Mysi model krzemicy utworzony przez wielokrotne wdychanie krystalicznego pyłu krzemionkowego

W opisanym mysim modelu krzemicy generowanej przez infuzję laserową śródcząsteczkowego pyłu krzemionkowego, wszystkie zawiesiny CSD kilkakrotnie symulowały występowanie i rozwój krzemicy u ludzi w dużym stopniu. Ta metoda oszczędza czas i poziom, a także jest praktyczna i skuteczna. Ponadto nie powoduje mechanicznych urazów górnych dróg oddechowych w wyniku operacji.

Metoda ta może być również wykorzystana do przygotowania modeli chorób wirusów, bakterii i tak dalej. Procedurę zademonstruje Hangbing Cao, student klasy mistrzowskiej z mojego laboratorium, wykwalifikowany w przygotowaniu mysiego modelu krzemicy. Rozpocznij od przygotowania krystalicznego pyłu krzemionkowego lub CSD co najmniej jeden dzień przed podaniem kroplówek do nosa.

Aby to zrobić, zmiel krzemionkę w zaprawie agatowej przez pół godziny. Aby sprawdzić wielkość i kształt cząstek, przygotuj próbkę do skaningowej mikroskopii elektronowej lub SEM za pomocą taśmy przewodzącej w celu związania cząstek krzemu. Za pomocą suszarki do włosów delikatnie zdmuchnij cząsteczki, które nie są mocno związane, zanim przystąpisz do robienia zdjęcia.

Następnie wymieszaj zmieloną krzemionkę i sterylną sól fizjologiczną w stężeniu 20 miligramów na mililitr za pomocą wytrząsarki ultradźwiękowej. Na koniec należy wirować przygotowaną zawiesinę CSD przez 10 sekund. Podawaj 50 mikrolitrów CSD znieczulonej myszy za pomocą kroplówki do nosa przez cztery do ośmiu sekund.

Potraktuj mysz kontrolną równą ilością soli fizjologicznej, a następnie trzymając ciało myszy dłonią, uszczypnij skórę z tyłu szyi kciukiem i palcem wskazującym, jednocześnie unieruchamiając tylne kończyny myszy pozostałymi palcami. Delikatnie naciśnij obszar bicia serca myszy drugim palcem wskazującym od pięciu do 10 razy przez pięć sekund. Podgrzewaj zatopioną w parafinie tkankę płucną na gorącej płycie w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez ponad cztery godziny.

Aby odwoskować i nawodnić sekcję parafinową, namocz szkiełko w ksylenie przez 30 minut dwa razy, następnie kolejno zanurz szkiełko na pięć minut w bezwodnym 95%85% i 75% etanolu, a na koniec w wodzie dejonizowanej, a następnie umieść szkiełko w wiadrze do barwienia hematoksyliną na 10 minut, a następnie delikatnie spłucz pod bieżącą wodą przez pięć minut. Zanurz go w wiadrze do barwienia eozyny na 10 sekund. Po odwodnieniu próbki w 75%85%95% i bezwodnym etanolu przez pięć minut każdy, wyczyść fragment tkanki, zanurzając go w ksylenie na pięć minut i zamknij go około 60 mikrolitrami kropli neutralnej żywicy.

Ostrożnie umieść prowadnicę pokrywy na sekcji. W przypadku barwienia Massona, odwoskowane i uwodnione próbki parafiny należy zabarwić świeżo przygotowanym 50% hematoksyliną Weigerta przez 10 minut, a następnie po namoczeniu tkanki w kwaśnym upłynnianiu etanolu przez 10 sekund, delikatnie spłukać szkiełko bieżącą wodą w celu uzyskania niebieszczenia jąder. Następnie zabarwić próbkę kroplami czerwonego roztworu barwiącego przez siedem minut i myć 30% roztworem roboczym kwasu solnego przez jedną minutę.

Po zanurzeniu szkiełka w 95% alkoholu na 20 sekund, odwodnić próbkę bezwodnym etanolem przez jedną do trzech sekund dwa razy i, jak pokazano wcześniej, oczyścić i uszczelnić próbkę. W przypadku czerwonego barwienia Syriusza naciekaj odwoskowaną i uwodnioną część przez godzinę roztworem do barwienia na czerwono Sirius, a następnie barwić jądra komórkowe przez osiem do 10 minut roztworem barwiącym Mayer hematokslyn. Delikatnie opłucz go pod bieżącą wodą przez 10 minut przed odwodnieniem, oczyszczeniem i uszczelnieniem szkiełka.

Naciekać odparafinową i uwodnioną próbkę parafiny 30 mililitrami roztworu do pobierania antygenu EDTA o trzech miligramach na mililitr. Gotować próbkę przez 20 do 30 minut, a następnie umyć ją wodą dejonizowaną i inkubować w PBST przez pięć minut. Moczyć próbkę przez 15 minut w świeżo przygotowanym 0,3% roztworze nadtlenku wodoru i myć ją trzy razy przez pięć minut za każdym razem za pomocą PBST.

Przepuszczać błonę próbki przez 15 minut 0,3% roztworem Triton 100 i blokować 30 do 40 mikrolitrami 5% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA przez jedną godzinę. Po usunięciu roztworu blokującego dodać odpowiednio rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe NF-kappa B i CD-68 i inkubować próbkę przez noc w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza w mokrym pudełku z szkiełkiem mikroskopowym IHC. Następnego dnia, po przeniesieniu próbki do temperatury pokojowej na jedną godzinę, przemyć ją trzykrotnie po pięć minut, każdy za pomocą PBST.

Inkubować próbkę przez godzinę w króliczych przeciwciałach drugorzędowych znakowanych peroksydazą chrzanową przeciwko mysim chrzanom w temperaturze pokojowej. Po inkubacji ponownie przemyć próbki trzy razy przez pięć minut każda za pomocą PBST, a następnie inkubować próbkę z substratem DAB odpowiadającym przeciwciału znakowanemu enzymem przez pięć do 20 minut. Po wygaszeniu reakcji wodą dejonizowaną należy przeciwbarwić próbkę przez 30 sekund hematoksyliną Weigerta.

Opłucz go pod bieżącą wodą przez minutę, odwodnij, wyczyść i uszczelnij tkankę. Przed przystąpieniem do analizy western blot homogenizuj tkankę roztworem roboczym RIPA na lodzie przez pięć minut za pomocą ręcznego młynka elektrycznego. Inkubować przez godzinę na lodzie z wytrząsaniem i odwirować homogenat w temperaturze 14,800 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zebrać supernatant i określić stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA. Dodać 20 mikrolitrów buforu 5X ładującego do supernatantu, a następnie podgrzać sześć mikrogramów na mikrolitr roztworu do przechowywania białka przygotowanego za pomocą RIPA w metalowej kąpieli w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 20 minut. Przechowywać 100 mikrolitrów podwielokrotności roztworu białka w każdej probówce w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

W przypadku elektroforezy rozcieńczyć podwielokrotności do dwóch do trzech mikrogramów na mikrolitr lizatem RIPA, a następnie dodać 20 mikrogramów próbki na studzienkę, aby uruchomić żel. Przenieś białko do membrany PVDF wstępnie aktywowanej metanolem przez 20 sekund przy użyciu metody mokrego transferu prądem 400 miliamperów przez jedną do dwóch godzin. Po przemyciu membrany pięć razy przez pięć minut, każdy roztworem PBST, zablokuj 5% BSA lub odtłuszczonym mlekiem na jedną godzinę.

Zanurz paski w pierwszorzędowym roztworze przeciwciała zawierającym NF-kappa B i beta aktynę rozcieńczoną 5% BSA. Delikatnie wstrząśnij paskami przez noc w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza przed umyciem ich PBST. Następnie inkubuj paski, najpierw w rozcieńczonym przeciwciałie drugorzędowym przez godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem, a następnie ze wzmocnionym wywoływaczem chemiluminescencji przez trzy minuty.

Wystaw pasek na działanie aparatu do obrazowania żelu na 20 sekund i zmierz wartość szarości paska, aby ocenić poziom białka za pomocą oprogramowania systemowego. Obrazy SEM CSD wykazały, że cząstki miały nieregularny kształt. Barwienie na czerwono Siriusa przeprowadzone w celu zmierzenia odkładania się kolagenu wykazało, że postęp zwłóknienia płuc u myszy był znacznie przyspieszony po ekspozycji na CSD przez jeden miesiąc.

Mikroskopia polaryzacyjna ujawniła trzy różne typy włókien kolagenowych, z których włókna kolagenowe typu pierwszego pokazane na czerwono są czynnikiem ryzyka krzemicy, jednak w grupie nośnej nie stwierdzono znaczącego zwłóknienia. Wskazywały na to również odpowiednie wyniki zwłóknienia. Barwienie HE tkanki płucnej myszy leczonej CSD wykazało typowe guzki krzemionkowe charakteryzujące się upłynnioną martwicą po fagocytozie CSD w centrum otoczonym makrofagami na obrzeżach.

Barwienie Massona wykazało również, że guzki były wzbogacone o CSD, któremu towarzyszyło zwłóknienie. Barwienie immunohistochemiczne CD-68 dodatkowo ujawniło szeroką obecność makrofagów w tkance płucnej. Mikroskopia światła spolaryzowanego wykazała, że te makrofagi połknęły CSD, powodując poważne uszkodzenie płuc.

Barwienie immunohistochemiczne wykazało wyższe barwienie NF-kappa B, co wskazuje na wyższą odpowiedź zapalną w grupie leczonej CSD niż w grupie podnośnika. Reprezentatywny western blot wykazał również, że myszy leczone CSD miały wyższą ekspresję NF-kappa B w płucach, a różnica w ekspresji między obiema grupami była znacząca. Aby uniknąć niedrożności dróg oddechowych i przyspieszyć regenerację oddechową, obszar serca myszy musi być delikatnie masowany od pięciu do 10 razy, jak wykazano po upływie pięciu sekund.

Model ten może badać niektóre mechanizmy leżące u podstaw krzemicy i wspomagać badania przesiewowe leków terapeutycznych, a także ustalać kluczowe parametry, takie jak dawkowanie i czas trwania. Technologia ta oferuje wygodny, skuteczny i ekonomiczny sposób wystawiania modeli myszy na działanie cząstek stałych, niezależnie od tego, czy dodaje to bakterie. Monitorowanie zachowania myszy może pomóc w określeniu potencjalnych skutków wdychania cząstek stałych.