Name: Mikroskopia sił atomowych w trybie kontaktowym jako szybka technika obserwacji morfologicznej i analizy uszkodzeń komórek bakteryjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Poznaj mikroskopię sił atomowych w trybie kontaktowym do analizy morfologii i uszkodzeń komórek bakteryjnych Staphylococcus aureus oraz Pseudomonas hunanensis. Ta metoda pozwala precyzyjnie ocenić zmiany strukturalne wywołane nanocząstkami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ramiro Muniz-Diaz dziękuje CONACyT za stypendium.

1. Izolacja i identyfikacja bakterii
<ol>
	<li>Izolacja szczepu endofitycznego z merystemów cebul czosnku:
	<ol>
		<li>Umieść 2 mm fragmenty merystemów z wcześniej obranych, zdezynfekowanych i pokrojonych bulw czosnku na agarze sojowym z tryptykazą (TSA) jako bogate podłoże wzrostowe i inkubuj w temperaturze 25 °C przez 1 dzień.</li>
		<li>Opierając się na różnicach morfologicznych kolonii bakteryjnych - kształcie, rozmiarze, kolorze, krawędzi, świetle przechodzącym, świetle odbitym, teksturze, konsystencji i produkcji pigmentu - opisz różne obserwowane morfotypy i oczyść przez krzyżowanie smug reprezentatywnej kolonii każdego morfotypu.</li>
		<li>Wszystkie oczyszczone szczepy bakterii należy zachować w 30% glicerolu w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Zidentyfikuj losowo wybrany szczep (9AP) poprzez sekwencjonowanie 16S rDNA. Wyodrębnij DNA zgodnie z metodą Hoffmana i Winstona8.</li>
		<li>Amplifikuj 16S rRNA przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) ze 100 ng DNA, 1x buforem polimerazy, 4 mM MgCl2, 0,4 mM dNTP, 10 pmol każdy z uniwersalnych oligonukleotydów 27F/1492r i 1 U polimerazy DNA9. Stosować następujące warunki termocyklera: 95 °C przez 5 minut do wstępnej denaturalizacji; po których następuje 35 cykli po 1 minutę w temperaturze 94 °C jako temperatura denaturalizacji, 1 minuta w temperaturze 56 °C jako temperatura hybrydyzacji i 1 minuta w temperaturze 72 °C jako temperatura przedłużenia; a następnie 10 minut w temperaturze 72 °C jako końcowe przedłużenie.</li>
		<li>Sekwencjonuj kapilarnie produkt PCR przy użyciu tych samych oligonukleotydów; użyj metody dideoksy-końcowej z zestawem instalacyjnym matrycy do sekwencjonowania kapilarnego10 i wykonaj elektroforezę w zautomatyzowanym systemie wielokapilarnym11.</li>
		<li>Ręcznie edytuj sekwencje, porównaj sekwencję z biblioteką GenBank za pomocą wyszukiwania BLAST i wstępnie zidentyfikuj szczep ze złotym standardem co najmniej 98,7% identyczności z najbliższym gatunkiem12,13. 
		UWAGA: Szczep 9AP został zidentyfikowany jako należący do gatunku Pseudomonas hunanensis, z identycznością 99,86% z sekwencją szczepu P. hunanensis LV (JX545210).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki bakteryjnej do obserwacji morfologicznej przez AFM
<ol>
	<li>W sterylnych warunkach umieścić kroplę zawiesiny bakteryjnej (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) na szkiełku podstawowym.</li>
	<li>Utrwalić próbki na szkiełku przez ogrzewanie na sucho. Delikatnie przełóż szkiełko kilka razy nad płomieniem, aż próbka wyschnie. 
	UWAGA: Utrwalanie próbek jest rutynową techniką w mikrobiologii, mającą na celu obserwację utrwalonych organizmów prokariotycznych i jak najdokładniejsze symulowanie ich struktury jako żywych komórek.</li>
	<li>Umieścić utrwalone próbki na szalce Petriego i przenieść je do urządzenia AFM w celu obserwacji. 
	UWAGA: Ponieważ próbki mogą z czasem ulegać zmianom w wyniku warunków pogodowych, należy przeznaczyć maksymalnie 24 godziny na analizę w sprzęcie AFM. Utrzymuj próbki w stanie wolnym od kurzu.</li>
</ol>
3. Przeciwbakteryjne działanie nanocząsteczek MgO przeciwko bakteriom
UWAGA: Synteza i charakterystyka nanocząsteczek MgO zostały wcześniej opublikowane14. W niniejszej pracy aktywność przeciwbakteryjną nanomateriałów oszacowano na podstawie podręcznika Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) z zastosowaniem metod makrorozcieńczenia i mikrorozcieńczenia do inhibicji15,16.
<ol>
	<li>Określenie minimalnej aktywności hamującej (MIC) i środków bakteriobójczych (CMB)
	<ol>
		<li>Przedrost szczepów
		<ol>
			<li>Zaszczepić odpowiednią ilość Escherichia coli lub Staphylococcus aureus w pożywnym bulionie, aby uzyskać końcowe stężenie 1 × 108 jtk/ml.</li>
			<li>Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 °C (± 2 °C) przez 18-24 godzin.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Postgrowth zaaklimatyzowanych szczepów
		<ol>
			<li>Zanurzyć sterylną pętlę bakteriologiczną w zawiesinie, dotykając dna probówki.</li>
			<li>Wykonaj smugi z pętlą na agarze z eozyną i błękitem metylenowym oraz agarze odżywczym.</li>
			<li>Inkubować płytki agarowe w temperaturze 37 °C (± 2 °C) przez 24 godziny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybór kolonii do przygotowania standaryzowanego inokulum
		<ol>
			<li>Weź od trzech do pięciu kolonii o tym samym typie morfologicznym, dotykając wierzchołka kolonii na szalce Petriego pętlą bakteriologiczną.</li>
			<li>Przenieś i zanurz zaznaczenie w 3-5 ml bulionu Müller-Hinton.</li>
			<li>Inkubować w temperaturze 37 °C (± 2 °C) do uzyskania zmętnienia 1 × 108 jtk/ml lub 2 × 108 jtk/ml. 
			UWAGA: W tej pracy normy zmętnienia McFarlanda zostały wykorzystane jako odniesienie dla zawiesin bakteriologicznych; w szczególności wzorzec 0,5 odpowiada w przybliżeniu jednorodnej zawiesinie E. coli o stężeniu 1,5 × 108 komórek/ml. Do pomiaru zmętnienia użyto spektrofotometru UV-Vis.</li>
			<li>Weź 1 ml i dodaj go do 9 ml sterylnego bulionu. Wziąć 200 μl tego rozcieńczenia i dodać go do 19,8 ml sterylnego bulionu, aby uzyskać końcowe stężenie 5 × 105 jtk/ml.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wymagane stężenia nanocząstek MgO
		<ol>
			<li>Do przygotowania roztworów należy użyć ultrasonografu.</li>
			<li>Zawiesić nanomateriał w sterylnej wodzie o stężeniu dwukrotnie wyższym niż wymagane do otrzymania roztworów seryjnych.</li>
			<li>Dodać te zawiesiny do sterylnych probówek zawierających bulion Müllera-Hintona, aby uzyskać nowy zakres stężeń wymaganych w eksperymencie. 
			UWAGA: Do mikrorozcieńczenia zastosowano następujące stężenia MgO NPs: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1,000 ppm, 2,000 ppm, 3,000 ppm, 4,000 ppm i 8,000 ppm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie mikrorozcieńczenia15
		<ol>
			<li>Przygotować nową i sterylną 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania (mikropłytkę). Oznaczyć kolumnę nr 12 mikropłytki jako kolumnę sterylności; oznaczyć kolumnę nr 11 jako kolumnę kontroli wzrostu.</li>
			<li>Dodać 120 μl zawiesin nanocząstek o różnych stężeniach do kolumn nr 1-10.</li>
			<li>Zaszczepić 120 μl bakterii (5 × 105 CFU/ml) do studzienek w kolumnach nr 1-10, 
			UWAGA: W tym badaniu rząd G i rząd H były kontrolne z ceftriaksonem w stężeniach sugerowanych przez normy CLSI: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,06 ppm i 0,03 ppm.</li>
			<li>Inkubować 96-dołkową mikropłytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C (35 °C ± 2 °C). Na koniec przeanalizuj studnie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja zmian morfostrukturalnych w szczepach bakteryjnych wywołanych przez nanocząstki MgO za pomocą AFM
	<ol>
		<li>Pobrać 250 μl ze studzienek do testów mikrorozcieńczenia, wymieszać z 750 μl sterylnej wody i odwirować przy 2 000 × g od 2 min do 5 min w temperaturze 5 °C.</li>
		<li>Osady należy przemyć trzykrotnie 1 ml sterylnej wody za każdym razem, a pod koniec płukania dodać do nich 500 μl wody.</li>
		<li>Aby uzyskać obrazy AFM, należy pobrać 10-20 μl końcowej zawiesiny z każdej studzienki startowej, wykonać rozmaz na szkiełku uprzednio oczyszczonym ultradźwiękami (30 min) i suszyć w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomiary AFM
UWAGA: Tutaj mikroskop sił atomowych w trybie kontaktowym został zamontowany na stacji roboczej antywibracyjnej, która pozwalała na odizolowanie mikroskopu od jakichkolwiek mechanicznych źródeł drgań i utrzymywała system w poziomie. Zakłócenia elektryczne są zmniejszone dzięki filtrom liniowym i ochronie przeciwprzepięciowej. Zastosowany tutaj AFM automatycznie wyrównuje wiązkę laserową do fotodetektora.
<ol>
	<li>Włącz komputer i AFM, a następnie wybierz tryb kontaktowy, sondy contAI-G i opcje automatycznego nachylenia w narzędziach programowych. Domyślne wartości kontrolera Z to Setpoint = 20 nM, P-Gain = 10 000, I-Gain = 1,000, D-Gain = 0 i Napięcie końcówki = 0 mV.</li>
	<li>Umieść próbki w trybie kontaktowym AFM za pomocą głowicy z zakresem skanowania 70 μm. Zastosowaliśmy wsporniki krzemowe ContAI-G o stałej sprężystości 0,13 N/m.</li>
	<li>Użyj kamery zamontowanej na dwóch soczewkach zintegrowanych z głowicą skanującą, aby uzyskać szybki podgląd powierzchni obszaru pod sondą.</li>
	<li>Ręcznie wykonaj przemieszczenie w płaszczyźnie XY, aby wybrać żądany obszar. Sonda jest przystosowana do elektronicznego zbliżania się do próbki powierzchniowej, aż do osiągnięcia warunków kontaktu. Elektronicznie dostosuj płaszczyznę pomiarową XY skanera i powierzchnię próbki, zmniejszając nachylenia w kierunkach XY.</li>
	<li>Korzystaj ze standardowych parametrów oprogramowania: 1 linia na sekundę przy 256 punktach na linię.</li>
	<li>Najpierw wykonaj pełny zakres skanowania obszaru 70 μm x 70 μm, a następnie wybierz mniejszy obszar za pomocą narzędzia do powiększania. AFM automatycznie optymalizuje zakres wykresu w Z. 
	UWAGA: Zmniejszając liczbę linii na sekundę, wydłuża się całkowity czas skanowania, jakość skanowania jest bardziej zdefiniowana, a niektóre szumy z pomiaru są również usuwane.</li>
	<li>Aby wybrać nowy obszar z próbki, należy elektronicznie schować wspornik i przesunąć próbkę wzdłuż płaszczyzny XY. Wykonaj nowe skanowanie, korzystając z procedury opisanej w krokach 4.5 i 4.6. 
	UWAGA: Uzyskane skany są wyświetlane w jednokolorowej skali paskowej, w której jasne kolory są związane z wyższymi wysokościami, a ciemne kolory są powiązane z większymi wysokościami. Oprogramowanie AFM generuje widok 3D skanu, który pozwala na docenienie szczegółów mierzonej powierzchni.</li>
	<li>Przetwarzanie danych należy przetworzyć za pomocą wyrównywania linii po linii w menu Narzędzia obrazu w wyborze filtra, co jest najczęściej używaną i najprostszą metodą poziomowania. 
	UWAGA: Ta metoda poziomowania bierze każdą poziomą lub pionową linię utworzoną na obrazie AFM i dopasowuje ją do równania wielomianowego.</li>
	<li>Zoptymalizuj maksymalną i minimalną wysokość na pasku kolorów po prawej stronie, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość obrazu.</li>
	<li>Przeprowadź analizę obrazu za pomocą menu Analiza na pasku narzędzi. Określ wysokości i odległości, wybierając punkt początkowy i końcowy po wybraniu żądanego narzędzia. 
	UWAGA: Użytkownicy muszą wypróbować różne filtry w menu Narzędzia, aby uniknąć artefaktów obrazu końcówki spowodowanych spłaszczeniem używanym w procesie poziomowania. Artefakty obrazu są wyświetlane jako smugi i są wyświetlane na niektórych obrazach AFM.</li>
</ol>

<ol><li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+form+of+the+bacterial+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22American+Scientist%22%5BJournal%5D)">Growth and form of the bacterial cell wall.</a> American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).</li>
<li>Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+growth+and+form+under+mechanical+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Bacterial growth and form under mechanical compression.</a> Scientific Report. 5, 11367(2015).</li>
<li>Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+shape%3A+Some+features+of+ultrastructure%2C+evolution%2C+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Bulletin+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology.</a> Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).</li>
<li>Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell shape.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (8), 601-610 (2005).</li>
<li>Smith, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+morphology+drives+spatial+patterning+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).</li>
<li>Volke, D. C., Nikel, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+bacteria+in+shape%3A+Synthetic+morphology+approaches+for+the+design+of+efficient+microbial+cell+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories.</a> Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111(2018).</li>
<li>Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+force+tapping+atomic+force+microscopy+for+advancing+cell+and+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology.</a> Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).</li>
<li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).</li>
<li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li>
<li>Behr, S., Mätzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fully+automated+multicapillary+electrophoresis+device+for+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ELECTROPHORESIS%22%5BJournal%5D)">A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis.</a> ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).</li>
<li>Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methods+for+the+solid-phase+sequence+analysis+of+nucleic+acid+fragments+using+the+Sanger+dideoxy+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleosides+%26+Nucleotides%22%5BJournal%5D)">New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure.</a> Nucleosides & Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Stackebrandt, E., Ebers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomic+parameter+revisited%3A+Tarnished+gold+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Today%22%5BJournal%5D)">Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards.</a> Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).</li>
<li>Muñiz Diaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+triethylamine-based+synthesis+of+MgO+nanoparticles+and+their+antibacterial+effect+against+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria.</a> Nanomaterials. 11 (2), 410(2021).</li>
<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 48, 5-16 (2001).</li>
<li>Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtitre+plate-based+antibacterial+assay+incorporating+resazurin+as+an+indicator+of+cell+growth%2C+and+its+application+in+the+in+vitro+antibacterial+screening+of+phytochemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals.</a> Methods. 42 (4), 321-324 (2007).</li>
<li>Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+cell+wall%3A+Morphogenesis+and+fatal+variations+in+the+presence+of+penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).</li>
<li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((autolysin+ring+associated+with+cell+separation+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus.</a> Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).</li>
<li>Zuttion, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-adhesive+effect+of+glycoclusters+on+Pseudomonas+aeruginosa+bacteria+adhesion+to+epithelial+cells+studied+by+AFM+single+cell+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy.</a> Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).</li>
<li>Kahli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+growth+conditions+on+Pseudomonas+fluorescens+morphology+characterized+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579(2022).</li>
<li>Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphostructural+changes+induced+in+E.+coli+exposed+to+copper+ions+in+water+at+increasing+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations.</a> World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).</li>
<li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vivo+atomic+force+microscopy-infrared+spectroscopy+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 140(2018).</li>
<li>Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+oxide+nanoparticles+as+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents.</a> Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).</li>
<li>Lee, H. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NaCl+influences+thermal+resistance+and+cell+morphology+of+Escherichia+coli+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains.</a> Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).</li>
<li>Song, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+effects+of+Schisandra+chinensis+extract+on+and+its+application+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food.</a> Journal of Food Safety. 38 (5), e12503(2018).</li>
<li>Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermotolerance+of+Staphylococcus+aureus+after+sublethal+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Arab+Universities+Journal+of+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock.</a> Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).</li>
<li>Shar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+of+platinum+by+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metals%22%5BJournal%5D)">Biomineralization of platinum by Escherichia coli.</a> Metals. 9 (4), 407(2019).</li>
<li>Baidamshina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+microbial+biofilms+using+Ficin%2C+a+nonspecific+plant+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease.</a> Scientific Reports. 7, 46068(2017).</li>
<li>Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+adsorbed+serum+proteins+during+adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+an+abiotic+surface+and+Candida+albicans+hyphae-An+AFM+study%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Mikroskopia to technika powszechnie stosowana w laboratoriach biologicznych, która pozwala na badanie struktury, wielkości, morfologii i układu komórkowego próbek biologicznych. Aby udoskonalić tę technikę, można zastosować kilka rodzajów mikroskopów, które różnią się od siebie charakterystykami optycznymi lub elektronicznymi, które decydują o mocy rozdzielczości instrumentu.
W badaniach naukowych do scharakteryzowania komórek bakteryjnych wymagane jest zastosowanie mikroskopii; na przykład mi...

Różne kształty bakterii zostały po raz pierwszy zauważone przez Antony'ego van Leeuwenhoeka w XVII wieku1. Bakterie istniały w bardzo różnych kształtach od czasów starożytnych, od kul po rozgałęziające się komórki2. Kształt komórki jest podstawowym warunkiem dla taksonomów bakteryjnych do opisania i sklasyfikowania każdego gatunku bakterii, głównie w celu morfologicznego rozdzielenia typów Gram-dodatnich i Gram-ujemnych klasa3. Wiadomo, że kilka pierwiastków determinuje formy komórek bakteryjnych, z których wszystkie są zaangażowane w osłony komórkowe i podporę jako składniki ściany komórkowej i błony, a także w cytoszkielecie. W ten sposób naukowcy wciąż wyjaśniają chemiczne, biochemiczne i fizyczne mechanizmy i procesy związane z określaniem form komórek bakteryjnych, z których wszystkie są definiowane przez klastry genów, które definiują kształty bakterii2,4.
Dodatkowo, naukowcy wykazali, że kształt pręcika jest prawdopodobnie formą przodków komórek bakteryjnych, ponieważ ten kształt komórki wydaje się optymalny pod względem parametrów istotnych dla komórki. Tak więc ziarniaki, spirale, vibrio, nitkowate i inne formy są uważane za adaptacje do różnych środowisk; Rzeczywiście, poszczególne morfologie ewoluowały niezależnie wiele razy, co sugeruje, że kształty bakterii mogą być adaptacjami do określonych środowisk3,5. Jednak w trakcie cyklu życia komórki bakteryjnej kształt komórki zmienia się i dzieje się to również jako odpowiedź genetyczna na szkodliwe warunki środowiskowe3. Kształt i rozmiar komórki bakteryjnej silnie determinują sztywność, wytrzymałość i stosunek powierzchni do objętości bakterii, a ta cecha może być wykorzystana w procesach biotechnologicznych6.
Mikroskopia elektroniczna jest używana do badania próbek biologicznych ze względu na duże powiększenie, które można osiągnąć poza mikroskopami opartymi na świetle. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) i skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) są najczęściej stosowanymi technikami w tym celu; Próbki wymagają jednak pewnej obróbki przed umieszczeniem ich w komorze mikroskopu w celu uzyskania odpowiednich obrazów. Wymagana jest złota okładka na próbkach, a czas potrzebny na całkowite pozyskanie obrazu nie powinien być zbyt długi. Natomiast mikroskopia sił atomowych (AFM) jest techniką szeroko stosowaną w analizie powierzchni, ale jest również stosowana w badaniu próbek biologicznych.
Istnieje kilka rodzajów trybów AFM używanych w analizie powierzchni, takich jak tryb kontaktowy, tryb bezkontaktowy lub stukanie, mikroskopia siły magnetycznej (MFM), przewodząca AFM, mikroskopia sił piezoelektrycznych (PFM), stukanie w siłę szczytową (PFT), rezonans kontaktowy i objętość siły. Każdy tryb jest używany w analizie materiałów i dostarcza różnych informacji o powierzchni materiałów oraz ich właściwościach mechanicznych i fizycznych. Jednak niektóre tryby AFM są używane do analizy próbek biologicznych in vitro, takie jak PFT, ponieważ PFT pozwala na uzyskanie danych topograficznych i mechanicznych o komórkach w ciekłym podłożu7.
W tej pracy użyliśmy najbardziej podstawowego trybu zawartego w każdym starym i prostym modelu AFM - trybu kontaktowego. AFM wykorzystuje ostrą sondę (o średnicy około <50 nm) do skanowania obszarów mniejszych niż 100 μm. Sonda jest wyrównana z próbką w celu interakcji z polami siłowymi związanymi z próbką. Powierzchnia jest skanowana za pomocą sondy, aby utrzymać stałą siłę. Następnie generowany jest obraz powierzchni poprzez monitorowanie ruchu wspornika podczas poruszania się po powierzchni. Zebrane informacje dostarczają informacji o nanomechanicznych właściwościach powierzchni, takich jak przyczepność, elastyczność, lepkość i ścinanie.
W trybie kontaktu AFM, wspornik jest skanowany w poprzek próbki ze stałym ugięciem. Pozwala to na określenie wysokości próbek (Z), co stanowi przewagę nad innymi technikami mikroskopu elektronicznego. Oprogramowanie AFM umożliwia generowanie skanu obrazu 3D poprzez interakcję między końcówką a powierzchnią próbki, a ugięcie końcówki jest skorelowane z wysokością próbki za pomocą lasera i detektora.
W trybie statycznym (tryb kontaktowy) ze stałą siłą, wyjście przedstawia dwa różne obrazy: wysokość (topografia z) i sygnał odchylenia lub błędu. Tryb statyczny jest cennym, prostym trybem obrazowania, szczególnie w przypadku wytrzymałych próbek w powietrzu, które mogą wytrzymać duże obciążenia i siły skręcające wywierane w trybie statycznym. Tryb ugięcia lub błędu działa w trybie stałej siły. Jednak obraz topograficzny jest dodatkowo wzmocniony przez dodanie sygnału ugięcia do struktury powierzchni. W tym trybie sygnał ugięcia jest również określany jako sygnał błędu, ponieważ ugięcie jest parametrem sprzężenia zwrotnego; Wszelkie cechy lub morfologia, które pojawiają się w tym kanale, są spowodowane "błędem" w pętli sprzężenia zwrotnego, a raczej pętlą sprzężenia zwrotnego wymaganą do utrzymania stałej wartości zadanej ugięcia.
Unikalny design AFM sprawia, że jest on kompaktowy - wystarczająco mały, aby zmieścić się na blacie stołu - a jednocześnie ma wystarczająco wysoką rozdzielczość, aby rozdzielić atomowe kroki. Sprzęt AFM ma niższy koszt niż sprzęt do innych mikroskopów elektronicznych, a koszty konserwacji są minimalne. Mikroskop nie wymaga laboratorium ze specjalnymi warunkami, takimi jak czyste pomieszczenie lub odizolowana przestrzeń; Potrzebuje tylko biurka bez wibracji. W przypadku AFM próbki nie muszą być poddawane skomplikowanemu przygotowaniu, jak w przypadku innych technik (złota okładka, odchudzanie); Do uchwytu na próbkę należy dołączyć wyłącznie suchą próbkę.
Używamy trybu kontaktowego AFM do obserwacji morfologii bakterii i efektów nanocząsteczków. Można zaobserwować populację i morfologię komórkową bakterii umocowanych na podłożu, a także uszkodzenia komórek wytwarzane przez nanocząstki na gatunkach bakterii. Obrazy uzyskane w trybie kontaktowym AFM potwierdzają, że jest to potężne narzędzie i nie jest ograniczone odczynnikami i skomplikowanymi procedurami, co czyni ją prostą, szybką i ekonomiczną metodą charakteryzacji bakterii.

<table><tbody><tr><td>AFM EasyScan 2</td><td>NanoSurf</td><td>wycofany</td><td>z pomiarów Pętla</td></tr><tr><td>bakteriologiczna</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td>Instrument do inokulacji bakteryjnej</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4337455</td><td>Zestaw instalacyjny Matrix</td></tr><tr><td>Bioedit</td><td>nie dotyczy</td><td>wersja 7.2.5</td><td>Edytor</td></tr> <tr><td>wyrównania sekwencjiSpektrometr Cary 60</td><td>Agilent Technologies</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>ceftriazon</td><td>Merck</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td> do antybiotyków <td>eppendorf</td><td>nie dotyczy</td><td>do usuwania cząstek, które zakłócają AFM</td></tr><tr><td>ContAI-G Wspornik krzemowy</td><td>BudgetSensors</td><td>ContAl-G-10</td><td>Media pomiarowe</td></tr><tr><td>eozyna i błękit metylenowy</td><td>agar Merck</td><td>nie dotyczy</td><td>pożywka do hodowli bakteryjnych</td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 25922</td><td>szczep bakteryjny</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M8295</td><td>PCR mikropłytki genu 16S rRNA</td></tr><tr><td></td><td>10558295 Thermo Scientific</td><td></td><td>do analizy mikrorozcieńczeń</td></tr><tr><td>M&uuml; bulion ller-Hinton</td><td>Merck</td><td>nie dotyczy</td><td>pożywka bakteryjna pożywka</td></tr><tr><td>agar</td><td>Merck</td><td>nie dotyczy</td><td>pożywka do hodowli bakteryjnych</td></tr><tr><td>pożywny bulion</td><td>Merck</td><td>nie dotyczy</td><td>pożywka do hodowli bakteryjnych</td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>nie dotyczy</td> nie <td>dotyczy</td><td>wzrost bakterii</td></tr><tr><td>Pseudomonas hunanensis 9AP</td><td>nie dotyczy</td><td>nie dotyczy</td><td>wyizolowany z główki czosnku za pomocą CNRG</td></tr><tr><td>Sekwencjonowanie Sangera</td><td>Macrogen</td><td>nie dotyczy</td><td>usługa sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Stacja robocza antywibracyjna ScienceDesk</td><td>Szkiełka ThorLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>nie dotyczy</td><td>nie dotyczy</td><td>uchwyt szklany do analizy próbek bakteryjnych</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 25923</td><td>szczep bakteryjny</td></tr><tr><td>Thermalcycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Veriti-4375786</td><td>amplifikacja PCR</td></tr><tr><td>Tryptikazeina agar sojowy</td><td>BD</td><td>BA-256665</td><td>ultradźwiękowiec podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td></td><td>Procesor ultradźwiękowy Cole-Parmer, 220 VAC</td><td>nie dotyczy</td> mieszania <td>rozcieńczeń nanocząstek</td></tr></tbody></table>

mikroskopia sił atomowych w trybie kontaktowym jako szybka technika obserwacji morfologicznej i analizy uszkodzeń komórek bakteryjnych

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

Mikroskopia elektronowa jest jednym z narzędzi niezbędnych do scharakteryzowania struktur komórkowych. Procedura jest jednak skomplikowana i kosztowna ze względu na przygotowanie próbki do obserwacji. Mikroskopia sił atomowych (AFM) jest bardzo przydatną techniką charakteryzacji ze względu na jej wysoką rozdzielczość w trzech wymiarach oraz ze względu na brak jakichkolwiek wymagań dotyczących próżni i przewodności próbki. AFM może obrazować szeroką gamę próbek o różnej topografii i różnych typach materiałów. 
AFM dostarcza informacji o topografii 3D o wysokiej rozdzielczości od poziomu angstrema do skali mikronów. W przeciwieństwie do tradycyjnej mikroskopii, AFM wykorzystuje sondę do generowania obrazu topografii powierzchni próbki. W tym protokole sugeruje się stosowanie tego typu mikroskopii do charakterystyki morfologicznej i uszkodzeń komórek bakterii umocowanych na podłożu. Użyto szczepów Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) i Pseudomonas hunanensis (wyizolowanych z próbek cebulek czosnku). W tej pracy komórki bakteryjne hodowano w określonych pożywkach hodowlanych. Aby zaobserwować uszkodzenia komórek, Staphylococcus aureus i Escherichia coli inkubowano z różnymi stężeniami nanocząstek (NP). 
Kropla zawiesiny bakteryjnej została utrwalona na szklanym podłożu, a zdjęcia zostały wykonane za pomocą AFM w różnych skalach. Uzyskane obrazy ukazały cechy morfologiczne bakterii. Ponadto, stosując AFM, można było zaobserwować uszkodzenia struktury komórkowej spowodowane działaniem nanocząsteczek. Na podstawie uzyskanych obrazów można wykorzystać kontaktowe AFM do scharakteryzowania morfologii komórek bakteryjnych unieruchomionych na podporze. AFM jest również odpowiednim narzędziem do badania wpływu nanocząsteczek na bakterie. W porównaniu z mikroskopią elektronową, AFM jest niedrogą i łatwą w użyciu techniką.

Obrazy morfologii i wielkości szczepów S. aureus oraz P. hunanensis, a także organizacja populacji obu szczepów, zostały zarejestrowane za pomocą mikroskopii sił atomowych w trybie kontaktowym. Obrazy S. aureus wykazały, że jego populacja była rozmieszczona strefowo z agregatami gronkowców (Rysunek 1A). Wraz ze zwiększeniem skali uzyskano lepszy wgląd w rozkład populacji i morfologię gronkowców (Rysunek 1B). Wyniki mikroskopowe wykazał...

Tutaj prezentujemy zastosowanie mikroskopii sił atomowych (AFM) jako prostej i szybkiej metody charakteryzacji bakterii i analizujemy szczegóły, takie jak rozmiar i kształt bakterii, biofilmy kultur bakteryjnych oraz aktywność nanocząsteczek jako środków bakteriobójczych.

Mikroskopia sił atomowych w trybie kontaktowym jako szybka technika obserwacji morfologicznej i analizy uszkodzeń komórek bakteryjnych

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

Protokół ten pokazuje zastosowanie mikroskopii sił atomowych w trybie kontaktowym do obserwacji zmian w morfologii komórek spowodowanych określoną chorobą lub leczeniem. Zdecydowanie zaleca się używanie szczelnych pojemników do tej procedury, aby uniknąć zanieczyszczenia i jak najszybszą analizę utrwalonej próbki, aby uniknąć starzenia. Rozpocząć od zamocowania próbek na szkiełku, delikatnie przesuwając szkiełko kilka razy nad płomieniem, aż próbka wyschnie.Umieścić utrwalone próbki na szalce Petriego i przetransportować je do mikroskopu sił atomowych w celu obserwacji. Następnie włącz komputer i mikroskop sił atomowych. Następnie wybierz tryb kontaktu, sondy ContAI-G i opcje automatycznego nachylenia w oprogramowaniu.Ustaw domyślne wartości dla kontrolera Z, ustawiając nastawę na 20 nanometrów, wzmocnienie P na 10 000, wzmocnienie I na 1 000, wzmocnienie D na zero i napięcie końcówki na zero miliwoltów. Korzystając z głowicy o zakresie skanowania 70 mikrometrów, umieść próbki w trybie kontaktowym AFM. Uzyskaj szybki podgląd powierzchni obszaru pod sondą za pomocą kamery zamontowanej na dwóch soczewkach zintegrowanych z głowicą skanującą.Teraz wybierz żądany obszar, ręcznie przesuwając go w płaszczyźnie XY. Pozwól sondzie elektronicznie zbliżyć się do powierzchni próbki, aż do osiągnięcia kontaktu. Elektronicznie dostosuj płaszczyznę pomiarową XY skanera i powierzchnię próbki, zmniejszając kierunek nachylenia XY.Ustaw standardowe parametry oprogramowania na jedną linię na sekundę i 256 punktów na linię. Następnie wykonaj pełny zakres skanowania obszaru o wymiarach 70 na 70 mikrometrów. Zaznacz mniejszy obszar za pomocą narzędzia do powiększania.Wybierz nowy obszar z próbki, cofając elektronicznie wspornik i przesuwając próbkę wzdłuż płaszczyzny XY. Następnie wykonaj nowe skanowanie, jak pokazano wcześniej. Następnie użyj wyrównywania linia po linii w menu narzędzi obrazu w wyborze filtrów, aby przeprowadzić przetwarzanie danych.Zoptymalizuj maksymalną i minimalną wysokość paska kolorów, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość obrazu. Na koniec przeprowadź analizę obrazu za pomocą menu analizy. Wybierz punkt początkowy i końcowy za pomocą żądanego narzędzia, aby określić długość i odległość.Mikroskopowa analiza sił atomowych kultur bakteryjnych wykazała, że kultury Staphylococcus aureus były rozmieszczone w strefach z agregatami ziarniaków. Zwiększone skale wykazały, że w większym stopniu doceniano rozmieszczenie populacji i morfologię ziarniaków. Obrazy w trybie kontaktowym AFM pozwoliły na określenie wielkości ziarniaków, które wykazywały średnią szerokość 1,25 mikrometra.Pseudomonas hunanensis wykazywał jednorodne rozmieszczenie na całej powierzchni nośnej szkła, tworząc przylegającą monowarstwę. Kultury miały kształt pałeczek o długości 1,9 mikrometra i szerokości 0,9 mikrometra. Mikrorozcieńczenie nanocząstek tlenku magnezu Staphylococcus aureus spowodowało utratę gładkiej powierzchni i jednorodnych konturów z powodu poważnego pogorszenia struktury komórkowej.Tworzenie pęcherzyków i uwalnianie materiału cytozolowego obserwowano w hodowlach w stężeniach wyższych niż MIC. Podobne wyniki uzyskano w hodowlach E. coli, gdzie kontrole wykazywały gładkie powierzchnie, co podkreślało jej jednorodny kształt przypominający pręciki. Struktura całkowicie zniknęła przy ekspozycji na nanocząstki 1000 PPM, a widoczne były tylko ich sylwetki.Ważne jest, aby prawidłowo wykonać mocowanie próbki, ponieważ jest to niezbędne do dalszej analizy. Filtr obrazu pomaga zapewnić dobrą rozdzielczość obrazu i szczegóły próbki. Korzystając z metody mocowania, można zastosować tryby bezdotykowe AFM, które mogą być pomocne w badaniu właściwości mechanicznych.Metodologia ta może być niedrogim i użytecznym narzędziem do badań medycznych i mikrobiologicznych skoncentrowanych na analizie uszkodzeń komórek bakteryjnych.

contact-mode-atomic-force-microscopy-as-rapid-technique-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Żywe bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie mogą zostać unieruchomione na miki powlekanej żelatyną i obrazowane w cieczy przy użyciu mikroskopii sił atomowych (AFM).

Immobilizacja bakterii do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii sił atomowych

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Metoda badania struktury fotoreceptora białkowego za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) jest opisana w tym artykule. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) ujawnia nienaruszone dimery białkowe na powierzchni miki.

Mikroskopia sił atomowych fotoreceptorów światła czerwonego przy użyciu ilościowego mapowania właściwości nanomechanicznych PeakForce

Tutaj szczegółowo opisujemy techniki eksperymentalne używane do oceny sił wypukłości, które podosomy przykładają do odpowiedniej folii, od przygotowania filmu do automatycznej analizy obrazów topograficznych.

Mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji wsporników mikroskopu sił atomowych (AFM) z pojedynczym limfocytem T i cząstką kulki do badań immunologicznych. Przedstawiono procedury badania wiązania jednoparowych komórek T z komórkami dendrytycznymi przez AFM oraz monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów w czasie rzeczywistym na pojedynczą cząstkę stałą za pomocą AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym.

Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Ten protokół ma na celu automatyzację pomiarów AFM na setkach komórek mikrobiologicznych. Najpierw drobnoustroje są unieruchamiane w mikrostrukturach stemplowych PDMS, a następnie pomiary spektroskopii sił są wykonywane automatycznie na setkach unieruchomionych komórek.

Automatyzacja pomiarów mikroskopem sił bioatomowych na setkach komórek C. albicans

Prezentowany jest tutaj protokół techniki Conpokal, która łączy mikroskopię konfokalną i mikroskopię sił atomowych w jedną platformę instrumentów. Conpokal zapewnia tę samą komórkę, ten sam region, prawie równoczesne obrazowanie konfokalne i mechaniczną charakterystykę żywych próbek biologicznych.

Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach

Mikroskopia sił atomowych - spektroskopia w podczerwieni (AFM-IR) stanowi potężną platformę do badań nad bakteriami, umożliwiając osiągnięcie rozdzielczości w nanoskali. Zarówno mapowanie zmian subkomórkowych (np. po podziale komórki), jak i badania porównawcze składu chemicznego (np. wynikającego z oporności na leki) mogą być prowadzone na poziomie pojedynczej komórki u bakterii.

Mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii

Obecny protokół opisuje modyfikacje transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) z systemem oświetlenia świetlnego, wytwarzanie komórek płynnych oraz obserwacje in situ TEM indukowanych światłem interakcji między komórkami bakteryjnymi a fotosensybilizatorem. Omówiono również metody przygotowania próbek, uszkodzenia wiązki elektronów i obrazowanie.

Indukowana światłem transmisyjna mikroskopia elektronowa in situ do obserwacji oddziaływania ciecz-miękka materia

Poznaj mikroskopię sił atomowych w trybie kontaktowym do analizy morfologii i uszkodzeń komórek bakteryjnych Staphylococcus aureus oraz Pseudomonas hunanensis. Ta metoda pozwala precyzyjnie ocenić zmiany strukturalne wywołane nanocząstkami.

Mikroskopia sił atomowych w trybie kontaktowym jako szybka technika obserwacji morfologicznej i analizy uszkodzeń komórek bakteryjnych (Wideo) | JoVE Journal

Mikroskopia sił atomowych w trybie kontaktowym jako szybka technika obserwacji morfologicznej i analizy uszkodzeń komórek bakteryjnych

Przeglądaj więcej filmów