Name: Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę. Protokół statycznej kultury zawiesinowej zwiększa skuteczność różnicowania i redukuje stres komórkowy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie od STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF i Canadian Institutes of Health Research. Jia Zhao i Shenghui Liang są laureatami nagrody Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam jest stypendystą programu Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima jest laureatką stypendium Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship oraz nagrody upamiętniającej Ecole Polytechnique w 1989 roku. Serdecznie dziękujemy dr Edouardowi G. Stanleyowi z MCRI i Monash University za udostępnienie linii Mel1 INS GFP/W oraz Alberta Diabetes Institute Islet Core za izolację i dystrybucję ludzkich wysp trzustkowych. Dziękujemy również za wsparcie ze strony Instytutu Nauk Przyrodniczych ds. Obrazowania i Cytometrii Przepływowej Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

<ol><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes.</a> Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).</li>
<li>Petersen, M. C., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+insulin+action+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of insulin action and insulin resistance.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+journey+of+islet+cell+transplantation+and+future+development%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The journey of islet cell transplantation and future development.</a> Islets. 10 (2), 80-94 (2018).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li>
<li>Jennings, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+pancreas+from+foregut+to+endocrine+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment.</a> Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).</li>
<li>Jorgensen, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+illustrated+review+of+early+pancreas+development+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">An illustrated review of early pancreas development in the mouse.</a> Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).</li>
<li>Jensen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+factors+in+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory factors in pancreatic development.</a> Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).</li>
<li>Hald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+Ptf1a+antiserum+and+localization+of+Ptf1a+in+relation+to+Nkx6.1+and+Pdx1+during+the+earliest+stages+of+mouse+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).</li>
<li>Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).</li>
<li>Rukstalis, J. M., Habener, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3%3A+a+master+regulator+of+pancreatic+islet+differentiation+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration.</a> Islets. 1 (3), 177-184 (2009).</li>
<li>Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Neurod1+contributes+to+the+lineage+potential+of+Neurogenin3%2B+endocrine+precursor+cells+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas.</a> PLoS Genetics. 9 (2), e1003278(2013).</li>
<li>Balboa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional%2C+metabolic+and+transcriptional+maturation+of+human+pancreatic+islets+derived+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells.</a> Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).</li>
<li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem-cell-derived+islets+ameliorate+diabetes+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates.</a> Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).</li>
<li>Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+cytoskeleton+to+direct+pancreatic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).</li>
<li>Yoshihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-evasive+human+islet-like+organoids+ameliorate+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes.</a> Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).</li>
<li>Mahaddalkar, P. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pancreatic+beta+cells+from+CD177%28%2B%29+anterior+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).</li>
<li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+insulin-secreting+islet+clusters+in+a+multiwell-based+static+3D+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system.</a> Cell Reports Methods. 3, 10046(2023).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+beta-cell+function+reveals+glucose-mediated+heterogeneity+of+beta-cell+functional+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development.</a> Elife. 8, e41540(2019).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+calcium+activities+from+pancreatic+beta-cells+in+zebrafish+embryos+using+spinning-disc+confocal+and+two-photon+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy.</a> Bio-protocol. 11 (23), e4245(2021).</li>
<li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+enhances+calcium+transients+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta-cells+by+activating+phospholipase+C+signal+pathway+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).</li>
<li>Bruin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+and+function+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+in+macroencapsulation+devices+following+transplant+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice.</a> Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).</li>
<li>Toyoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+aggregation+optimizes+the+differentiation+of+human+ESCs+and+iPSCs+into+pancreatic+bud-like+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells.</a> Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).</li>
<li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+cellular+identity+during+human+in+vitro+beta-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation.</a> Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pancreatic+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules.</a> Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).</li>
<li>Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+clustering+enhances+PDX1+and+NKX6.1+expression+in+pancreatic+endoderm+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1190(2020).</li>
<li>Mamidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosignalling+via+integrins+directs+fate+decisions+of+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors.</a> Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+human+embryonic+stem+cell-derived+NKX6.1-expressing+pancreatic+progenitor+cells+accelerates+the+maturation+of+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo.</a> Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
</ol>

Timothy J. Kieffer był pracownikiem ViaCyte podczas przygotowywania tego manuskryptu. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W artykule opisano siedmioetapowy protokół hybrydowy, który pozwala na wytwarzanie wysp trzustkowych hPSC zdolnych do wydzielania insuliny po prowokacji glukozą w ciągu 40 dni hodowli in vitro. Uważa się, że spośród tych wielu etapów, skuteczna indukcja ostatecznej endodermy stanowi ważny punkt wyjścia dla ostatecznych wyników różnicowania 18,27,28. W protokole producenta zaleca się gęstość wysiewu na poziomie 2,6 × 10<...

Komórki beta trzustki wydzielają insulinę w odpowiedzi na wzrost poziomu glukozy we krwi. Pacjenci bez wystarczającej produkcji insuliny z powodu autoimmunologicznego zniszczenia komórek beta w cukrzycy typu 1 (T1D)1 lub z powodu dysfunkcji komórek beta w cukrzycy typu 2 (T2D)2, są zazwyczaj leczeni podawaniem insuliny egzogennej. Pomimo tej ratującej życie terapii, nie jest ona w stanie dokładnie dorównać znakomitej kontroli stężenia glukozy we krwi, jaką osiąga się dzięki dynamicznemu wydzielaniu insuliny z komórek beta w dobrej wierze. W związku z tym pacjenci często cierpią z powodu zagrażających życiu epizodów hipoglikemii i innych powikłań wynikających z przewlekłych skoków hiperglikemii. Przeszczepienie ludzkich martwych wysp trzustkowych z powodzeniem przywraca ścisłą kontrolę glikemii u pacjentów z cukrzycą typu 1, ale jest ograniczone przez dostępność dawców wysp trzustkowych i trudności w oczyszczaniu zdrowych wysp trzustkowych do przeszczepu3,4. Wyzwanie to można zasadniczo rozwiązać, wykorzystując hPSC jako alternatywny materiał wyjściowy.
Obecne strategie generowania wysp trzustkowych wydzielających insulinę z hPSC in vitro często mają na celu naśladowanie procesu rozwoju embrionalnej trzustki in vivo5,6. Wymaga to wiedzy na temat odpowiedzialnych szlaków sygnałowych i czasowego dodawania odpowiednich rozpuszczalnych czynników, aby naśladować krytyczne etapy rozwoju zarodkowej trzustki. Program trzustkowy rozpoczyna się od zaangażowania w ostateczną endodermę, która jest oznaczona przez czynniki transkrypcyjne widelec box A2 (FOXA2) i region determinujący płeć Y-box 17 (SOX17)7. Kolejne różnicowanie ostatecznej endodermy polega na tworzeniu prymitywnej rurki jelitowej, przekształcającej się w tylne jelito przednie, które wyraża homeobox 1 trzustki i dwunastnicy (PDX1)7,8,9, oraz ekspansję nabłonka do komórek progenitorowych trzustki, które wykazują współekspresję PDX1 i NK6 homeobox 1 (NKX6.1)10,11.
Dalsze zaangażowanie w komórki wysp wydzielniczych towarzyszy przejściowa ekspresja pro-endokrynologicznego regulatora głównego neurogeniny-3 (NGN3)12 oraz stabilna indukcja kluczowych czynników transkrypcyjnych różnicowania neuronów 1 (NEUROD1) i NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. Główne komórki wyrażające hormony, takie jak komórki beta produkujące insulinę, komórki alfa produkujące glukagon, komórki delta wytwarzające somatostatynę i komórki PPY trzustkowe wytwarzające polipeptydy, są następnie programowane. Dzięki tej wiedzy, a także odkryciom z obszernych, wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, ostatnie postępy umożliwiły wygenerowanie wysp trzustkowych hPSC z komórkami przypominającymi komórki beta zdolne do wydzielania insuliny14,15,16,17,18,19.
Zgłoszono protokoły krokowe do generowania komórek beta reagujących na glukozę6,14,18,19. Zbudowany na podstawie tych badań, obecny protokół obejmuje użycie zestawu progenitorów trzustki do generowania komórek progenitorowych trzustki PDX1 + / NKX6.1 + w hodowli płaskiej, a następnie agregacji płytek mikrodołkowych w klastry o jednolitej wielkości i dalszego różnicowania w kierunku wysp trzustkowych hPSC wydzielających insulinę z protokołem R w statycznej hodowli zawiesinowej 3D. Analizy kontroli jakości, w tym cytometria przepływowa, barwienie immunologiczne i ocena funkcjonalna, są wykonywane w celu rygorystycznej charakterystyki różnicujących się komórek. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy opis każdego etapu ukierunkowanego różnicowania i nakreśla podejścia do charakterystyki in vitro.

<table><tbody><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-tyronina (T3)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>Hormon tarczycy</td></tr><tr><td>4% roztwór PFA</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-281692</td><td>Należy obchodzić się z dygestoriami</td></tr><tr><td>96-Well, Ultralow Attachment, płaskie dno</td><td>Corning Costar (VWR)</td><td>CLS3474</td><td>Płaskie dno; do statycznej hodowli zawiesiny w ostatnich trzech etapach</td></tr><tr><td>Technologie Accutase</td><td>STEMCELL</td><td>07920</td><td>Odczynnik dysocjacyjny do komórek Stage 4</td></tr><tr><td>Płytki Aggrewell400</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34415</td><td>400 &micro; Płytki mikrodołkowe o średnicy m Płytki</td></tr><tr><td>Aggrewell800</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34815</td><td>800 &micro; Płytki mikrodołkowe o średnicy m</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Koza anty-ludzka FOXA2 (koza IgG)</td><td>R& Systemy D</td><td>IC2400G</td><td>1:100 w cytometrii przepływowej; używany do oznaczania komórek etapu 1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Kozia IgG Kontrola izotypu</td><td>R& D Systems</td><td>IC108G</td><td>1:100 w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Mysz anty-ludzka SST (mysia IgG2B)</td><td>BD Sciences</td><td>566032</td><td>1:250 w cytometrii przepływowej; używany do oznaczania komórek etapu 7</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Mysz IgG2B Kontrola izotypu</td><td>R& D Systems</td><td>IC0041G</td><td>1:500 w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mysi anty-ludzki peptyd C (mysi IgG1&kappa;)</td><td>BD Pharmingen</td><td>565831</td><td>1:2,000 w cytometrii przepływowej; używany do oznaczania komórek etapu 7</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mysz anty-ludzka INS (mysia IgG1&kappa;)</td><td>BD Sciences</td><td>565689</td><td>1:2,000 w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mysz anty-ludzka NKX6.1 (mysz IgG1&kappa;)</td><td>BD Sciences</td><td>563338</td><td>1:33 w cytometrii przepływowej; używany do oznaczania komórek etapu 4</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mysz anty-ludzka SOX17 (mysia IgG1&kappa;)</td><td>BD Sciences</td><td>562594</td><td>1:50 w cytometrii przepływowej; używany do oznaczania komórek etapu 1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mysz IgG1&kappa; Kontrola izotypu</td><td>BD Sciences</td><td>557714</td><td>1:50 w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>ALK5i II</td><td>Cayman Chemicals</td><td>14794</td><td>Inhibitor sygnalizacji TGF-beta</td></tr><tr><td>Roztwór do płukania zapobiegający przywieraniu&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7010</td><td>Komora testowa roztworu do płukania mikrostudzienki</td></tr><tr><td></td><td>Cellvis</td><td>D35-10-1-N</td><td>Do celów statycznego GSIS i obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>Do procedury barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Przeciwciało CK19</td><td>DAKO</td><td>M0888</td><td>1:50 w całej górze immunofluorescencja</td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>Średni suplement</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Do jądrowego barwienia przeciwbarwiącego</td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330032</td><td>Roztwór rozcieńczający Matrix</td></tr><tr><td>Osioł anty-kozioł Alexa Fluor 555</td><td>Technologie życia</td><td>A21432</td><td>1:500 w całej górze immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Osioł anty-koza Alexa Fluor 647</td><td>Technologie życia</td><td>A21447</td><td>1:500 w całej górze immunofluorescencja</td></tr><tr><td>osła anty-mysz Alexa Fluor 555</td><td>Life technologies</td><td>A31570</td><td>1:500 w całej górze immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Osioł anty-mysz Alexa Fluor 647</td><td>Life technologies</td><td>A31571</td><td>1:500 w całej górze immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Osioł anty-królik Alexa Fluor 555</td><td>Life technologies</td><td>A31572</td><td>1:500 w całej immunofluorescencji mount</td></tr><tr><td>Osioł anty-królik Alexa Fluor 647</td><td>Technologie życia</td><td>A31573</td><td>1:500 w całej immunofluorescencji</td></tr><tr><td>osła anty-owce Alexa Fluor 647</td><td>Technologie życia</td><td>A21448</td><td>1:500 w całej immunofluorescencji</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>Bez Ca2+ i Mg2+</td></tr><tr><td>ELISA, insulina, ludzka</td><td>Alpco</td><td>80-INSHU-E01.1</td><td>Do pomiaru insuliny ludzkiej</td></tr><tr><td>Wolny od kwasów tłuszczowych BSA</td><td>Proliant</td><td>68700</td><td>Średni suplement</td></tr><tr><td>Zestaw roztworów do utrwalania i przepuszczalności</td><td>BD Sciences</td><td>554714</td><td>Fix/Perm i 10x roztwory do trwałej ondulacji/prania</td></tr><tr><td>Delikatny odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td>Do pasażowania grudek hPSC podczas hodowli podtrzymującej</td></tr><tr><td>Przeciwciało glukagonu</td><td>Sigma</td><td>G2654</td><td>1:400 w całym organizmie immunofluorescencji</td></tr><tr><td>GLUT1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA1-37782</td><td>1:200 w całej górze immunofluorescencja</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Suplement L-glutaminy</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td>Do oczyszczania i montażu tkanek</td></tr><tr><td>GSi XX</td><td>Sigma Millipore</td><td>565789</td><td>Inhibitor Notch</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>Średni suplement</td></tr><tr><td>ITS-X (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500056</td><td>Insulina-Transferyna-Selen-Etanoloamina; Średni suplement</td></tr><tr><td>LDN193189&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72147</td><td>Antagonista BMP</td></tr><tr><td>Przeciwciało MAFA</td><td>Abcam</td><td>ab26405</td><td>1:200 w całej górze immunofluorescencyjna</td></tr><tr><td>Matrigel, z kwalifikacją hESC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-774-552</td><td>Macierz zewnątrzkomórkowa do powlekania powierzchni naczyń krwionośnych</td></tr><tr><td>MCDB131 medium</td><td>Technologie życia</td><td>10372019</td><td>Pożywka bazowa</td></tr><tr><td>Kompletny zestaw mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologie</td><td>85850</td><td>pożywka z komórkami macierzystymi i 5-krotny suplement w zestawie</td></tr><tr><td>N-Cys (N-acetylocysteina)</td> <td>Sigma</td><td>A9165</td><td>Przeciwutleniacz</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td>Średni suplement</td></tr><tr><td>NEUROD1 przeciwciało</td><td>R& D Systems</td><td>AF2746</td><td>1:20 w całej górze immunofluorescencja</td></tr><tr><td>NKX6.1 przeciwciało</td><td>DSHB</td><td>F55A12-c</td><td>1:50 w całej górze immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Przeciwciało polipeptydowe trzustki</td><td>R& D Systems</td><td>AF6297</td><td>1:200 w immunofluorescencji całej monty</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>z przeciwciałem Ca2+ i Mg2+</td></tr><tr><td>PDX1</td><td>Abcam</td><td>ab47267</td><td>1:200 w całej górze immunofluorescencja</td></tr><tr><td>PE Mysz anty-ludzka GCG (mysz IgG1&kappa;)</td><td>BD Sciences</td><td>565860</td><td>1:2,000 w cytometrii przepływowej; używany do oznaczania komórek etapu 7</td></tr><tr><td>PE Mysz anty-ludzka NKX6.1 (mysia IgG1k)</td><td>BD Sciences</td><td>563023</td><td>1:250 w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>PE Mysz anty-ludzka PDX1 (mysia IgG1k)</td><td>BD Sciences</td><td>562161</td><td>1:200 w cytometrii przepływowej; używany do oznaczania komórek etapu 4</td></tr><tr><td>PE Mysz IgG1&kappa; Kontrola izotypu</td><td>BD Sciences</td><td>554680</td><td>1:2,000 w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>PE Mysz-ludzka chromogranina A (CHGA, mysia IgG1k)</td><td>BD Sciences</td><td>564563</td><td>1:200 w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>R428&nbsp;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>21523</td><td>Inhibitor kinazy tyrozynowej AXL</td></tr><tr><td>Kwas retinoidowy, all-trans</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Światłoczuły</td></tr><tr><td>bufor do lizy RIPA, 10x</td><td>Sigma</td><td>20-188</td><td>Do ekstrakcji hormonów</td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Sigma</td><td>S4572</td><td>Inhibitor SHH</td></tr><tr><td>SLC18A1 przeciwciało</td><td>Sigma</td><td>HPA063797</td><td>1:200 w całej ilości immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Przeciwciało somatostatyny</td><td>Sigma</td><td>HPA019472</td><td>1:100 w całej górze immunofluorescencja</td></tr><tr><td>STEMdiff Zestaw progenitorów trzustki</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05120</td><td>Zawarte podłoża podstawowe i suplementy</td></tr><tr><td>Przeciwciało synaptofizyny</td><td>Novus</td><td>NB120-16659</td><td>1:25 w całej górze immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Do przepuszczalności</td></tr><tr><td>Trolox&nbsp;</td><td>Sigma Millipore</td><td>648471</td><td>Analog witaminy E</td></tr><tr><td>TrypLE Enzyme Express Life</td><td>technologie</td><td>12604-021</td><td>odczynnik enzymatyczny do dysocjacji komórek do pasażowania pojedynczych komórek hPSC</td></tr><tr><td>Przeciwciało trypsyny1/2/3</td><td>R& D Systems</td><td>AF3586</td><td>1:25 w całości immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td>Inhibitor ROCK</td></tr><tr><td>Siarczan</td><td>Sigma</td><td>Z0251</td><td>Średni suplement</td></tr></tbody></table>

różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki beta wydzielające insulinę dostarcza materiału do badania funkcji komórek beta i leczenia cukrzycy. Pozostają jednak wyzwania związane z uzyskaniem komórek beta pochodzących z komórek macierzystych, które odpowiednio naśladują natywne ludzkie komórki beta. Opierając się na wcześniejszych badaniach, wygenerowano komórki wysp trzustkowych pochodzących z hPSC, aby stworzyć protokół o lepszych wynikach różnicowania i spójności. Opisany tutaj protokół wykorzystuje zestaw progenitorowy trzustki podczas etapów 1-4, a następnie protokół zmodyfikowany na podstawie artykułu opublikowanego wcześniej w 2014 r. (zwanego dalej "protokołem R") podczas etapów 5-7. Uwzględniono szczegółowe procedury korzystania z zestawu progenitorów trzustki i płytek mikrodołkowych o średnicy 400 μm do generowania klastrów progenitorowych trzustki, protokół R do różnicowania endokrynologicznego w 96-dołkowym formacie zawiesiny statycznej oraz charakterystykę in vitro i ocenę funkcjonalną wysp trzustkowych pochodzących z hPSC. Pełny protokół zajmuje 1 tydzień na początkową ekspansję hPSC, a następnie ~5 tygodni na uzyskanie wysp trzustkowych hPSC wytwarzających insulinę. Personel posiadający podstawowe techniki hodowli komórek macierzystych i przeszkolony w zakresie testów biologicznych może odtworzyć ten protokół.

Opracowaliśmy hybrydową strategię różnicowania komórek macierzystych w wydzielające insulinę wyspy hPSC-islets w siedmiu krokach, która wykorzystuje zestaw do hodowli progenitorów trzustki w pierwszych czterech etapach w kulturze planarnej, a następnie zmodyfikowany protokół oparty na wcześniej opisanej metodzie6 w statycznej kulturze zawiesinowej w trzech ostatnich etapach (Rysunek 1). W tym protokole zapewnienie kultury o niemal pełnej konfluencji (90%-100%) 24 h po...

Różnicowanie komórek macierzystych w komórki wysp trzustkowych stanowi alternatywne rozwiązanie dla konwencjonalnego leczenia cukrzycy i modelowania chorób. Opisujemy szczegółowy protokół hodowli komórek macierzystych, który łączy komercyjny zestaw różnicujący z wcześniej zwalidowaną metodą, aby pomóc w wytwarzaniu wysp trzustkowych wydzielających insulinę pochodzących z komórek macierzystych w naczyniu.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

Protokół ten wykorzystuje strategię hodowli w zawiesinie statycznej do różnicowania komórek progenitorowych trzustki w klastry wysp trzustkowych, zmniejsza stres, którego doświadczają komórki podczas hodowli wstrząsowej, i znacznie poprawia sukces różnicowania. Protokół sprzętowy jest przyjazny dla początkujących i pozwala zaoszczędzić czas na optymalizację pierwszych czterech etapów. Personel posiadający podstawowe techniki hodowli komórek macierzystych może odtworzyć ten protokół z dużą szansą na wygenerowanie funkcjonalnych klastrów przypominających wyspy trzustkowe.Na początek należy wstępnie pokryć dołki matrigelem z kwalifikacją hESC rozcieńczonym w lodowatym DMEM/F12 i umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i temperaturze 5% na 30 minut. Odessać zużytą pożywkę z kultury hPSC i spłukać raz DPBS. Dysocjuj hodowlę hPSC na pojedyncze komórki za pomocą enzymu dysocjacji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut.Po dysocjacji przepłucz komórki, dodając ciepłą pożywkę DMEM/F12 i przenieś je do 15- lub 50-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300 G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w kompletnym pożywce z komórek macierzystych zawierającej 10-mikromolowy Y-27632. Następnie wykonaj liczenie żywych komórek za pomocą hemocytometru.Po policzeniu aspiruj rozcieńczony matrigel i natychmiast wysiewaj żywe komórki w ilości od 1,6 do 1,8 razy od 10 do pięciu na centymetr kwadratowy gęstości na dołkach pokrytych matryżelem. Inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze przez 24 godziny. Następnie, w pierwszym etapie, pierwszego dnia, przygotuj pożywkę etapu 1A.Zastąp zużytą pożywkę pożywką etapu 1A i inkubuj przez 24 godziny. Następnego dnia zużytą pożywkę ze studzienek należy zastąpić świeżo przygotowaną pożywką etapu 1B. W drugim etapie, w dniu pierwszym, należy przygotować pożywkę etapową 2A i zastąpić pożywkę ze studzienek pożywką stopnia 2A.Inkubować przez 24 godziny przed dodaniem pożywki stopnia 2B do studzienek; Etap trzeci, dzień pierwszy, odessać zużyte podłoże ze studzienek, a następnie dodać świeżo przygotowane podłoże etapu 3 i inkubować w wilgotnym inkubatorze. W czwartym etapie, pierwszego dnia, zastąp zużytą pożywkę świeżo przygotowaną pożywką etapu 4 i inkubuj w wilgotnym inkubatorze. W czwartym etapie, w piątym dniu, wstępnie potraktuj mikrostudzienki 500 mikrolitrami roztworu do płukania zapobiegającego przywieraniu na studzienkę.Odwirować płytkę mikrodołkową o stężeniu 1,300 G przez pięć minut i obserwować pod mikroskopem, aby upewnić się, że w mikrostudzienkach nie zostały uwięzione pęcherzyki powietrza. Następnie odessać roztwór płuczący ze studzienek i spłukać raz jednym mililitrem DPBS. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki agregacyjnej do każdej studzienki.Po usunięciu zużytej pożywki z kultur progenitorowych trzustki, przemyj kulturę raz DPBS, a następnie dysocjuj na pojedyncze komórki odczynnikiem dysocjacyjnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 12 minut. Opłucz komórki ciepłym DMEM/F12 i przenieś je do probówki do odwirowania przy 300 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić osad w pożywce agregacyjnej i przeprowadzić liczenie żywych komórek.Wysiewaj od 2,4 do 3,6 miliona komórek na studzienkę i dodaj pożywkę agregacyjną do każdej studzienki, aby uzyskać końcową objętość dwóch mililitrów na studzienkę. Używając końcówki do pipety P-1000, delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 G przez pięć minut, aby wychwycić komórki w mikrostudzienkach i inkubować w wilgotnym inkubatorze przez 24 godziny w celu zainicjowania agregacji.Po agregacji delikatnie odpipetuj agregaty w górę i w dół kilka razy, aby unosić wszystkie niezagregowane komórki. Gdy agregaty osiądą, ostrożnie usuń zużyte podłoże zawierające pływające niezagregowane komórki bez zasysania agregatów. Dozować świeżą pożywkę etapu 5 na powierzchnię płytki mikrodołkowej, aby usunąć kruszywa z mikrodołków i przenieść je do płytki sześciodołkowej o bardzo niskim mocowaniu.Po zebraniu wszystkich kruszyw w sześciu dołkach o bardzo niskim przyłączeniu, należy je ponownie zawiesić w pożywce etapu 5, aby dostosować gęstość do 20 klastrów na 100 mikrolitrów. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej, dozować 50 mikrolitrów pożywki stopnia 5 do każdego dołka 96-dołkowej płytki ULA o płaskim dnie o bardzo niskim nasadce. Napełnij studzienki narożne i krawędziowe 200 mikrolitrami DPBS.Delikatnie wymieszać zawiesinę aparatu udojowego za każdym razem przed dozowaniem. Następnie dodać 100 mikrolitrów zawiesiny klastra do każdego dołka płaskiej 96-dołkowej płytki ULA. Umieść płytki hodowlane na równej powierzchni w nawilżanym inkubatorze na 24 godziny.Następnego dnia lub w piątym etapie, w drugim dniu, za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie usunąć 90 mikrolitrów zużytej pożywki z każdej studzienki i odświeżyć 100 mikrolitrami pożywki etapu 5. W szóstym etapie, pierwszego dnia, zastąp 90 mikrolitrów zużytej pożywki 100 mikrolitrami pożywki etapu 6 na studzienkę. Na etapie siódmym, pierwszego dnia, usuń zużyte podłoże i dodaj 100 mikrolitrów pożywki etapu 7 do dołka.W tym badaniu, przy użyciu płytek mikrodołkowych, wygenerowano jednocześnie tysiące skupisk progenitorów trzustki o jednolitej wielkości i morfologii, a średnia wydajność agregacji wyniosła około 74%Co ważne, ekspresja PDX1 i NKX6.1 utrzymywała się na wysokim poziomie w tych klastrach po agregacji. Komórki wykazujące ekspresję insuliny były stopniowo indukowane w skupiskach endokrynnych, na co wskazują zwiększone sygnały GFP insuliny w żywych kulturach w czasie. Rozmiar klastra wzrasta ze średniej średnicy 150 mikronów do 220 mikronów między etapami piątym i siódmym.Charakterystyka składu komórkowego pokazuje, że wyspy trzaskowe hPSC w siódmym stadium generowane przez protokół hybrydowy były głównie endokrynologiczne i składały się z czterech głównych typów komórek wysp trzustkowych. Ten hybrydowy protokół wygenerował głównie monohormonalne komórki wysp trzustkowych i mniejszość komórek bihormonalnych. Różnicujące się komórki beta wyrażają NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 i GLUT1.Ponadto w siódmym etapie hodowli indukowano 60% podwójnie dodatnich komórek insuliny i PDX1 oraz 50% komórek podwójnie dodatnich peptydu C i NKX6.1. In vitro statyczne testy wydzielania insuliny stymulowane glukozą wykazały, że wyspy trzustkowe hPSC siódmego stopnia wydzielają wysoki poziom insuliny w odpowiedzi na wysoki poziom glukozy i bezpośrednią depolaryzację. Całkowita zawartość insuliny w wyspach trzustkowych hPSC jest w przybliżeniu o połowę mniejsza niż w wysepkach ze zwłok.Wielodołkowy system hodowli statycznej do generowania wysp trzustkowych pochodzących z komórek macierzystych ułatwia wykonywanie różnych testów in situ i może służyć jako odpowiednia platforma do opracowywania protokołów i badań przesiewowych na małą skalę. Aby zminimalizować fuzję klastra podczas hodowli statycznej w płytce 96-dołkowej, nie należy przechylać płytki podczas zmiany pożywki. Zawsze trzymaj płytę poziomo na równej powierzchni.

differentiation-human-pluripotent-stem-cells-into-insulin-producing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejsze badanie opisuje metodę ukierunkowanego różnicowania w celu indukowania różnicowania komórek macierzystych zarodkowych człowieka w kierunku trzustkowym. Szczególnie istotnym odkryciem jest fakt, że kokultura z komórkami śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych progenitorów trzustkowych do komórek wykazujących ekspresję insuliny.

Kowykultura komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do insulinotwórczych komórek trzustki w podejściu ukierunkowanego różnicowania

Opisano protokół izolacji, hodowli i obrazowania klastrów komórek wysp trzustkowych (ICC) pochodzących z ludzkich komórek trzustki płodu. Metoda szczegółowo opisuje kroki niezbędne do wygenerowania ICC z tkanki, hodowli jako monowarstw lub w zawiesinie jako agregatów, oraz obrazu dla markerów proliferacji i decyzji o losie komórek trzustki.

Izolacja, hodowla i obrazowanie klastrów ludzkich płodowych komórek trzustkowych

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które są zaangażowane w ostateczną endodermę w celu poprawy dalszych zastosowań i dalszego różnicowania.

Szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy 4-etapowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do komórek progenitorowych trzustki NKX6-1+ in vitro. Protokół ten może być stosowany do różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Skuteczne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do progenitorów trzustki NKX6-1+

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki białka homeobox 1+ trzustki/dwunastnicy (PDX1+) w celu wytworzenia linii trzustki w oparciu o jednowarstwowy wzrost pojedynczych komórek bez typu kolonijnego. Metoda ta jest odpowiednia do wytwarzania jednorodnych komórek pochodzących z hPSC, manipulacji genetycznych i badań przesiewowych.

Wydajne wytwarzanie białka homeobox trzustki/dwunastnicy 1+ w tylnym odcinku jelita przedniego/trzustki z hPSC w kulturach adhezyjnych

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodę zwiększania koekspresji czynników transkrypcyjnych PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w płaskich monowarstwach. Osiąga się to poprzez uzupełnienie świeżej macierzy, manipulowanie gęstością komórek i dysocjację komórek endodermalnych.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Tutaj prezentujemy solidny, szybki i skalowalny protokół różnicowania kardiomiocytów dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Kardiomiocyty uzyskane przy użyciu tej metody na dużą skalę mogą zapewnić wystarczającą liczbę komórek do ich skutecznego wykorzystania w modelowaniu chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i potencjalnie zastosowaniach klinicznych.

Produkcja kardiomiocytów na dużą skalę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wysoce powtarzalnego protokołu różnicowania opartego na małych cząsteczkach

Poznaj metodę różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę. Protokół statycznej kultury zawiesinowej zwiększa skuteczność różnicowania i redukuje stres komórkowy.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę

Przeglądaj więcej filmów