Name: Testy cytotoksyczności z liniami komórkowymi danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj testy cytotoksyczności z liniami komórkowymi danio pręgowanego ZEM2S i ZFL w płytkach 96-dołkowych. Ta metoda łączy różne punkty końcowe w celu oceny ostrości toksyczności chemikaliów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pamięci dr Márcio Lorenciniego, współautora tej pracy, doskonałego badacza w dziedzinie kosmetyków i oddanego promowaniu badań kosmetycznych w Brazylii. Autorzy są wdzięczni Laboratorium Wielozadaniowemu na Wydziale Fizjologii (UFPR) za dostępność sprzętu oraz za wsparcie finansowe Koordynacji na rzecz Doskonalenia Kadr Szkolnictwa Wyższego (CAPES, Brazylia) (Kod Finansowy 001) i Grupo Boticario.

UWAGA: Listę materiałów wykorzystanych w tym protokole znajduje się w Tabeli materiałów, a skład zastosowanych roztworów i pożywek w Tabeli 1.
1. Przygotowanie komórek ZFL i ZEM2S
<ol>
	<li>Zacznij od kolby T75 z komórkami ZFL lub ZEM2S o 80% konfluencji, hodowanymi w odpowiedniej pożywce kompletnej w temperaturze 28 °C bez CO2.</li>
	<li>Usuń pożywkę hodowlaną z kolby i przemyj komórki, dodając 10 mL 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) (0.01 M). Do kolb hodowlanych dodaj 3 mL 1x trypsyny (0,05% v/v; 0,5 mM trypsyny-EDTA). Inkubuj w temperaturze 28 °C przez 3 min.</li>
	<li>Delikatnie opukaj kolbę, aby odczepić komórki, a następnie przerwij trawienie trypsyną, dodając do kolby 3 mL kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mL i odwiruj przy 100 × g przez 5 min.</li>
	<li>Po wirowaniu ostrożnie usuń supernatant, dodaj 1 mL pożywki kompletnej dla komórek ZFL lub ZEM2S i resuspenduj osad za pomocą mikropipety.</li>
</ol>
2. Liczenie komórek metodą wykluczania barwnika trypan blue
<ol>
	<li>Dodaj 10 µL zawiesiny komórkowej i 10 µL barwnika błękitu trypanowego do mikroprobówki w celu policzenia komórek i oceny ich żywotności. Wymieszać zawiesinę komórkową z barwnikiem za pomocą pipety.</li>
	<li>Następnie przenieść 10 µL tej mieszaniny (zawiesiny komórkowej + błękitu trypanu) do komory Neubauera i policzyć komórki w czterech dużych polach (kwadrantach Q) znajdujących się w narożach komory, przyjmując, że komórki żywe to takie, które nie pobrały błękitu trypanu. Wyznaczyć liczbę żywych komórek, korzystając z równania (1): 
	<img alt="Wzór obliczania liczby komórek, ΣQ/4 x 10^4, równanie do kwantyfikacji komórek." src="/files/ftp_upload/64860/64860eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> (1)</li>
	<li>Oblicz końcową liczbę komórek w zawiesinie komórkowej, mnożąc liczbę komórek wyznaczoną za pomocą równania (1) przez dwa (czynnik rozcieńczenia wynikający z zastosowania błękitu trypanu). 
	UWAGA: Alternatywnie można zastosować zautomatyzowany system liczenia komórek (np.., można użyć cytometru z funkcją liczenia komórek i oceny ich żywotności).</li>
</ol>
3. Wysiewanie komórek na płytki 96-dołkowe
<ol>
	<li>Oblicz objętość zawiesiny komórkowej niezbędną do uzyskania liczby komórek wymaganej do przeprowadzenia testów cytotoksyczności. Liczba żywych komórek dla każdej linii komórkowej została wskazana poniżej:
	<ol>
		<li>Wysiać 60 000 żywych komórek komórki ZEM2S na studzienkę; zatem dla całej płytki należy użyć sześciu milionów komórek w 20 ml pożywki kompletnej (200 µL/well, płytka 96-dołkowa).</li>
		<li>Wysiać 40 000 żywych komórek komórki ZFL na dołek; zatem dla całej płytki należy użyć czterech milionów komórek w 20 ml pożywki kompletnej (200 µL/well, płytka 96-dołkowa).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie przenieś odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej do zbiornika na odczynniki (sterylnego) i dopełnij pełną pożywką hodowlaną dla ZFL lub ZEM2S do objętości 20 ml. Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie wymieszaj roztwór, pipetując go w górę i w dół. 
	UWAGA: Należy uważać, aby nie dopuścić do powstania piany ani pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Dodaj 200 µL zawiesiny komórkowej do każdej studzienki przezroczystej 96-dołkowej płytki polistyrenowej za pomocą mikropipety wielokanałowej. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C przez 24 h. 
	UWAGA: Płytka musi posiadać co najmniej trzy studzienki bez komórek dla kontroli tła, do których należy dodać wyłącznie kompletną pożywkę. W analizach z wykorzystaniem płytek 96-dołkowych często występuje efekt brzeżny (spowodowany silniejszym odparowaniem w studzienkach brzegowych), który może wpływać na żywotność komórek w tych studzienkach.28Efekt ten może być silniejszy lub słabszy w zależności od marki i konstrukcji płytki 96-dołkowej.28Chociaż nie odnotowaliśmy zaburzeń wzrostu ani żywotności komórek ZFL i ZEM2S w studzienkach brzegowych, sugerujemy uszczelnienie płytki parafimem lub samoprzylepną folią uszczelniającą w celu zapobiegania temu zjawisku lub hodowanie komórek wyłącznie w 60 studzienkach wewnętrznych i wypełnienie studzienek brzegowych PBS.</li>
</ol>
4. Ekspozycja komórek na substancję testową
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń zużyte medium z dołków za pomocą mikropipety wielokanałowej.</li>
	<li>Poddaj komórki działaniu substancji testowych w różnych stężeniach. Przygotuj roztwory odpowiednich stężeń substancji testowej w pożywce hodowlanej dla ZFL lub ZEM2S bez dodatku płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (medium ekspozycyjne). Następnie dodaj 100 µL tych roztworów na dołek w trzech powtórzeniach technicznych (tj. trzy dołki na jedno stężenie substancji testowej).</li>
	<li>W przypadku kontroli, umieść grupy kontrolne na tej samej płytce co substancję testową w trzech powtórzeniach technicznych (trzy dołki na grupę kontrolną). W ten sposób dla kontroli ślepej (B) dodaj 100 µL medium ekspozycyjnego do dołków bez komórek, dla kontroli negatywnej (NC) dodaj 100 µL medium ekspozycyjnego do dołków z komórkami, a dla kontroli pozytywnej (PC) poddaj komórki działaniu 1% roztworu Triton X-100 przygotowanego w medium ekspozycyjnym. W niektórych przypadkach na płytce powinna znaleźć się kontrola rozpuszczalnika (SC), przyjmując wyraźnie niecytotoksyczne stężenie jako końcowe stężenie rozpuszczalnika. 
	UWAGA: Zaleca się stosowanie 0,5% DMSO jako rozpuszczalnika; w tych liniach komórkowych DMSO może być stosowany w stężeniu do 1% bez przekraczania progu cytotoksyczności wynoszącego 10% w stosunku do kontroli negatywnej.</li>
	<li>Inkubuj płytki w temperaturze 28 °C przez 24 h. Uszczelnij płytki parafilmem lub samoprzylepną folią uszczelniającą, aby zapobiec odparowywaniu pożywki hodowlanej. 
	​UWAGA: Niektóre substancje chemiczne mogą wykazywać wewnętrzną absorbancję tła lub fluorescencję, co może zakłócać absorbancję lub fluorescencję barwnika wskaźnikowego (np. związki barwne mogą wpływać na absorbancję, albumina surowicy29 oraz związki interferujące z enzymami redukcyjnymi30,31). W takim przypadku na płytce musi znaleźć się dodatkowa kontrola poprzez dodanie roztworów substancji testowej do dołków bez komórek. Służy to weryfikacji możliwej interferencji autoabsorbancji/autofluorescencji substancji chemicznej z barwnikami. Jeśli wykryta zostanie interferencja, należy ocenić, czy można ją wykluczyć w celu uzyskania prawidłowego wyniku oceny cytotoksyczności.</li>
</ol>
5. Testy cytotoksyczności
UWAGA: Wszystkie roztwory należy przygotować zgodnie z Tabelą 1. Wszystkie opisane poniżej etapy (Rysunek 1>) są przeprowadzane w warunkach sterylnych. Nie zaleca się używania pipety do usuwania pożywki ekspozycyjnej, ponieważ komórki mogą łatwo oddzielić się od dołków po obróbce chemicznej.
<ol>
	<li>Testy AB i CFDA-AM
	<ol>
		<li>Po 24 h ekspozycji na substancję testową ostrożnie usunąć medium ekspozycyjne, wlewając jego zawartość do tacy zbierającej.</li>
		<li>Przemyć płytkę 200 µL PBS. Ostrożnie usunąć PBS, wlewając go do tacy zbierającej, aby uniknąć utraty komórek.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 100 µL roztworu AB/CFDA-AM. Inkubować płytkę przez 30 min w ciemności w temperaturze 28 °C.</li>
		<li>Zmierz fluorescencję w płytkowym czytniku fluorescencji przy 530 nm (wzbudzenie) i 595 nm (emisja) dla AB oraz przy 493 nm (wzbudzenie) i 541 nm (emisja) dla CFDA-AM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test NR 
	UWAGA: Kroki testu NR wykonuje się bezpośrednio po testach AB i CFDA-AM (Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Odwirować roztwór roboczy NR (40 µg/mL) przy 600 × g przez 10 min. 
		UWAGA: Osad NR w probówce nie może zostać przeniesiony na płytki. Dlatego po odwirowaniu roztworu roboczego NR należy zebrać nadsącz za pomocą pipety, nie zasysając osadu NR. Przenieść nadsącz do zbiornika na odczynniki.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć roztwór AB/CFDA-AM, wlewając jego zawartość do tacy zbierającej.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 100 µL roztworu roboczego NR za pomocą wielokanałowej mikropipety. Inkubować płytkę w temperaturze 28 °C przez 3 h. 
		UWAGA: Po 3 h inkubacji sprawdzić pod mikroskopem, czy w płytkach nie wystąpiło wytrącanie NR. Osady NR mogą zakłócać ilościowe oznaczenie żywotności komórek, dlatego nie powinny być obecne.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć roztwór NR, wlewając jego zawartość do tacy zbierającej. Przemyć dołki, dodając 150 µL PBS na dołek.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 150 µL roztworu ekstrakcyjnego NR i inkubować płytkę na wstrząsarce do płytek przez 10 min przy łagodnym wstrząsaniu. Zmierzyć absorbancję przy 540 nm w czytniku płytek. 
		UWAGA: Należy wykonać drugi odczyt przy 690 nm, aby wykluczyć jakąkolwiek absorbancję tła w płytce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test MTT 
	UWAGA: Test MTT musi być przeprowadzony oddzielnie od testów opisanych powyżej (na nowej płytce) (Rysunek 2).
	<ol>
		<li>Ostrożnie usunąć medium ekspozycyjne, wlewając jego zawartość do tacy zbierającej.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 100 µL roztworu roboczego MTT za pomocą wielokanałowej mikropipety. Inkubować płytkę w temperaturze 28 °C przez 4 h.</li>
		<li>Usunąć roztwór MTT, wlewając jego zawartość do tacy zbierającej.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 100 µL DMSO w celu ekstrakcji kryształów formazanu, inkubując płytkę na wstrząsarce do płytek przez 10 min. Zmierzyć absorbancję przy 570 nm za pomocą czytnika płytek. 
		UWAGA: Należy wykonać drugi odczyt przy 690 nm, aby wykluczyć jakąkolwiek absorbancję tła w płytce. Należy zauważyć, że substancje testowe mogą zakłócać test MTT, co musi zostać ocenione w celu zapewnienia jakości uzyskanych danych32. W tym celu należy poddać ekspozycji dołki bez komórek zawierające stężenia testowe i MTT (0,5 mg/mL), a następnie inkubować, aby zaobserwować ewentualną zmianę barwy w dołkach, która mogłaby zwiększyć absorbancję i doprowadzić do fałszywych wyników żywotności. W tym teście należy unikać substancji chemicznych wchodzących w interakcje z MTT.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Obliczanie żywotności komórek/cytotoksyczności
UWAGA: Uzyskana surowa absorbancja lub fluorescencja jest wykorzystywana do obliczenia żywotności komórek jako procentu w stosunku do kontroli negatywnej (dla substancji testowych przygotowanych bezpośrednio w pośrodku ekspozycyjnym) lub kontroli rozpuszczalnika (dla substancji testowych przygotowanych z użyciem rozpuszczalników, takich jak DMSO). Przed wyznaczeniem procentowej żywotności komórek dane surowe muszą zostać znormalizowane względem kontroli pustej (blanku).
<ol>
	<li>Oblicz średnią absorbancję lub fluorescencję dla każdego z badanych stężeń substancji chemicznej oraz grupy kontrolnej (trzy dołki/próba).</li>
	<li>Aby określić procent żywotności komórek w stosunku do kontroli (negatywnej lub rozpuszczalnika), zastosuj równanie (2): 
	<img alt="Wzór na obliczanie żywotności komórek, równanie dla pomiaru fluorescencji lub absorbancji, analiza badawcza." src="/files/ftp_upload/64860/64860eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"> (2) 
	UWAGA: Jednostki absorbancji (abs) lub fluorescencji (fluo) reprezentują średnią wartość absorbancji lub fluorescencji zmierzonej w trzech dołkach na jedno stężenie; blank oznacza dołki bez komórek.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Testy cytotoksyczności są szeroko stosowane do oceny toksyczności in vitro, a w niniejszym artykule protokołu przedstawiono cztery powszechnie stosowane testy cytotoksyczności zmodyfikowane do wykonywania na liniach komórkowych danio pręgowanego (tj. gęstość komórek dla płytki 96-dołkowej, czas inkubacji w teście MTT, wyczerpanie FBS w warunkach narażenia na chemikalia oraz maksymalne dopuszczalne stężenie dla SC). Ponieważ testy te określają ilościowo cytotoksyczność za pomocą różnych punktów końcowych żywotnoś...

Substancje chemiczne muszą być testowane pod kątem ich bezpieczeństwa dla zdrowia ludzkiego i środowiska. Biomarkery molekularne i komórkowe są coraz częściej brane pod uwagę w ocenach bezpieczeństwa w celu przewidywania skutków dla organizmów żywych przez agencje regulacyjne i/lub przepisy (np. REACH, OECD, US EPA)1,2, ponieważ mogą one poprzedzać niekorzystny wynik in vivo (np. zaburzenia endokrynologiczne, odpowiedź immunologiczna, ostra toksyczność, fototoksyczność)3,4,5,6,7. W tym kontekście, cytotoksyczność została przyjęta jako miara do przewidywania ostrej toksyczności ryb5,8; Może jednak mieć wiele innych zastosowań w badaniach ekotoksyczności, takich jak definiowanie subcytotoksycznych stężeń substancji chemicznych w celu zbadania ich najróżniejszego zestawu skutków dla ryb (np. skutków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego).
W systemach hodowli komórkowych (in vitro), cytotoksyczność substancji chemicznych może być określana metodami różniącymi się typami punktów końcowych. Na przykład metoda cytotoksyczności może opierać się na punkcie końcowym związanym ze specyficzną morfologią obserwowaną podczas procesu śmierci komórki, podczas gdy inna może określać cytotoksyczność poprzez pomiar śmierci, żywotności i funkcjonalności komórki, morfologii, metabolizmu energetycznego oraz przyczepiania i proliferacji komórek. Substancje chemiczne mogą wpływać na żywotność komórek poprzez różne mechanizmy, dlatego ocena cytotoksyczności obejmująca różne punkty końcowe żywotności komórek jest niezbędna do przewidywania skutków chemicznych9.
MTT i Alamar Blue (AB) to testy, które określają wpływ na żywotność komórek na podstawie aktywności metabolicznej komórki. Test MTT ocenia aktywność enzymu mitochondrialnego dehydrogenazy bursztynianowej10. Redukcja żółtawego bromku 3-[4,5-dimetylotiazol-2ylo]-2,5-difenylotetrazolu (MTT) do błękitu formazanu zachodzi tylko w komórkach żywotnych, a jego gęstość optyczna jest wprost proporcjonalna do liczby komórek zdolnych do życia10. Test AB jest czułym wskaźnikiem oksydacyjno-redukcyjnym, w którym pośredniczą enzymy mitochondrialne, które fluoryzują i zmieniają kolor po redukcji resazuryny do rezorufiny przez żywe komórki11; jednak enzymy cytozolowe i mikrosomalne również przyczyniają się do redukcji AB i MTT12. Enzymy te mogą obejmować kilka reduktaz, takich jak oksydoreduktazy alkoholowe i aldehydowe, NAD(P)H: oksydoreduktaza chinonowa, reduktaza flawinowa, dehydrogenaza NADH i cytochromy11.
Test neutralnej czerwieni (NR) to test żywotności komórek oparty na włączeniu tego barwnika do lizosomów żywotnych komórek13. Wychwyt NR zależy od zdolności komórek do utrzymania gradientów pH. Gradient protonów wewnątrz lizosomów utrzymuje pH niższe niż cytoplazma. Przy normalnym fizjologicznym pH NR ma ładunek netto w przybliżeniu zerowy, co umożliwia mu przenikanie przez błony komórkowe. W ten sposób barwnik zostaje naładowany i zostaje zatrzymany w lizosomach. W związku z tym, im większa ilość zatrzymanego NR, tym większa liczba żywotnych komórek14. Substancje chemiczne, które uszkadzają powierzchnię komórki lub błony lizosomalne, upośledzają wychwyt tego barwnika.
Test CFDA-AM jest fluorometrycznym testem żywotności komórek opartym na zachowaniu estru acetoksymetylowego dioctanu 5-karboksyfluoresceiny (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, substrat esterazy, jest przekształcany w karboksyfluoresceinę, substancję fluorescencyjną, która jest polarna i nieprzepuszczalna przez błony żywych komórek15; w ten sposób jest zatrzymywana w wewnętrznej stronie nienaruszonej błony komórkowej, wskazując żywe komórki.
Niedawno, trzy testy cytotoksyczności (testy CFDA-AM, NR i AB) zostały połączone w zatwierdzonych wytycznych ISO (Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna) (ISO 21115:2019)16 i OECD (Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju) metoda testowa (OECD TG 249) do oceny ostrej toksyczności ryb przy użyciu linii komórkowej RTgill-W1 (stała linia komórkowa pstrąga tęczowego [Oncorhynchus mykiss] skrzela) na płytkach 24-dołkowych17. Chociaż istnieje metoda oparta na komórkach do przewidywania ostrej toksyczności u ryb, włożono wysiłki w opracowanie podobnych metod dla innych gatunków ryb i zwiększenie przepustowości tej metody. Niektóre przykłady obejmują rozwój linii komórkowych ZFL transfekowanych genami reporterowymi dla określonych szlaków toksyczności18,19, testy fototoksyczności w linii komórkowej RTgill-W120, oraz wykorzystanie linii komórkowych ZFL i ZF4 (fibroblasty danio pręgowanego pochodzące z 1-dniowych zarodków) do oceny toksyczności za pomocą kilku testów cytotoksyczności21.
Danio rerio (danio pręgowany) jest jednym z głównych gatunków ryb wykorzystywanych w badaniach toksyczności dla organizmów wodnych; dlatego metody oparte na komórkach z liniami komórkowymi danio pręgowanego do testowania toksyczności ryb mogą być niezwykle przydatne. Linia komórkowa ZFL to linia komórkowa hepatocytów nabłonka danio pręgowanego, która przedstawia główne cechy komórek miąższowych wątroby i może metabolizować ksenobiotyki7,22,23,24,25. Tymczasem linia komórkowa ZEM2S to embrionalna linia komórek fibroblastycznych danio pręgowanego wywodząca się ze stadium blastuli, która może być wykorzystana do zbadania wpływu rozwojowego na ryby26,27. W związku z tym protokół ten opisuje cztery testy cytotoksyczności (testy MTT, AB, NR i CFDA-AM), z modyfikacjami, które należy przeprowadzić na liniach komórkowych ZFL i ZEM2S na 96-dołkowych płytkach.

<table><tbody><tr><td>5-CFDA, AM (dioctan 5-karboksyfluoresceiny, ester acetoksymetylowy)</td><td>Invitrogen</td><td>C1345</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowych, płytka 96-dołkowa</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td>Powierzchnia: Standardowa, płaska podstawa</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td>Proszek, wysoka glukoza, pirogronian</td></tr><tr><td>FBS - Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, regiony zatwierdzone przez USDA</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>Szynka F-12 Mieszanka odżywcza, proszek</td><td>Gibco</td><td>21700026</td><td>Powder</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Gibco</td><td>41300021</td><td></td></tr><tr><td>Powder Neutralny czerwony&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4638</td><td>Proszek, Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna&nbsp;</td><td>Warmnest</td><td>KLD-350-BI</td> o <td>średnicy obrotu 22 mm</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (10X) z wapniem i magnezem</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa rezazuryny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7017</td><td>Proszek, Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Proszek,&nbsp; bioreagent do biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Błękit tiazolowy Bromek tetrazolu&nbsp; 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska plama trypanowa (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa ZEM2S</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>Ta linia komórkowa została dzięki uprzejmości profesora Dr. Michaela J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)</td></tr><tr><td>Linia komórkowa ZFL</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr></tbody></table>

testy cytotoksyczności z liniami komórkowymi danio pręgowanego

Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines

Linie komórkowe ryb stały się coraz częściej wykorzystywane w badaniach ekotoksyczności, a testy cytotoksyczności zostały zaproponowane jako metody przewidywania ostrej toksyczności ryb. W związku z tym protokół ten przedstawia testy cytotoksyczności zmodyfikowane w celu oceny żywotności komórek w liniach komórkowych zarodka danio pręgowanego (Danio rerio) (ZEM2S) i wątroby (ZFL) na płytkach 96-dołkowych. Oceniane punkty końcowe cytotoksyczności to integralność mitochondrialna (testy Alamar Blue [AB] i MTT), integralność błony poprzez aktywność esterazy (test CFDA-AM) i lizosomalna integralność błony (test neutralnej czerwieni [NR]). Po wystawieniu substancji badanych na 96-dołkową płytkę przeprowadza się testy cytotoksyczności; tutaj AB i CFDA-AM są przeprowadzane jednocześnie, a następnie NR na tej samej płytce, podczas gdy test MTT jest wykonywany na osobnej płytce. Odczyty dla tych testów są wykonywane przez fluorescencję dla AB i CFDA-AM oraz absorbancję dla MTT i NR. Testy cytotoksyczności przeprowadzone na tych liniach komórkowych ryb mogą być wykorzystane do badania ostrej toksyczności substancji chemicznych dla ryb.

Rysunek 3 przedstawia płytki z testami AB, CFDA-AM, NR oraz MTT. W przypadku testu AB (Rysunek 3A), studzienki kontrolne (blank) oraz studzienki bez żywych komórek lub z ich niewielką liczbą wykazują niebieski kolor i niską fluorescencję, natomiast studzienki z dużą liczbą żywych komórek mają barwę różową i wykazują wysokie wartości fluorescencji, co wynika z przekształcenia rezauryny (AB) w rezorufinę (substancję różową) przez żywe komórki. W przypadku testu CF...

Ten protokół przedstawia powszechnie stosowane testy cytotoksyczności (testy Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red i MTT) dostosowane do oceny cytotoksyczności w liniach komórkowych zarodka danio pręgowanego (ZEM2S) i wątroby (ZFL) na 96-dołkowych płytkach.

Testy cytotoksyczności z liniami komórkowymi danio pręgowanego

Fish cell lines have become increasingly used in ecotoxicity studies, and cytotoxicity assays have been proposed as methods to predict fish acute ...

Protokół badania cytotoksyczności z wykorzystaniem linii komórkowych danio pręgowanego może odpowiedzieć na pytania dotyczące ostrej toksyczności substancji chemicznych dla ryb lub pomóc w określeniu odpowiednich stężeń testowych dla innych alternatywnych testów na rybach. Główną zaletą tego 96-dołkowego testu na płytkach jest połączenie różnych punktów końcowych żywotności w celu określenia cytotoksyczności dla komórek danio pręgowanego, który jest ważnym gatunkiem ryb w badaniach ekotoksyczności. Protokół jest bardzo prosty.Jeśli poprawnie wykonasz wszystkie opisane kroki, nie powinieneś napotkać żadnego problemu. Protokół ten pomaga w uniknięciu badań ekotoksyczności na zwierzętach oceniających wpływ na linie komórkowe ryb pochodzące z różnych narządów lub etapów życia, takich jak hepatocyty w komórkach embrionalnych. Aby rozpocząć powlekanie komórek ZEM2S lub ZFL, należy obliczyć objętość odpowiednich zawiesin komórek potrzebnych do uzyskania żądanej liczby komórek do testów.Napełnij sterylny zbiornik odczynnika kompletną pożywką hodowlaną dla odpowiedniej linii komórkowej i przenieś obliczoną objętość zawiesiny komórek do zbiornika o całkowitej objętości 20 mililitrów. Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie wymieszaj roztwór w górę iw dół, nie tworząc piany ani pęcherzyków. Następnie za pomocą mikropipety wielokanałowej dodaj 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki przezroczystej 96-dołkowej płytki z polistyrenu, aby uzyskać żywotną liczbę komórek 60 000 komórek na studzienkę dla komórek ZEM2S i 40 000 komórek na studzienkę dla komórek ZFL.Inkubować płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby wystawić którykolwiek z typów komórek na działanie różnych stężeń badanych substancji chemicznych, należy przygotować pożądane stężenie roztworów badanych substancji chemicznych w pożywce hodowlanej dla danej linii komórkowej bez płodowej surowicy bydlęcej lub FBS. Po 24-godzinnej inkubacji ostrożnie wyrzuć zużyte pożywki z dołków za pomocą wielokanałowej mikropipety.Następnie dodać 100 mikrolitrów danego roztworu badanej substancji chemicznej do studzienki w trzech próbach technicznych, co oznacza trzy studzienki na każde stężenie badanej substancji chemicznej. Umieścić grupy kontrolne na tej samej płytce co badane substancje chemiczne w trzech egzemplarzach technicznych. W celu kontroli ślepej próby dodać 100 mikrolitrów pożywki ekspozycyjnej do trzech studzienek bezkomórkowych.W celu kontroli ujemnej dodać 100 mikrolitrów pożywki ekspozycyjnej do trzech studzienek zawierających komórki. W celu kontroli pozytywnej należy poddać trzy studzienki zawierające komórki działaniu 1% roztworu Triton X-100 przygotowanego w pożywce ekspozycyjnej. Uszczelnij płytki parafilmem lub samoprzylepną folią uszczelniającą, aby zapobiec parowaniu pożywki hodowlanej i inkubuj płytki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Po 24 godzinach od ekspozycji na badaną substancję chemiczną należy ostrożnie wyrzucić pożywkę ekspozycyjną ze studzienek, wlewając zawartość do tacki zbiorczej i umyć każdą studzienkę 200 mikrolitrami PBS. Następnie, aby usunąć PBS bez utraty komórek, ostrożnie wlej go do tacki zbiorczej. Aby wykonać testy Alamar Blue lub AB i CFDA-AM, dodaj 100 mikrolitrów odpowiedniego roztworu na studzienkę i inkubuj płytkę przez 30 minut w ciemności w temperaturze 28 stopni Celsjusza.Następnie zmierz fluorescencję w czytniku płytek fluorescencyjnych przy odpowiednich długościach fal wzbudzenia i emisji wymienionych w tekście. Aby przeprowadzić test czerwieni obojętnej lub NR, należy pobrać roztwór roboczy NR o stężeniu 40 mikrogramów na mililitr i odwirować przy 600 G przez 10 minut. Następnie ostrożnie wyjmij wcześniej dodane roztwory AB i CFDA-AM ze studzienek, wlewając zawartość do tacy zbiorczej.Za pomocą mikropipety wielokanałowej dodać 100 mikrolitrów roztworu roboczego NR do dołka i inkubować płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po zakończeniu inkubacji ostrożnie wlej roztwór NR z płytki do tacki zbiorczej i umyj studzienki, dodając 150 mikrolitrów PBS na studzienkę. Po umyciu dodać 150 mikrolitrów roztworu ekstrakcyjnego NR do dołka i inkubować płytkę, delikatnie potrząsając nią na wytrząsarce płytek przez 10 minut, a następnie zmierzyć absorbancję przy 540 nanometrach za pomocą czytnika płytek.Aby przeprowadzić test MTT, po 24-godzinnej ekspozycji na badaną substancję chemiczną ostrożnie usunąć podłoże ekspozycyjne, wlewając zawartość do tacki zbiorczej i za pomocą wielokanałowej mikropipety dodać 100 mikrolitrów roztworu roboczego MTT do studzienki w ciemności. Inkubuj płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez cztery godziny w ciemności. Następnie wyrzuć roztwór MTT, wlewając zawartość do tacki zbiorczej i dodaj 100 mikrolitrów DMSO do każdej studzienki, aby wyekstrahować kryształy formazanu.Inkubować płytkę na wytrząsarce przez 10 minut, a następnie zmierzyć absorpcję przy 517 nanometrach za pomocą czytnika płytek. W przypadku testu AP studzienki odpowiadające ślepej, kontroli dodatniej i wysoce cytotoksycznym stężeniom badanych substancji chemicznych wykazywały niebieski kolor i niską fluorescencję, co wskazuje na brak lub zmniejszenie liczby komórek zdolnych do życia. Natomiast studzienki odpowiadające niskim stężeniom cytotoksycznym badanej substancji chemicznej i kontroli ujemnej zawierające dużą liczbę żywotnych komórek przekształciły resazurynę w różową rezorufinę o wyższej fluorescencji.W przypadku testu NR wysoce cytotoksyczne stężenia badanych substancji chemicznych i kontroli dodatniej są przezroczyste lub bladoróżowe o niskiej absorbancji, podczas gdy studzienki zawierające żywe komórki zatrzymujące barwnik NR wykazywały ciemnoróżowy kolor i wysoką absorbancję. Podobnie, w przypadku testu MTT, studzienki bez żywotnych komórek są przezroczyste, podczas gdy te zawierające żywotne komórki przekształcają MTT w fioletowy formazan. Na podstawie obliczonych wartości procentowych żywotności komórek oszacowano połowę maksymalnego stężenia inhibitora lub wartość IC50 dla różnych badanych substancji chemicznych w liniach komórkowych ZFL i ZEM2S.Nie zaobserwowano istotnej różnicy w żywotności komórek dla kultur z FBS i bez FBS, co wskazuje na przydatność pożywek hodowlanych pozbawionych FBS przez okres ekspozycji chemicznej wynoszący 24 godziny. Testy MTT i NR nie wykazały znaczącego wpływu różnych stężeń DMSO od 0,1% do 1% na żywotność komórek, co wskazuje, że te linie komórkowe wspierają stosowanie DMSO jako rozpuszczalnika do 1%Zachowaj szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z platerowanymi komórkami, aby uniknąć samooderwania się podczas całej procedury i ostrożnie przygotuj neutralny czerwony roztwór roboczy, aby uniknąć wytrącania się barwnika. Procedura ta może być stosowana do badań dotyczących kilku aspektów skutków chemicznych na ryby przy użyciu modeli in vitro i przyczynić się do postępu w nieprzeprowadzanych badaniach ekotoksyczności na zwierzętach.

cytotoxicity-assays-with-zebrafish-cell-lines

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Ten film opisuje test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego w celu oceny powstawania nowotworów in vivo i zbadania efektu środków terapeutycznych.

Test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego: metoda oceny skuteczności przeciwnowotworowej leków na rakotwórczość u danio pręgowanego in vivo

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Ten protokół opisuje procedury wywoływania ostrego uszkodzenia nerek (AKI) u dorosłych ryb pręgowanych przy użyciu cisplatyny jako środka nefrotoksycznego. Szczegółowo opisaliśmy etapy oceny odtwarzalności techniki oraz dwie techniki analizy stanu zapalnego i śmierci komórek w tkance nerkowej, odpowiednio cytometrię przepływową i TUNEL.

Model ostrego uszkodzenia nerek wywołanego cisplatyną u dorosłych danio pręgowanego

Ten artykuł przedstawia metodę opracowywania, charakteryzowania i śledzenia w czasie rzeczywistym przerzutów nowotworowych w modelu nerwiaka zarodkowego danio pręgowanego, szczególnie w transgenicznej linii danio pręgowanego z nadekspresją MYCN i LMO1, która rozwija przerzuty spontanicznie.

Model danio pręgowanego z przerzutami nerwiaka zarodkowego

Danio pręgowany został ostatnio wykorzystany jako model do walidacji potencjalnych modyfikatorów promieniowania. Niniejszy protokół opisuje szczegółowe kroki w celu wykorzystania zarodków danio pręgowanego do eksperymentów przesiewowych opartych na promieniowaniu oraz niektóre podejścia obserwacyjne do oceny wpływu różnych metod leczenia i promieniowania.

Larwy danio pręgowanego jako model do oceny potencjalnych radiosensybilizatorów lub obrońców

Tutaj prezentujemy skuteczny, łatwy i szybki protokół hodowli 3D do tworzenia sferoid dwóch linii komórkowych danio pręgowanego (Danio rerio): ZEM2S (zarodek) i ZFL (normalny hepatocyt).

Metoda hodowli 3D sferoid embrionalnych i wątrobowych linii komórkowych danio pręgowanego

Użyliśmy barwienia proliferacji komórek, aby zidentyfikować komórki w stanie spoczynku w modelu T-ostrej białaczki limfoblastycznej u danio pręgowanego. Barwnik jest zatrzymywany w komórkach niedzielących się i redukowany podczas proliferacji komórek, co umożliwia selekcję uśpionych komórek do dalszego badania. Protokół ten zapewnia funkcjonalne narzędzie do badania samoodnowy w kontekście spoczynku komórkowego.

Identyfikacja komórek w stanie spoczynku w modelu ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej limfocytów T danio pręgowanego za pomocą barwienia proliferacji komórek

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Procedury oparte na mikropłytkach są opisane dla kolorymetrycznej lub fluorometrycznej analizy aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych. Procedury te pozwalają na szybkie oznaczenie takiej aktywności na dużej liczbie próbek środowiskowych w rozsądnych ramach czasowych.

Oznaczanie mikrobiologicznej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach, glebach i osadach za pomocą wysokoprzepustowych testów mikropłytek

Poznaj testy cytotoksyczności z liniami komórkowymi danio pręgowanego ZEM2S i ZFL w płytkach 96-dołkowych. Ta metoda łączy różne punkty końcowe w celu oceny ostrości toksyczności chemikaliów.

Testy cytotoksyczności z liniami komórkowymi danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów