCC #VR-1558</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboRuler Drabinka RNA niskiego zasięgu</td><td>SM1831</td><td>Thermo</td><td></td></tr><tr><td>RNAzystw H</td><td>M0297L</td><td>NEB</td><td></td></tr><tr><td>Kakodylan sodu, 0,4 M, pH 7,2</td><td>102090-964</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku sodu</td><td>S8263-150ML</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Odwrotna transkryptaza dla FSB i DTT</td><td>18064014</td><td>Thermo</td><td></td></tr><tr><td>Enzym TGIRT-III</td><td>TGIRT50</td><td>Ingex</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Clean & Koncentrator</td><td>D4060</td><td>Genesee</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Zestawy koncentratorów to zestawy do czyszczenia RNA</td>, <td>odczynniki R1016</td><td>Genesee</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>15596018</td><td>odczynnik do izolacji</td><td>termicznego</td> RNA</tr><tr><td>Woda, (do pracy z RNA) (traktowane DEPC, DNASE, wolne od RNAZ/Mol. Biol.)</td><td>BP561-1</td><td>fisherscientific</td><td></td></tr><tr><td>xGen Przygotowanie biblioteki RNA o szerokim zakresie 16rxn</td><td>10009865</td><td>IDT</td><td></td></tr><tr><td>Zymo RNA czyste i koncentratorowe kolumny</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sondowanie struktury rna za pomocą siarczanu dimetylu profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Probing RNA Structure with Dimethyl Sulfate Mutational Profiling with Sequencing In Vitro and in Cells

Rola struktury RNA w praktycznie każdym procesie biologicznym staje się coraz bardziej oczywista, zwłaszcza w ostatniej dekadzie. Jednak klasyczne podejścia do rozwiązywania struktury RNA, takie jak krystalografia RNA lub cryo-EM, nie nadążają za szybko rozwijającą się dziedziną i zapotrzebowaniem na rozwiązania o wysokiej przepustowości. Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem przy użyciu siarczanu dimetylu (DMS) MaPseq to podejście oparte na sekwencjonowaniu, które pozwala wywnioskować strukturę RNA na podstawie reaktywności zasady z DMS. DMS metyluje azot N1 w adenozynach i N3 w cytozynach na powierzchni Watsona-Cricka, gdy zasada jest niesparowana. Odwrotna transkrypcja zmodyfikowanego RNA za pomocą termostabilnej odwrotnej transkryptazy intronowej grupy II (TGIIRT-III) prowadzi do włączenia metylowanych zasad jako mutacji do cDNA. Podczas sekwencjonowania powstałego cDNA i mapowania go z powrotem do referencyjnego transkryptu, względne wskaźniki mutacji dla każdej zasady wskazują na "status" zasady jako sparowanej lub niesparowanej. Mimo że reaktywności DMS charakteryzują się wysokim stosunkiem sygnału do szumu zarówno in vitro, jak i w komórkach, metoda ta jest wrażliwa na stronniczość w procedurach obchodzenia się z nimi. Aby zmniejszyć to odchylenie, w niniejszym artykule przedstawiono protokół leczenia RNA za pomocą DMS w komórkach oraz za pomocą RNA transkrybowanego in vitro.

Gene-specific in vitro DMS-MaP 
Aby zbadać 5'UTR SARS2, pierwsze 300 pz wirusa zostało uporządkowane jako sekwencja gBlock wraz z trzema starterami. Obejmowały one dwa startery do propagacji fragmentu ("FW" i "RV") za pomocą PCR, a także jeden do dołączania promotora T7 ("FW-T7"). Sekwencje te przedstawiono w tabeli 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>nazwa</td>
			<td>Sekwencja (5'-&gt;3')</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fw</td>
			<td>ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rv</td>
			<td>GCAAACTGAGTTGGACGTGTGT</td> powiedział:
		</tr>
		<tr>
			<td>FW-T7</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGG ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sekwencja startera dla DMS-MaP RT-PCR SARS-CoV2 5'UTR. W tym przypadku FW-T7 i RV są potrzebne do wygenerowania matrycy DNA do transkrypcji in vitro, RV jest używany w odwrotnej transkrypcji, a para starterów FW-RV jest używana w późniejszej amplifikacji PCR cDNA. Startery wygrzewają się na samym początku genomu SARS-CoV2 (FW) i sekwencji tuż za obszarem zainteresowania. Skróty: DMS-MaP = profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem przy użyciu siarczanu dimetylu; RT-PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją; SARS-CoV2 = zespół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej – koronawirus 2; UTR = region nieprzetłumaczony; RV = odwrócony podkład; FW = starter do przodu.
Aby wygenerować RNA z fragmentu gBlock, sekwencja promotora polimerazy T7 została dołączona za pomocą nakładającego się PCR przy użyciu premiksu PCR zgodnie ze schematem widocznym w Rysunek 2A. Z wydłużonego fragmentu RNA zostało wygenerowane przy użyciu zestawu do transkrypcji T7. Matryca DNA została następnie wytrawiona przy użyciu DNazy i RNA wyizolowanej za pomocą kolumn RNA Clean &amp; Concentrator.
Kontrola jakości transkrypcji in vitro została przeprowadzona poprzez uruchomienie produktu RNA na 1% żelu agarozowym wraz z drabinką ssRNA. Ponieważ widoczne było tylko jedno prążkowanie, przeprowadzono sondowanie DMS in vitro i RT-PCR (patrz <silna klasa="xfig">Ryc. 2B).</silna>
Aby zweryfikować powodzenie reakcji PCR, próbka została przeprowadzona na 2% żelu agarozowym przy użyciu drabiny dsDNA. Po indeksowaniu pasmo powinno biec ~150 pz wyżej na tym samym żelu, biorąc pod uwagę wielkość indeksujących starterów.
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64820/64820fig2v2.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 2: Transkrypcja in vitro matrycy DNA. orazAby dokonać transkrypcji in vitro matrycy DNA, która nie ma jeszcze wewnętrznego promotora polimerazy RNA, matryca musi być najpierw dołączona przez nakładanie się PCR. Odbywa się to za pomocą startera do przodu, który zawiera sekwencję TAATACGACTCACTATAGG (w przypadku polimerazy RNA T7) przed pierwszymi zasadami nakładającymi się na pożądany fragment. Podkreślona podstawa symbolizuje tutaj miejsce rozpoczęcia transkrypcji polimerazy. Gdy promotor przyłączy się do fragmentu dsDNA, może zostać transkrybowany przez polimerazę T7. Co ważne, polimeraza wykorzystuje nić przeciwstawną do wspomnianej sekwencji promotora jako matrycę (kolor niebieski), skutecznie tworząc RNA identyczne z sekwencją znajdującą się bezpośrednio za wskazaną sekwencją promotora (kolor czerwony). (B) 1% żel agarozowy z drabinką ssRNA (tor 1) i transkrybowany in vitro produkt RNA w temperaturze 300 nt (ścieżka 2). (C) 2% żel agarozowy z GeneRuler 1 kb plus drabinka (tor 1), produkt PCR po RT-PCR biegnący w temperaturze 300 pz (tor 2) i zindeksowany fragment po przygotowaniu biblioteki biegnący w temperaturze 470 pz (tor 3). Skróty: RT-PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją; DMS = siarczan dimetylu; nt = nukleotydy; dsDNA = dwuniciowy DNA; ssRNA = jednoniciowy RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64820/64820fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>
Cały genom in vivo DMS-MaP z wykorzystaniem komórek zakażonych wirusem 
Przed leczeniem DMS komórki HCT-8 były zakażone OC43. Gdy zaobserwowano efekt cytopatyczny (CPE) 4 dni po zakażeniu (dpi) (jak widać w <silna klasa="xfig">Figura 3A), komórki te poddano leczeniu, a RNA wyekstrahowano i rybodeplekowano. Podczas przeprowadzania całkowitego RNA na żelu agarozowym widoczne były dwie jasne prążki, odpowiadające za podjednostki 40S i 60S rybosomu, które stanowią około 95% całkowitej masy RNA (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Gdy ekstrakcja RNA nie powiodła się lub uległa degradacji (np. przez wiele cykli zamrażania i rozmrażania), produkty degradacji RNA były widoczne na dnie żelu (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3C, drugi pas). Co więcej, po wyczerpaniu rRNA, dwa jasne pasma zniknęły, pozostawiając smugę na pasie (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3C, trzeci pas). Ostatecznie, po przygotowaniu biblioteki, próbki miały różny rozkład wielkości i zostały pokazane jako rozmaz na końcowym żelu PAGE. Pasmo zostało wycięte między 200 nukleotydami (nt) a 500 nt, zgodnie z sekwencjonowaniem sparowanych końców 150 x 150 planowanym do analizy tych bibliotek. Co najważniejsze, dimery adaptera pracujące z prędkością ~150 nt zostały oddzielone (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3D).</silna></silna></silna></silna></silna>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64820/64820fig3v2.jpg"> 
Rysunek 3: Punkty kontrolne in vivo DMS-MaP z komórkami zainfekowanymi wirusem. (A) Obraz mikroskopowy komórek HCT-8 zakażonych wirusem, 4 dni dpi. Aby uzyskać najwyższą możliwą wydajność wirusowego RNA z całkowitego RNA przy jednoczesnej minimalizacji niekorzystnych skutków spowodowanych śmiercią komórki, DMS należy dodać po rozpoczęciu CPE lub nawet wcześniej, jak widać na obrazie. (B) 1% żel agarozowy z sześcioma próbkami po 1 μg całkowitego RNA. Na każdym pasie widoczne są dwa jasne pasma, odpowiadające za podjednostki 40S i 60S, ponieważ rybosomalne RNA stanowi ~95% całkowitego RNA. Uwaga: Leczenie DMS w komórce powoduje pewną fragmentację i rozmazywanie RNA, ale dwa pasma rRNA powinny być nadal widoczne. Łagodna fragmentacja po modyfikacji jest tolerowana, ponieważ informacje zawierające znacznik metylacji są generowane i informują o strukturze RNA podczas inkubacji DMS, gdy komórki są jeszcze żywe. (C) 1% żel agarozowy GeneRuler 1 kb plus drabinkowy marker DNA (ścieżka 1) całkowite RNA przechowywane wcześniej w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy (ścieżka 2) i rybodeplerowany RNA (tor 3). Podczas przechowywania RNA przez długi czas z kilkoma cyklami zamrażania i rozmrażania, RNA zaczyna ulegać degradacji i prawdopodobnie nie powinno być używane do eksperymentów sondujących. Co więcej, po rybodeplenacji całkowitego RNA, dwa jasne pasma, stanowiące podjednostki 40S i 60S rybosomu, zanikają i zaczyna pojawiać się rozmaz resztkowych RNA. (D) Żel PAGE z GeneRuler 1 kb plus drabinkowy marker DNA (tor 1) i próbka biblioteczna RNA przygotowanego z całego genomu. Żel należy wyciąć w zależności od potrzeb sekwencjonowania. W przypadku sekwencjonowania z parami końców obejmującego 150 cykli z obu stron, żel należy wyciąć w zakresie od 300 pz do 500 pz. Dimery adaptera (pracujące z prędkością 170 pz) powinny być oddzielone. Skróty: DMS-MaP = profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem przy użyciu siarczanu dimetylu; DPI = dni po zakażeniu; CPE = efekt cytopatyczny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64820/64820fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Po sekwencjonowaniu, pliki .fastq zostały przeanalizowane poprzez wysłanie zadania na serwer WWW DREEM (http://rnadreem.org/), wraz z plikiem referencyjnym .fasta. Dane wyjściowe generowane przez serwer obejmują pliki kontroli jakości generowane przez fastqc (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) i TrimGalore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), a także inne pliki wyjściowe zawierające średnie częstości mutacji w populacji. Oprócz diagramu pokazującego częstość mutacji w formacie interaktywnego .html (patrz Rysunek 4A) oraz pliku .csv z surowymi reaktywacjami na zasadę i plikiem struct_constraint.txt, który można odczytać za pomocą kilku programów do przewidywania struktury RNA, zawiera on również plik bitvector.txt informujący o mutacjach z odczytu. Na tej podstawie obliczono struktury średniej populacji, przesyłając pliki .fasta i struct_constraint.txt do serwera WWW RNAfold (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi). Wykorzystuje to oprogramowanie ViennaRNA do generowania przewidywań struktury w oparciu o minimalną energię swobodną, które można przeglądać online lub pobrać w formacie ct lub wiedeńskim. Aby wygenerować modele struktury RNA, te pliki do pobrania zostały przesłane do VARNA (https://varna.lri.fr/, patrz Rysunek 4B). Wreszcie, pliki bitvector.txt mogą być używane przez stabilną wersję DREEM (https://codeocean.com/capsule/6175523/tree/v1) do poszukiwania alternatywnych konformacji RNA. Aby uzyskać dobre modele struktury za pomocą DREEM, należy osiągnąć pokrycie 10 000 odczytów na bazę; W przypadku klastrowania może być wymagane do 100 000 odczytów na bazę. Przegląd całego przepływu pracy można znaleźć w Rysunek 4C.
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64820/64820fig4v2.jpg"> 
Rysunek 4: Przykładowe dane uzyskane z eksperymentów chemicznych SARS-CoV2 5'UTR. (A) Profil reaktywności pierwszych 300 zasad genomu SARS-CoV2 pokolorowany według zasady (A: czerwony, C: niebieski, U: zielony, G: żółty). Surowe reaktywności oblicza się jako bezwzględną częstość mutacji podzieloną przez pokrycie. Zasady o otwartej budowie mają wysokie wartości reaktywności; Zasady angażujące się w parowanie zasad mają niskie wartości reaktywności. U i G nie są modyfikowane przez DMS i mają niskie wartości reaktywności, wynikające z niewierności polimerazy. Przewidywania zostały wykonane za pomocą serwera WWW DREEM. (B) Model struktury SARS-CoV2 5'UTR przewidywany na podstawie wartości reaktywności wykonanych za pomocą VARNA. Zasady o wysokich wartościach reaktywności są pokolorowane na czerwono; Zasady o niskich wartościach reaktywności są pokolorowane na biało. (C) Przebieg analizy DMS-MaP rozpoczynający się od plików .fastq uzyskanych z sekwencjonowania. Mogą one być kontrolowane pod względem jakości za pomocą fastqc; sekwencje adaptera są przycinane za pomocą TrimGalore, a następnie mapowane z powrotem do sekwencji referencyjnej za pomocą Bowtie2. Z uzyskanych plików .bam DREEM zlicza mutacje w każdym odczycie, tworząc mapę mutacji lub plik .bitvector.txt. Informują one o mutacjach każdego odczytu w sposób zależny od pozycji, na podstawie których można stworzyć średnie profile reaktywności populacji. Alternatywnie, wektory bitowe mogą być grupowane za pomocą DREEM w celu poszukiwania alternatywnych konformacji RNA. Na koniec uzyskane modele konstrukcji są wizualizowane za pomocą oprogramowania (np. VARNA). Skróty: DMS-MaP = profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem przy użyciu siarczanu dimetylu; SARS-CoV2 = zespół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej - koronawirus 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64820/64820fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

The role of RNA structure in virtually any biological process has become increasingly evident, especially in the past decade. However, classical ...

DMS-MaP to metoda oparta na sekwencjonowaniu, która pozwala nam uzyskać migawkę struktury RNA i dowiedzieć się, jak zmienia się ona w różnych warunkach. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod określania struktury, takich jak krystalografia i mikroskopia elektronowa, DMS-MaP może być stosowany w komórkach i dekonwolucyjnych zespołach struktur RNA. Ponieważ struktura RNA ma wpływ na wiele zjawisk biologicznych, nasza metoda może dostarczyć mechanistycznego wglądu w prawie każdą dziedzinę badań biologicznych.Rozpocznij od przeniesienia 89 mikrolitrów buforu do ponownego składania do wyznaczonej 1,5-mililitrowej probówki dla każdej reakcji o końcowej objętości 100 mikrolitrów. Rozgrzej rurkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce umieszczonej pod kapturem chemicznym. Dodaj 10 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do probówki PCR i przenieś do niej od jednego do 10 pikomoli RNA.Inkubuj go w termocyklerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez jedną minutę, aby zdenaturować RNA. A następnie natychmiast umieść probówkę na bloku lodu, aby uniknąć nieprawidłowego fałdowania RNA. Teraz, aby ponownie złożyć RNA, dodaj próbkę do wyznaczonej probówki zawierającej bufor do ponownego fałdowania w temperaturze 37 stopni Celsjusza i dobrze wymieszaj przed inkubacją przez 10 do 20 minut.Następnie dodaj jeden mikrolitr 100% siarczanu dimetylu lub DMS o stężeniu 10,5 mola do probówki zawierającej próbkę RNA i inkubuj mieszaninę reakcyjną przez pięć minut, wstrząsając nią z prędkością od 800 do 1 400 obrotów na minutę. Po pięciominutowej reakcji schładzaj go 60 mikrolitrami 100% beta-merkaptoetanolu i dobrze wymieszaj przed wirowaniem i natychmiastowym umieszczeniem RNA na lodzie. Następnie oczyść RNA i wymyj go w 10 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz.Określić ilościowo RNA za pomocą spektrofotometru. Na koniec przechowuj zmodyfikowany RNA w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po dodaniu mieszaniny reakcyjnej do probówki PCR należy przenieść co najmniej 100 nanogramów eluowanego zmodyfikowanego RNA w 10 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz do probówki PCR.Mieszaninę inkubować w temperaturze 57 stopni Celsjusza przez 30 minut do 1,5 godziny w termocyklerze. 30 minut wystarcza do wytworzenia produktu zawierającego 500 nukleotydów. Następnie dodaj do niego jeden mikrolitr czterech molowych wodorotlenków sodu, dobrze wymieszaj pipetą i inkubuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby zdegradować RNA i uwolnić TGIRT z komplementarnego DNA.Stosując podejście kolumnowe do usunięcia starterów, oczyść komplementarne DNA. I wykonaj PCR, aby go wzmocnić. Sprawdź, czy test PCR powiódł się, umieszczając dwa mikrolitry produktu PCR na żelu agarozowym przed przystąpieniem do przygotowania biblioteki.Następnie należy określić ilościowo wyekstrahowane fragmenty za pomocą spektrofotometru przed indeksowaniem fragmentów do sekwencjonowania. Komórki zakażone wirusem, wyhodowane do pożądanego stadium zakażenia, należy przenieść do specjalnego i odpowiedniego dygestorium o wymaganym poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Dodać 2,5% objętości DMS do pożywki hodowlanej zawierającej komórki i zamknąć pojemnik parafilmem.Natychmiast inkubować pojemnik w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po inkubacji ostrożnie odpipetować i wyrzucić pożywkę zawierającą DMS do odpowiednich odpadów chemicznych. Następnie delikatnie dodaj 10 mililitrów buforu zatrzymującego do komórek, zeskrob komórki i przenieś je do 15-mililitrowej stożkowej probówki.Osad komórki przez odwirowanie probówki przez trzy minuty przy 3 000 g. Usuń supernatant i umyj osad komórkowy dwa razy 10 mililitrami PBS. Po praniu ostrożnie usuń resztki PBS w jak największym stopniu.Rozpuść osad w odpowiedniej ilości odczynnika do izolacji RNA, aby przeprowadzić ekstrakcję RNA. Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do jednego mililitra homogenizowanych komórek w odczynniku do izolacji RNA i wiruj przez 15 do 20 sekund, aż roztwór komórkowy zmieni kolor na jasnoróżowy. Poczekaj, aż nastąpi separacja faz, na co wskazuje różowa faza lipidowa osiadająca na dnie.Wirować probówkę z prędkością około 20 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed przeniesieniem górnej fazy wodnej do nowej probówki. Oczyść RNA i eluuj w wystarczającej ilości wody wolnej od nukleaz. Następnie, po wykonaniu zubożenia rybosomalnego RNA przy użyciu preferowanego podejścia, wymyj RNA w odpowiedniej objętości wody wolnej od nukleaz i oznacz go ilościowo za pomocą spektrofotometru.Oczyszczone RNA może być ponownie wykorzystane w RT-PCR. Za pomocą wspomnianego serwera WWW można wygodnie analizować dane DMS-MaP. Odczyty są mapowane na odwołanie, a mutacje na bazę są zliczane.Uzyskane w ten sposób pliki ze średnimi populacjami mogą być wykorzystane jako ograniczenia w dobrze znanym oprogramowaniu do przewidywania struktury RNA. Powstałe w ten sposób struktury o minimalnej energii swobodnej można wizualizować za pomocą oprogramowania takiego jak VARNA. Na razie tylko stabilna wersja DREAM może dekonwoluować zespoły struktur RNA.Trwają jednak prace nad tym, aby ta funkcja była bardziej dostępna dla całej społeczności. Transkrypcja in vitro fragmentu gBlock wydłużonego przez przyłączenie promotora polimerazy T7 wygenerowała interesujący RNA, pojawiający się jako pojedyncze prążko na 300 nukleotydach na 1% żelu agarozowym. Na powodzenie specyficznego dla genu RT-PCR przeprowadzonego na zmodyfikowanym RNA DMS wskazywało pojedyncze prążki na 300 par zasad na 2% żelu agarozowym.Zindeksowany fragment pojawił się około 150 par zasad wyżej niż oczekiwano. Leczenie DMS przeprowadzono na komórkach HCT-8 wykazujących działanie cytopatyczne cztery dni po zakażeniu wirusem. Wyekstrahowane całkowite RNA pojawiło się na żelu agarozowym jako dwa jasne prążki, odpowiadające za podjednostki 40S i 60S.Po wyczerpaniu rybosomalnego RNA dwie jasne prążki zniknęły, pozostawiając smugę na odpowiednim pasie. Po przygotowaniu biblioteki próbki miały różny rozkład wielkości i pojawiały się jako rozmaz. Pasmo wycięto od 200 do 500 nukleotydów, a dimery adapterowe oddzielono.Model struktury genomu SARS-CoV-2 wykazał, że zasady o otwartej konformacji mają wyższą reaktywność w porównaniu z tymi zaangażowanymi w parowanie zasad. Profil reaktywności zasad wskazywał, że uracyl i guanina miały niskie wartości reaktywności i nie były modyfikowane przez DMS. Dzięki naszej metodzie jesteśmy w stanie przewidzieć struktury w komórkach w sposób wysokoprzepustowy bez ograniczeń rozmiaru.Metryki kontrolne są bardzo ważne, ponieważ zapewniają wgląd w dokładność przewidywań struktury. Aby jeszcze bardziej zweryfikować dokładność przewidywania, należy przeprowadzić więcej eksperymentów, które zakłócają lub zmieniają strukturę.

probing-rna-structure-with-dimethyl-sulfate-mutational-profiling-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie syntetycznego substratu tRNA dla homologu metylotransferazy DNA/tRNA 2 (Dnmt2) z Entamoeba histolytica, Ehmeth, oraz pomiar jego aktywności metylotransferazy. To podejście eksperymentalne może być wykorzystane do badania aktywności innych białek Dnmt2.

Analiza metylacji tRNA in vitro z użyciem enzymu DNA i tRNA metylotransferazy Dnmt2 (Ehmeth) z Entamoeba histolytica

Tutaj prezentujemy protokół do analizy interakcji RNA/białko. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) opiera się na zróżnicowanej migracji kompleksów RNA/białko i wolnego RNA podczas natywnej elektroforezy żelowej. Za pomocą znakowanej radioaktywnie sondy RNA, kompleksy RNA/białko można uwidocznić za pomocą autoradiografii.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Rybonukleotydy są jednymi z najliczniejszych niekanonicznych nukleotydów włączonych do genomu podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA. Jeśli rybonukleotydy nie zostaną prawidłowo usunięte, mogą powodować uszkodzenie DNA i mutagenezę. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia eksperymentalne, które są stosowane do oceny obfitości inkorporacji rybonukleotydów w DNA i ich skutków mutagennych.

Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami

Tutaj opisujemy test hybrydyzacji in situ, który umożliwia czułe i specyficzne wykrywanie sekwencji tak krótkich jak 50 nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu na poziomie pojedynczej komórki. Test, który może być wykonywany ręcznie lub automatycznie, może umożliwić wizualizację wariantów splicingu, krótkich sekwencji i mutacji w kontekście tkanki.

Wizualizacja wariantów genetycznych, krótkich celów i mutacji punktowych w kontekście morfologicznym tkanki za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest techniką używaną do wprowadzania specyficznych mutacji w kwasie dezoksyrybonukleinowym (DNA). Protokół ten opisuje, jak przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce za pomocą 2-etapowego i 3-etapowego podejścia opartego na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), które ma zastosowanie do dowolnego fragmentu DNA będącego przedmiotem zainteresowania.

Mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji RNA w Escherichia coli

Szczegółowe protokoły zarówno in vitro, jak i selektywnej acylacji 2'-hydroksylowej w komórce, analizowane za pomocą eksperymentów z rozszerzaniem starterów (SHAPE) w celu określenia drugorzędowej struktury sekwencji pre-mRNA interesujących w obecności małej cząsteczki ukierunkowanej na RNA, są przedstawione w tym artykule.

Wykorzystanie in vitro i in-cell SHAPE do badania zmian strukturalnych pre-mRNA wywołanych małymi cząsteczkami

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Struktura wtórna RNA została głównie zaobserwowana w dojrzałym RNA metodami sondowania struktury. Sekwencjonowanie śledzenia struktury kotranskrypcyjnej (CoSTseq) jednoczy jądrowy run-on, który był wykorzystywany do badania pozycji polimerazy na powstającym RNA, z wykorzystaniem sondowania struktury. CoSTseq umożliwia tym samym obserwację wtórnej struktury RNA w RNA podczas aktywnej transkrypcji.

Porównawcza analiza struktury RNA transkryptów powstających i dojrzałych u Saccharomyces cerevisiae

Protokół ten opisuje wizualny test z wykorzystaniem rozdzielonych reporterów RNA brokułów do wykrywania i ilościowego określania parowania zasad międzycząsteczkowych w klastrzach RNA in vitro.

Wizualizacja i ilościowa parowanie baz międzycząsteczkowych RNA w klastrach in vitro z wykorzystaniem raporterów RNA brokułów podzielonych

Poznaj metodę DMS-MaP do analizy struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu w warunkach in vitro i w komórkach żywych. Technika ta umożliwia profilowanie mutacyjne i dostarcza wgląd w dynamikę strukturalną RNA w czasie rzeczywistym.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Przeglądaj więcej filmów