Name: Monitorowanie zmian w komórkach śródbłonka żyły pępowinowej po zakażeniu wirusowym za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym opartej na impedancji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Poznaj metodę ciągłego monitorowania zmian morfologicznych w komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) podczas zakażenia wirusem Zika za pomocą systemu RTCA. Ta nieinwazyjna technika umożliwia wykrywanie przejściowych efektów, takich jak odłączanie się komórek i wyciek naczyniowy, dostarczając cennych informacji o integralności naczyń krwionośnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie otrzymało wsparcie od Ministerstwa Szkolnictwa Wyższego Malezji w ramach programu Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019) oraz finansowanie w ramach Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Przygotowanie HUVEC
	<ol>
		<li>Hoduj 7,5 x 105 komórek HUVEC/ml w kolbie do hodowli komórkowej o długości 75cm2 (pokrytej 20 μg/ml kolagenu typu 1) zawierającej 12 ml pożywki dla komórek śródbłonka (ECM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 0,01% suplementem wzrostu komórek śródbłonka (ECGS), który zawiera czynniki wzrostu, hormony i białka niezbędne do hodowli HUVEC, i 0,01% penicyliny-streptomycyny (P/S). Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Konfiguracja eksperymentu RTCA
<ol>
	<li>Weryfikacja rezystora przebiega na RTCA
	<ol>
		<li>Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania RTCA na pulpicie, aby uruchomić aplikację. Pojawi się okno logowania, wpisz nazwę użytkownika i hasło, aby się zalogować.</li>
		<li>Umieść 96-dołkową płytkę rezystora RTCA z dołkiem A1 skierowanym do wewnątrz do stacji RTCA znajdującej się w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
		<li>W zakładce Exp Notes w oprogramowaniu RTCA wpisz nazwę eksperymentu, numer seryjny urządzenia i typ urządzenia (tabliczka QC).</li>
		<li>Na karcie Układ na karcie Komórka oprogramowania RTCA zaznacz wszystkie studnie i kliknij prawym przyciskiem myszy podświetlone studnie, aby upewnić się, że wszystkie studnie są włączone (wyszarzone).</li>
		<li>Na karcie Harmonogram w oprogramowaniu RTCA kliknij przycisk Step_1. Wprowadź przeciągnięcia: 10 i interwał: 30 s. Kliknij przycisk Zastosuj. Kliknij Start/Kontynuuj w lewym górnym rogu oprogramowania, aby rozpocząć weryfikację. 
		UWAGA: Upewnij się, że połączenie studzienek ze stacją RTCA jest w porządku, obserwując "Skanowana płyta. Połączenia OK" u dołu strony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przebieg weryfikacji rezystora w celu analizy danych
	<ol>
		<li>Na karcie Indeks komórek sprawdź dane po zakończeniu przebiegu. Wszystkie wartości CI powinny być mniejsze niż 0,063.</li>
		<li>W dolnej części zakładki Indeks komórek sprawdź nieprzetworzone dane skanowania. Nieprzetworzone dane skanowania powinny wykazywać powtarzające się wzorce wartości 40,0 ± 2,0 (wiersze A i H), 67,5 ± 2,5 (wiersze B i G), 93,6 ± 2,9 (wiersze C i F) oraz 117,6 ± 3,2 (wiersze D i E).</li>
		<li>Aby zatrzymać przebieg weryfikacji, kliknij opcję Blacha > Blacha zwalniająca. 96-dołkowa płytka rezystora RTCA jest teraz gotowa do wyjęcia ze stacji RTCA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskiwanie informacji o tantie na RTCA
	<ol>
		<li>Specjalistyczną złotą płytkę mikroelektrodową pokrytą kolagenem typu 1 (pokrytą 20 μg/ml kolagenu typu 1) umyć 60 μl/studzienkę zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS; wodorowęglanem sodu, bez chlorku wapnia i siarczanu magnezu) 2x.</li>
		<li>Odrzucić pozostały HBSS i dodać 50 μl/basenik ECM. Umieść specjalistyczną złotą płytkę mikroelektrodową zawierającą ECM z dołkiem A1 skierowanym do wewnątrz do stacji RTCA znajdującej się w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Na karcie Exp Notes w oprogramowaniu RTCA wpisz nazwę eksperymentu, numer seryjny urządzenia i typ urządzenia (format 96-dołkowy).</li>
		<li>Na karcie Układ na karcie Komórka oprogramowania RTCA zaznacz studnie, które będą używane, i kliknij prawym przyciskiem myszy podświetlone studnie, aby upewnić się, że wszystkie studnie są włączone (wyszarzone).</li>
		<li>Na karcie Harmonogram oprogramowania RTCA kliknij Step_1, a następnie kliknij Start/Kontynuuj w lewym górnym rogu oprogramowania, aby uzyskać odczyt tła. 
		UWAGA: Upewnij się, że połączenie studzienek jest prawidłowe, obserwując "Zeskanowana płyta. Połączenia OK" u dołu strony.</li>
		<li>Po uzyskaniu odczytu tła specjalistyczna płytka złotej mikroelektrody jest teraz gotowa do wysiewu komórek i gotowa do usunięcia ze stacji RTCA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat HUVEC w specjalistycznej płytce złoto-mikroelektrodowej
	<ol>
		<li>Wysiewaj HUVEC na specjalistycznej złotej płytce mikroelektrodowej z 50 μl / dołek kondycjonowanej pożywki, 1 x 104 komórki / dołek (kondycjonowane podłoże: ECM uzupełnione 10% FBS, 0,01% ECGS i 0,01% P / S). Umieścić płytkę z powrotem w stacji RTCA z dołkiem A1 skierowanym do wewnątrz w celu inkubacji przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, 
		UWAGA: Zliczanie komórek przeprowadzono na zawiesinie komórek ze współczynnikiem rozcieńczenia równym dwa za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Na karcie Harmonogram kliknij przycisk Dodaj krok w lewym górnym rogu. Kliknij Step_2 i zmień Przebiegi: 601 i Interwał: 2 min. Kliknij Zastosuj. Kliknij Step_2 i kliknij Start/Kontynuuj w lewym górnym rogu oprogramowania.</li>
		<li>Po 20 godzinach inkubacji i gdy wartości CI w zakładce Wykres studzienki wskazują plateau, płytka jest gotowa do infekcji. Na karcie Harmonogram w oprogramowaniu RTCA kliknij przycisk Przerwij krok.</li>
		<li>Specjalistyczna płytka ze złotą mikroelektrodą jest teraz gotowa do wyjęcia ze stacji RTCA w celu wykonania kolejnych czynności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Infekcja wirusowa w HUVEC
<ol>
	<li>Rozcieńczenie wirusa
	<ol>
		<li>Kultura podstawowa ZIKV jest utrzymywana w temperaturze -80 °C. W tym badaniu należy usunąć zapas wirusa znajdujący się w fiolkach kriogenicznych i rozcieńczyć zapas ZIKV za pomocą ECM bez surowicy w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) 0,1 i 1, 
		UWAGA: Stado ZIKV zostało wcześniej przygotowane przez przeprowadzenie rozmnażania w komórkach Vero i zebranie supernatantu ZIKV 34.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie monowarstwy komórkowej
	<ol>
		<li>Usuń i wyrzuć kondycjonowaną pożywkę (ECM uzupełnioną 10% FBS, 0,01% ECGS i 0,01% P/S) z każdej studzienki. Przepłucz każdą studzienkę 60 μl HBSS 2x. Włóż HBSS za pomocą boku studni; Nie strzelaj do monowarstwy komórek.</li>
		<li>Pracując od najwyższego do najniższego rozcieńczenia, dodać do studzienki 40 μl każdej rozcieńczonej próbki wirusa w ECM bez surowicy. Trzykrotnie należy wykonać studzienkę dla każdego rozcieńczenia i utrzymać sześć studzienek bez infekcji (trombina kontroli ujemnej i kontrola dodatnia). Nie strzelaj do monowarstwy komórek; Zamiast tego dodaj rozcieńczonego wirusa za pomocą boku studzienki. Do każdego wkładania należy używać nowej końcówki do pipety. 
		UWAGA: Trombina została wybrana jako kontrola pozytywna, ponieważ może szybko zwiększyć przepuszczalność śródbłonka HUVEC.</li>
		<li>Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby umożliwić adsorpcję wirusa. Przesuwaj płytkę 5 razy co 15 minut, aby umożliwić adsorpcję wirusa w całej monowarstwie komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodanie pożywki do hodowli komórkowych nakładki
	<ol>
		<li>Po 1 godzinie inkubacji usunąć i wyrzucić zawiesinę wirusa od najniższego do najwyższego stężenia.</li>
		<li>Umyj zainfekowane komórki 60 μl HBSS 2x. Pokryj studzienkę ECM uzupełnionym 2% FBS. W przypadku studzienek kontroli dodatniej rozcieńczyć trombinę do 20 U/ml z ECM uzupełnionym 2% FBS i pokryć studzienki pożywką ECM zawierającą trombinę. Nie strzelaj do monowarstwy komórek; Zamiast tego dodaj nośnik nakładki za pomocą boku studni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieszczenie zainfekowanej specjalistycznej płytki złotej mikroelektrody z powrotem w stacji RTCA
	<ol>
		<li>Na karcie Harmonogram kliknij przycisk Dodaj krok w lewym górnym rogu. Kliknij na Step_3 i zmień Sweeps: 3,601 i Interval: 2 min. Kliknij Apply.</li>
		<li>Kliknij przycisk OK w wyświetlonym oknie podręcznym. Umieść zainfekowaną specjalistyczną płytkę z mikroelektrodą złotą z dołkiem A1 skierowaną do wewnątrz do stacji RTCA znajdującej się w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Kliknij Step_3 i kliknij Start/Kontynuuj w lewym górnym rogu oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych i eksport danych
<ol>
	<li>Dodanie informacji doświadczalnych dotyczących każdej studzienki
	<ol>
		<li>Na karcie Układ kliknij kartę Komórka (Rysunek 2A). Aby wprowadzić informacje o komórce docelowej i określić typ studni dla każdej studzienki, podświetl studnię i wpisz nazwę, numer i kolor komórki docelowej u dołu oprogramowania. Kliknij Zastosuj (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
		<li>Aby wybrać i określić typ studzienki dla każdej studzienki na karcie Komórka, podświetl studzienkę, wybierz typ studzienki (próbka, kontrola dodatnia lub kontrola ujemna) i kliknij przycisk Ustaw.</li>
		<li>W zakładce Layout kliknij na zakładkę Treatment (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Aby wprowadzić informacje o zabiegu, zaznacz studzienkę i wpisz nazwę zabiegu, stężenie zabiegu, jednostkę i kolor. Kliknij Zastosuj (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
		<li>Aby wybrać i określić typ studzienki dla każdej studzienki na karcie Leczenie, podświetl studzienkę, wybierz typ studzienki (próbka, kontrola pozytywna lub kontrola ujemna) i kliknij przycisk Ustaw. 
		UWAGA: Dla każdego wyboru można podświetlić wiele dołków w tym samym czasie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Normalizacja wartości CI
	<ol>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy po prawej stronie karty Analiza danych i wybierz Znormalizowany indeks komórki z listy rozwijanej Oś Y (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A). W sekcji Oś X na dole wybierz znormalizowany czas jako ostatni zmierzony punkt czasowy, w którym specjalistyczna płytka ze złotą mikroelektrodą została usunięta z powodu infekcji (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). 
		UWAGA: Proces normalizacji przeprowadzany przez oprogramowanie usuwa większość zmienności wynikającej z różnic w wysiewaniu i przyczepianiu studni, o ile wybrany punkt normalizacji przypada przed dodaniem wirusa i/lub zabiegiem. W związku z tym optymalnym punktem czasowym normalizacji powinien być ostatni punkt czasowy przed dodaniem wirusa i/lub leczenia. Punkt czasowy do normalizacji można sprawdzić na karcie Harmonogram w obszarze Step_2. Całkowity wskazany czas to punkt czasowy do normalizacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykreślanie uzyskanych danych za pomocą oprogramowania RTCA
	<ol>
		<li>Na karcie Analiza danych wybierz studnie, które mają zostać dodane do wykresu, podświetlając dołki i klikając << Dodaj. Znormalizowany indeks komórki w stosunku do wykresu czasu jest teraz gotowy do skopiowania i wyeksportowania. Upewnij się, że zaznaczyłeś pole wyboru Średnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksport danych za pomocą oprogramowania RTCA
	<ol>
		<li>W lewym górnym rogu oprogramowania RTCA kliknij Płyta, > Eksportuj informacje o eksperymencie.... Zaznacz pole wyboru, aby wybrać dane do wyeksportowania. Kliknij przycisk OK. 
		UWAGA: Nieprzetworzone dane (nieprzetworzone wartości CI) można eksportować, gdy zaznaczona jest opcja Indeks komórki > Wszystko.</li>
		<li>Wybierz folder, w którym chcesz zapisać plik eksportu. Kliknij ZAPISZ. Pojawi się wyskakujące okienko wskazujące eksport informacji eksperymentalnych. Po zakończeniu eksportowania pojawi się kolejne okno wskazujące, że wyeksportowane informacje o eksperymencie są gotowe do wyświetlenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Cytocydobójcze zakażenie wirusowe w komórkach permisywnych jest zwykle związane z istotnymi zmianami w morfologii i biosyntezie komórek36. Zmiany morfologiczne komórek wywołane przez wirusa, takie jak kurczenie się komórek, powiększanie komórek i / lub tworzenie syncytorii, są również znane jako efekty cytopatyczne (CPE), charakterystyczne dla niektórych infekcji wirusowych37. W EC CPE został opisany jako zniszczenie komórek i przerwanie ścisłych połączeń między każdym EC, ...

Komórki śródbłonka (EC) pokrywają wewnętrzną powierzchnię wszystkich naczyń krwionośnych i limfatycznych. Są one połączone przylegającymi, ścisłymi połączeniami szczelinowymi, tworzącymi półprzepuszczalną barierę między krwią lub limfą a otaczającymi tkankami1,2. Nienaruszone połączenia komórka-komórka śródbłonka mają kluczowe znaczenie dla regulacji transportu makrocząsteczek, substancji rozpuszczonych i płynów, co ma kluczowe znaczenie dla fizjologicznych aktywności odpowiednich tkanek i narządów3. Bariera śródbłonkowa jest dynamiczna i modulowana przez określone bodźce4. Zaburzenie lub utrata funkcji bariery śródbłonkowej jest cechą charakterystyczną patofizjologii chorób w ostrym i przewlekłym stanie zapalnym w patogenezie wielu chorób5,6,7, w tym infekcja wirusowa8,9,10,11. W przypadku flawiwirusów stwierdzono, że niestrukturalne białko NS1 może zmieniać przepuszczalność śródbłonka, na przykład poprzez przerwanie warstwy podobnej do glikokaliksu śródbłonka w wyniku zwiększonej ekspresji i aktywacji katepsyny L, sialidaz i heparynazy endoglikozydazy9. W stanie chorobowym integralność monowarstwy śródbłonka jest zaburzona, a połączenia komórka-komórka są zakłócone, co może prowadzić do uszkodzenia i dysfunkcji śródbłonka12 i ostatecznie rozległych objawów patologicznych w wielu układach narządowych13,14. Zakażenie wirusowe EC powoduje zmiany w komórkowych szlakach sygnałowych i komórkowym profilu ekspresji genów, co może wpływać na funkcje bariery płynowej, powodować zakłócenia EC i indukować przeciek naczyniowy10,15. Stwierdzono, że zakażenie EC wirusem Zika (ZIKV) zaburza integralność połączeń, co powoduje zmiany w przepuszczalności naczyń i prowadzi do dysfunkcji bariery śródbłonkowej, co prowadzi do przecieku naczyniowego10,15. Badania wykazały, że ZIKV jest związany z poważnymi wadami wrodzonymi; Jednak niewiele wiadomo o dokładnym mechanizmie, za pomocą którego to się dzieje16,17. Zrozumienie zmian bariery śródbłonkowej podczas infekcji ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmu choroby.
EC są obecnie używane jako ważny eksperymentalny system modeli naczyniowych in vitro dla różnych procesów fizjologicznych i patologicznych18,19,20,21. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) były szeroko stosowane jako podstawowy, nieunieśmiertelniony system komórkowy do badania śródbłonka naczyniowego i biologii naczyń in vitro22,23,24,25. HUVEC zostały po raz pierwszy wyizolowane do hodowli in vitro na początku lat siedemdziesiątych XX wieku z żyły pępowinowej ludzkiej pępowiny26. HUVEC mają morfologię przypominającą bruk, którą łatwo jest zmusić do rozmnażania się w laboratorium. Ze względu na naprężenie ścinające po utrzymywaniu przez długi czas w stanie zlewania obserwuje się wydłużenie kształtu komórki. HUVEC można scharakteryzować obecnością ciał Weibela i Palade'a (WPB), pęcherzyków pinocytarnych, niewielkich ilości włókienek znajdujących się w pobliżu jądra, mitochondriów o rurkowatych kształtach, które rzadko wykazują rozgałęzienia, elipsoidalnego jądra z drobnoziarnistym wzorem skondensowanej chromatyny oraz od jednego do trzech jąderek obecnych w każdym jądrze27. Chociaż HUVEC wykazują liczne cechy morfologiczne, identyfikacji HUVEC nie można osiągnąć za pomocą samego badania optycznego. Testy, takie jak barwienie immunofluorescencyjne kadheryny śródbłonka naczyń krwionośnych (VE)-kadheryny, są powszechnie stosowane do monitorowania integralności naczyń krwionośnych w HUVECs28,29,30,31.
To badanie opisuje protokół analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) infekcji HUVEC. System RTCA wykorzystuje specjalistyczne, pokryte złotem płytki zawierające mikroelektrody, które zapewniają przewodzącą powierzchnię do mocowania ogniwa. Kiedy komórki przyczepiają się do powierzchni mikroelektrody, tworzy się bariera, która utrudnia przepływ elektronów przez mikroelektrody. Pomiar impedancji generowanej przez mikroelektrody może być wykorzystany do uzyskania informacji o niektórych procesach komórkowych, w tym o przyczepianiu się komórek, proliferacji i migracji32. Zgłoszony test jest testem komórkowym opartym na impedancji, który w połączeniu z analizatorem komórek w czasie rzeczywistym zapewnia ciągły pomiar proliferacji żywych komórek, zmian morfologii (takich jak kurczenie się komórek) i jakości przylegania komórek w sposób nieinwazyjny i wolny od znaczników. W tym badaniu analizator komórek w czasie rzeczywistym jest używany do monitorowania integralności śródbłonka i zmian morfologicznych HUVEC podczas infekcji ZIKV. Krótko mówiąc, przyrząd mierzy przepływ elektronów przekazywany w specjalistycznych płytkach mikromiareczkowych pokrytych złotymi mikroelektrodami w obecności pożywki hodowlanej (roztworu przewodzącego prąd elektryczny). Przyleganie komórek lub zmiany w liczbie i morfologii komórek zakłócają przepływ elektronów i powodują zmiany impedancji, które mogą być uchwycone przez instrument (rysunek uzupełniający 1). Różnica między wzrostem, proliferacją i przyleganiem HUVEC przed i po zakażeniu ZIKV jest rejestrowana w czasie rzeczywistym przez sygnał impedancji elektrycznej, a następnie przekształcana w wartość indeksu komórkowego (CI). Wartość CI sprzed infekcji jest używana jako punkt odniesienia dla normalizacji wartości CI. Zmiany wartości CI odzwierciedlają zmiany morfologiczne komórek lub utratę przylegania komórek po zakażeniu33. Wyniki badania pokazują, że protokół RTCA umożliwia wykrycie przejściowych efektów lub zmian morfologicznych komórek podczas infekcji wirusowej w porównaniu z testem końcowym, takim jak barwienie immunofluorescencyjne kadheryny VE. Metoda RTCA może być przydatna do analizy zmian integralności naczyń krwionośnych HUVEC po zakażeniu innymi wirusami.

<table><tbody><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Nest</td><td>615601</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; Inkubator C z 5% CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 kolba do hodowli tkankowych&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotyku penicylina-streptomycyna (P / S)</td><td>Sciencell</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego, klasa II</td><td>Holten</td><td>HB2448</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu 1</td><td>SIgma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Suplement wzrostu komórek śródbłonka (EKGS)</td><td>Sciencell</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka z komórek śródbłonka (ECM)</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>E-płyta 96</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>05232368001</tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sciencell</td><td>0025</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td>Hemocytometr <td>Sigma-Aldrich</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboroptik LTD</td><td>Neubauer poprawił</td><td></td></tr><tr><td>ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td><td>Mikroskop</td> odwrócony Sciencell <td>8000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ZEISS</td><td>Laptop TELAVAL 31</td><td></td></tr><tr><td>Latitude 3520</td><td>Dell&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety wielokanałowe (10 - 100 &mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta wielokanałowa (30 - 300 &mikro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Rezerwator odczynników</td><td>Tarsons</td><td>T38-524090</td><td></td></tr><tr><td>Płytka rezystora RTCA 96</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>05232350001</tr><tr><td>RTCA Software Pro (wersja 2.6.1)</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>5454433001</tr><tr><td>Pipety jednokanałowe (10 - 100 i mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Pipety jednokanałowe (100 - 1000 &mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Pipety jednokanałowe (20 - 200 &mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Analizator komórek w czasie rzeczywistym SP (Model: W380)</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>00380601030</td><td>https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232</td></tr></tbody></table>

monitorowanie zmian w komórkach śródbłonka żyły pępowinowej po zakażeniu wirusowym za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym opartej na impedancji

Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis

Komórki śródbłonka pokrywają wewnętrzną powierzchnię wszystkich naczyń krwionośnych i limfatycznych, tworząc półprzepuszczalną barierę regulującą wymianę płynów i substancji rozpuszczonych między krwią lub limfą a otaczającymi je tkankami. Zdolność wirusa do przekraczania bariery śródbłonka jest ważnym mechanizmem ułatwiającym rozprzestrzenianie się wirusa w organizmie człowieka. Zgłasza się, że wiele wirusów zmienia przepuszczalność śródbłonka i/lub powoduje przerwanie bariery komórkowej śródbłonka podczas infekcji, co może spowodować przeciek naczyniowy. Obecne badanie opisuje protokół analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA), wykorzystujący komercyjny analizator komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania integralności śródbłonka i zmian przepuszczalności podczas infekcji wirusem Zika (ZIKV) ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Sygnały impedancyjne zarejestrowane przed i po zakażeniu ZIKV zostały przekształcone w wartości indeksu komórkowego (CI) i przeanalizowane. Protokół RTCA pozwala na wykrycie przejściowych efektów w postaci zmian morfologicznych komórek podczas infekcji wirusowej. Test ten może być również przydatny do badania zmian w integralności naczyniowej HUVEC w innych konfiguracjach eksperymentalnych.

Przed infekcją ZIKV wartość CI zarejestrowana dla monowarstwy HUVEC hodowanej na specjalnej płytce mikrotitracyjnej powlekanej złotymi mikroelektrodami przekraczała 8, co sugerowało silne właściwości adhezyjne. Płytki lub dołki z indeksem CI poniżej 8 powinny zostać odrzucone. Następnie HUVEC zainfekowano ZIKV przy MOI wynoszącym 0,1 oraz 1, a impedancję komórek rejestrowano przez 7 dni. Wartość CI w przypadku HUVEC zainfekowanych ZIKV P6-740 przy MOI 0,1 (jasnoniebieska linia) zaczęła spadać w 15 h po infekcji (HPI) w p...

Obecne badanie opisuje protokół monitorowania zmian w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) podczas infekcji wirusowej za pomocą systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA).

Monitorowanie zmian w komórkach śródbłonka żyły pępowinowej po zakażeniu wirusowym za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym opartej na impedancji

Endothelial cells line the inner surface of all blood and lymphatic vessels, creating a semi-permeable barrier regulating fluid and solute exchange ...

Protokół ten pozwolił na ciągłe wykrywanie przejściowego efektu w postaci pewnych zmian morfologicznych podczas infekcji wirusowej, takich jak oderwanie i unoszenie się przylegających komórek. Protokół ten pozwolił na nieinwazyjne i niepracochłonne podejście do ciągłego monitorowania zmian morfologicznych komórek i wychwytywania przejściowych efektów, takich jak przeciek naczyniowy, który można było przeoczyć w teście końcowym. Protokół ten może być używany do analizy zmian integralności naczyń krwionośnych innych linii komórkowych w różnych konfiguracjach eksperymentalnych, jeśli komórki są komórkami przylegającymi.Po przygotowaniu HUVEC uruchom aplikację RTCA, klikając dwukrotnie ikonę na pulpicie. Wpisz nazwę użytkownika i hasło w oknie logowania. Umieść 96-dołkową płytkę rezystora RTCA z dołkiem A1 skierowanym do wewnątrz do stacji RTCA znajdującej się w inkubatorze do hodowli komórkowych.Następnie przejdź do zakładki notatek z eksperymentu w oprogramowaniu RTCA i wpisz nazwę eksperymentu, numer seryjny urządzenia i typ urządzenia. Na karcie układu pod zakładką komórki oprogramowania RTCA zaznacz wszystkie studnie i kliknij prawym przyciskiem myszy podświetlone studnie, aby upewnić się, że wszystkie studnie są włączone. Następnie otwórz zakładkę harmonogramu w oprogramowaniu RTCA.Kliknij przycisk Step_1 i ustaw liczbę przeciągnięć na 10 sekund, a interwał na 30 sekund. Następnie kliknij start kontynuuj w lewym górnym rogu oprogramowania, aby rozpocząć weryfikację. Po uruchomieniu otwórz kartę indeksu komórki, aby sprawdzić dane.Wszystkie wartości indeksu komórki powinny być mniejsze niż 0,063. Następnie sprawdź surowe dane skanowania w dolnej części zakładki indeksu komórek pod kątem powtarzających się wzorców wartości, jak opisano w manuskrypcie. Aby zakończyć przebieg weryfikacji, kliknij opcję Blacha i wybierz opcję Blacha zwalniająca.Wyjmij 96-dołkową płytkę rezystora RTCA ze stacji RTCA. Aby uzyskać podstawowe informacje na temat RTCA, umyj dwukrotnie specjalistyczną złotą płytkę mikroelektrody pokrytą kolagenem typu 1 60 mikrolitrami na studzienkę HBSS. Wyrzuć pozostały HBSS i dodaj 50 mililitrów na studzienkę macierzy zewnątrzkomórkowej.Następnie umieść płytkę w stacji RTCA znajdującej się w inkubatorze do hodowli komórkowych z dołkiem A1 skierowanym do wewnątrz. Na karcie uwag exp w oprogramowaniu RTCA wpisz nazwę eksperymentu, numer seryjny urządzenia i typ urządzenia. Przejdź do zakładki komórki w oprogramowaniu RTCA i wybierz kartę układu.Zaznacz studnie, które mają być używane, i kliknij prawym przyciskiem myszy podświetlone studnie, aby upewnić się, że wszystkie studnie są włączone. Teraz przejdź do zakładki harmonogram w oprogramowaniu RTCA. Kliknij Step_1, a następnie kliknij przycisk Start lub Kontynuuj w lewym górnym rogu, aby uzyskać odczyt tła.Płytka jest teraz gotowa do wysiewu komórek i usuwania ze stacji RTCA. Następnie zasiej od 10 do czwartej komórki na studzienkę HUVEC na złotej płytce mikroelektrody z 50 mikrolitrami na studzienkę kondycjonowanego podłoża. Umieść płytkę z powrotem w stacji RTCA znajdującej się w inkubatorze do hodowli komórkowych, ze studzienką A1 skierowaną do wewnątrz.Następnie w zakładce harmonogramu oprogramowania kliknij dodaj krok w lewym górnym rogu. Kliknij Step_2. Zmień przebiegi na 601, interwał na dwie minuty, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.Kliknij Step_2, a następnie kliknij start lub kontynuuj w lewym górnym rogu oprogramowania. Po 20 godzinach inkubacji, gdy wartości indeksu komórek w zakładce wykresu studzienki pokazują plateau, płytka jest gotowa do infekcji. Na karcie harmonogramu w oprogramowaniu RTCA kliknij przycisk przerwij krok.Płytka jest teraz gotowa do wyjęcia ze stacji RTCA. Aby zainfekować wirusa Hpec, należy pobrać zapas wirusa Zika z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć zapas wirusa Zika macierzą zewnątrzkomórkową bez surowicy w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych, aby uzyskać wielokrotność infekcji 0,1 i jeden.Następnie wyrzuć kondycjonowane podłoże z każdej studzienki i przepłucz każdą studzienkę 60 mikrolitrami HBSS, używając boku studzienki. Dodać 40 mikrolitrów rozcieńczonej próbki wirusa do studzienki, zaczynając od najwyższego do najniższego rozcieńczenia, używając strony studzienki. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aby umożliwić wchłanianie wirusa.Obracaj płytkę pięć razy co 15 minut, aby umożliwić wchłanianie wirusa przez monowarstwę komórkową. Po jednej godzinie inkubacji usunąć i wyrzucić zawiesinę wirusa od najniższego stężenia do najwyższego. Umyj zainfekowane komórki dwukrotnie 60 mililitrami HBSS.Na studzienki nałożyć macierz zewnątrzkomórkową uzupełnioną 2% FBS. W przypadku studzienek kontroli pozytywnej rozcieńczyć trombinę w 20 jednostkach na mililitr macierzą zewnątrzkomórkową uzupełnioną 2% FBS i pokryć studzienki trombiną zawierającą pożywkę macierzy zewnątrzkomórkowej, używając boku studzienki. Teraz kliknij kartę harmonogramu i dodaj krok w lewym górnym rogu.Przejdź do Step_3 i zmodyfikuj przebiegi na 3 601, a interwał na dwie minuty. Kliknij Zastosuj, a następnie kliknij OK w wyskakującym oknie. Umieść zainfekowaną specjalistyczną złotą płytkę mikroelektrodową z dołkiem A1 skierowaną do wewnątrz do stacji RTCA znajdującej się w inkubatorze hodowli.Na koniec kliknij Step_3 i kliknij start kontynuuj w lewym górnym rogu oprogramowania. Wartość indeksu komórkowego HUVEC zakażonych wirusem Zika P6-740 przy wielokrotności infekcji 0,1 zaczęła spadać po 15 godzinach od zakażenia, w porównaniu z negatywną kontrolą infekcji. Osoby zakażone wirusem Zika P6-740 przy wielokrotności jednego zakażenia wykazały spadek indeksu komórkowego po 11 godzinach od zakażenia.Po 24 godzinach od zakażenia nastąpił 5% i 7% spadek znormalizowanej wartości indeksu komórkowego, gdy komórki śródbłonka zostały zainfekowane przy wielokrotności infekcji wynoszącej odpowiednio 0,1 i jeden. Zmniejszenie o 50% wartości znormalizowanego indeksu komórkowego odnotowano po 96 godzinach od zakażenia i 66,75 godzin po zakażeniu po zakażeniu przy wielokrotności infekcji wynoszącej odpowiednio 0,1 i jeden. Znormalizowana wartość indeksu komórkowego osiągnęła najniższy punkt po 107 godzinach od zakażenia, ze zmniejszeniem o 51% i 60% po zakażeniu przy wielokrotności infekcji wynoszącej odpowiednio 0,1 i jeden.Stwierdzono, że znormalizowana wartość indeksu komórkowego ma wzrost o 4% i 13% od 107 godzin po zakażeniu do końca eksperymentu po 168 godzinach od infekcji. Przed każdym eksperymentem RTCA niezbędna jest weryfikacja rezystora przy użyciu 96-dołkowej płytki RTCA, aby upewnić się, że każdy bioczujnik działa dobrze i zapewnia wiarygodne wartości indeksu komórek.

monitoring-changes-human-umbilical-vein-endothelial-cells-upon-viral

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół wideo przedstawia izolację i hodowlę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępekowej (HUVEC) z ludzkiej pępowiny. Po izolacji komórki te mogą być wykorzystywane w testach angiogenezy in vitro, takich jak zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego, zaprezentowany również przez laboratorium Hughesa.<br...

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

Niniejszy artykuł opisuje technikę in vitro służącą do monitorowania naciekania komórek nowotworowych przez monowarstwę komórek śródbłonka. Dane są pozyskiwane w czasie rzeczywistym jako funkcja zmian impedancji na powierzchni elektrod znajdujących się na dnie studzienki.

Technika oparta na pomiarze impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

W tym filmie pokazujemy proces monitorowania zdarzeń komórkowych w czasie rzeczywistym, w tym proliferację przylegających komórek, za pomocą testu impedancji komórkowej. W tym przypadku przylegające ogniwa działają jak izolatory, ograniczając przepływ prądu między elektrodami i zwiększając impedancję.

Analiza oparta na impedancji komórkowej do monitorowania procesów komórkowych w czasie rzeczywistym

Ten film opisuje technikę opartą na impedancji komórkowej do badania kinetyki przetrwania wirusów wywołujących efekty cytopatyczne. Metoda mierzy impedancję elektryczną zakażonych wirusem przylegających komórek wstępnie potraktowanych solą fizjologiczną.

Test kinetyki przeżycia oparty na impedancji komórkowej w celu oceny przeżycia wirusa

Ten protokół omawia Wykrywanie Impedancji Elektrycznej Komórki, metodę rejestrowania i analizy widma impedancji przylegających komórek do ilościowego określenia przyczepienia, proliferacji, ruchliwości i reakcji komórkowych na bodźce farmakologiczne i toksyczne. Położono nacisk na wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-substrat.

Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Szczegółowo opisano protokoły hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), przejściowej transfekcji znakowanych fluorescencyjnie markerów wzrostu mikrotubul, obrazowania żywych komórek i automatycznej analizy dynamiki wzrostu mikrotubul międzyfazowych.

Obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości i automatyczna analiza dynamiki mikrotubul w żywych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej

Zgłoszono tutaj protokół do ilościowego oznaczania zakaźnych cząsteczek wirusa za pomocą monitorowania w czasie rzeczywistym impedancji elektrycznej zainfekowanych komórek. Praktyczne zastosowanie tej metody przedstawiono poprzez ilościowe określenie rozpadu wirusa grypy A przy różnych parametrach fizykochemicznych naśladujących warunki środowiskowe.

Monitorowanie przeżywalności wirusa grypy poza gospodarzem za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym

Tutaj pokazujemy użycie komórkowej impedancji elektrycznej (CEI) jako bardzo łatwej i prostej metody badania infekcji wirusem Zika i jego replikacji w ludzkich komórkach w czasie rzeczywistym. Ponadto test CEI jest przydatny do oceny związków przeciwwirusowych.

Komórkowa platforma impedancji elektrycznej do oceny inhibitorów wirusa Zika w czasie rzeczywistym

Opisany tutaj test TCID50 wykorzystuje bezoznakowe pomiary impedancji w czasie rzeczywistym oraz moduł Virology systemu, aby obiektywnie monitorować efekty cytopatyczne (CPE) wywołane wirusem w czasie rzeczywistym. Ten uprościony test znacznie skraca czas pracy praktycznej, jednocześnie wspierając wysokoprzepustowe, ilościowe pomiary kinetyczne CPE oraz umożliwiając zautomatyzowane, w czasie rzeczywistym obliczenia TCID50.

Uproszczony, bezoznakowy, w czasie rzeczywistym 50% testu zakaźnego hodowli tkanek (TCID50) z impedancją do automatycznego ilościowania miana wirusowego

Poznaj metodę ciągłego monitorowania zmian morfologicznych w komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) podczas zakażenia wirusem Zika za pomocą systemu RTCA. Ta nieinwazyjna technika umożliwia wykrywanie przejściowych efektów, takich jak odłączanie się komórek i wyciek naczyniowy, dostarczając cennych informacji o integralności naczyń krwionośnych.

Monitorowanie zmian w komórkach śródbłonka żyły pępowinowej po zakażeniu wirusowym za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym opartej na impedancji (Wideo) | JoVE Journal

Monitorowanie zmian w komórkach śródbłonka żyły pępowinowej po zakażeniu wirusowym za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym opartej na impedancji

Przeglądaj więcej filmów