Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

DMS-MaP to metoda oparta na sekwencjonowaniu, która pozwala nam uzyskać migawkę struktury RNA i dowiedzieć się, jak zmienia się ona w różnych warunkach. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod określania struktury, takich jak krystalografia i mikroskopia elektronowa, DMS-MaP może być stosowany w komórkach i dekonwolucyjnych zespołach struktur RNA. Ponieważ struktura RNA ma wpływ na wiele zjawisk biologicznych, nasza metoda może dostarczyć mechanistycznego wglądu w prawie każdą dziedzinę badań biologicznych.

Rozpocznij od przeniesienia 89 mikrolitrów buforu do ponownego składania do wyznaczonej 1,5-mililitrowej probówki dla każdej reakcji o końcowej objętości 100 mikrolitrów. Rozgrzej rurkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce umieszczonej pod kapturem chemicznym. Dodaj 10 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do probówki PCR i przenieś do niej od jednego do 10 pikomoli RNA.

Inkubuj go w termocyklerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez jedną minutę, aby zdenaturować RNA. A następnie natychmiast umieść probówkę na bloku lodu, aby uniknąć nieprawidłowego fałdowania RNA. Teraz, aby ponownie złożyć RNA, dodaj próbkę do wyznaczonej probówki zawierającej bufor do ponownego fałdowania w temperaturze 37 stopni Celsjusza i dobrze wymieszaj przed inkubacją przez 10 do 20 minut.

Następnie dodaj jeden mikrolitr 100% siarczanu dimetylu lub DMS o stężeniu 10,5 mola do probówki zawierającej próbkę RNA i inkubuj mieszaninę reakcyjną przez pięć minut, wstrząsając nią z prędkością od 800 do 1 400 obrotów na minutę. Po pięciominutowej reakcji schładzaj go 60 mikrolitrami 100% beta-merkaptoetanolu i dobrze wymieszaj przed wirowaniem i natychmiastowym umieszczeniem RNA na lodzie. Następnie oczyść RNA i wymyj go w 10 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz.

Określić ilościowo RNA za pomocą spektrofotometru. Na koniec przechowuj zmodyfikowany RNA w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po dodaniu mieszaniny reakcyjnej do probówki PCR należy przenieść co najmniej 100 nanogramów eluowanego zmodyfikowanego RNA w 10 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz do probówki PCR.

Mieszaninę inkubować w temperaturze 57 stopni Celsjusza przez 30 minut do 1,5 godziny w termocyklerze. 30 minut wystarcza do wytworzenia produktu zawierającego 500 nukleotydów. Następnie dodaj do niego jeden mikrolitr czterech molowych wodorotlenków sodu, dobrze wymieszaj pipetą i inkubuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby zdegradować RNA i uwolnić TGIRT z komplementarnego DNA.

Stosując podejście kolumnowe do usunięcia starterów, oczyść komplementarne DNA. I wykonaj PCR, aby go wzmocnić. Sprawdź, czy test PCR powiódł się, umieszczając dwa mikrolitry produktu PCR na żelu agarozowym przed przystąpieniem do przygotowania biblioteki.

Następnie należy określić ilościowo wyekstrahowane fragmenty za pomocą spektrofotometru przed indeksowaniem fragmentów do sekwencjonowania. Komórki zakażone wirusem, wyhodowane do pożądanego stadium zakażenia, należy przenieść do specjalnego i odpowiedniego dygestorium o wymaganym poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Dodać 2,5% objętości DMS do pożywki hodowlanej zawierającej komórki i zamknąć pojemnik parafilmem.

Natychmiast inkubować pojemnik w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po inkubacji ostrożnie odpipetować i wyrzucić pożywkę zawierającą DMS do odpowiednich odpadów chemicznych. Następnie delikatnie dodaj 10 mililitrów buforu zatrzymującego do komórek, zeskrob komórki i przenieś je do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Osad komórki przez odwirowanie probówki przez trzy minuty przy 3 000 g. Usuń supernatant i umyj osad komórkowy dwa razy 10 mililitrami PBS. Po praniu ostrożnie usuń resztki PBS w jak największym stopniu.

Rozpuść osad w odpowiedniej ilości odczynnika do izolacji RNA, aby przeprowadzić ekstrakcję RNA. Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do jednego mililitra homogenizowanych komórek w odczynniku do izolacji RNA i wiruj przez 15 do 20 sekund, aż roztwór komórkowy zmieni kolor na jasnoróżowy. Poczekaj, aż nastąpi separacja faz, na co wskazuje różowa faza lipidowa osiadająca na dnie.

Wirować probówkę z prędkością około 20 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed przeniesieniem górnej fazy wodnej do nowej probówki. Oczyść RNA i eluuj w wystarczającej ilości wody wolnej od nukleaz. Następnie, po wykonaniu zubożenia rybosomalnego RNA przy użyciu preferowanego podejścia, wymyj RNA w odpowiedniej objętości wody wolnej od nukleaz i oznacz go ilościowo za pomocą spektrofotometru.

Oczyszczone RNA może być ponownie wykorzystane w RT-PCR. Za pomocą wspomnianego serwera WWW można wygodnie analizować dane DMS-MaP. Odczyty są mapowane na odwołanie, a mutacje na bazę są zliczane.

Uzyskane w ten sposób pliki ze średnimi populacjami mogą być wykorzystane jako ograniczenia w dobrze znanym oprogramowaniu do przewidywania struktury RNA. Powstałe w ten sposób struktury o minimalnej energii swobodnej można wizualizować za pomocą oprogramowania takiego jak VARNA. Na razie tylko stabilna wersja DREAM może dekonwoluować zespoły struktur RNA.

Trwają jednak prace nad tym, aby ta funkcja była bardziej dostępna dla całej społeczności. Transkrypcja in vitro fragmentu gBlock wydłużonego przez przyłączenie promotora polimerazy T7 wygenerowała interesujący RNA, pojawiający się jako pojedyncze prążko na 300 nukleotydach na 1% żelu agarozowym. Na powodzenie specyficznego dla genu RT-PCR przeprowadzonego na zmodyfikowanym RNA DMS wskazywało pojedyncze prążki na 300 par zasad na 2% żelu agarozowym.

Zindeksowany fragment pojawił się około 150 par zasad wyżej niż oczekiwano. Leczenie DMS przeprowadzono na komórkach HCT-8 wykazujących działanie cytopatyczne cztery dni po zakażeniu wirusem. Wyekstrahowane całkowite RNA pojawiło się na żelu agarozowym jako dwa jasne prążki, odpowiadające za podjednostki 40S i 60S.

Po wyczerpaniu rybosomalnego RNA dwie jasne prążki zniknęły, pozostawiając smugę na odpowiednim pasie. Po przygotowaniu biblioteki próbki miały różny rozkład wielkości i pojawiały się jako rozmaz. Pasmo wycięto od 200 do 500 nukleotydów, a dimery adapterowe oddzielono.

Model struktury genomu SARS-CoV-2 wykazał, że zasady o otwartej konformacji mają wyższą reaktywność w porównaniu z tymi zaangażowanymi w parowanie zasad. Profil reaktywności zasad wskazywał, że uracyl i guanina miały niskie wartości reaktywności i nie były modyfikowane przez DMS. Dzięki naszej metodzie jesteśmy w stanie przewidzieć struktury w komórkach w sposób wysokoprzepustowy bez ograniczeń rozmiaru.

Metryki kontrolne są bardzo ważne, ponieważ zapewniają wgląd w dokładność przewidywań struktury. Aby jeszcze bardziej zweryfikować dokładność przewidywania, należy przeprowadzić więcej eksperymentów, które zakłócają lub zmieniają strukturę.