System detekcji wirusów DNA oparty na RPA-CRISPR/Cas12a-SPM i głębokim uczeniu

Nasz protokół wprowadza szybki i bardzo czuły system wykrywania wirusa żaby 3. Co istotne, metoda ta umożliwia wykrywanie wirusów DNA w miejscu opieki nad pacjentem, odgrywając kluczową rolę w zapobieganiu występowaniu chorób pandemicznych. Główną zaletą tej techniki jest integracja RPA z systemem CRISPR/Cas12a, uzupełniona przenośnym mikroskopem opartym na smartfonie i klasyfikacją AI.

Ta integracja znacznie zwiększa skuteczność i dokładność wykrywania, jednocześnie zmniejszając liczbę błędów przypisywanych czynnikom ludzkim. Na początek dodaj cztery kluczowe enzymy RPA do buforu reakcyjnego. Następnie dodaj do mieszanki wstępnie zaprojektowane podkłady.

Dokładnie wymieszaj mieszaninę. Dodaj jeden mikrolitr docelowego DNA uzyskanego z wirusa żaby 3 do każdej reakcji RPA i wiruj, aby dobrze wymieszać. Następnie odpipetuj siedem mikrolitrów 100-milimolowego chlorku magnezu, aby zainicjować reakcję.

Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby zakończyć test. Przygotuj białko CAS12a bakterii Lachnospiraceae z RNA CRISPR, aby utworzyć funkcjonalne kompleksy. Wymieszaj białko bakteryjne i 10 X bufor reakcyjny CRISPR/Cas12a.

Teraz dodaj 500 nanomolową jednoniciową sondę reporterową DNA. Dodaj jeden mikrolitr produktu reakcji RPA do mieszaniny reakcyjnej CRISPR/Cas12a CRISPR RNA. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Zmierz sygnały fluorescencyjne za pomocą czytnika mikropłytek. W celu wykrycia za pomocą mikroskopu smartfona, najpierw należy pipetować przygotowaną mieszaninę reakcyjną na wycofane szkiełko podstawowe. Następnie przykryj go szkiełkiem nakrywkowym przed inkubacją.

Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu smartfona i dostosuj ogniskową oraz ostrość. Uchwyć obraz, aby zmierzyć sygnały fluorescencyjne. ImageJ służy do pomiaru średniej wartości szarości każdego obrazu oraz odchylenia standardowego średniej wartości szarości w grupie stężeń.

Zastosuj model uczenia głębokiego AlexNet 33 do klasyfikacji. Teraz użyj Pythona, aby zmienić kształt obrazów wejściowych na 224 na 224 przez trzy kanały. Na koniec użyj wstępnie wytrenowanej sieci szkieletowej z zestawem danych ImageNet, aby wyodrębnić cechy obrazu.

Szósta para starterów zapewniała maksymalną wydajność amplifikacji i została wybrana. CRISPR RNA-3 okazał się najbardziej skuteczny w przypadku rozszczepienia bocznego. Zastosowanie opracowanego systemu detekcji z wybranymi starterami RPA i CRISPR RNA spowodowało istotne różnice pomiędzy 10 aM FV3 a kontrolą.

Najważniejszą kwestią, o której należy pamiętać, jest konkretny krok wykrywania CAS 12a. RNA CRISPR reakcji może być modyfikowane lub przeprojektowywane tak, aby celować w inne wirusy DNA w oparciu o detekcję CAS 12a. Proponowana metoda może pomóc we wstępnej ocenie ilości docelowego wirusa.

Na tej podstawie można zastosować inne metody, takie jak qPCR, w celu uzyskania dokładniejszego miana wirusa. Technika ta stanowi wstępną próbę w kierunku przenośnego wykrywania wirusów DNA. Jeśli chodzi o wirusa żaby 3 użytego w tym protokole, szybkie wykrycie może skłonić do podjęcia skutecznych środków ochronnych, zmniejszając straty w przemyśle hodowlanym.