Name: Przeszczep dootrzewnowy w celu wywołania ostrej białaczki szpikowej u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu dootrzewnowego do wywołania ostrej białaczki szpikowej u myszy. Technika ta jest wygodniejsza i tańsza niż tradycyjne wstrzyknięcia dożylne, zachowując skuteczność w generowaniu modelu AML.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Centralnemu Ośrodku Cytometrii Przepływowej Instytutu Huck oraz Ośrodkowi Histopatologii Laboratorium Diagnostyki Zwierząt, Wydziału Nauk Weterynaryjnych i Biomedycznych, Uniwersytetu Stanowego Pensylwanii, za terminowe wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez granty z American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, numer dostępu 00000005 do K.S.P. i R.F.P.

<ol><li>Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li>
<li>Fortier, J. M., Graubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+human+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+and+Research%22%5BJournal%5D)">Murine models of human acute myeloid leukemia.</a> Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).</li>
<li>Ernst, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+requires+the+mixed-lineage+leukemia+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene.</a> Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).</li>
<li>Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+the+cellular+origin+in+acute+myeloid+leukemia%3A+learning+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hemasphere%22%5BJournal%5D)">The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models.</a> Hemasphere. 3 (1), 152(2019).</li>
<li>Zhan, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+transplant+in+mice+by+intra-femoral+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection.</a> Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).</li>
<li>Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+cells+and+monoclonal+antibodies+into+mice%3A+comparison+of+tail+vein+and+retroorbital+routes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSuckow%2C+MA+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. , CRC Press Inc. (2001).</li>
<li>Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+chronic+cannulation+of+the+jugular+vein+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%2C+Biochemistry%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice.</a> Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).</li>
<li>Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gastric+mucin+on+virulence+of+bacteria+in+intraperitoneal+injections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).</li>
<li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+anesthesia%2C+analgesia%2C+and+part+I%3A+anesthetic+considerations+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal%22%5BJournal%5D)">Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li>
<li>Leong, S. -K., Ling, E. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+neurons+with+fluorescent+dyes+administered+via+intravenous%2C+subcutaneous+or+intraperitoneal+route%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route.</a> Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).</li>
<li>Ma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+of+magnetic+Fe3O4-nanoparticle+induces+hepatic+and+renal+tissue+injury+via+oxidative+stress+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).</li>
<li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+transduction%3A+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li>
<li>Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+therapies+supplement%3A+the+peritoneum+as+an+ectopic+site+of+hematopoiesis+following+in+utero+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation.</a> Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injection+of+mesenchymal+stem+cells+is+effective+in+treating+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048(2012).</li>
<li>Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+in+vivo+immunomodulatory+effects+of+intravenous+and+intraperitoneal+administration+of+adipose-tissue+mesenchymal+stem+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).</li>
<li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+bone+marrow-derived+MSCs+improves+cisplatinum-induced+renal+injury+through+paracrine+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms.</a> Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).</li>
<li>Castelo-Branco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+but+not+intravenous+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+home+to+the+inflamed+colon+and+ameliorate+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis.</a> PLoS One. 7 (3), 33360(2012).</li>
<li>Bazhanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneally+infused+human+mesenchymal+stem+cells+form+aggregates+with+mouse+immune+cells+and+attach+to+peritoneal+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs.</a> Stem Cell Research & Therapy. 7, 27(2016).</li>
<li>Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg5-dependent+autophagy+contributes+to+the+development+of+acute+myeloid+leukemia+in+an+MLL-AF9-driven+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model.</a> Cell Death & Disease. 7 (9), 2361(2016).</li>
<li>Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of hematopoietic stem cells.</a> Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).</li>
<li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+population+of+cells+in+the+bone+marrow+that+phenotypically+mimics+hematopoietic+stem+cells%3A+resting+stem+cells+or+mystery+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population.</a> Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).</li>
<li>Gott, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+Cs-137+gamma+rays+and+320-kV+X-rays+in+a+mouse+bone+marrow+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dose+Response%22%5BJournal%5D)">A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model.</a> Dose Response. 18 (2), 1559325820916572(2020).</li>
<li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection of mice.</a> Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li>
<li>Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+neural+development+to+cognition%3A+unexpected+roles+for+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin.</a> Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).</li>
<li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+treatment+reduces+leukemia+burden+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia.</a> FASEB Journal. 36 (5), 22328(2022).</li>
<li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+initiated+by+Mll-AF9%3A+gene+dosage+and+critical+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells.</a> Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).</li>
<li>Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Te wyżej opisane badania dostarczają dowodów na to, że przeszczepienie komórek Lin jest porównywalne z komórkami LSK w pokoleniu 1° mysiej AML. Ponadto aktualne dane pokazują również, że wstrzyknięcie i.p. jest skuteczną i wygodną metodą ustalenia mysiej AML w porównaniu z wstrzyknięciem dożylnym (lub r.o.).
Oprócz komórek LSK, inne populacje, takie jak progenitor granulocytów-monocytów (GMP), wspólny progenitor limfoidalny (CLP) i wspólny przodek szpiku (CMP), zostały podmienione j...

Ostra białaczka szpikowa (AML) to rodzaj nowotworu hematologicznego o zróżnicowanej etiologii ze złym rokowaniem1. Generowanie modeli zwierzęcych AML stanowi podstawę do zrozumienia jego złożonych odmian i patobiologii w celu odkrycia nowych terapii2. Leukemogeneza u myszy polega na przeszczepieniu komórek dawcy wykazujących ekspresję onkoprotein fuzyjnych, w tym fuzji z udziałem genu białaczki mieszanej (MLL) w celu silnego wywołania AML, w celu naśladowania choroby u ludzi3. Różne pochodzenie komórkowe komórek dawcy zostało zgłoszone w transplantacji AML4, przy czym bardzo niewiele wiadomo o komórkach odpowiedzialnych za pochodzenie choroby.
Opracowano wiele dróg do przeszczepu u myszy; zamiast iniekcji doudowej, która bezpośrednio wprowadza zmutowane komórki dawcy do szpiku kostnego5, dożylne wstrzyknięcie, które wykorzystuje splot zatoki żylnej, żyłę ogonową i żyłę szyjną, było szeroko stosowane do generowania mysich modeli AML6,7,8,9. W przypadku iniekcji retro-orbitalnej (r.o.) różne nieodłączne wady, takie jak ograniczenie objętości, wysokie wymagania techniczne, małe szanse na powtórzenie prób lub błędów oraz potencjalne urazy oka, były głównymi przeszkodami z ograniczonymi lub żadnymi realnymi alternatywami7. Iniekcja żyły ogonowej może mieć podobne problemy poza miejscowymi urazami; Aby ułatwić procedurę, myszy często muszą być rozgrzane, aby rozszerzyły swoje żyły ogonowe10. Trudno jest również zlokalizować żyłę ogonową bez dodatkowego źródła światła, szczególnie u myszy szczepu C57BL/6. W przypadku iniekcji do żyły szyjnej personel badawczy wymaga odpowiedniego przeszkolenia, aby zlokalizować żyłę i ograniczyć możliwe powikłania. Ponadto zarówno iniekcje do zatok żylnych, jak i żył szyjnych muszą być wykonywane w znieczuleniu, co dodaje kolejny poziom złożoności. W związku z tym kuszące jest zbadanie nowych dróg transplantacji, aby ułatwić ustanowienie mysich modeli AML.
Wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) jest powszechnie stosowane do podawania leków, barwników i środków znieczulających11,12,13,14,15; był również używany do wprowadzania komórek krwiotwórczych do hematopoezy ektopowej16 oraz do przeszczepiania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego u różnych myszy models17,18,19,20,21. Jednak rzadko stosuje się go do ustalania nowotworów układu krwiotwórczego u myszy, szczególnie w celu zbadania progresji choroby AML.
Niniejsze badanie opisuje wykonalność iniekcji i.p. w generowaniu modeli myszy AML, dodatkowo porównując skuteczność przeszczepu populacji lineage ujemnych (Lin-) i Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) jako komórek dawcy. Odkrycia te zapewniają prosty i skuteczny sposób generowania eksperymentalnych modeli AML i pokrewnych białaczek szpikowych. Taka metoda ma potencjał, aby pogłębić nasze zrozumienie mechanizmów choroby, a także zapewnić stosunkowo łatwy model do testowania eksperymentalnych terapii.

<table><tbody><tr><td>a-Wybierz kompetentne komórki&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-85027</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A-9434</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A0797</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V&mdash; Bioprodukty</td><td>Gemini</td> o niskiej zawartości endotoksyn <td>Cat# 700-102P</td><td></td></tr><tr><td>HCl cyprofloksacyny</td><td>GoldBio.com</td><td>Cat# C-861-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, bez glutaminy</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Corning</td><td>Cat# 21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sól disodowa (EDTA-2Na), dwuwodzian, klasa biologii molekularnej</td><td>Calbiochem</td><td>Cat# 324503</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca - Premium Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Cat# S11550</td><td></td></tr><tr><td>Holo-transferyna, bydlęca</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# T1283</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór insuliny ludzki</td><td>Sigma</td><td>Kat# I-9278</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Ilbecco's Medium Iscove (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 12440-053</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM (100&razy;) roztwór</td><td>HyClone, Gelifesciences</td><td>Cat# SH30034.01</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion, Lennox</td><td>NEOGEN</td><td>Cat #: 7290A</td><td></td></tr><tr><td>LB Rosół z agarem (Miller)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# L-3147</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-mysz CD45.1 (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-124-211</td><td></td></tr><tr><td>Mysia interleukina-3 (IL-3)</td><td>Produkty biologiczne Gemini</td><td>Kot# 300-324P</td><td></td></tr><tr><td>Mysia interleukina-6 (IL-6)</td><td>Produkty biologiczne Gemini</td><td>Kot# 300-327P</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik komórek macierzystych myszy (SCF)</td><td>Produkty biologiczne Gemini</td><td>Cat# 300-348P</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100x</td><td>Corning</td><td>Cat# 30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa Phenix-Eco (pECO)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu (KHCO3), granulowany</td><td>JT. Baker Cat</td><td># 2940-01</td><td></td></tr><tr><td>Szczurzy anty-mysz CD117 (c-kit) (APC)</td><td>BioLegend&nbsp;</td><td>Kat # 105812</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat# 558162</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi Flt3-Ligand</td><td>Pepro Tech, INC.</td><td>Cat# 250-31L</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki fragment fibronektyny retronektyny</td><td>TaKaRa</td><td>Cat# T100A</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-293 Odczynnik</td><td>MirusBio</td><td>Cat# MIR 2705</td><td></td></tr><tr><td>TRI</td><td>Sigma</td><td>Aldrich Cat# T9424</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>Cat # 15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25200-056</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol (BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# M3148</td><td></td></tr><tr><td>Testy komercyjne&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep Zestaw do izolacji krwiotwórczych komórek progenitorowych myszy&nbsp;</td><td>Technologie StemCell</td><td>Cat# 19856Zestaw</td> do odwrotnej transkrypcji <td></td></tr><tr><td>cDNA o dużej pojemności&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>Cat# 4368813</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa qPCR SuperMix</td><td>Quanta Bio</td><td>Cat# 95051-500</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Maxi Kit (25)</td><td>Qiagen</td><td>Cat#:12163</td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td><em</tr><tr><td>>Ai14TdTomato mice</td> Jackson <td>Laboratory</td><td>Strain # 007914</td><td></td></tr><tr><td>Myszy CD45.1 C57BL6/J& nbsp;</td><td>Myszy Jackson Laboratory</td><td>Strain # 002014</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2 C57BL6/J&nbsp;</td><td>Szczep laboratoryjny Jackson</td><td># 000664</td><td></td></tr><tr><td>Instrumenty i oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe illustrator&nbsp;</td><td>Wersja 25.2.3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy BD accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.8.0</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneSys oprogramowanie&nbsp;</td><td>Wersja 1.5.7.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism wersja 6&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemavet 950FS&nbsp;</td><td>Drew Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7300 System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Biosystemy</td><td></td><td></td>stosowane</tr><tr><td>Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescencyjne obrazowanie fluorescencyjne</td><td>G:Box Chemi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przeszczep dootrzewnowy w celu wywołania ostrej białaczki szpikowej u myszy

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Istnieje niezaspokojona potrzeba nowych terapii w leczeniu ostrej białaczki szpikowej (AML) i związanego z nią nawrotu, który dotyczy komórek macierzystych przetrwałej białaczki (LSC). Eksperymentalny model gryzoni z ostrą białaczką szpikową (AML) do testowania terapii opartych na skutecznym przeszczepianiu tych komórek za pomocą zastrzyków zaoczodołowych u myszy biorców jest najeżony wyzwaniami. Celem tego badania było opracowanie łatwej, niezawodnej i spójnej metody generowania solidnego mysiego modelu AML przy użyciu drogi dootrzewnowej. W niniejszym protokole komórki szpiku kostnego były transdukowane retrowirusem eksprymującym ludzką onkoproteinę fuzyjną MLL-AF9. Zbadano skuteczność populacji lineage ujemnych (Lin-) i Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) jako LSC dawców w rozwoju pierwotnej AML, a wstrzyknięcie dootrzewnowe przyjęto jako nową metodę generowania AML. Porównanie między iniekcjami dootrzewnowymi i zaoczodołowymi przeprowadzono w przeszczepach seryjnych w celu porównania i skontrastowania obu metod. Zarówno komórki Lin, jak i LSK transdukowane ludzkim wirusem MLL-AF9 dobrze wszczepiają się w szpik kostny i śledzionę biorców, prowadząc do pełnoobjawowej AML. Dootrzewnowe wstrzyknięcie komórek dawcy spowodowało AML u biorców po seryjnym przeszczepie, a naciekanie komórek AML wykryto we krwi, szpiku kostnym, śledzionie i wątrobie biorców za pomocą cytometrii przepływowej, qPCR i analiz histologicznych. Tak więc wstrzyknięcie dootrzewnowe jest skuteczną metodą indukcji AML wykorzystującą seryjne przeszczepianie komórek białaczkowych dawcy.

Porównanie wydajności transplantacji mysich komórek AML z wykorzystaniem dróg r.o. i i.p. 
Wcześniej opisano indukcję 1˚ AML u myszy biorców poddanych transplantacji zaocznej (r.o.) komórkami LSK transdukowanymi MLL-AF9, a zdolność do transplantacji komórek 1˚ AML została wykazana poprzez transplantację seryjną30. Niniejsze badanie jest pierwszą próbą oceny możliwości wykorzystania komórek Lin- szpiku kostnego do przeprowadzenia transplantacji. Obecność aberracyjne...

Tutaj dootrzewnowe wstrzykiwanie komórek białaczkowych jest wykorzystywane do wykrywania i rozprzestrzeniania ostrej białaczki szpikowej (AML) u myszy. Ta nowa metoda jest skuteczna w seryjnym przeszczepianiu komórek AML i może służyć jako alternatywa dla osób, które mogą doświadczać trudności i niespójności podczas wstrzykiwania dożylnego myszom.

Przeszczep dootrzewnowy w celu wywołania ostrej białaczki szpikowej u myszy

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ komórki lin-ujemne i komórki SK wyizolowane od tych samych myszy dawców nie miały widocznej różnicy w wytwarzaniu AML indukowanej przez MLL-AF9. Również wstrzyknięcie IP komórek białaczkowych może z powodzeniem opracować mysi model AML. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami przeszczepu ta technika jest wygodniejsza i tańsza.Na początek wysterylizuj 8-10-tygodniową samicę myszy C57BL/6J CD45.1 za pomocą 70% etanolu. Umieść mysz na sterylnej podkładce chirurgicznej na styropianowej płycie i przypnij nogi przez poduszki na łapy myszy. Przetnij skórę powyżej jamy brzusznej na linii środkowej i poszerz przestrzeń podskórną w kierunku tylnych nóg sterylnymi nożyczkami o ostrym końcu.Przedłuż nacięcie od linii środkowej brzucha w dół do kostek i poszerz przestrzeń podskórną poniżej tylnych nóg ostrzami nożyczek o ostrym końcu. Przetnij ścięgno Achillesa nożyczkami z ostrym końcem. Przytrzymaj ścięgno za pomocą kleszczy z zębami i odetnij drugi koniec przymocowany do kości udowej, aby usunąć mięsień brzuchaty łydki.Przetnij ścięgno mięśnia czworogłowego przyczepionego do kolana nożyczkami z ostrym końcem. Przytrzymaj ścięgno i przetnij głowę mięśnia przyczepioną do kości udowej, aby usunąć mięsień brzuchaty łydki. Przetnij pozostałe mięśnie otaczające kość udową na końcu przyczepione do kości piszczelowej.Następnie przetnij kostkę nożyczkami z ostrym końcem, upewniając się, że kość piszczelowa pozostaje nienaruszona. Przytrzymaj dystalny koniec kości udowej i przetnij staw biodrowy nożyczkami z ostrym końcem, upewniając się, że głowa kości udowej pozostaje nienaruszona. Przenieś piszczele i kości udowe do bufora przepływowego w 15-mililitrowej probówce.Oddziel kość piszczelową i udową, łamiąc kolano ręką. Usuń rzepkę, chrząstkę i kłykcie kości udowej, aby odsłonić płaskowyż piszczelowy i dystalną część kości udowej. Usuń mięśnie za pomocą sterylnej gazy i namocz kości w buforze przepływowym.Przeciąć szyjkę kości udowej i przepłukać komórki szpiku kostnego buforem przepływowym z obu końców kości udowej za pomocą 10-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 23. Następnie przetnij kostkę piszczelową i przepłucz komórki szpiku kostnego buforem przepływowym z obu końców kości piszczelowej. Rozprowadzić komórki, pipetując w górę i w dół za pomocą 10-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 18.Odwirować zawiesinę jednokomórkową w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 400 G przez trzy minuty. Odrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek lub RBC w celu lizy krwinek czerwonych przez trzy minuty. Dodaj pięć mililitrów buforu przepływowego, aby zatrzymać lizę.Następnie odwirować zawiesinę komórek i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach bufora przepływowego. Umieść sitko o średnicy 70 mikronów na probówce o pojemności 50 mililitrów i przepuść zawiesinę przez sitko, aby zebrać komórki. Dostosuj stężenie komórek za pomocą bufora przepływowego do jednego razy 10 do ośmiu na mililitr w probówkach polipropylenowych z okrągłym dnem.Wybierz komórki ujemne pod względem linii za pomocą zestawu do izolacji komórek krwiotwórczych myszy zgodnie z instrukcjami producenta. Po zakończeniu odwiruj posortowane hematopoetyczne komórki macierzyste i niesortowane komórki line-ujemne i ponownie zawieś w trzech mililitrach 2X cytokin, pożywce IMDM i trzech mililitrach supernatantu wirusa w naczyniu pokrytym retro-reduktorem. Inkubuj naczynie w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 6 lub 24 godziny.Po transdukcji zbierz komórki przez odwirowanie. W razie potrzeby użyj trypsyny, aby zebrać komórki przymocowane do dna naczynia. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad we wstępnie podgrzanym PBS.Wstrzyknąć komórki do myszy głównego biorcy zaoczodołowo lub dootrzewnowo za pomocą połówki igły o rozmiarze 27. Monitoruj mysz codziennie. Po miesiącu należy co tydzień pobierać krew przez krwawienie zaoczodołowe w celu monitorowania leukocytozy poprzez ocenę pełnej morfologii krwi w teorii HEMAVET.Podejrzyj oko kciukiem i palcem wskazującym, a następnie przeniknij do splotu zatoki żylnej sterylną rurką kapilarną hematokrytu przez wewnętrzny kantu. Zbierz od 20 do 25 mikrolitrów krwi do probówki do pobierania krwi EDTA i zamknij powieki, aby zatrzymać krwawienie. Nałóż jedną kroplę roztworu okulistycznego siarczanu gentamycyny na oko.Gdy białe krwinki osiągną cztery razy 10 do czterech komórek na mikrolitr, wyizoluj komórki szpiku kostnego, przepłukując kości udowe i piszczelowe buforem przepływowym, a następnie wykonaj lizę RBC, jak opisano wcześniej. Następnie, aby zebrać splenocyty, umieść mysz na sterylnej podkładce chirurgicznej na styropianowej desce i przypnij nogi przez poduszki łap myszy. Wysterylizuj mysz 70% etanolem.Przetnij skórę i mięśnie w linii środkowej, aby odsłonić jamę brzuszną sterylnymi nożyczkami o ostrym końcu. Odizoluj śledzionę i umieść ją w buforze przepływowym w 15-mililitrowej probówce. Przetrzyj śledzionę przez sitko o średnicy 70 mikronów w sześciocentymetrowym naczyniu z trzema mililitrami buforu przepływowego.Przenieś komórki z naczynia do 15-mililitrowej probówki, a następnie odwiruj zawiesinę jednokomórkową, odrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach buforu do lizy RBC na trzy minuty. Dodaj pięć mililitrów buforu przepływowego, aby zatrzymać lizę i odwirować zawiesinę komórek. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach bufora przepływowego, wymieszać i przepuścić przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów, aby zebrać komórki do probówki o pojemności 50 mililitrów.Zidentyfikuj pierwotne komórki ostrej białaczki szpikowej lub AML, barwiąc splenocyty i komórki szpiku kostnego za pomocą sprzężonego z FITC przeciwciała anty-mysiego CD45.1 i wykrywając za pomocą cytometru przepływowego. Komórki są najpierw bramkowane na FSC-A, FSC-H i FSC-A SSC-A w celu uzyskania singletów. Populacja CD45.1 dodatnia jest bramkowana na wykresie FL1 przez porównanie jej z niebarwionymi komórkami.W przypadku przeszczepu wtórnego należy ponownie zawiesić komórki śledziony CD45.1 AML od pierwotnych biorców zaoczodołowych w PBS i wstrzyknąć je po orbicie do samca myszy CD45.2. Obecność nieprawidłowej leukocytozy i zwiększona infiltracja komórek białaczkowych w szpiku kostnym i śledzionie potwierdza możliwość wykorzystania komórek ujemnych pod względem linii szpiku kostnego do wytworzenia pierwotnej AML. Nie zaobserwowano istotnych różnic u pierwotnych biorców translowanych LSK lub komórkami ujemnymi pod względem linii.Komórki AML rozprzestrzeniają się w jamie brzusznej głównych biorców przez białaczkę mieszaną lub komórki ujemne pod względem linii MLL-AF9. Wyniki te potwierdziły również ustalenie pierwotnej AML poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie komórek ujemnych w szpiku kostnym transdukowanych MLL-AF9 w postaci leukocytozy oraz obecność komórek AML w szpiku kostnym i śledzionie myszy biorców. Jednak pierwotny przeszczep przez wstrzyknięcie dootrzewnowe trwał dłużej do rozwinięcia AML niż przez wstrzyknięcie zaoczodołowe, pomimo równej liczby komórek dawcy.Wtórni biorcy wykazywali leukocytozę i znaczną powiększenie wątroby i śledziony w okresie krótszym niż miesiąc po przeszczepie. Komórki AML wykryto również we krwi obwodowej, szpiku kostnym i śledzionie, a także w jamie otrzewnej. Wstrzyknięcie dootrzewnowe osiem razy 10 do pięciu komórek AML osiągnęło porównywalne wszczepienie do wstrzyknięcia zaoczodołowego osiem razy 10 do pięciu AML.Myszy biorcy trzeciego rzędu ostro wykazywały objawy AML, w tym leukocytozę i powiększenie wątroby i śledziony, obecność komórek białaczkowych we krwi, szpiku kostnym i śledzionie, obserwacja histologiczna kości udowej i śledziony dodatkowo wykazała naciekanie komórek białaczkowych. W porównaniu z przeszczepami wtórnymi i trzeciorzędowymi, przeszczep trzeciorzędowy postępował znacznie szybciej niż przeszczep wtórny. W obecnym modelu sortowanie komórek LSK nie jest konieczne.Komórki linowo-ujemne mogą być transdukowane wirusem AML przez 6 godzin lub 24 godziny. Nie wpłynie to na efektywność założenia modelki.

intra-peritoneal-transplantation-for-generating-acute-myeloid

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie wykonujemy dootrzewnowe wstrzyknięcie zawiesiny komórek raka jajnika w modelu mysim, aby zbadać kolonizację komórek raka jajnika w tkance tłuszczowej otrzewnej i ich późniejsze przerzuty.

Dootrzewnowe wstrzykiwanie komórek: metoda dostarczania komórek rakowych do tkanki tłuszczowej otrzewnej modelu mysiego

Ten film demonstruje indukcję choroby jelitowej przeszczep przeciwko gospodarzowi, GvHD, u śmiertelnie napromieniowanej myszy biorcy przy użyciu allogenicznych hematopoetycznych komórek macierzystych i indukujących GvHD alloreaktywnych limfocytów T indukujących śledzionę. Protokół ten pomaga w ustaleniu modelu ciężkiej ostrej choroby jelitowej GvHD, aby zrozumieć mechanizm choroby i opracować innowacyjne opcje terapeutyczne.

Indukcja choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w modelach mysich za pomocą allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego i komórek śledziony

Opisujemy protokół, w którym kondycjonowanie busulfanu pozwala na zastąpienie szpiku kostnego myszy biorcy komórkami szpiku kostnego od myszy dawców, które powszechnie wyrażają zielone białko fluorescencyjne, przy braku napromieniowania. Technika ta jest przydatna do badania akumulacji komórek szpiku kostnego w ośrodkowym układzie nerwowym.

Busulfanu jako środek mielosupresyjny do generowania stabilnego chimeryzmu szpiku kostnego na wysokim poziomie u myszy

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Ten manuskrypt zawiera opis metodologii użytej do ustanowienia modeli myszy transdukcyjno-transplantacyjnych. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat błędów technicznych, których należy unikać podczas wykonywania przeszczepów szpiku kostnego. Należy uzyskać jasne zrozumienie znaczenia wysokiego miana wirusa, transfekcji/transdukcji i napromieniania.

Mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego

Tutaj opisujemy protokół, w którym model ksenoprzeszczepu uzyskany od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną jest używany jako strategia oceny i monitorowania toksyczności związanej z receptorem chimerycznego antygenu T ukierunkowanym na CD19.

Ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów T przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną

Ten protokół opisuje doudowe wstrzyknięcie kilku krwiotwórczych lub białaczkowych komórek macierzystych, w tym komórek z edytowanymi genami, w mysich modelach ksenoprzeszczepów, co nie tylko umożliwi szybki i bezpieczny przeszczep komórek, ale także seryjne analizy szpiku kostnego.

Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

Zastrzyki doudowe pozwalają na wszczepienie niewielkiej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC), poprzez umieszczenie komórek bezpośrednio w jamie szpiku kostnego. Tutaj opisujemy eksperymentalny protokół wstrzykiwania do kości udowej ludzkich HSPC myszom z niedoborem odporności.

Wstrzyknięcie doudowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych myszom z obniżoną odpornością

W tym miejscu opisano metodę opartą na cytometrii fosfoprzepływowej do analizy sygnalizacji za szlakami mTORC1, JAK / STAT5 i MAPK w ostrych ludzkich komórkach białaczki szpikowej ksenoprzeszczepowanych myszom i uzyskanych z aspiratów szpiku kostnego. Poziomy p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 i p-ERK1/2 są jednocześnie mierzone za pomocą spektralnego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości.

Wewnątrzkomórkowa cytometria fosfoflowa ostrej białaczki szpikowej Ksenotransplantacje pochodzące od pacjentów

Protokół ma na celu opisanie mysiego modelu generującego nawroty ostrej białaczki limfoblastycznej, oparty na dynamice odpowiedzi na chemioterapię indukcyjną.

Model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej

Ten protokół pokazuje wstrzyknięcie do żyły skroniowej w celu dostarczenia dożylnego komórek raka u dzieci noworodkom myszy, umożliwiając precyzyjne, możliwe do powtórzenia modelowanie wczesnych reakcji immunologicznych przeciwko rakiem. Metoda ta umożliwia ocenę wpływu interwencji, takich jak immunomodulacja czy terapia, kiedy są one zastosowane w okresie noworodkowym.

Model noworodka dożylnego przeszczepu do oceny działań odpornościowych we wczesnym okresie życia przeciwko komórkom nowotworowym

Poznaj metodę przeszczepu dootrzewnowego do wywołania ostrej białaczki szpikowej u myszy. Technika ta jest wygodniejsza i tańsza niż tradycyjne wstrzyknięcia dożylne, zachowując skuteczność w generowaniu modelu AML.

Przeszczep dootrzewnowy w celu wywołania ostrej białaczki szpikowej u myszy

Przeglądaj więcej filmów