Name: Metoda hodowli 3D sferoid embrionalnych i wątrobowych linii komórkowych danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę hodowli 3D sferoid z linii komórkowych danio pręgowanego ZEM2S i ZFL. Protokół umożliwia szybkie generowanie jednolitych kul komórkowych do badań toksyczności chemikaliów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pamięci dr Márcio Lorenciniego, współautora tej pracy, doskonałego badacza w dziedzinie kosmetyków i oddanego promowaniu badań kosmetycznych w Brazylii. Autorzy są wdzięczni Laboratorium Wielozadaniowemu na Wydziale Fizjologii (UFPR) za dostępność sprzętu oraz za wsparcie finansowe Koordynacji na rzecz Doskonalenia Kadr Szkolnictwa Wyższego (CAPES, Brazylia) (Kod Finansowy 001) i Grupo Boticário.

Kluczowe etapy generowania sferoidów 3D z linii komórkowych ZFL i ZEM2S w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem przedstawiono na Rysunku 1.
UWAGA: Szczegóły dotyczące wszystkich materiałów użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów, a roztwory i pożywki hodowlane użyte w tym protokole w Tabeli 1.
1. Pożywka do hodowli komórkowych i hodowle monolayerowe
<ol>
	<li>Hodować obie linie komórkowe (ZFL, ZEM2S) jako monowarstwy w inkubatorze w temperaturze 28 °C bez CO2, a następnie pasażować w stosunku 1:3 po osiągnięciu przez nie ~80% konfluencji.
	<ol>
		<li>Zacząć od kolby T75 z komórkami ryb zebrafish przy konfluencji ~80%, hodowanymi zgodnie z powyższym opisem.</li>
		<li>Usunąć pożywkę kompletną i przemyć komórki, dodając do kolby hodowlanej za pomocą pipety 1x roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS) (0.01 M).</li>
		<li>Za pomocą pipety dodać do kolb hodowlanych 3 mL 1x trypsyny-0,5 mM EDTA (0,05% [v/v]) i inkubować w 28 °C przez 3 min w celu odklejenia komórek od ścianek kolby.</li>
		<li>Delikatnie opukać kolbę, aby uwolnić komórki, a następnie zatrzymać trawienie trypsyną poprzez dodanie do kolby 3 mL kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Za pomocą pipety przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mL i wirować przy 100 × g przez 5 min.</li>
		<li>Po utworzeniu osadu ostrożnie usunąć nadsącz, dodać 1 mL pożywki kompletnej dla odpowiedniej używanej linii komórkowej (ZFL lub ZEM2S) i resuspender za pomocą mikropipety. Pobrać alikwot do zliczenia komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Liczenie komórek z użyciem testu wykluczania barwnika trypanu błękitnego
<ol>
	<li>Do mikroprobówki należy dodać 10 µL zawiesiny komórkowej oraz 10 µL barwnika trypan blue w celu policzenia komórek i oceny ich żywotności. Zawiesinę komórkową i barwnik należy wymieszać za pomocą pipety.</li>
	<li>Następnie 10 µL tej mieszaniny (zawiesina komórkowa + trypan blue) należy przenieść do komory Neubauera i policzyć komórki w czterech dużych polach (kwadrantach: Q) znajdujących się w narożnikach komory, uznając za żywe te komórki, które nie przyjęły barwnika trypan blue. Liczbę żywych komórek należy obliczyć zgodnie z równaniem (1): 
	<img alt="Równanie liczby komórek, ΣQ/4 × 10⁴, schemat formuły do analizy ilościowej." src="/files/ftp_upload/64859/64859eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">     (1)</li>
	<li>Aby obliczyć końcową liczbę komórek w zawiesinie, liczbę komórek wyznaczoną za pomocą równania (1) należy pomnożyć przez 2 (czynnik rozcieńczenia wynikający z zastosowania trypan blue). 
	UWAGA: Alternatywnie można zastosować automatyczny system liczenia komórek.</li>
</ol>
3. Wysiewanie komórek na płytki ULA
<ol>
	<li>Po obliczeniu liczby komórek, dostosuj zawiesinę komórkową tak, aby nanieść 200 µL zawiesiny na każdą studzienkę 96-dołkowej płytki ULA o okrągłym dnie, zachowując liczbę komórek wymaganą dla każdej linii komórkowej, zgodnie z poniższymi wytycznymi:
	<ol>
		<li>Nanieś 7 000 żywych komórek ZFL na studzienkę; zatem dla całej płytki ULA wykorzystaj 700 000 komórek w 20 mL pożywki kompletnej.</li>
		<li>Nanieś 3 500 żywych komórek ZEM2S na studzienkę; zatem dla całej płytki ULA wykorzystaj 350 000 komórek w 20 mL pożywki kompletnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj zawiesinę komórkową o dostosowanym stężeniu komórek w zbiorniku na pożywkę i wymieszaj ją za pomocą mikropipety wielokanałowej, dbając o to, aby nie powstała piana ani pęcherzyki powietrza. Używając mikropipety wielokanałowej, dodaj 200 µL dostosowanej zawiesiny komórkowej do każdej studzienki płytki ULA. 
	UWAGA: Płytkę należy uszczelnić parafilmem lub samoprzylepną folią uszczelniającą, aby zapobiec odparowywaniu pożywki hodowlanej z 96-dołkowej płytki.</li>
</ol>
4. Formowanie sferoidów
<ol>
	<li>Inkubuj płytkę ULA na wytrząsarce orbitalnej przy 70 rpm przez 5 dni w inkubatorze w temperaturze 28 °C. Pozostaw sferoidy do uformowania się podczas 5 dni wytrząsania orbitalnego (Rysunek 2), aż osiągną średnią średnicę ~225 µm (sferoidy ZFL) i ~226 µm (sferoidy ZEM2S)12. 
	UWAGA: Sferoidy są gotowe do użycia po 5 dniach inkubacji (maksymalna kolistość).</li>
	<li>Aby utrzymać sferoidy w kulturze przez więcej niż 5 dni, usuwaj 100 µL zużytej pożywki co 5 dni i dodawaj 100 µL świeżej pełnej pożywki hodowlanej za pomocą wielokanałowej mikropipety. 
	​UWAGA: Należy uważać, aby nie odessać sferoidów podczas tego procesu.</li>
</ol>
5. Pomiar rozmiaru (średnicy) i kształtu (wskaźnika kolistości) sferoidów
<ol>
	<li>Należy przeprowadzić akwizycję obrazów.
	<ol>
		<li>Za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego z systemem akwizycji obrazu należy wykonać zdjęcie o określonej skali. 
		UWAGA: Należy użyć preparatu kalibracyjnego do okularu mikroskopu lub komory Neubauera (w której znane są rozmiary pól) w celu wyznaczenia skali.</li>
		<li>Pod mikroskopem, używając tego samego obiektywu, który posłużył do wykonania zdjęcia skali, należy wykonać zdjęcia w pełni uformowanych sferoidów (tj.., 5-dniowe sferoidy). 
		UWAGA: Wszystkie obrazy muszą zostać wykonane przy użyciu tego samego systemu obrazowania, ponieważ rozdzielczość obrazu ma istotne znaczenie dla określenia wielkości i kształtu sferoidów, a może ona różnić się w zależności od rodzaju zastosowanego systemu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw skalę.
	<ol>
		<li>Za pomocą oprogramowania ImageJ otwórz obraz o zdefiniowanej skali (kliknij Plik | otwórz).</li>
		<li>Wybierz selektor liniowy z paska narzędzi przeciągnij myszką linię wzdłuż długości zdefiniowanej skali na obrazie.</li>
		<li>Ustaw skalę, wybierając Analizuj | Ustaw skalęi należy poczekać na Ustawienie skali otworzyć okno.</li>
		<li>W Ustawienie skali okno, uzupełnij lukę w Znana odległość przy znanej odległości (µm) odpowiadający linii prostej; wypełnij Jednostka długości z Hm dla µmKliknij Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.. 
		UWAGA: Skala w pikselach/µm jest wyświetlane na dole okna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw parametry pomiarowe.
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu ImageJ wybierz Analiza | Ustawienia pomiarów aby otworzyć Ustawienie pomiarów okno</li>
		<li>W Ustawienia pomiarów oknie zaznacz pola odpowiadające pożądanym pomiarom (t.j. Obszar i Kształt deskryptory). Kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznacz średnicę oraz kolistość sferoidów.
	<ol>
		<li>Otwórz zdjęcie sferoidu (Plik | Otwórz).</li>
		<li>Wybierz narzędzie do zaznaczania swobodnego na pasku narzędzi a następnie, używając myszy, zaznacz zewnętrzną stronę sferoidu, jak pokazano w Rysunek 3A. 
		UWAGA: Aby przybliżyć lub oddalić obraz, naciśnij klawisz Ctrl i użyj kółka myszy, przesuwając je w dół lub w górę, lub naciśnij Kontrola klawisz i użyj klawiszy strzałek w górę lub w dół na klawiaturze.</li>
		<li>Wybierz Analiza | Pomiar aby otworzyć Wyniki okno, w którym wyświetlane są wartości pomiarowe.</li>
		<li>Korzystając z Obszar wartość, oblicz rozmiar (średnicę) sferoidów, korzystając z równania (2): 
		<img alt="Wzór na średnicę koła: \(d = \sqrt{\frac{\text{Pole}}{\pi}} \times 2\); algebra geometryczna." src="/files/ftp_upload/64859/64859eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">     (2)</li>
		<li>Wskaźnik kolistości jest podawany w oknie Wyniki (Results) jako „Circ.” i jest automatycznie obliczany przez oprogramowanie zgodnie z równaniem (3): 
		<img alt="Wzór na zwartość kształtu, \(4\pi \times \frac{\text{Pole}}{\text{Obwód}^2}\), równanie matematyczne." src="/files/ftp_upload/64859/64859eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3">     (3) 
		UWAGA: Wskaźnik kolistości równy 1,0 oznacza idealny kształt sferoidalny, natomiast wartość bliska 0,0 wskazuje na kształt wydłużony13.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research.+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
<li>Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+more+representative+in+vitro+method+for+fish+ecotoxicology%3A+morphological+and+biochemical+characterisation+of+three-dimensional+spheroidal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes.</a> Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).</li>
<li>Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+hepatocyte+spheroids+-+A+powerful+%28though+underexplored%29+alternative+in+vitro+model+to+study+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470(2022).</li>
<li>Baron, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmaceutical+metabolism+in+fish%3A+using+a+3-D+hepatic+in+vitro+model+to+assess+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance.</a> PloS One. 12 (1), 0168837(2017).</li>
<li>Langan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+size+does+not+impact+metabolism+of+the+%CE%B2-blocker+propranolol+in+3D+intestinal+fish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 947(2018).</li>
<li>Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+three-dimensional+%283D%29+spheroid+cultures+of+the+continuous+rainbow+trout+liver+cell+line+RTL-W1%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).</li>
<li>Jeong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+CBZ-induced+catalysis+and+cytochrome+gene+expression+in+three+dimensional+zebrafish+liver+cellculture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+and+Analytical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture.</a> Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161(2016).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720(2011).</li>
<li>Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hollow+sphere+soft+lithography+approach+for+long-term+hanging+drop+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>de Souza, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+3D+cultures+of+zebrafish+liver+and+embryo+cell+lines%3A+a+comparison+of+different+spheroid+formation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods.</a> Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22ImageJ%2FFiji%22%5BJournal%5D)">ImageJ user guide.</a> ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).</li>
<li>Guidony, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+proteins+activity+and+cytotoxicity+in+zebrafish+hepatocytes+exposed+to+triclosan%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan.</a> Environmental Pollution. 271, 116368(2021).</li>
<li>da Silva, N. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+goethite+in+the+effects+of+glyphosate+and+Roundup%C2%AE+on+ZFL+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line.</a> Toxicology In Vitro. 65, 104755(2020).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+is+a+key+factor+influencing+the+invasion+and+proliferation+of+Toxoplasma+gondii+in+fish+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells.</a> Experimental Parasitology. 217, 107966(2020).</li>
<li>Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+induced+by+glyphosate+and+glyphosate-based+herbicides+in+the+zebrafish+hepatocyte+cell+line+%28ZF-L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L).</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).</li>
<li>Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+water+soluble+fraction+of+gasoline+on+ZFL+cell+line%3A+Cytotoxicity%2C+genotoxicity+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress.</a> Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).</li>
<li>Morozesk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+multiwalled+carbon+nanotubes+co-exposure+with+cadmium+on+zebrafish+cell+line%3A+Metal+uptake+and+accumulation%2C+oxidative+stress%2C+genotoxicity+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892(2020).</li>
<li>Dognani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofibrous+membranes+for+low-concentration+Cr+VI+adsorption%3A+kinetic%2C+thermodynamic+and+the+influence+on+ZFL+cells+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability.</a> Materials Research. , 24(2021).</li>
<li>ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/crl-2147">https://www.atcc.org/products/crl-2147</a> (2022).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187(2016).</li>
<li>Gajski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxic+potential+of+selected+cytostatic+drugs+in+human+and+zebrafish+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research+International%22%5BJournal%5D)">Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells.</a> Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).</li>
<li>Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effects+of+octocrylene+on+zebrafish+larvae+and+liver+cell+line+%28ZFL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL).</a> Aquatic Toxicology. 236, 105843(2021).</li>
<li>Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+determination+of+oxygen+consumption+rates+and+diffusion+coefficients+in+multicellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids.</a> Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).</li>
<li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability%2C+spheroid+size%2C+and+hepatocellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).</li>
<li>Ho, R. K., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+of+cell+fate+in+the+early+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo.</a> Science. 261 (5117), 109-111 (1993).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocadherin-19+and+N-cadherin+interact+to+control+cell+movements+during+anterior+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).</li>
<li>Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cultures+from+zebrafish+embryos+and+adult+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+transcriptome+characterization+of+model+zebrafish+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines.</a> Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Jest to prosta, łatwa i szybka metoda generowania sferoid linii komórkowych wątroby i zarodka danio pręgowanego. Metoda ta została opracowana przez tę grupę w oparciu o modyfikacje istniejących metod sferoidów 3D w celu przezwyciężenia problemów zgłaszanych w badaniach naukowych związanych z powstawaniem sferoidów, a także niepewności co do dokładności danych z testów sferoidalnych 3D. Na przykład zgłaszane problemy dotyczą trudności w obsłudze, czasochłonności generowania sferoid, konieczności doboru sferoid o podobnej ...

Sferoidy to małe kule komórek, które powstają, gdy komórki są hodowane w bliskim kontakcie międzykomórkowym w hodowli 3D. Zdolność sferoid do naśladowania środowiska tkankowego in vivo została już zbadana w różnych liniach komórkowych i komórkach pierwotnych1,2. Jednakże, mimo że sferoidy są dobrze rozwinięte do badań toksyczności dla ssaków, rozwój sferoid do badań toksyczności na kręgowcach innych niż ssaki (np. ryby) jest nadal w toku3. W przypadku linii komórkowych ryb sferoidy zostały opracowane przy użyciu wielu różnych metod, takich jak wytrząsanie orbitalne (OS) przy użyciu różnych typów płytek studzienkowych3,4,5,6,7, oraz metoda lewitacji magnetycznej za pomocą nanocząstek magnetycznych8. Jednak niektóre z tych metod hodowli sferoidów mogą mieć więcej wad niż inne.
Na przykład, metody gyratory na dużych mikropłytkach (płytki 24-dołkowe) mogą generować dużą liczbę sferoid różniących się wielkością i kształtem; w rzeczywistości wykazano tworzenie struktur wielosferoidalnych7. Wymaga to intensywnych wysiłków, aby ręcznie wybrać sferoidy o podobnym rozmiarze i kształcie do eksperymentu. Metoda hodowli 3D wiszącej kropli jest powszechnie stosowana do generowania sferoid linii komórkowych ssaków1,2,9,10,11, dzięki czemu można wygenerować pojedyncze sferoidy na kroplę, unikając problemów opisanych powyżej. Jednakże, chociaż zmodyfikowana metoda wiszącego spadku (wisząca kropla + wytrząsanie orbitalne) jest w stanie wygenerować sferoidy ZFL przy użyciu niedrogiej metody, ma swoje wady12. Utworzone agregaty komórkowe nie mogą być utrzymywane przez długi czas w kroplach; W związku z tym należy je przenieść na płytki studzienne. Proces ten wymaga intensywnego obchodzenia się z nim i długich okresów pracy w okapie z przepływem laminarnym, ponieważ jest wykonywany kroplami za pomocą mikropipety12. Ponadto ta metoda wymaga 10 dni na pełne uformowanie sferoid ZFL (5 dni w zawieszeniu + 5 dni w systemie operacyjnym)12. Wady te mogą ograniczać zastosowanie sferoid ryb 3D do testowania toksyczności, zwłaszcza biorąc pod uwagę potencjalne zastosowania w zakresie priorytetyzacji chemicznej i zrównoważonego rozwoju produktów.
Tak więc, ten artykuł opisuje protokół hodowli 3D zdolny do generowania pojedynczych sferoid linii komórkowych ZFL (D. rerio normal hepatocyte) i ZEM2S (D. rerio blastula phase embryo) w oparciu o połączone użycie 96-dołkowych, ultra-niskich płytek przyłączeniowych (ULA-plates) i wytrząsarki orbitalnej (średnica obrotowa 22 mm). Zastosowana metoda jest prosta i powtarzalna i może wygenerować dużą liczbę sferoid o podobnej wielkości i kształcie w krótkim czasie (5 dni). Zalety tej metody mogą przyczynić się do zastosowania modeli 3D ryb do badań toksyczności dla organizmów wodnych zarówno w przemyśle, jak i środowisku akademickim, a także przyczynić się do postępu we wdrażaniu alternatywnych metod badania ekotoksyczności.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowa, przezroczysta, okrągłodenna mikropłytka o bardzo niskim nasadce, pakowana pojedynczo, z pokrywką, sterylny</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, proszek, wysoka zawartość glukozy, pirogronian</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka odżywcza Ham's F-12, proszek</td><td>Gibco</td><td>21700026</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Przetwarzanie i analiza obrazu w Javie ( ImageJ) Oprogramowanie 1.52p</td><td>&nbsp; National Institutes of Health, USA</td><td></td><td>Dostępne w: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, shakerka</td><td>w proszku Gibco</td><td>41300021</td><td></td></tr><tr><td>Orbital&nbsp;</td><td>Warmnest</td><td>KLD-350-BI</td><td>Średnica obrotu 22 mm</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (10x) z wapniem i magnezem</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, regiony zatwierdzone przez USDA</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu, proszek,&nbsp; bioodczynnik do biologii molekularnej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Trypanowa niebieska plama (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowej</td><td></td><td>Linia komórkowa Gibco</td> 15400054 <td></td></tr><tr><td>ZEM2S</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>Ta linia komórkowa została dzięki uprzejmości profesora Dr. Michaela J. Carvana (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)</td></tr><tr><td>Linia komórkowa ZFL</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda hodowli 3d sferoid embrionalnych i wątrobowych linii komórkowych danio pręgowanego

A 3D Culture Method of Spheroids of Embryonic and Liver Zebrafish Cell Lines

Linie komórkowe ryb są obiecującymi modelami in vitro do oceny ekotoksyczności; jednak konwencjonalne systemy hodowli jednowarstwowej (hodowla 2D) mają dobrze znane ograniczenia (np. długowieczność hodowli i utrzymanie niektórych funkcji komórkowych in vivo). W związku z tym zaproponowano hodowle 3D, takie jak sferoidy, ponieważ modele te mogą odtwarzać struktury podobne do tkanek, lepiej odsłuchując warunki in vivo. W tym artykule opisano skuteczny, łatwy i szybki protokół hodowli 3D do tworzenia sferoid z dwiema liniami komórkowymi danio pręgowanego (Danio rerio): ZEM2S (zarodek) i ZFL (normalny hepatocyt). Protokół polega na posiewaniu komórek na okrągłej, bardzo niskiej płytce 96-dołkowej. Po 5 dniach wytrząsania orbitalnego (70 obr./min) tworzy się pojedyncza sferoida na studzienkę. Uformowane sferoidy mają stabilny rozmiar i kształt, a ta metoda pozwala uniknąć tworzenia się wielu sferoid w studni; W związku z tym nie jest konieczne ręczne wybieranie sferoid o podobnych rozmiarach. Łatwość, szybkość i powtarzalność tej metody sferoidalnej sprawiają, że jest ona przydatna w wysokoprzepustowych testach in vitro.

Pojedyncze sferydy w każdej studzience o stabilnym rozmiarze i kształcie tworzone są za pomocą tej metody. Rysunek 2 ilustruje proces formowania pojedynczych sferydoidów komórek ZFL i ZEM2S w dołku płytki ULA podczas wstrząsania orbitalnego (70 obr./min). Linie komórkowe ZFL i ZEM2S wykazują różne zachowania w kulturze 3D. Linia komórkowa ZEM2S posiada cechy umożliwiające łatwe formowanie sferycznej struktury już od pierwszego dnia wstrząsania orbitalnegoRycina 2E</stron...

Tutaj prezentujemy skuteczny, łatwy i szybki protokół hodowli 3D do tworzenia sferoid dwóch linii komórkowych danio pręgowanego (Danio rerio): ZEM2S (zarodek) i ZFL (normalny hepatocyt).

Metoda hodowli 3D sferoid embrionalnych i wątrobowych linii komórkowych danio pręgowanego

Fish cell lines are promising in vitro models for ecotoxicity assessment; however, conventional monolayer culture systems (2D culture) have well-known ...

Protokół ten może z łatwością wygenerować sferoidy danio pręgowanego, model 3D in vitro o różnym potencjale zastosowania w testach toksyczności ryb. Jest to prosta i szybka metoda generowania pojedynczych sferoid linii komórkowych danio pręgowanego o bardzo podobnej wielkości i kształcie. Jeśli poprawnie wykonasz wszystkie opisane kroki, nie powinieneś napotkać żadnych problemów.Sferoidy danio pręgowanego mogą przynieść ogromne korzyści mechanizmowi, badaniu wpływu chemikaliów na ryby, co pomaga poprawić ocenę bezpieczeństwa środowiskowego produktów takich jak kosmetyki. Procedurę zademonstruje Irisdoris Rodrigues de Souza, doktor genetyki z mojego laboratorium. Na początek weź kolbę T75 z komórkami danio pręgowanego przy około 80% zbiegu.Usunąć całą pożywkę i umyć komórki, dodając 0,01 molowego PBS do kolby hodowlanej za pomocą pipety. Umyć kolbę hodowlaną PBS, delikatnie potrząsając kolbą, a następnie wyjąć PBS. Dodaj trzy mililitry trypsyny 0,5 milimolowego EDTA do kolby hodowlanej i inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez trzy minuty.W celu odłączenia komórek od kolby, delikatnie postukać w kolbę, aby uwolnić komórki. A następnie zatrzymaj trawienie trypsyny, dodając trzy mililitry kompletnej pożywki hodowlanej do kolby. Za pomocą pipety przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów i wirować przy sile 100 G przez pięć minut.Następnie ostrożnie usuń supernatant. Dodać jeden mililitr kompletnej pożywki dla odpowiedniej używanej linii komórkowej i ponownie zawiesić osad za pomocą mikropipety. Dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i 10 mikrolitrów niebieskiego barwnika trypanowego do mikroprobówki, aby policzyć komórki i ocenić ich żywotność.Wymieszać zawiesinę komórkową i barwnik za pomocą pipety i przenieść 10 mikrolitrów tej mieszaniny do komory Neubauera. Policz komórki w czterech dużych kwadratach lub kwadrantach umieszczonych w rogach komory, biorąc pod uwagę komórki, które nie przyjmują błękitu trypanowego, jako żywotne. Następnie oblicz liczbę żywotnych komórek, korzystając z równania pokazanego na ekranie.Pomnóż tę liczbę komórek przez dwa, aby obliczyć ostateczną liczbę komórek w zawiesinie komórek. Po obliczeniu liczby komórek dostosuj zawiesinę komórek do płytki 200 mikrolitrów tej zawiesiny na dołek 96-dołkowej płytki ULA z okrągłym dnem z liczbą komórek wymaganą dla każdej linii komórkowej. Przygotować zawiesinę o dostosowanym stężeniu komórek w zbiorniku pożywki i wymieszać ją za pomocą wielokanałowej mikropipety, nie tworząc piany ani pęcherzyków.Dodać 200 mikrolitrów dostosowanej zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki ULA z okrągłym dnem. za pomocą pipety wielokanałowej. Płytkę należy uszczelnić folią Parafilm lub samoprzylepną folią uszczelniającą, aby uniknąć parowania pożywki hodowlanej z płytki 96-dołkowej.Inkubować płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 70 obr./min przez pięć dni w inkubatorze o temperaturze 28 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla. Po pięciu dniach obserwuj sferoidy pod mikroskopem światła odwróconego, aby ocenić wygenerowane sferoidy. Aby zmierzyć ich kształt i rozmiar, uzyskaj zdjęcia sferoid i użyj oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów.Po ustawieniu oprogramowania tak, aby mierzyło wybrany obszar na podstawie znanej skali, wybierz zewnętrzną stronę sferoidy, aby określić jej pole i okrągłość. Obszar sferoidy służy do określenia jego rozmiaru poprzez obliczenie średnicy d, a oprogramowanie zapewnia okrągłość sferoidy za pomocą wzoru, który wykorzystuje wybrany obszar i obwód. Agregat komórek ZFL powstaje w pierwszym dniu wytrząsania orbitalnego.Agregat komórkowy zwiększa swoją okrągłość w trzecim dniu i osiąga odpowiedni kształt sferoidalny w piątym dniu. Pokazano tu 16-dniową sferoidę ZFL w płytce ULA. Linia komórkowa ZEM2S tworzy sferoidy od pierwszego dnia wytrząsania orbitalnego.Sferoida zachowuje swój kształt i powiększa się trzeciego dnia, a jej maksymalna okrągłość zostaje osiągnięta w piątym dniu. Pokazano tutaj 10-dniową sferoidę ZEM2S w płytce ULA. Zmierzona wielkość sferoid linii komórkowych ZFL i ZEM2S oraz zmierzony wskaźnik cykliczności sferoid ZFL i ZEM2S są pokazane na tym rysunku.Ten obraz graficzny przedstawia wzorzec wzrostu sferoid ZFL i ZEM2S. Sferoida ZFL i sferoida ZEM2S powstały po pięciu dniach wytrząsania orbitalnego z prędkością 100 obr./min. Na rysunku przedstawiono wzór wzrostu i wskaźnik kołowości sferoid utworzonych przy prędkościach obrotowych 70 i 100 obr./min.70 obr./min to najbardziej odpowiednia prędkość do formowania sferoid ZFL i ZEM2S tą metodą. Barwienie błon komórkowych za pomocą lektyny Alexa Fluor 594 i jąder za pomocą DAPI wykazuje integralność komórkową w rdzeniu sferoid. Fluorescencja rezorufiny powstała w wyniku redukcji AlamarBlue pokazuje żywotne komórki w rdzeniu obu sferoid.Przedstawiono tutaj test żywotności MTT w hodowli 3D i hodowli 2D linii komórkowej ZEM2S i ZFL, który nie wykazuje istotnych różnic. Próbując wykonać tę procedurę, upewnij się, że uszczelniłeś płytki, aby uniknąć zmiany pH pożywki hodowlanej i parowania w studzienkach. Sferoidy mogą być stosowane w różnych testach in vitro w celu oceny toksycznego wpływu na wątrobę ryb lub w badaniach rozwojowych z wykorzystaniem zarodkowej linii komórkowej ZEM2S.Protokół ten może przyczynić się do rozwoju badań in vitro na rybach, przyczyniając się do postępu w badaniach ekotoksyczności bez udziału zwierząt.

a-3d-culture-method-spheroids-embryonic-liver-zebrafish-cell

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Somitogeneza to rytmiczny proces rozwojowy, który przestrzennie kształtuje oś ciała zarodków kręgowców. Wcześniej opracowaliśmy transgeniczne linie ryb danio pręgowanego, które wykorzystują fluorescencyjne reportery do obserwacji cyklicznych genów napędzających ten proces. Tutaj hodujemy rozproszone komórki z tych linii i obrazujemy ich oscylacje w czasie in vitro.

Generowanie rozproszonych kultur komórek mezodermy presomitycznej do obrazowania zegara segmentacji danio pręgowanego w pojedynczych komórkach

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Tutaj oferujemy powtarzalną metodę badania neurogenezy u dorosłych za pomocą testu neurosfery pochodzącego z całego mózgu lub z obszaru kresomózgowia, tektalu lub móżdżku mózgu dorosłego danio pręgowanego. Dodatkowo opisujemy procedurę manipulowania ekspresją genów w neurosferach danio pręgowanego.

Izolacja i hodowla neurosfer mózgowych dorosłych danio pręgowanego

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Przedstawiamy skuteczny i łatwy w użyciu protokół do przygotowania pierwotnych hodowli komórkowych zarodków danio pręgowanego do transfekcji i obrazowania żywych komórek, a także protokół do przygotowania pierwotnych komórek z mózgu dorosłego danio pręgowanego.

Hodowla i transfekcja komórek pierwotnych danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół 3-D hodowli tkankowej tylnej osi ciała danio pręgowanego, umożliwiający badanie segmentacji kręgowców na żywo. Ten model eksplantatu zapewnia kontrolę nad wydłużaniem osi, zmianą źródeł morfogenu i obrazowaniem na żywo na poziomie tkankowym w rozdzielczości subkomórkowej.

Trójwymiarowa hodowla eksplantatów ogonowych w celu zbadania segmentacji kręgowców u danio pręgowanego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

Organoidy rewolucjonizują spersonalizowane modelowanie tkanek do rozwoju narządów, odkrywania leków i badań nad chorobami. Inżynieria organoidowa się naprzód w tworzeniu skomplikowanych tkanek syntetycznych. Celem jest zintegrowanie morfogenezy, technologii asembloidów i biomatryc w celu poczynienia postępów w inżynierii tkankowej. Protokół ten pomaga w modelowaniu organogenezy wątroby i ustalaniu wytycznych dotyczących budowy tkanek syntetycznych.

Techniki uprawy in vitro do modelowania organogenezy wątroby, budowania asembloidów i projektowania tkanek syntetycznych przy użyciu ludzkich linii komórkowych

Poznaj metodę hodowli 3D sferoid z linii komórkowych danio pręgowanego ZEM2S i ZFL. Protokół umożliwia szybkie generowanie jednolitych kul komórkowych do badań toksyczności chemikaliów.

Metoda hodowli 3D sferoid embrionalnych i wątrobowych linii komórkowych danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów