Izolacja i oczyszczanie komórek śródbłonka mikronaczyniowego i makronaczyniowego z próbek pochodzących z płuc
3 lutego 2023
Chociaż jest to trudne, izolacja komórek śródbłonka płuc jest niezbędna do badań nad zapaleniem płuc. Niniejszy protokół opisuje procedurę wysokowydajnej izolacji komórek śródbłonka makronaczyniowego i mikronaczyniowego o wysokiej czystości.
Protokół ten jest istotny w przypadku izolacji komórek śródbłonka z próbek tkanek lub bardzo małych fragmentów naczyń krwionośnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją odtworzyć w dowolnym laboratorium badawczym i pozwala uzyskać dobrą czystość komórek śródbłonka, nawet z bardzo małych próbek. Przygotowanie próbki miąższu płuc należy rozpocząć od umycia pobranych próbek w 50-mililitrowej probówce zawierającej PBS bez chlorku wapnia i chlorku magnezu lub PBS minus minus.
Przenieś próbki na sterylną szalkę Petriego i pokrój ręcznie na małe fragmenty o wielkości około trzech do czterech milimetrów za pomocą nożyczek chirurgicznych. W przypadku odcinka tętniczego pobrane próbki należy umyć w 50-mililitrowej probówce zawierającej PBS minus minus i przenieść ją na sterylną szalkę Petriego bez siekania. Aby usunąć dużą część zalegającej krwi, należy podać dwa przemycia PBS minus minus do pokrojonego w kostkę miąższu płucnego lub odcinka tętnicy płucnej.
Następnie umieść próbki w 15-mililitrowych probówkach i inkubuj z pięcioma mililitrami kolagenazy typu II przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby usunąć duże fragmenty, umieść sterylne sitko o wielkości jednego milimetra wielkości siatki na wierzchu 50-mililitrowej probówki zbiorczej i wlej całą zawartość z 15-mililitrowej probówki na sitko. Następnie delikatnie masuj strawioną tkankę szpatułką, a następnie spłucz próbkę PBS minus minus, aż do napełnienia probówki zbiorczej.
Aby usunąć nienaczyniowe komórki śródbłonka, przefiltruj odpływ zebrany z strawionych komórek w świeżej 50-mililitrowej probówce za pomocą sitka do komórek o rozmiarze 70 mikrometrów. Następnie za pomocą sitka o wielkości siatki 40 mikrometrów zbierz odpływ do świeżej 50-mililitrowej probówki oznaczonej jako probówka 1. Odwirować próbki o sile 30 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia skupisk komórek.
Za pomocą sterylnej pipety przenieś supernatant do świeżej 50-mililitrowej probówki oznaczonej jako probówka 2. Zawieś granulat w probówce 1 i napełnij probówkę do 50 mililitrów PBS minus minus. Podobnie napełnij probówkę 2 do 50 mililitrów PBS minus minus
.Po zakończeniu odwirować próbki o stężeniu 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić granulki z dwoma mililitrami pożywki wzrostowej i wysiać zawiesinę w dwóch oddzielnych dołkach wstępnie zakodowanej sześciodołkowej płytki. Zaobserwowano, że część traktowanych agregatów komórkowych, w tym komórki mięśni gładkich lub SMC i fibroblasty, była związana z długimi włóknami.
Ponadto SMC stanowiły większość singletów niezawierających komórek krwi. Małe, zwarte skupiska komórek o średnicach nie przekraczających 10 do 20 mikrometrów pozbawione były elementów przypisywanych fragmentom tkanki zrębu. Uzyskano około 70% czystych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc (HLMVEC), pojedynczych komórek.
Otrzymując czyste preparaty HLMVEC, posortowane komórki przyjęły charakterystyczny kształt przypominający śródbłonek. Mikroskopia ogniskowa wykazała, że prawie 100% oczyszczonych komórek tłuszczu było wybarwionych pozytywnie na obecność antygenów komórek śródbłonka, a mianowicie CD31 i bardziej specyficznego czynnika von Willebranda. Kiedy komórki te zostały osadzone w matrygelu, wytworzyły struktury rurkowe i HUVEC, potwierdzając ich fenotyp śródbłonka.
Ze względu na krótki czas inkubacji podczas trawienia enzymatycznego ważne jest wstępne podgrzanie kolagenazy. Kolejną kwestią jest to, że podczas sedymentacji klastrów komórkowych ważne jest, aby delikatnie usunąć supernatant bez dotykania agregatów komórkowych na palecie. Procedura ta opiera się na zastosowaniu wirowania i filtracji, a zatem może dostarczyć nowych informacji, które pozwolą nam oddzielić inne typy komórek na podstawie ich cech, takich jak rozmiar i grupowanie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół izolacji komórek śródbłonka płuc, który ma kluczowe znaczenie dla badania stanu zapalnego płuc. Metoda ta pozwala na uzyskanie wysokiej czystości komórek śródbłonka pochodzących zarówno z naczyń makroskopowych, jak i mikroskopowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórki
- Biologia naczyniowa
- Badania nad zapaleniem płuc
Wprowadzenie
- Komórki śródbłonka odgrywają kluczową rolę w zapaleniu płuc.
- Techniki izolacji mogą różnić się pod względem wydajności i czystości.
- Wysoka powtarzalność w warunkach laboratoryjnych jest niezbędna dla uzyskania spójnych wyników.
Zastosowane metody
- Trawienie enzymatyczne z użyciem kolagenazy typu II
- Ludzkie mikro naczyniowe komórki śródbłonka płuc (HLMVEC)
- Techniki wirowania i filtracji
Główne wyniki
- Osiągnięto wysoką wydajność oczyszczonych HLMVEC na poziomie około 70%.
- Oczyszczone komórki wykazywały typową morfologię śródbłonkową i barwiły się dodatnio w kierunku markerów śródbłonka.
- Technika ta umożliwia izolację czystych komórek śródbłonka, oferując potencjalne możliwości analizy separacji komórek w oparciu o ich rozmiar i skupianie się w klastry.
Wnioski
- Protokół ten zwiększa zrozumienie biologii komórek śródbłonka w badaniach nad płucami.
- Stanowi on wartościowe narzędzie do badania mechanizmów stanu zapalnego płuc oraz zdrowia naczyniowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna izolacja makronaczyniowych i mikronaczyniowych komórek śródbłonka z tkanki płuc umożliwia opracowanie modeli istotnych dla przebiegu chorób oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie badań i rozwoju (B&R) w sektorze biofarmaceutycznym. Dostęp do wysokiej czystości, specyficznych dla danej lokalizacji komórek śródbłonka zwiększa wiarygodność prognostyczną w badaniach nad biologią naczyń oraz w badaniach translacyjnych. Możliwość ta pozwala uzupełnić luki w portfelu badawczym w sytuacjach, gdy komercyjne źródła komórek lub biobanki są niewystarczające do prowadzenia dochodzeń specyficznych dla danego genotypu lub choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach biofarmaceutycznych&D
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcji komórek śródbłonka w kontekstach istotnych dla przebiegu chorób.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie czystych populacji komórek do analizy szlaków sygnałowych.
- Ułatwia walidację punktów uchwycenia, umożliwiając bezpośrednie badanie specyficznych dla danej lokalizacji fenotypów śródbłonka.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane komórki pierwotne do rzetelnego opracowywania testów i screeningu związków.
- Poprawia powtarzalność testów poprzez minimalizację zanieczyszczeń komórkami nieśródbłonkowymi.
- Umożliwia ilościową ocenę odpowiedzi śródbłonka na potencjalne terapeutyki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele in vitro do biologii naczyń krwionośnych człowieka w kontekście chorobowym.
- Wspiera odkrywanie translacyjnych biomarkerów poprzez umożliwienie prowadzenia badań na pierwotnych ludzkich komórkach śródbłonka.
- Ułatwia przejście od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej w badaniach nad chorobami naczyniowymi i zapalnymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół izolacji znajduje zastosowanie na etapie przejściowym między wczesną fazą odkryć a opracowywaniem modeli przedklinicznych, umożliwiając dalsze badania przesiewowe i studia translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Dostarcza czyste komórki śródbłonka do weryfikacji hipotez i wyjaśniania szlaków sygnałowych.
- Przesiewy: Zapewnia zestandaryzowane populacje komórek dla powtarzalnych platform analitycznych.
- Analityka: Dostarcza wyników ilościowych, takich jak czystość, ekspresja markerów oraz funkcjonalne tworzenie cewek.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z modelami przedklinicznymi z wykorzystaniem komórek specyficznych dla danej choroby lub genotypu.
- Zastosowania instytucjonalne: Oferuje powtarzalną i skalowalną metodę, którą można dostosować do różnych potrzeb badań naczyniowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechaniczną w badaniach naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację komórek, poprawiając powtarzalność i skalowalność w różnych laboratoriach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki dostarczeniu odpowiednich modeli biologicznych na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację z uwzględnieniem ryzyka poprzez wypełnienie luk w dostępności komórek specyficznych dla danej choroby i genotypu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie preparatyki tkanek i technik hodowli komórkowych.
- Wymagany jest dostęp do podstawowej aparatury biologii komórki, takiej jak wirówki i sterylne stanowiska pracy.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia spójnej czystości i fenotypu komórek.
- Metoda jest dostosowana do różnych źródeł tkanek, jednak w przypadku innych organów może wymagać optymalizacji protokołu.
- Krótki czas trawienia enzymatycznego oraz ostrożne obchodzenie się z materiałem są kluczowe dla żywotności i czystości komórek.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Sample Preparation and Enzymatic Digestion
1:47
Recovery of the Digested Cells and Removal of Non-Endothelial Cells (EC) by Filtration
2:32
Sedimentation of Cell Clusters and Cell Seeding
3:16
Results: Purification and Characterization of Freshly Isolated HLMVECs
4:30
Conclusion
