Testy cytotoksyczności z liniami komórkowymi danio pręgowanego

Protokół badania cytotoksyczności z wykorzystaniem linii komórkowych danio pręgowanego może odpowiedzieć na pytania dotyczące ostrej toksyczności substancji chemicznych dla ryb lub pomóc w określeniu odpowiednich stężeń testowych dla innych alternatywnych testów na rybach. Główną zaletą tego 96-dołkowego testu na płytkach jest połączenie różnych punktów końcowych żywotności w celu określenia cytotoksyczności dla komórek danio pręgowanego, który jest ważnym gatunkiem ryb w badaniach ekotoksyczności. Protokół jest bardzo prosty.

Jeśli poprawnie wykonasz wszystkie opisane kroki, nie powinieneś napotkać żadnego problemu. Protokół ten pomaga w uniknięciu badań ekotoksyczności na zwierzętach oceniających wpływ na linie komórkowe ryb pochodzące z różnych narządów lub etapów życia, takich jak hepatocyty w komórkach embrionalnych. Aby rozpocząć powlekanie komórek ZEM2S lub ZFL, należy obliczyć objętość odpowiednich zawiesin komórek potrzebnych do uzyskania żądanej liczby komórek do testów.

Napełnij sterylny zbiornik odczynnika kompletną pożywką hodowlaną dla odpowiedniej linii komórkowej i przenieś obliczoną objętość zawiesiny komórek do zbiornika o całkowitej objętości 20 mililitrów. Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie wymieszaj roztwór w górę iw dół, nie tworząc piany ani pęcherzyków. Następnie za pomocą mikropipety wielokanałowej dodaj 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki przezroczystej 96-dołkowej płytki z polistyrenu, aby uzyskać żywotną liczbę komórek 60 000 komórek na studzienkę dla komórek ZEM2S i 40 000 komórek na studzienkę dla komórek ZFL.

Inkubować płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby wystawić którykolwiek z typów komórek na działanie różnych stężeń badanych substancji chemicznych, należy przygotować pożądane stężenie roztworów badanych substancji chemicznych w pożywce hodowlanej dla danej linii komórkowej bez płodowej surowicy bydlęcej lub FBS. Po 24-godzinnej inkubacji ostrożnie wyrzuć zużyte pożywki z dołków za pomocą wielokanałowej mikropipety.

Następnie dodać 100 mikrolitrów danego roztworu badanej substancji chemicznej do studzienki w trzech próbach technicznych, co oznacza trzy studzienki na każde stężenie badanej substancji chemicznej. Umieścić grupy kontrolne na tej samej płytce co badane substancje chemiczne w trzech egzemplarzach technicznych. W celu kontroli ślepej próby dodać 100 mikrolitrów pożywki ekspozycyjnej do trzech studzienek bezkomórkowych.

W celu kontroli ujemnej dodać 100 mikrolitrów pożywki ekspozycyjnej do trzech studzienek zawierających komórki. W celu kontroli pozytywnej należy poddać trzy studzienki zawierające komórki działaniu 1% roztworu Triton X-100 przygotowanego w pożywce ekspozycyjnej. Uszczelnij płytki parafilmem lub samoprzylepną folią uszczelniającą, aby zapobiec parowaniu pożywki hodowlanej i inkubuj płytki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Po 24 godzinach od ekspozycji na badaną substancję chemiczną należy ostrożnie wyrzucić pożywkę ekspozycyjną ze studzienek, wlewając zawartość do tacki zbiorczej i umyć każdą studzienkę 200 mikrolitrami PBS. Następnie, aby usunąć PBS bez utraty komórek, ostrożnie wlej go do tacki zbiorczej. Aby wykonać testy Alamar Blue lub AB i CFDA-AM, dodaj 100 mikrolitrów odpowiedniego roztworu na studzienkę i inkubuj płytkę przez 30 minut w ciemności w temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Następnie zmierz fluorescencję w czytniku płytek fluorescencyjnych przy odpowiednich długościach fal wzbudzenia i emisji wymienionych w tekście. Aby przeprowadzić test czerwieni obojętnej lub NR, należy pobrać roztwór roboczy NR o stężeniu 40 mikrogramów na mililitr i odwirować przy 600 G przez 10 minut. Następnie ostrożnie wyjmij wcześniej dodane roztwory AB i CFDA-AM ze studzienek, wlewając zawartość do tacy zbiorczej.

Za pomocą mikropipety wielokanałowej dodać 100 mikrolitrów roztworu roboczego NR do dołka i inkubować płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po zakończeniu inkubacji ostrożnie wlej roztwór NR z płytki do tacki zbiorczej i umyj studzienki, dodając 150 mikrolitrów PBS na studzienkę. Po umyciu dodać 150 mikrolitrów roztworu ekstrakcyjnego NR do dołka i inkubować płytkę, delikatnie potrząsając nią na wytrząsarce płytek przez 10 minut, a następnie zmierzyć absorbancję przy 540 nanometrach za pomocą czytnika płytek.

Aby przeprowadzić test MTT, po 24-godzinnej ekspozycji na badaną substancję chemiczną ostrożnie usunąć podłoże ekspozycyjne, wlewając zawartość do tacki zbiorczej i za pomocą wielokanałowej mikropipety dodać 100 mikrolitrów roztworu roboczego MTT do studzienki w ciemności. Inkubuj płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez cztery godziny w ciemności. Następnie wyrzuć roztwór MTT, wlewając zawartość do tacki zbiorczej i dodaj 100 mikrolitrów DMSO do każdej studzienki, aby wyekstrahować kryształy formazanu.

Inkubować płytkę na wytrząsarce przez 10 minut, a następnie zmierzyć absorpcję przy 517 nanometrach za pomocą czytnika płytek. W przypadku testu AP studzienki odpowiadające ślepej, kontroli dodatniej i wysoce cytotoksycznym stężeniom badanych substancji chemicznych wykazywały niebieski kolor i niską fluorescencję, co wskazuje na brak lub zmniejszenie liczby komórek zdolnych do życia. Natomiast studzienki odpowiadające niskim stężeniom cytotoksycznym badanej substancji chemicznej i kontroli ujemnej zawierające dużą liczbę żywotnych komórek przekształciły resazurynę w różową rezorufinę o wyższej fluorescencji.

W przypadku testu NR wysoce cytotoksyczne stężenia badanych substancji chemicznych i kontroli dodatniej są przezroczyste lub bladoróżowe o niskiej absorbancji, podczas gdy studzienki zawierające żywe komórki zatrzymujące barwnik NR wykazywały ciemnoróżowy kolor i wysoką absorbancję. Podobnie, w przypadku testu MTT, studzienki bez żywotnych komórek są przezroczyste, podczas gdy te zawierające żywotne komórki przekształcają MTT w fioletowy formazan. Na podstawie obliczonych wartości procentowych żywotności komórek oszacowano połowę maksymalnego stężenia inhibitora lub wartość IC50 dla różnych badanych substancji chemicznych w liniach komórkowych ZFL i ZEM2S.

Nie zaobserwowano istotnej różnicy w żywotności komórek dla kultur z FBS i bez FBS, co wskazuje na przydatność pożywek hodowlanych pozbawionych FBS przez okres ekspozycji chemicznej wynoszący 24 godziny. Testy MTT i NR nie wykazały znaczącego wpływu różnych stężeń DMSO od 0,1% do 1% na żywotność komórek, co wskazuje, że te linie komórkowe wspierają stosowanie DMSO jako rozpuszczalnika do 1%Zachowaj szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z platerowanymi komórkami, aby uniknąć samooderwania się podczas całej procedury i ostrożnie przygotuj neutralny czerwony roztwór roboczy, aby uniknąć wytrącania się barwnika. Procedura ta może być stosowana do badań dotyczących kilku aspektów skutków chemicznych na ryby przy użyciu modeli in vitro i przyczynić się do postępu w nieprzeprowadzanych badaniach ekotoksyczności na zwierzętach.