Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę

Protokół ten wykorzystuje strategię hodowli w zawiesinie statycznej do różnicowania komórek progenitorowych trzustki w klastry wysp trzustkowych, zmniejsza stres, którego doświadczają komórki podczas hodowli wstrząsowej, i znacznie poprawia sukces różnicowania. Protokół sprzętowy jest przyjazny dla początkujących i pozwala zaoszczędzić czas na optymalizację pierwszych czterech etapów. Personel posiadający podstawowe techniki hodowli komórek macierzystych może odtworzyć ten protokół z dużą szansą na wygenerowanie funkcjonalnych klastrów przypominających wyspy trzustkowe.

Na początek należy wstępnie pokryć dołki matrigelem z kwalifikacją hESC rozcieńczonym w lodowatym DMEM/F12 i umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i temperaturze 5% na 30 minut. Odessać zużytą pożywkę z kultury hPSC i spłukać raz DPBS. Dysocjuj hodowlę hPSC na pojedyncze komórki za pomocą enzymu dysocjacji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut.

Po dysocjacji przepłucz komórki, dodając ciepłą pożywkę DMEM/F12 i przenieś je do 15- lub 50-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300 G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w kompletnym pożywce z komórek macierzystych zawierającej 10-mikromolowy Y-27632. Następnie wykonaj liczenie żywych komórek za pomocą hemocytometru.

Po policzeniu aspiruj rozcieńczony matrigel i natychmiast wysiewaj żywe komórki w ilości od 1,6 do 1,8 razy od 10 do pięciu na centymetr kwadratowy gęstości na dołkach pokrytych matryżelem. Inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze przez 24 godziny. Następnie, w pierwszym etapie, pierwszego dnia, przygotuj pożywkę etapu 1A.

Zastąp zużytą pożywkę pożywką etapu 1A i inkubuj przez 24 godziny. Następnego dnia zużytą pożywkę ze studzienek należy zastąpić świeżo przygotowaną pożywką etapu 1B. W drugim etapie, w dniu pierwszym, należy przygotować pożywkę etapową 2A i zastąpić pożywkę ze studzienek pożywką stopnia 2A.

Inkubować przez 24 godziny przed dodaniem pożywki stopnia 2B do studzienek; Etap trzeci, dzień pierwszy, odessać zużyte podłoże ze studzienek, a następnie dodać świeżo przygotowane podłoże etapu 3 i inkubować w wilgotnym inkubatorze. W czwartym etapie, pierwszego dnia, zastąp zużytą pożywkę świeżo przygotowaną pożywką etapu 4 i inkubuj w wilgotnym inkubatorze. W czwartym etapie, w piątym dniu, wstępnie potraktuj mikrostudzienki 500 mikrolitrami roztworu do płukania zapobiegającego przywieraniu na studzienkę.

Odwirować płytkę mikrodołkową o stężeniu 1,300 G przez pięć minut i obserwować pod mikroskopem, aby upewnić się, że w mikrostudzienkach nie zostały uwięzione pęcherzyki powietrza. Następnie odessać roztwór płuczący ze studzienek i spłukać raz jednym mililitrem DPBS. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki agregacyjnej do każdej studzienki.

Po usunięciu zużytej pożywki z kultur progenitorowych trzustki, przemyj kulturę raz DPBS, a następnie dysocjuj na pojedyncze komórki odczynnikiem dysocjacyjnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 12 minut. Opłucz komórki ciepłym DMEM/F12 i przenieś je do probówki do odwirowania przy 300 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić osad w pożywce agregacyjnej i przeprowadzić liczenie żywych komórek.

Wysiewaj od 2,4 do 3,6 miliona komórek na studzienkę i dodaj pożywkę agregacyjną do każdej studzienki, aby uzyskać końcową objętość dwóch mililitrów na studzienkę. Używając końcówki do pipety P-1000, delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 G przez pięć minut, aby wychwycić komórki w mikrostudzienkach i inkubować w wilgotnym inkubatorze przez 24 godziny w celu zainicjowania agregacji.

Po agregacji delikatnie odpipetuj agregaty w górę i w dół kilka razy, aby unosić wszystkie niezagregowane komórki. Gdy agregaty osiądą, ostrożnie usuń zużyte podłoże zawierające pływające niezagregowane komórki bez zasysania agregatów. Dozować świeżą pożywkę etapu 5 na powierzchnię płytki mikrodołkowej, aby usunąć kruszywa z mikrodołków i przenieść je do płytki sześciodołkowej o bardzo niskim mocowaniu.

Po zebraniu wszystkich kruszyw w sześciu dołkach o bardzo niskim przyłączeniu, należy je ponownie zawiesić w pożywce etapu 5, aby dostosować gęstość do 20 klastrów na 100 mikrolitrów. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej, dozować 50 mikrolitrów pożywki stopnia 5 do każdego dołka 96-dołkowej płytki ULA o płaskim dnie o bardzo niskim nasadce. Napełnij studzienki narożne i krawędziowe 200 mikrolitrami DPBS.

Delikatnie wymieszać zawiesinę aparatu udojowego za każdym razem przed dozowaniem. Następnie dodać 100 mikrolitrów zawiesiny klastra do każdego dołka płaskiej 96-dołkowej płytki ULA. Umieść płytki hodowlane na równej powierzchni w nawilżanym inkubatorze na 24 godziny.

Następnego dnia lub w piątym etapie, w drugim dniu, za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie usunąć 90 mikrolitrów zużytej pożywki z każdej studzienki i odświeżyć 100 mikrolitrami pożywki etapu 5. W szóstym etapie, pierwszego dnia, zastąp 90 mikrolitrów zużytej pożywki 100 mikrolitrami pożywki etapu 6 na studzienkę. Na etapie siódmym, pierwszego dnia, usuń zużyte podłoże i dodaj 100 mikrolitrów pożywki etapu 7 do dołka.

W tym badaniu, przy użyciu płytek mikrodołkowych, wygenerowano jednocześnie tysiące skupisk progenitorów trzustki o jednolitej wielkości i morfologii, a średnia wydajność agregacji wyniosła około 74%Co ważne, ekspresja PDX1 i NKX6.1 utrzymywała się na wysokim poziomie w tych klastrach po agregacji. Komórki wykazujące ekspresję insuliny były stopniowo indukowane w skupiskach endokrynnych, na co wskazują zwiększone sygnały GFP insuliny w żywych kulturach w czasie. Rozmiar klastra wzrasta ze średniej średnicy 150 mikronów do 220 mikronów między etapami piątym i siódmym.

Charakterystyka składu komórkowego pokazuje, że wyspy trzaskowe hPSC w siódmym stadium generowane przez protokół hybrydowy były głównie endokrynologiczne i składały się z czterech głównych typów komórek wysp trzustkowych. Ten hybrydowy protokół wygenerował głównie monohormonalne komórki wysp trzustkowych i mniejszość komórek bihormonalnych. Różnicujące się komórki beta wyrażają NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 i GLUT1.

Ponadto w siódmym etapie hodowli indukowano 60% podwójnie dodatnich komórek insuliny i PDX1 oraz 50% komórek podwójnie dodatnich peptydu C i NKX6.1. In vitro statyczne testy wydzielania insuliny stymulowane glukozą wykazały, że wyspy trzustkowe hPSC siódmego stopnia wydzielają wysoki poziom insuliny w odpowiedzi na wysoki poziom glukozy i bezpośrednią depolaryzację. Całkowita zawartość insuliny w wyspach trzustkowych hPSC jest w przybliżeniu o połowę mniejsza niż w wysepkach ze zwłok.

Wielodołkowy system hodowli statycznej do generowania wysp trzustkowych pochodzących z komórek macierzystych ułatwia wykonywanie różnych testów in situ i może służyć jako odpowiednia platforma do opracowywania protokołów i badań przesiewowych na małą skalę. Aby zminimalizować fuzję klastra podczas hodowli statycznej w płytce 96-dołkowej, nie należy przechylać płytki podczas zmiany pożywki. Zawsze trzymaj płytę poziomo na równej powierzchni.