Metoda hodowli 3D sferoid embrionalnych i wątrobowych linii komórkowych danio pręgowanego
20 stycznia 2023
Tutaj prezentujemy skuteczny, łatwy i szybki protokół hodowli 3D do tworzenia sferoid dwóch linii komórkowych danio pręgowanego (Danio rerio): ZEM2S (zarodek) i ZFL (normalny hepatocyt).
Protokół ten może z łatwością wygenerować sferoidy danio pręgowanego, model 3D in vitro o różnym potencjale zastosowania w testach toksyczności ryb. Jest to prosta i szybka metoda generowania pojedynczych sferoid linii komórkowych danio pręgowanego o bardzo podobnej wielkości i kształcie. Jeśli poprawnie wykonasz wszystkie opisane kroki, nie powinieneś napotkać żadnych problemów.
Sferoidy danio pręgowanego mogą przynieść ogromne korzyści mechanizmowi, badaniu wpływu chemikaliów na ryby, co pomaga poprawić ocenę bezpieczeństwa środowiskowego produktów takich jak kosmetyki. Procedurę zademonstruje Irisdoris Rodrigues de Souza, doktor genetyki z mojego laboratorium. Na początek weź kolbę T75 z komórkami danio pręgowanego przy około 80% zbiegu.
Usunąć całą pożywkę i umyć komórki, dodając 0,01 molowego PBS do kolby hodowlanej za pomocą pipety. Umyć kolbę hodowlaną PBS, delikatnie potrząsając kolbą, a następnie wyjąć PBS. Dodaj trzy mililitry trypsyny 0,5 milimolowego EDTA do kolby hodowlanej i inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez trzy minuty.
W celu odłączenia komórek od kolby, delikatnie postukać w kolbę, aby uwolnić komórki. A następnie zatrzymaj trawienie trypsyny, dodając trzy mililitry kompletnej pożywki hodowlanej do kolby. Za pomocą pipety przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów i wirować przy sile 100 G przez pięć minut.
Następnie ostrożnie usuń supernatant. Dodać jeden mililitr kompletnej pożywki dla odpowiedniej używanej linii komórkowej i ponownie zawiesić osad za pomocą mikropipety. Dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i 10 mikrolitrów niebieskiego barwnika trypanowego do mikroprobówki, aby policzyć komórki i ocenić ich żywotność.
Wymieszać zawiesinę komórkową i barwnik za pomocą pipety i przenieść 10 mikrolitrów tej mieszaniny do komory Neubauera. Policz komórki w czterech dużych kwadratach lub kwadrantach umieszczonych w rogach komory, biorąc pod uwagę komórki, które nie przyjmują błękitu trypanowego, jako żywotne. Następnie oblicz liczbę żywotnych komórek, korzystając z równania pokazanego na ekranie.
Pomnóż tę liczbę komórek przez dwa, aby obliczyć ostateczną liczbę komórek w zawiesinie komórek. Po obliczeniu liczby komórek dostosuj zawiesinę komórek do płytki 200 mikrolitrów tej zawiesiny na dołek 96-dołkowej płytki ULA z okrągłym dnem z liczbą komórek wymaganą dla każdej linii komórkowej. Przygotować zawiesinę o dostosowanym stężeniu komórek w zbiorniku pożywki i wymieszać ją za pomocą wielokanałowej mikropipety, nie tworząc piany ani pęcherzyków.
Dodać 200 mikrolitrów dostosowanej zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki ULA z okrągłym dnem. za pomocą pipety wielokanałowej. Płytkę należy uszczelnić folią Parafilm lub samoprzylepną folią uszczelniającą, aby uniknąć parowania pożywki hodowlanej z płytki 96-dołkowej.
Inkubować płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 70 obr./min przez pięć dni w inkubatorze o temperaturze 28 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla. Po pięciu dniach obserwuj sferoidy pod mikroskopem światła odwróconego, aby ocenić wygenerowane sferoidy. Aby zmierzyć ich kształt i rozmiar, uzyskaj zdjęcia sferoid i użyj oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów.
Po ustawieniu oprogramowania tak, aby mierzyło wybrany obszar na podstawie znanej skali, wybierz zewnętrzną stronę sferoidy, aby określić jej pole i okrągłość. Obszar sferoidy służy do określenia jego rozmiaru poprzez obliczenie średnicy d, a oprogramowanie zapewnia okrągłość sferoidy za pomocą wzoru, który wykorzystuje wybrany obszar i obwód. Agregat komórek ZFL powstaje w pierwszym dniu wytrząsania orbitalnego.
Agregat komórkowy zwiększa swoją okrągłość w trzecim dniu i osiąga odpowiedni kształt sferoidalny w piątym dniu. Pokazano tu 16-dniową sferoidę ZFL w płytce ULA. Linia komórkowa ZEM2S tworzy sferoidy od pierwszego dnia wytrząsania orbitalnego.
Sferoida zachowuje swój kształt i powiększa się trzeciego dnia, a jej maksymalna okrągłość zostaje osiągnięta w piątym dniu. Pokazano tutaj 10-dniową sferoidę ZEM2S w płytce ULA. Zmierzona wielkość sferoid linii komórkowych ZFL i ZEM2S oraz zmierzony wskaźnik cykliczności sferoid ZFL i ZEM2S są pokazane na tym rysunku.
Ten obraz graficzny przedstawia wzorzec wzrostu sferoid ZFL i ZEM2S. Sferoida ZFL i sferoida ZEM2S powstały po pięciu dniach wytrząsania orbitalnego z prędkością 100 obr./min. Na rysunku przedstawiono wzór wzrostu i wskaźnik kołowości sferoid utworzonych przy prędkościach obrotowych 70 i 100 obr./min.
70 obr./min to najbardziej odpowiednia prędkość do formowania sferoid ZFL i ZEM2S tą metodą. Barwienie błon komórkowych za pomocą lektyny Alexa Fluor 594 i jąder za pomocą DAPI wykazuje integralność komórkową w rdzeniu sferoid. Fluorescencja rezorufiny powstała w wyniku redukcji AlamarBlue pokazuje żywotne komórki w rdzeniu obu sferoid.
Przedstawiono tutaj test żywotności MTT w hodowli 3D i hodowli 2D linii komórkowej ZEM2S i ZFL, który nie wykazuje istotnych różnic. Próbując wykonać tę procedurę, upewnij się, że uszczelniłeś płytki, aby uniknąć zmiany pH pożywki hodowlanej i parowania w studzienkach. Sferoidy mogą być stosowane w różnych testach in vitro w celu oceny toksycznego wpływu na wątrobę ryb lub w badaniach rozwojowych z wykorzystaniem zarodkowej linii komórkowej ZEM2S.
Protokół ten może przyczynić się do rozwoju badań in vitro na rybach, przyczyniając się do postępu w badaniach ekotoksyczności bez udziału zwierząt.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia prosty i wydajny protokół generowania trójwymiarowych (3D) sferoidów z ryb danio pręgowanego z wykorzystaniem dwóch linii komórkowych: ZEM2S i ZFL. Metoda została opracowana z myślą o łatwości użycia i szybkim wykonaniu, co czyni ją odpowiednią do różnych zastosowań w badaniach toksyczności u ryb.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Toksykologia
Wstęp
- Zebrafish są powszechnie wykorzystywane w badaniach biologicznych ze względu na ich przezroczyste embriony i szybki rozwój.
- Sferoidy służą jako trójwymiarowy model in vitro, który ściśle naśladuje warunki in vivo.
- Zrozumienie wpływu substancji chemicznych na ryby jest kluczowe dla oceny bezpieczeństwa środowiskowego.
- Niniejszy protokół ma na celu usprawnienie procesu tworzenia sferoidów do celów badawczych.
Cel badania
- Opracowanie szybkiej i skutecznej metody tworzenia sferoidów z ryb danio pręgowanych.
- Ułatwienie badań nad wpływem substancji chemicznych na ryby.
- Udoskonalenie metodologii testów toksyczności u ryb.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie kolb T75 do hodowli komórkowej.
- Utrzymywanie komórek przy konfluencji na poziomie około 80%.
- Stosowanie szczegółowego protokołu tworzenia sferoidów.
- Prezentacja przeprowadzona przez eksperta w dziedzinie genetyki w celu zapewnienia przejrzystości.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na skuteczne generowanie jednorodnych sferoidów z linii komórkowych ryb zebrafish.
- Sferoidy charakteryzują się spójnym rozmiarem i kształtem, co czyni je odpowiednimi do zastosowań eksperymentalnych.
- Potencjalne zastosowania w ocenie toksyczności chemicznej w środowiskach wodnych.
- Uproszczony proces minimalizuje komplikacje podczas formowania sferoidów.
Wnioski
- Niniejszy protokół hodowli 3D jest skuteczny w generowaniu sferoidów z ryb danio pręgowanych.
- Stanowi on obiecujące rozwiązanie w zakresie ulepszania metodologii testowania toksyczności u ryb.
- W przyszłych badaniach model ten może zostać wykorzystany do ocen bezpieczeństwa środowiskowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Trójwymiarowe (3D) hodowle sferoidów z rybki zebrafish stanowią skalowalną i powtarzalną platformę in vitro do mechanistycznej oceny ekotoksyczności oraz bezpieczeństwa związków chemicznych. Metoda ta eliminuje ograniczenia hodowli 2D, umożliwiając organizację komórkową przypominającą tkankę oraz dłuższą żywotność funkcjonalną, co zwiększa wiarygodność predykcyjną w badaniach przesiewowych na wczesnym etapie. Kompatybilność z analizami wysokoprzepustowymi sprawia, że jest ona cennym narzędziem w triażu portfolio oraz w optymalizacji ryzyka podczas rozwoju w obszarze badań i rozwoju (R&D) w farmacji i ochronie środowiska.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną analizę efektów związków w kontekście 3D istotnym dla danej tkanki.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez odtworzenie funkcji komórkowych podobnych do tych występujących in vivo.
- Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie angażowania celu i analizy szlaków sygnałowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne sferoidy odpowiednie do wysokoprzepustowego screeningu związków.
- Dostarcza ilościowych wyników, takich jak rozmiar, kolistość i żywotność sferoidów, do odczytów testowych.
- Ogranicza interwencję manualną poprzez generowanie jednolitych, pojedynczych sferoidów w każdej studzience.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami biologii rozwojowej i modelami istotnymi dla chorób w kontekście toksykologii translacyjnej.
- Zapewnia ciągłość od wczesnych etapów odkrywania leków po przedkliniczną ocenę bezpieczeństwa w kontekście wodnym i środowiskowym.
- Wspiera podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka poprzez dostarczenie rzetelnych i skalowalnych danych in vitro.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta metoda sferoidów 3D wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, stanowiąc pomost między wczesnymi badaniami mechanistycznymi a przesiewaniem wysokoprzepustowym w celu oceny związków środowiskowych i farmaceutycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w systemie istotnym fizjologicznie.
- Screening: Zapewnia gotowość i powtarzalność testu dla przepływów pracy w ocenie związków chemicznych.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar morfologii i żywotności sferoidów do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Stanowi platformę do korelacji wyników in vitro z punktami końcowymi in vivo w toksykologii.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje ustandaryzowany, skalowalny protokół, który można dostosować do wielu klas związków i zespołów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w ocenie toksyczności.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne hodowle 3D dla przepływów pracy o wysokiej przepustowości.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez redukcję ryzyka biologicznego na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój związków o zwiększonej istotności biologicznej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej i pracy z sferoidami 3D.
- Wymaga dostępu do płytek ultra-low attachment, wytrząsarek orbitalnych oraz oprogramowania do analizy obrazu.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności w badaniach wieloośrodkowych.
- Możliwość adaptacji do różnych linii komórkowych ryb zebrafish i potencjalnie innych gatunków po optymalizacji protokołu.
- Ograniczenia obejmują konieczność starannego uszczelniania płytek w celu zapobiegania parowaniu i zmianom pH.
