Name: Przewidywanie farmakologii sieciowej i eksperymentalna walidacja mechanizmu działania Trichosanthes-Fritillaria thunbergii przeciwko gruczolakorakowi płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T14:35:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Odkryj mechanizm działania Trichosanthes-Fritillaria thunbergii przeciwko gruczolakorakowi płuc z wykorzystaniem farmakologii sieciowej i weryfikacji eksperymentalnej. Badanie wykazuje rolę szlaku PI3K/AKT.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Program Szkolenia w zakresie Innowacji Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie (Nie: 202110026036).

Wszystkie procedury farmakologii sieciowej zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dla metod oceny farmakologii sieciowej18. Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami dotyczącymi zarządzania laboratorium Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie.
1. Sieciowa prognoza farmakologiczna
<ol>
	<li>Dobór składników aktywnych
	<ol>
		<li>Otwórz bazę danych HERB (http://herb.ac.cn)19 i użyj "Gualou" (chińska nazwa Trichosanthes kirilowii Maxim) i "Zhebeimu" (chińska nazwa Bulbus Fritillariae thunbergii) jako słów kluczowych, aby uzyskać składniki tych dwóch leków. Pobierz listę i kanoniczne struktury SMILES powiązanych składników obu leków.</li>
		<li>Określ, czy uzyskany składnik jest składnikiem aktywnym.
		<ol>
			<li>Uwzględnij jako składniki aktywne te, które mają doustną biodostępność (OB) i wartości podobne do leków (DL) w bazie danych grupy HERB (tj. składniki o OB ≥ 30% i DL ≥ 0,18)20,21.</li>
			<li>Jeśli komponent nie ma wartości OB i DL, wprowadź komponent do szwajcarskiej bazy danych ADME (http://www.swissadme.ch/index.php)22, aby uzyskać informacje o każdym komponencie. Jako składniki aktywne należy uwzględnić składniki o "wysokiej" absorpcji IG i co najmniej dwóch wartościach DL "Tak".</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Docelowa predykcja składników aktywnych
	<ol>
		<li>Otwórz bazę danych HERB (http://herb.ac.cn). Wyszukaj i skopiuj kanoniczne struktury SMILES aktywnych składników.</li>
		<li>Otwórz bazę danych SEA (Similarity ensemble approach, http://sea.bkslab.org)23. Wklej kanoniczne struktury SMILES aktywnych komponentów w polu wyszukiwania i kliknij Wypróbuj SEA, aby uzyskać klucz docelowy, nazwę celu, wartość P i MaxTC każdego aktywnego komponentu.</li>
		<li>Skopiuj dane do arkusza kalkulacyjnego i użyj funkcji filtrowania pliku arkusza kalkulacyjnego, aby przefiltrować obiekty docelowe aktywnych komponentów według klucza docelowego (Człowiek, P < 0,05 i MaxTC > 0,5).</li>
		<li>Skopiuj wszystkie cele do arkusza kalkulacyjnego i usuń duplikaty, aby uzyskać cele leków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przewidywanie celów chorobowych
	<ol>
		<li>Otwórz bazę danych GeneCards (https://www.genecards.org)24 i bazę danych Online Mendl Inheritance in Man (OMIM, https://www.omim.org)25 i użyj Lung Adenocarcinoma jako słowa kluczowego, aby uzyskać cele chorobowe gruczolakoraka płuc.</li>
		<li>Pobierz arkusze kalkulacyjne z celami chorobowymi. Usuń powtarzające się obiekty docelowe, aby uzyskać obiekty docelowe LUAD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowa sieci lek-składnik-choroba-cel
	<ol>
		<li>Skopiuj cele związane z LUAD i cele leków do tej samej kolumny w nowym arkuszu kalkulacyjnym. Użyj funkcji Dane - Zidentyfikuj duplikaty na pasku narzędzi, aby uzyskać cele przecięć obiektów docelowych związanych z LUAD i celów związanych z aktywnym komponentem Trichosanthes-Fritillaria thunbergii.</li>
		<li>Otwórz Cytoscape 3.8.0. Kliknij Plik na pasku menu, a następnie wybierz Importuj sieć > z pliku, aby zaimportować plik arkusza kalkulacyjnego. Zoptymalizuj rozmiar i kolor węzłów sieci za pomocą paska stylów w lewym panelu sterowania.</li>
		<li>Użyj funkcji Analizuj sieć do analizy topologii sieci. Kliknij Narzędzia na pasku menu, a następnie wybierz Analizuj sieć. W panelu Tabela kliknij przycisk Stopień na pasku tytułu, aby ułożyć komponenty według stopnia w kolejności malejącej. Weź dziesięć najważniejszych komponentów i celów jako główne aktywne komponenty i główne cele.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowa sieci IPP i badania przesiewowe białek rdzeniowych
	<ol>
		<li>Otwórz bazę danych STRING (https://cn.string-db.org/)26. Wklej listę potencjalnych celów Trichosanthes-Fritillaria thunbergii przeciwko LUAD w formacie tekstowym do okna dialogowego Lista nazw. Wybierz Homo sapiens w Organizmy i kliknij przyciski SZUKAJ > KONTYNUUJ.</li>
		<li>Gdy wyniki będą dostępne, kliknij Ustawienia i zaznacz opcję Wysoki poziom ufności (0,700) w Ustawienia podstawowe > Minimalny wymagany wynik interakcji. Zaznacz opcję Ukryj rozłączone węzły w sieci w ustawieniach zaawansowanych, a następnie kliknij przycisk AKTUALIZUJ.</li>
		<li>Kliknij Eksporty na pasku tytułu i pobierz krótki tekst tabelaryczny relacji PPI w formacie TSV.</li>
		<li>Otwórz Cytoscape 3.8.0. Kliknij Plik > Importuj >sieć z pliku, aby zaimportować plik w formacie TSV do analizy wizualnej.</li>
		<li>Użyj funkcji Network Analyzer, aby przeprowadzić analizę topologiczną. Zoptymalizuj rozmiar i kolor węzłów sieci za pomocą paska stylów w lewym panelu sterowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wzbogacenia firmy KEGG
	<ol>
		<li>Otwórz platformę Metascape (https://metascape.org/)27. Wklej listę potencjalnych celów terapeutycznych w formacie tekstowym do okna dialogowego, a następnie kliknij przycisk Prześlij. Zaznacz H. sapiens zarówno w Danych wejściowych jako gatunek, jak i Analiza jako gatunek, a następnie kliknij przycisk Analiza niestandardowa. Wybierz opcję Wzbogacanie, zaznacz tylko ścieżkę KEGG, a następnie kliknij opcję Analiza wzbogacania. Gdy pasek postępu osiągnie 100%, kliknij pomarańczowy przycisk Strona raportu z analizy, aby wyświetlić wyniki wzbogacania.</li>
		<li>Kliknij plik zip wszystko w jednym, aby pobrać wynik wzbogacania, a następnie otwórz plik _ FINAL_GO.csv w folderze Enrichment_GO, aby uzyskać wynik.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie języka R (https://cran.r-project.org/). Wpisz install.package ("ggplot2") i library (ggplot2) w języku R, aby zainstalować pakiet ggplot2 R. Naciśnij Enter, aby uruchomić program do wizualizacji KEGG.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Weryfikacja eksperymentalna
<ol>
	<li>Preparat leku 
	UWAGA: Fritillaria thunbergii Miq i Trichosanthes kirilowii Maxim zostały zakupione w szpitalu Dongzhimen, powiązanym z Pekińskim Uniwersytetem Medycyny Chińskiej.
	<ol>
		<li>Wymieszaj ze sobą 50 g Fritillaria thunbergii Miq i 50 g Trichosanthes kirilowii Maxim. Namoczyć mieszaninę w 1 l wody destylowanej przez 20 minut, a następnie odsączać mieszaninę w temperaturze 100 °C pod normalnym ciśnieniem przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przefiltruj wywar, aby uzyskać filtrat z podwójną warstwą sterylnej gazy medycznej, a następnie użyj bibuły filtracyjnej o grubości 80 μm do dalszego filtrowania ekstraktu. Powtórz powyższą operację trzy razy.</li>
		<li>Wymieszać filtrat ze sobą, aby uzyskać około 1,2 l wywaru. Umieścić roztwór w kolbie wyparki obrotowej. Ustawić prędkość obrotową na 50 obr./min przy temperaturze 37 °C. Wymieszać i skondensować wywary w ekstrakt w wyparce obrotowej przez 6 godzin, aby uzyskać lepką ciecz.</li>
		<li>Włącz mechanizm liofilizacji próżniowej, aby wstępnie schłodzić temperaturę do -40 °C. Uzyskany ekstrakt umieścić w tacy na materiał i umieścić w wymrażarce w celu zamrożenia.</li>
		<li>Gdy temperatura wymrażarki osiągnie -50 °C, a materiał był zamrożony przez 2 godziny, należy przenieść zamrożone materiały na suszarkę umieszczoną w wymrażarce. Włącz pompę próżniową, aby rozpocząć proces liofilizacji. Wyjmij liofilizowany proszek i przechowuj go w lodówce w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla komórek
	<ol>
		<li>Skonfiguruj kompletną pożywkę DMEM z 89% pożywką zasadową DMEM, 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną.</li>
		<li>Po usunięciu komórek A549 z ciekłego azotu, inkubować komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i mieszać, aż pożywka w fiolce się rozpuści.</li>
		<li>Dodaj czterokrotną objętość kompletnego podłoża DMEM do stopionych komórek. Odwirować komórki (4 °C, 679 x g, 5 min) i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić wytrącone komórki w 6 ml kompletnej pożywki DMEM, umieścić je w kolbie hodowlanej T25 i inkubować kolbę w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie żywotności komórek
	<ol>
		<li>Trawić komórki A549 logarytmicznej fazy wzrostu za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny przez 1 minutę w temperaturze 37°C. Dodaj 1 ml kompletnej pożywki DMEM, aby zneutralizować trypsynę i delikatnie ją przedmuchnąć, aby przyspieszyć wydalanie komórek. Odwirować mieszaninę w celu uzyskania osadu komórkowego (4 °C, 192 x g, 5 min). Ponownie zawiesić uzyskane komórki za pomocą kompletnego podłoża DMEM.</li>
		<li>Dodaj zawiesinę komórek do hemocytometru i policz za pomocą automatycznego licznika komórek. Rozcieńczyć go do 5 x 104 komórek/ml za pomocą kompletnego podłoża DMEM.</li>
		<li>Rozpuść 1 g ekstraktu wodnego Trichosanthes-Fritillaria thunbergii w 10 ml roztworu PBS i przesterylizuj go przez filtr 0,22 μm. Rozcieńczyć mieszaninę do 90 mg/ml, 80 mg/ml, 70 mg/ml, 60 mg/mL, 50 mg/mL, 40 mg/mL, 30 mg/mL, 20 mg/ml i 10 mg/ml za pomocą PBS.</li>
		<li>Rozcieńczone komórki należy umieścić na 96-dołkowych płytkach po 100 μl na dołek. Po przyleganiu komórek dodaj 1 μl ekstraktów wodnych Trichosanthes-Fritillaria thunbergii o różnych stężeniach, aby dostosować stężenie każdej studzienki do 900 μg/ml, 800 μg/mL, 700 μg/ml, 600 μg/ml, 500 μg/ml, 400 μg/ml, 300 μg/mL, 200 μg/ml i 100 μg/ml.</li>
		<li>Po 24 godzinach hodowli odrzucić oryginalną pożywkę i dodać 100 μl pożywki zasadowej DMEM do dalszej inkubacji przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Po powyższej obróbce dodać 20 μl roztworu MTS (tabela materiałów) i inkubować komórki przez kolejną 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Przenieś inkubowaną mieszaninę na inną płytkę. Zmierzyć absorbancję (OD) przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Oblicz żywotność komórki, korzystając z następującego wzoru: 
		Żywotność (%) = 100 × (OD próbki poddanej działaniu środka − OD pożywki)/(OD próbki kontrolnej − OD pożywki). 
		UWAGA: Minimalne stężenie zbliżone do IC50 definiuje się jako wysoką dawkę. Stężenie, przy którym proliferacja komórek zaczyna być hamowana, definiuje się jako stężenie niskiej dawki, a wartość pośrednią definiuje się jako stężenie średniej dawki dla kolejnych badań eksperymentalnych. W tym badaniu 400 μg/ml, 600 μg/ml i 800 μg/ml zastosowano jako niskie, średnie i wysokie dawki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Interwencja lekowa i pobieranie próbek 
	UWAGA: Wzrost komórek wykreślono w funkcji czasu, aby określić fazę logarytmiczną.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć logarytmiczne komórki A549 w fazie wzrostu do 5 x 105 komórek/ml. Dodaj 2 ml zawiesiny komórkowej do płytki 6-dołkowej i hoduj przez 12 godzin.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.3.3, aby uzyskać rozcieńczenia ekstraktu wodnego Trichosanthes-Fritillaria thunbergii w stężeniach 80 mg/ml, 60 mg/ml i 40 mg/ml PBS. Dodać 20 μl roztworu PBS, 20 μl ekstraktu wodnego Trichosanthes-Fritillaria thunbergii o stężeniu 40 mg/ml, 20 μl ekstraktu wodnego Trichosanthes-Fritillaria thunbergii o sile 60 mg/ml i 20 μl ekstraktu wodnego Trichosanthes-Fritillaria thunbergii o stężeniu 80 mg/ml do ślepej próby kontrolnej, grupy o niskim stężeniu, grupy o średnim stężeniu, i grupa o wysokim stężeniu. Po 24 godzinach interwencji należy odrzucić supernatant i trzykrotnie oczyścić komórki PBS. 
		UWAGA: Stężenia w ślepej próbie kontrolnej, grupie o niskim stężeniu, grupie o średnim stężeniu i grupie o wysokim stężeniu ekstraktu wodnego Trichosanthes-Fritillaria thunbergii wynosiły odpowiednio 0 μg/ml, 400 μg/ml, 600 μg/ml i 800 μg/ml.</li>
		<li>Dodać 250 μl buforu RIPA (zawierającego 1% PMSF i 1% inhibitora fosfatazy) do każdej studzienki i poddać komórki lizie przez 30 minut. Zebrać lizat do odwirowania (4 °C, 6,714 x g, 10 min) i otrzymać supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western blotting (zachodnia plama)
	<ol>
		<li>Wykryć stężenie białka w próbkach metodą BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj buforu RIPA, aby dostosować stężenie każdej próbki, aby było spójne.</li>
		<li>Zmieszać 40 μl próbki białka z 10 μl 5-krotnego buforu ładującego i gotować przez 5 minut w temperaturze 100 °C. Odwirować mieszaninę (4 °C, 6,714 x g, 10 min) w celu otrzymania supernatantu do dalszych doświadczeń.</li>
		<li>Wyizolować białka za pomocą elektroforezy żelowej przy użyciu elektroforezy pionowej 120 V.</li>
		<li>Przygotuj elektryczną "kanapkę" (gąbka - bibuła filtracyjna - żel - membrana PVDF - bibuła filtracyjna - gąbka). Zanurzyć aparat transferowy w łaźni lodowej i przenieść białko na membrany PVDF pod napięciem 70 V przez 60 minut.</li>
		<li>Użyj 100 ml roztworu TBST (0,05% [v/v] Tween-20, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) i 5 g odtłuszczonego mleka w proszku, aby skonfigurować 5% mleko. Wstępnie rozcieńczyć przeciwciała AKT i p-AKT rozcieńczalnikiem przeciwciał w stosunku 1:1,000.</li>
		<li>Zablokuj membranę PVDF w 5% odtłuszczonym mleku w proszku na 1 godzinę z potrząsaniem. Po zablokowaniu wyrzucić mleko blokujące i dodać rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe do inkubacji przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po usunięciu przeciwciała pierwszorzędowego należy użyć roztworu TBST, aby przemyć membranę PVDF pięć razy przez 5 minut każde.</li>
		<li>Wstępnie rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe rozcieńczalnikiem przeciwciał w stosunku 1:5 000. Dodać przeciwciało drugorzędowe i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1,5 godziny. Po usunięciu przeciwciała drugorzędowego należy użyć roztworu TBST do przemycia membrany PVDF pięć razy przez 5 minut każde.</li>
		<li>Wykryj białko za pomocą systemu detekcji chemiluminescencyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Dokowanie molekularne
<ol>
	<li>Otwórz bazę danych UniProt (https://www.uniprot.org)28. Wpisz symbole docelowe w polu wyszukiwania i kliknij przycisk SZUKAJ. W podtytule Struktura kliknij przycisk Pobierz, aby wyświetlić struktury 3D docelowych białek.</li>
	<li>Otwórz bazę danych RCSB PDB (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29. Wpisz nazwę makrocząsteczek białka w polu wyszukiwania. Pobierz struktury makrocząsteczek białek w formacie PDB.</li>
	<li>Pobierz pakiet instalacyjny oprogramowania UCSF Chimera 1.16 (https://vina.scripps.edu/) i AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/). Zainstaluj i otwórz oprogramowanie UCSF Chimera 1.16. Kliknij Plik > Otwórz, aby wyświetlić białko receptorowe.</li>
	<li>Kliknij Narzędzia > Edycji struktury > Przygotowanie doku i zaznacz Usuń rozpuszczalnik, Dodaj wodory i Dodaj ładunki w wyskakującym okienku, aby usunąć wodę i dodać ładunki uwodornienia i zrównoważenia. Kliknij Napisz plik Mol2, aby zapisać białko receptorowe w formacie mol2. Wykonaj ten sam krok na ligandzie.</li>
	<li>Kliknij Plik > Otwórz, aby wyświetlić ligand w formacie mol2 w oprogramowaniu UCSF Chimera 1.16. W narzędziu Tools > Surface/Binding Analysis > AutoDock Vina ustaw pasek receptora na nazwę białka receptora, a pasek liganda na nazwę liganda. Wprowadź wartość w polu za środkiem i rozmiarem, aby dostosować nowo utworzoną przestrzeń, co umożliwi pełne objęcie liganda i receptora.</li>
	<li>Kliknij OK, aby przeprowadzić wirtualne badanie przesiewowe dokowania molekularnego, aby uzyskać optymalną lokalizację do wiązania liganda z receptorem. Zapisz wartość energii wiązania w optymalnym położeniu.</li>
</ol>
4. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie statystyczne SPSS 26.0. Kliknij Plik> Importuj dane w celu załadowania danych.</li>
	<li>Przedstawić dane doświadczalne jako średnią ± odchylenie standardowe.</li>
	<li>Porównywanie wielu grup przy użyciu jednokierunkowego ANOVA. 
	UWAGA: P < 0,05 uznano za statystycznie istotne w tej pracy.</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Ogólnie rzecz biorąc, kompletne badanie farmakologiczne sieci obejmuje identyfikację składników aktywnych z baz danych, pozyskiwanie celów odpowiadających aktywnym składnikom i chorobom, budowę sieci lek-składnik-choroba-cel oraz przewidywanie głównych celów i ścieżek. Związek między składnikami aktywnymi a białkami rdzeniowymi (dokowanie molekularne) jest wstępnie przewidywany przez technologię komputerową, a ostateczna weryfikacja jest przeprowadzana za pomocą eksperymentu.
Wybór odpowiednic...

Rak płuc odnosi się do nowotworów złośliwych wywodzących się z błony śluzowej oskrzeli płuc, w tym raka płaskonabłonkowego, gruczolakoraka, raka wielkokomórkowego i raka drobnokomórkowego1. Gruczolakorak płuc (LUAD) jest najczęstszym typem raka płuc, stanowiącym około 40% wszystkich przypadków raka płuc2. Większość pacjentów jest diagnozowana w zaawansowanym stadium lub ma odległe przerzuty, a tym samym traci możliwość operacji3. W obecnym leczeniu klinicznym jednoczesna chemioradioterapia jest najczęstszą strategią leczenia LUAD, ale jej zastosowanie jest ograniczone ze względu na poważne działania niepożądane4.
Tradycyjna medycyna chińska (TCM) może skutecznie łagodzić objawy kliniczne u pacjentów z LUAD i zmniejszać działania niepożądane spowodowane radioterapią i chemioterapią, dzięki czemu stała się hotspotem badawczym5,6,7. W tradycyjnej medycynie chińskiej rak płuc należy do kategorii "nagromadzenia płuc" i "płuc skategory". Niedobór Qi i interakcja flegmy, zastoju i trucizny są ważne w patogenezie raka płuc. Dlatego tonizacja Qi oraz eliminacja flegmy i zastoju krwi są głównymi metodami leczenia klinicznego8 metod raka płuc zgodnie z teorią TCM9. Trichosanthes kirilowii (Trichosanthes kirilowii) Maxim (Gualou) i Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) reprezentują powszechną parę leków w leczeniu raka płuc, a ta kombinacja ma wpływ na usuwanie ciepła i redukcję flegmy10,11,12. Jednak jego mechanizm działania jest nadal niejasny i konieczne jest przeprowadzenie dalszych badań.
Farmakologia sieciowa to kompleksowa metoda oparta na teorii biologii systemów i farmakologii wielokierunkowej, która ma na celu ujawnienie złożonych relacji sieciowych między wieloma lekami i chorobami13. Tradycyjne chińskie recepty charakteryzują się tym, że są wieloskładnikowe i wielocelowe, co oznacza, że są bardzo odpowiednie do badań farmakologicznych sieci14,15. Ostatnio farmakologia sieciowa stała się potężnym podejściem do badania formuł TCM i stała się hotspotem badawczym16,17.
Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, wszystkie badania nad farmakologią sieciową są przedstawione jako tekst. Zaprezentowanie tej technologii za pomocą wideo znacznie obniży próg uczenia się i ułatwi promocję tej technologii, co jest jedną z zalet tego artykułu. W tym badaniu wzięliśmy Trichosanthes-Fritillaria thunbergii przeciwko gruczolakorakowi płuc jako przykład w celu przeprowadzenia przewidywania farmakologii sieciowej i walidacji eksperymentalnej.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>A549&nbsp; linia komórkowa</td><td>Procell</td><td>CL-0016</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało AKT</td><td>CST</td><td>4691S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Solarbio</td><td>PC0020</td><td></td></tr><tr><td>System detekcji chemiluminescencji</td><td>Szanghaj Qinxiang Fabryka instrumentów naukowych</td><td>ChemiScope 6100</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM)</td><td>Solarbio</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL)&nbsp;</td><td>ABclonal</td><td>RM00021</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ScienCell</td><td>0025</td><td></td></tr><tr><td>HRP Koza Anty-Królicza IgG (H+L)</td><td>ABklonalny</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy MTS</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>p-AKT</td> przeciwciało <td>CST</td><td>6040S</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>C14-15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>Solarbio</td><td>P0100</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor fosfatazy</td><td>Beyotime</td><td>P1081</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Membrany z polifluorku winylidenu (PVDF)</td><td>Milipore</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>roztwór do lizy RIPA</td><td>Solarbio</td><td>R0010</td><td></td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory</td><td>RE52CS-1</td><td></td></tr><tr><td>Próżniowy mechanizm liofilizacji</td><td>Ningbo Scientz Biotechnology</td><td>SCIENTZ-10</td><td></td></tr> <tr><td>i beta;-aktyna</td><td>przeciwciało ABclonal</td><td>AC026</td><td></td></tr></tbody></table>

przewidywanie farmakologii sieciowej i eksperymentalna walidacja mechanizmu działania trichosanthes-fritillaria thunbergii przeciwko gruczolakorakowi płuc

Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma

Naszym celem było zbadanie mechanizmu działania Trichosanthes-Fritillaria thunbergii w leczeniu gruczolakoraka płuc (LUAD) w oparciu o farmakologię sieciową i weryfikację eksperymentalną. Skuteczne składniki i potencjalne cele Trichosanthis i Fritillaria thunbergii zebrano za pomocą wysokoprzepustowej bazy danych eksperymentów i badań referencyjnych (HERB) tradycyjnej medycyny chińskiej oraz bazy danych podejścia zespołowego podobieństwa (SEA), a cele związane z LUAD zostały odpytane przez bazy danych GeneCards i Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Sieć leków-komponentów-chorób-celów została skonstruowana przez oprogramowanie Cytoscape. Przeprowadzono analizę sieci interakcji białko-białko (PPI), funkcji ontologii genów (GO) oraz analiz wzbogacania szlaków encyklopedii genów i genomów z Kioto (KEGG) w celu uzyskania podstawowych celów i kluczowych szlaków. Do późniejszej walidacji eksperymentalnej wykorzystano wodny ekstrakt z komórek Trichosanthes-Fritillaria thunbergii i A549. Za pomocą bazy danych HERB i przeszukania literatury przebadano 31 skutecznych związków i 157 potencjalnych genów docelowych Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, z których 144 były celami regulatorowymi Trichosanthes-Fritillaria thunbergii w leczeniu gruczolakoraka płuc. Analiza funkcjonalnego wzbogacenia GO wykazała, że mechanizm działania Trichosanthes-Fritillaria thunbergii przeciwko gruczolakorakowi płuc polega głównie na fosforylacji białek. Analiza wzbogacenia szlaku KEGG sugeruje, że leczenie gruczolakoraka płuc przez Trichosanthes-Fritillaria thunbergii obejmuje głównie szlak sygnałowy PI3K/AKT. Walidacja eksperymentalna wykazała, że wodny ekstrakt Trichosanthes-Fritillaria thunbergii może hamować proliferację komórek A549 i fosforylację AKT. Za pomocą farmakologii sieciowej i walidacji eksperymentalnej zweryfikowano, że szlak sygnałowy PI3K/AKT odgrywa istotną rolę w działaniu Trichosanthes-Fritillaria thunbergii w leczeniu gruczolakoraka płuc.

Zidentyfikowano łącznie 31 aktywnych składników związanych z Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, w tym 21 składników Trichosanthes i 10 składników Fritillaria thunbergia, a także 144 odpowiadające im cele. W sumie z bazy danych GeneCards i bazy danych OMIM wyekstrahowano odpowiednio 9 049 i 67 genów związanych z LUAD. Po usunięciu duplikatów zidentyfikowano 9 057 genów związanych z LUAD. W celu uzyskania potencjalnych celów terapeutycznych wyznaczono część wspólną genów związanych z LUAD oraz...

To badanie ujawnia mechanizm działania Trichosanthes-Fritillaria thunbergii w leczeniu gruczolakoraka płuc na podstawie farmakologii sieciowej i weryfikacji eksperymentalnej. Badanie wykazało również, że szlak sygnałowy PI3K/AKT odgrywa istotną rolę w działaniu Trichosanthes-Fritillaria thunbergii w leczeniu gruczolakoraka płuc.

Przewidywanie farmakologii sieciowej i eksperymentalna walidacja mechanizmu działania Trichosanthes-Fritillaria thunbergii przeciwko gruczolakorakowi płuc

We aimed to study the mechanism of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii in treating lung adenocarcinoma (LUAD) based on network pharmacology and ...

Tradycyjna medycyna chińska, Porozmawiamy o cechach wieloskładnika celu. To jest bardzo podstawowe pole dla badań sieciowych i biologicznych. Przeprowadziliśmy demonstrację technologii, która obniży próg.Farmakologia sieciowa jest systematyczną technologią analityczną, buduje narzędzia interakcji pracy sieciowej wielu czynników. Może skutecznie przewidzieć pojedynczą ścieżkę Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Dane Network Pharmacological pochodzą z bazy danych, chociaż nie może przewidzieć związku z lekami, białkami, a to i tak musi zostać zweryfikowane przez kolejne eksperymenty. Aby rozpocząć, otwórz bazę danych HERB i użyj Gua Liu i Zhebimu jako słów kluczowych, aby uzyskać składniki tych dwóch leków.Pobierz listę i kanoniczną strukturę SMILES powiązanych składników obu leków. Teraz określ, czy otrzymany składnik jest aktywny, włączając składniki o biodostępności po podaniu doustnym i wartościach podobnych do leku w bazie danych grupy HERB. Jeśli składnik nie ma biodostępności po podaniu doustnym i wartości podobnych do leku, wprowadź go do szwajcarskiej bazy danych ADME, aby uzyskać informacje o każdym składniku.Uwzględnij składniki o wysokim wchłanianiu IG i co najmniej dwóch wartościach podobnych do leku jako składniki aktywne. Aby przewidzieć cel aktywnych składników, otwórz bazę danych HERB. Wyszukaj i skopiuj kanoniczne struktury SMILES aktywnych składników.Następnie otwórz podejście zespołu podobieństwa i wklej kanoniczne struktury SMILES aktywnych komponentów w polu wyszukiwania. Kliknij na try SEA', aby uzyskać klucz docelowy, nazwę docelową, wartość P i maksymalny TC każdego aktywnego komponentu. Skopiuj dane do arkusza kalkulacyjnego i użyj funkcji filtrowania plików arkusza kalkulacyjnego, aby przefiltrować cele aktywnych komponentów według klucza docelowego.Skopiuj wszystkie cele do arkusza kalkulacyjnego i usuń duplikaty, aby uzyskać cele leków. Teraz otwórz bazę danych kart genowych i online dziedziczenie mendlowskie u człowieka, aby przewidzieć cele choroby. Użyj Gruczolakorak płuc'jako słowo kluczowe, aby uzyskać cele chorobowe gruczolakoraka płuc.Pobierz arkusze kalkulacyjne z celami choroby i usuń powtarzające się cele, aby uzyskać cele gruczolakoraka płuc. Skonstruuj sieć docelową choroby składnika leku, kopiując cele związane z gruczolakorakiem płuc i cele leków do tej samej kolumny w nowym arkuszu kalkulacyjnym. Użyj funkcji identyfikacji duplikatów danych na pasku narzędzi, aby uzyskać cele przecięcia celów związanych z gruczolakorakiem płuc i celów związanych z aktywnym komponentem Trichosanthes Fritillaria Thunbergia.Otwórz Cytoscape 3.8.0. Kliknij plik na pasku menu i wybierz import. Po nim sieć z pliku.Aby zaimportować plik arkusza kalkulacyjnego, zoptymalizuj rozmiar i kolor węzłów sieci za pomocą paska stylów w lewym panelu sterowania. Użyj funkcji analizuj sieć do analizy topologii sieci. Kliknij narzędzia na pasku menu i wybierz analizuj sieć.W panelu tabeli kliknij stopień na pasku tytułu, aby ułożyć komponenty według stopnia w kolejności malejącej. Weź 10 najważniejszych składników i celów jako główne aktywne składniki i podstawowe cele. Skonstruowanie sieci PPI i badanie przesiewowe białek rdzeniowych.Otwórz bazę danych ciągów i wklej listę w formacie tekstowym potencjalnych celów Trichosanthes Fritillaria Thunbergia, przeciwko gruczolakorakom płuc w oknie dialogowym listy. Następnie wybierz homosapiens w organizmach. Kliknij przycisk wyszukiwania i wybierz przycisk Kontynuuj, gdy wyniki będą dostępne, kliknij ustawienia I zaznacz opcję wysoki poziom ufności 0,700 W ustawieniach podstawowych, w obszarze minimalny wymagany wynik interakcji, zaznacz wysokie rozłączone węzły w sieci, w ustawieniach zaawansowanych.Następnie kliknij przycisk aktualizacji. Następnie kliknij eksporty w pasku tytułu i pobierz krótki tekst tabelaryczny relacji PPI w formacie TSV. Otwórz Cytoscape 3.8.0.Kliknij plik, wybierz, zaimportuj, a następnie sieć z pliku, aby zaimportować plik w formacie TSV do analizy wizualnej. Użyj funkcji analizatora sieci, aby przeprowadzić analizę topologiczną. Zoptymalizuj rozmiar i kolor węzłów sieci za pomocą paska stylów w lewym panelu sterowania.Przeprowadź analizę wzbogacenia KEGG, otwierając platformę Medscape, wklejając listę potencjalnych celów terapeutycznych w formacie tekstowym do okna dialogowego, a następnie klikając przycisk prześlij. Zaznacz Homo sapiens zarówno w danych wejściowych jako gatunek", jak i analizie jako gatunek", a następnie kliknij przycisk analizy niestandardowej. Wybierz opcję wzbogacanie.Zaznacz tylko ścieżkę KEGG, a następnie kliknij na analizę wzbogacenia. Gdy pasek postępu osiągnie 100%kliknij pomarańczowy przycisk na stronie raportu z analizy, aby wyświetlić wyniki wzbogacania. Kliknij wszystko w jednym pliku zip", aby pobrać wynik wzbogacania, a następnie otwórz plik csv _FINAL_GO w folderze Enrichment_GO, aby uzyskać wynik.Otwórz R-Software i wpisz pakiet instalacyjny GG plot two'i bibliotekę GG Plot two'w R Do instalacji pakietu GG plot two R. Naciśnij Enter, aby uruchomić program KEGG Visualization. Aby wykryć żywotność komórek, trawić logarytmiczne komórki fazy wzrostu A 549 za pomocą jednego mililitra 0,25% trypsyny przez jedną minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Dodaj jeden mililitr DMEM Complete Medium, aby zneutralizować trypsynę i delikatnie ją przedmuchnąć, aby przyspieszyć wydalanie komórek. Następnie odwirować mieszaninę, aby uzyskać osad komórkowy i ponownie zawiesić otrzymane komórki za pomocą DMEM Complete Medium. Dodaj zawiesinę komórek do hemocytometru i policz za pomocą automatycznego licznika komórek, rozcieńczyć ją pięć razy 10 do czwartej komórki na mililitr, używając kompletnej pożywki DMEM Teraz rozpuść jeden gram ekstraktu wodnego Trichosanthes Fritillaria Thunbergia w 10 mililitrach PBS i przefiltruj go przez filtr 0,22 mikrometra.Rozcieńczyć mieszaninę do różnych stężeń za pomocą PBS. Umieść 100 mikrolitrów rozcieńczonych komórek w każdym dołku na 96-dołkowej płytce. Po przyleganiu komórek dodaj jeden mikrolitr ekstraktów wodnych Trichosanthes Fritillaria Thunbergia o różnych stężeniach, aby dostosować stężenie każdej studzienki.Wyrzuć oryginalną pożywkę po 24 godzinach hodowli i dodaj 100 mikrolitrów DMEM. Podłoże podstawowe do dalszej inkubacji przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji dodaj 20 mikrolitrów roztworu MTS i inkubuj komórki przez kolejną godzinę.Przenieś inkubowaną mieszaninę na inną płytkę. Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz chłonność przy długości fali 490 nanometrów i oblicz żywotność komórek. Rozcieńczyć logarytmiczną fazę wzrostu A 549 komórek pięć razy 10 do piątych komórek na mililitr.Dodaj dwa mililitry zawiesiny komórkowej do płytki sześciodołkowej i hoduj przez 12 godzin. Po uzyskaniu różnych rozcieńczeń PBS ekstraktu wodnego Trichosanthes Fritillaria Thunbergia, jak wykazano wcześniej, dodać 20 mikrolitrów roztworu PBS do ślepej próby kontrolnej i 20 mikrolitrów różnych rozcieńczeń ekstraktu wodnego Trichosanthes Fritillaria Thunbergia do różnych grup stężeń. Po 24 godzinach od interwencji wyrzucić supernatant i trzykrotnie oczyścić komórki PBS.Dodaj 250 mikrolitrów buforu RIPA do każdej studzienki i poddaj komórki lizie przez 30 minut. Zebrać lizat do odwirowania i uzyskać supernatant. Przedstawiono sieć docelowych interakcji składnika leku Trichosanthes Fritillaria Thunbergia z gruczolakorakiem płuc.W sieci interakcji, 10 najlepszych otrzymanych składników aktywnych to kluczowe składniki aktywne działania Trichosanthes Fritillaria Thunbergia w leczeniu gruczolakoraka płuc. Sieć PPI obejmowała 122 funkcjonalne białka i 210 relacji interakcji. 10 najważniejszych białek rdzeniowych bierze udział głównie w neowaskularyzacji, proliferacji komórek, apoptozie i transporcie błony komórkowej.Spośród 20 najważniejszych szlaków uszeregowanych przez KEGG, szlak sygnałowy PI3K-AKT, szlak sygnałowy Rap1, szlak sygnałowy fosfolipazy-D i szlak sygnałowy MAPK1 są ściśle związane z rakiem płuc, wśród których szlak PI3K-AKT zajął pierwsze miejsce. Ekstrakty Trichosanthes Fritillaria Thunbergia w stężeniach powyżej 400 mikrogramów na mililitr mogły hamować proliferację komórek, a efekt hamowania na komórki A-549 w stężeniach do 800 mikrogramów na mililitr był bliski połowie stężenia hamującego. Interwencja ekstraktów Trichosanthes Fritillaria Thunbergia nie spowodowała istotnych zmian w ekspresji białka AKT w żadnej z grup.Jednak ekspresja p-AKT seryny-473 była zahamowana i wykazywała efekt zależny od dawki. Krytyczne składniki Trichosanthes Fritillaria Thunbergia były molekularnie dokowane z kluczowymi białkami szlaku PI3K AKT, a wyniki sugerowały, że energie wiązania Diosmetiny i Kaempferolu z AKT1 były mniejsze niż minus siedem, co wskazuje na silną aktywność wiązania. Najważniejszą rzeczą jest osiągnięcie składników aktywnych zgodnie z celami Tradycyjnej Medycyny Chińskiej.A także cele, których celem jest rdzeń Network Pharmacological.

network-pharmacology-prediction-experimental-validation-trichosanthes

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) model raka płuc oparty na biologicznym rusztowaniu kolagenowym do badania wrażliwości na terapie ukierunkowane na niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC). Pokazujemy różne techniki odczytu w celu określenia wskaźnika proliferacji, apoptozy i stanu przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT). Zebrane dane są integrowane z modelem in silico w celu przewidywania wrażliwości leków.

Połączony model tkankowy 3D guza płuca wykonany in vitro/in silico do przewidywania skuteczności leków w określonych tłach mutacyjnych

Obecny protokół opisuje zintegrowaną strategię badania kluczowych celów i mechanizmów Fructus Phyllanthi przeciwko hiperlipidemii w oparciu o przewidywania farmakologiczne sieci i weryfikację metabolomiczną.

Sieciowa farmakologia, przewidywanie i metabolomika: walidacja mechanizmu działania Fructus Phyllanthi przeciwko hiperlipidemii

Ten manuskrypt opisuje procedury operacyjne i środki ostrożności mające na celu zbadanie potencjalnych powszechnych mechanizmów patogennych łączących pierwotny zespół Sjögrena z gruczolakorakiem płuc poprzez analizę bioinformatyczną i weryfikację eksperymentalną.

Pierwotny zespół Sjögrena związany z gruczolakorakiem płuc: badanie potencjalnych powszechnych mechanizmów patogennych i weryfikacja eksperymentalna

W badaniu tym oceniono skuteczność przeciwdepresyjną Qiangzhifang w szczurzym modelu przewlekłej depresji wywołanej stresem ograniczającym i wyjaśniono jego wpływ regulacyjny na szlaki HIF-1 i JAK-STAT za pomocą farmakologii sieciowej i analizy dokowania molekularnego.

Farmakologia sieciowa i walidacja mechanizmów przeciwdepresyjnych Qiangzhifang w modelu szczura depresji wywołanej przewlekłym stresem

Przedstawiono testy rozlanego hamującego kontroli nocyceptywnej, sumowania czasowego oraz hiperalgezji ran u pacjentek położniczych. Testy te oceniają hamujące i pobudzające mechanizmy przetwarzania bólu i są tutaj wykorzystywane do oceny endogennej analizji w różnych momentach ciąży oraz w okresie okołoporodowym, aby pomóc w określeniu indywidualnego ryzyka wystąpienia bólu przewlekłego.

Paradygmat eksperymentalny do przewidywania bólu pooperacyjnego (PPOP)

Eksperymentalne nosicielstwo ludzkiej pneumokoki oferuje naturalny model nosicielstwa i potencjalny model do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek. Technika ta jest cenna, ale złożona i wiąże się z ryzykiem klinicznym związanym z wprowadzeniem patogenu do organizmu człowieka. Opracowaliśmy szczegółowy protokół.

Eksperymentalny nosiciel pneumokoków u ludzi

Protokół ten opisuje, jak używać ilościowego PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (QRT-PCR) do wykrywania mRNA specyficznego dla komórek nowotworowych reprezentującego przerzuty w tkance płucnej myszy.

Ocena przerzutów do płuc w modelach guza sutka myszy za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Opisujemy algorytm kliniczny, oparty na dziesięcioleciach doświadczenia w diagnozowaniu i chirurgicznym leczeniu ludzkiego zapalenia stawów kręgosłupa w największym centrum medycznym chińskiego obszaru pasterskiego Xinjiang.

Diagnostyka i leczenie operacyjne ludzkiego zapalenia stawów kręgosłupa brucelarnego

Obecne badanie pokazuje ustanowienie trzech różnych modeli dawstwa płuc (dawstwo po śmierci mózgu, dawstwo po śmierci krążeniowej i dawstwo po wstrząsie krwotocznym). Porównuje procesy zapalne i zaburzenia patologiczne związane z tymi zdarzeniami.

Badanie eksperymentalnych modeli dawstwa narządów do przeszczepu płuc

Odkryj mechanizm działania Trichosanthes-Fritillaria thunbergii przeciwko gruczolakorakowi płuc z wykorzystaniem farmakologii sieciowej i weryfikacji eksperymentalnej. Badanie wykazuje rolę szlaku PI3K/AKT.

Przewidywanie farmakologii sieciowej i eksperymentalna walidacja mechanizmu działania Trichosanthes-Fritillaria thunbergii przeciwko gruczolakorakowi płuc (Wideo) | JoVE Journal

Przewidywanie farmakologii sieciowej i eksperymentalna walidacja mechanizmu działania Trichosanthes-Fritillaria thunbergii przeciwko gruczolakorakowi płuc

Przeglądaj więcej filmów