Monitorowanie zmian w komórkach śródbłonka żyły pępowinowej po zakażeniu wirusowym za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym opartej na impedancji

Protokół ten pozwolił na ciągłe wykrywanie przejściowego efektu w postaci pewnych zmian morfologicznych podczas infekcji wirusowej, takich jak oderwanie i unoszenie się przylegających komórek. Protokół ten pozwolił na nieinwazyjne i niepracochłonne podejście do ciągłego monitorowania zmian morfologicznych komórek i wychwytywania przejściowych efektów, takich jak przeciek naczyniowy, który można było przeoczyć w teście końcowym. Protokół ten może być używany do analizy zmian integralności naczyń krwionośnych innych linii komórkowych w różnych konfiguracjach eksperymentalnych, jeśli komórki są komórkami przylegającymi.

Po przygotowaniu HUVEC uruchom aplikację RTCA, klikając dwukrotnie ikonę na pulpicie. Wpisz nazwę użytkownika i hasło w oknie logowania. Umieść 96-dołkową płytkę rezystora RTCA z dołkiem A1 skierowanym do wewnątrz do stacji RTCA znajdującej się w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Następnie przejdź do zakładki notatek z eksperymentu w oprogramowaniu RTCA i wpisz nazwę eksperymentu, numer seryjny urządzenia i typ urządzenia. Na karcie układu pod zakładką komórki oprogramowania RTCA zaznacz wszystkie studnie i kliknij prawym przyciskiem myszy podświetlone studnie, aby upewnić się, że wszystkie studnie są włączone. Następnie otwórz zakładkę harmonogramu w oprogramowaniu RTCA.

Kliknij przycisk Step_1 i ustaw liczbę przeciągnięć na 10 sekund, a interwał na 30 sekund. Następnie kliknij start kontynuuj w lewym górnym rogu oprogramowania, aby rozpocząć weryfikację. Po uruchomieniu otwórz kartę indeksu komórki, aby sprawdzić dane.

Wszystkie wartości indeksu komórki powinny być mniejsze niż 0,063. Następnie sprawdź surowe dane skanowania w dolnej części zakładki indeksu komórek pod kątem powtarzających się wzorców wartości, jak opisano w manuskrypcie. Aby zakończyć przebieg weryfikacji, kliknij opcję Blacha i wybierz opcję Blacha zwalniająca.

Wyjmij 96-dołkową płytkę rezystora RTCA ze stacji RTCA. Aby uzyskać podstawowe informacje na temat RTCA, umyj dwukrotnie specjalistyczną złotą płytkę mikroelektrody pokrytą kolagenem typu 1 60 mikrolitrami na studzienkę HBSS. Wyrzuć pozostały HBSS i dodaj 50 mililitrów na studzienkę macierzy zewnątrzkomórkowej.

Następnie umieść płytkę w stacji RTCA znajdującej się w inkubatorze do hodowli komórkowych z dołkiem A1 skierowanym do wewnątrz. Na karcie uwag exp w oprogramowaniu RTCA wpisz nazwę eksperymentu, numer seryjny urządzenia i typ urządzenia. Przejdź do zakładki komórki w oprogramowaniu RTCA i wybierz kartę układu.

Zaznacz studnie, które mają być używane, i kliknij prawym przyciskiem myszy podświetlone studnie, aby upewnić się, że wszystkie studnie są włączone. Teraz przejdź do zakładki harmonogram w oprogramowaniu RTCA. Kliknij Step_1, a następnie kliknij przycisk Start lub Kontynuuj w lewym górnym rogu, aby uzyskać odczyt tła.

Płytka jest teraz gotowa do wysiewu komórek i usuwania ze stacji RTCA. Następnie zasiej od 10 do czwartej komórki na studzienkę HUVEC na złotej płytce mikroelektrody z 50 mikrolitrami na studzienkę kondycjonowanego podłoża. Umieść płytkę z powrotem w stacji RTCA znajdującej się w inkubatorze do hodowli komórkowych, ze studzienką A1 skierowaną do wewnątrz.

Następnie w zakładce harmonogramu oprogramowania kliknij dodaj krok w lewym górnym rogu. Kliknij Step_2. Zmień przebiegi na 601, interwał na dwie minuty, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.

Kliknij Step_2, a następnie kliknij start lub kontynuuj w lewym górnym rogu oprogramowania. Po 20 godzinach inkubacji, gdy wartości indeksu komórek w zakładce wykresu studzienki pokazują plateau, płytka jest gotowa do infekcji. Na karcie harmonogramu w oprogramowaniu RTCA kliknij przycisk przerwij krok.

Płytka jest teraz gotowa do wyjęcia ze stacji RTCA. Aby zainfekować wirusa Hpec, należy pobrać zapas wirusa Zika z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć zapas wirusa Zika macierzą zewnątrzkomórkową bez surowicy w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych, aby uzyskać wielokrotność infekcji 0,1 i jeden.

Następnie wyrzuć kondycjonowane podłoże z każdej studzienki i przepłucz każdą studzienkę 60 mikrolitrami HBSS, używając boku studzienki. Dodać 40 mikrolitrów rozcieńczonej próbki wirusa do studzienki, zaczynając od najwyższego do najniższego rozcieńczenia, używając strony studzienki. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aby umożliwić wchłanianie wirusa.

Obracaj płytkę pięć razy co 15 minut, aby umożliwić wchłanianie wirusa przez monowarstwę komórkową. Po jednej godzinie inkubacji usunąć i wyrzucić zawiesinę wirusa od najniższego stężenia do najwyższego. Umyj zainfekowane komórki dwukrotnie 60 mililitrami HBSS.

Na studzienki nałożyć macierz zewnątrzkomórkową uzupełnioną 2% FBS. W przypadku studzienek kontroli pozytywnej rozcieńczyć trombinę w 20 jednostkach na mililitr macierzą zewnątrzkomórkową uzupełnioną 2% FBS i pokryć studzienki trombiną zawierającą pożywkę macierzy zewnątrzkomórkowej, używając boku studzienki. Teraz kliknij kartę harmonogramu i dodaj krok w lewym górnym rogu.

Przejdź do Step_3 i zmodyfikuj przebiegi na 3 601, a interwał na dwie minuty. Kliknij Zastosuj, a następnie kliknij OK w wyskakującym oknie. Umieść zainfekowaną specjalistyczną złotą płytkę mikroelektrodową z dołkiem A1 skierowaną do wewnątrz do stacji RTCA znajdującej się w inkubatorze hodowli.

Na koniec kliknij Step_3 i kliknij start kontynuuj w lewym górnym rogu oprogramowania. Wartość indeksu komórkowego HUVEC zakażonych wirusem Zika P6-740 przy wielokrotności infekcji 0,1 zaczęła spadać po 15 godzinach od zakażenia, w porównaniu z negatywną kontrolą infekcji. Osoby zakażone wirusem Zika P6-740 przy wielokrotności jednego zakażenia wykazały spadek indeksu komórkowego po 11 godzinach od zakażenia.

Po 24 godzinach od zakażenia nastąpił 5% i 7% spadek znormalizowanej wartości indeksu komórkowego, gdy komórki śródbłonka zostały zainfekowane przy wielokrotności infekcji wynoszącej odpowiednio 0,1 i jeden. Zmniejszenie o 50% wartości znormalizowanego indeksu komórkowego odnotowano po 96 godzinach od zakażenia i 66,75 godzin po zakażeniu po zakażeniu przy wielokrotności infekcji wynoszącej odpowiednio 0,1 i jeden. Znormalizowana wartość indeksu komórkowego osiągnęła najniższy punkt po 107 godzinach od zakażenia, ze zmniejszeniem o 51% i 60% po zakażeniu przy wielokrotności infekcji wynoszącej odpowiednio 0,1 i jeden.

Stwierdzono, że znormalizowana wartość indeksu komórkowego ma wzrost o 4% i 13% od 107 godzin po zakażeniu do końca eksperymentu po 168 godzinach od infekcji. Przed każdym eksperymentem RTCA niezbędna jest weryfikacja rezystora przy użyciu 96-dołkowej płytki RTCA, aby upewnić się, że każdy bioczujnik działa dobrze i zapewnia wiarygodne wartości indeksu komórek.