Mikroskopia sił atomowych w trybie kontaktowym jako szybka technika obserwacji morfologicznej i analizy uszkodzeń komórek bakteryjnych
30 czerwca 2023
Tutaj prezentujemy zastosowanie mikroskopii sił atomowych (AFM) jako prostej i szybkiej metody charakteryzacji bakterii i analizujemy szczegóły, takie jak rozmiar i kształt bakterii, biofilmy kultur bakteryjnych oraz aktywność nanocząsteczek jako środków bakteriobójczych.
Protokół ten pokazuje zastosowanie mikroskopii sił atomowych w trybie kontaktowym do obserwacji zmian w morfologii komórek spowodowanych określoną chorobą lub leczeniem. Zdecydowanie zaleca się używanie szczelnych pojemników do tej procedury, aby uniknąć zanieczyszczenia i jak najszybszą analizę utrwalonej próbki, aby uniknąć starzenia. Rozpocząć od zamocowania próbek na szkiełku, delikatnie przesuwając szkiełko kilka razy nad płomieniem, aż próbka wyschnie.
Umieścić utrwalone próbki na szalce Petriego i przetransportować je do mikroskopu sił atomowych w celu obserwacji. Następnie włącz komputer i mikroskop sił atomowych. Następnie wybierz tryb kontaktu, sondy ContAI-G i opcje automatycznego nachylenia w oprogramowaniu.
Ustaw domyślne wartości dla kontrolera Z, ustawiając nastawę na 20 nanometrów, wzmocnienie P na 10 000, wzmocnienie I na 1 000, wzmocnienie D na zero i napięcie końcówki na zero miliwoltów. Korzystając z głowicy o zakresie skanowania 70 mikrometrów, umieść próbki w trybie kontaktowym AFM. Uzyskaj szybki podgląd powierzchni obszaru pod sondą za pomocą kamery zamontowanej na dwóch soczewkach zintegrowanych z głowicą skanującą.
Teraz wybierz żądany obszar, ręcznie przesuwając go w płaszczyźnie XY. Pozwól sondzie elektronicznie zbliżyć się do powierzchni próbki, aż do osiągnięcia kontaktu. Elektronicznie dostosuj płaszczyznę pomiarową XY skanera i powierzchnię próbki, zmniejszając kierunek nachylenia XY.
Ustaw standardowe parametry oprogramowania na jedną linię na sekundę i 256 punktów na linię. Następnie wykonaj pełny zakres skanowania obszaru o wymiarach 70 na 70 mikrometrów. Zaznacz mniejszy obszar za pomocą narzędzia do powiększania.
Wybierz nowy obszar z próbki, cofając elektronicznie wspornik i przesuwając próbkę wzdłuż płaszczyzny XY. Następnie wykonaj nowe skanowanie, jak pokazano wcześniej. Następnie użyj wyrównywania linia po linii w menu narzędzi obrazu w wyborze filtrów, aby przeprowadzić przetwarzanie danych.
Zoptymalizuj maksymalną i minimalną wysokość paska kolorów, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość obrazu. Na koniec przeprowadź analizę obrazu za pomocą menu analizy. Wybierz punkt początkowy i końcowy za pomocą żądanego narzędzia, aby określić długość i odległość.
Mikroskopowa analiza sił atomowych kultur bakteryjnych wykazała, że kultury Staphylococcus aureus były rozmieszczone w strefach z agregatami ziarniaków. Zwiększone skale wykazały, że w większym stopniu doceniano rozmieszczenie populacji i morfologię ziarniaków. Obrazy w trybie kontaktowym AFM pozwoliły na określenie wielkości ziarniaków, które wykazywały średnią szerokość 1,25 mikrometra.
Pseudomonas hunanensis wykazywał jednorodne rozmieszczenie na całej powierzchni nośnej szkła, tworząc przylegającą monowarstwę. Kultury miały kształt pałeczek o długości 1,9 mikrometra i szerokości 0,9 mikrometra. Mikrorozcieńczenie nanocząstek tlenku magnezu Staphylococcus aureus spowodowało utratę gładkiej powierzchni i jednorodnych konturów z powodu poważnego pogorszenia struktury komórkowej.
Tworzenie pęcherzyków i uwalnianie materiału cytozolowego obserwowano w hodowlach w stężeniach wyższych niż MIC. Podobne wyniki uzyskano w hodowlach E. coli, gdzie kontrole wykazywały gładkie powierzchnie, co podkreślało jej jednorodny kształt przypominający pręciki. Struktura całkowicie zniknęła przy ekspozycji na nanocząstki 1000 PPM, a widoczne były tylko ich sylwetki.
Ważne jest, aby prawidłowo wykonać mocowanie próbki, ponieważ jest to niezbędne do dalszej analizy. Filtr obrazu pomaga zapewnić dobrą rozdzielczość obrazu i szczegóły próbki. Korzystając z metody mocowania, można zastosować tryby bezdotykowe AFM, które mogą być pomocne w badaniu właściwości mechanicznych.
Metodologia ta może być niedrogim i użytecznym narzędziem do badań medycznych i mikrobiologicznych skoncentrowanych na analizie uszkodzeń komórek bakteryjnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie wykorzystuje mikroskopię sił atomowych (AFM) do szczegółowej charakteryzacji bakterii, koncentrując się na wielkości bakterii, kształcie, biofilmach kulturowych oraz efektach bakteriobójczych nanocząstek. Protokół kładzie nacisk na staranną przygotowanie próbek i specyficzne techniki obrazowania w celu obserwacji zmian morfologicznych w komórkach bakteryjnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Mikrobiologia
- Charakteryzacja bakterii
- Badania nanocząstek
Tło
- Mikroskopia sił atomowych jest ważnym narzędziem do obserwacji morfologii bakterii.
- Zrozumienie tworzenia biofilmów bakteryjnych i reakcji na bakteriobójcze środki pomaga w badaniach medycznych.
- Przygotowanie próbek jest kluczowe dla dokładnego obrazowania i analizy.
Zastosowane metody
- Mikroskopia sił atomowych w trybie kontaktowym
- Kultury Staphylococcus aureus i Pseudomonas hunanensis
- Testy ekspozycji na nanocząstki
Główne wyniki
- Analiza AFM ujawniła wielkość i rozkład komórek bakteryjnych, przy czym Staphylococcus aureus wykazywał średnią szerokość 1,25 mikrometru.
- Większe stężenia nanocząstek tlenku magnezu prowadziły do znaczących zmian morfologicznych w komórkach bakteryjnych.
- Badanie wykazuje skuteczność AFM w analizie integralności strukturalnej bakterii.
Wnioski
- Ta metodologia podkreśla przydatność AFM w mikrobiologii, szczególnie w ocenie uszkodzeń bakterii.
- Wyniki wnoszą do szerszej wiedzy na temat reakcji bakterii na różne terapie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Contact mode atomic force microscopy (AFM) enables rapid, high-resolution morphological assessment of bacterial cells, supporting early-stage evaluation of antimicrobial interventions. This technique provides actionable 3D topography and cell damage data without the complexity or cost of electron microscopy, facilitating efficient screening of nanoparticle effects on bacterial integrity. AFM's operational simplicity and quantitative outputs position it as a valuable tool for mechanistic de-risking and target validation in anti-infective discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of bacterial cell morphology and structural changes following compound exposure.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cell damage and morphological disruption at the nanoscale.
- Facilitates rapid hypothesis testing regarding antimicrobial mechanisms of action.
Screening & Assay Development
- Provides reproducible, quantitative topographical data for assay standardization and validation.
- Accelerates screening of nanoparticle or compound libraries for bactericidal effects.
- Delivers high-content imaging outputs suitable for downstream comparative analytics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological readouts with translational biomarkers of bacterial cell integrity.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical validation of antimicrobial candidates.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust evidence of cellular impact.
Pipeline & Workflow Integration
AFM contact mode integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early, quantitative assessment of bacterial cell damage and morphology in response to candidate interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of antimicrobial mechanisms and cellular targets.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging data for compound triage and prioritization.
- Analytics: Provides quantitative measurements of cell size, surface integrity, and morphological disruption.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with preclinical models by aligning morphological endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective platform for repeated use across diverse bacterial strains and compound classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antimicrobial efficacy and mechanism-of-action studies.
- Operational Value: Reduces time and cost compared to electron microscopy while maintaining high-resolution outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative evidence of cellular impact.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates based on direct morphological evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and sample preparation to ensure data quality.
- Needs access to AFM instrumentation with contact mode capability and appropriate probes.
- Demands standardized protocols for sample fixing and imaging to ensure reproducibility across teams.
- Adaptable to various bacterial strains and nanoparticle types with protocol optimization.
- Sample aging and contamination must be minimized to preserve morphological integrity for analysis.
