Identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka

Dwie przedstawione tutaj metody analizy fenotypowej oferują wysokiej jakości obrazy, które są wystarczające do przeprowadzenia ilościowej analizy fenotypowej i wykazania odpowiedzi fenotypowych na leczenie peptydami ze szczegółami naskórka. W związku z tym te dwie metody można wykorzystać do zrozumienia wzorca i rozwoju komórek naskórka. Te dwie metody są stosunkowo łatwymi i niezawodnymi technikami, ponieważ nie wymagają żadnych toksycznych chemikaliów ani kawałka naskórka, które są szeroko stosowane do analizy fenotypowej naskórka.

Techniki te są jednak skomplikowane i wymagają specjalistycznego szkolenia. Na początek ostrożnie wybierz i wytnij jeden z liścieni z poszczególnych sadzonek, które rosną równomiernie z innymi sadzonkami na talerzu, aby ograniczyć zmienność. Umieścić każdy liścienie w probówce mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr roztworu utrwalającego za pomocą kleszczy i pozostawić próbkę w roztworze utrwalającym na noc w temperaturze pokojowej.

Usuń roztwór utrwalający i dodaj jeden mililitr 70% etanolu. Odwrócić probówkę kilka razy i pozostawić probówkę zawierającą próbki w temperaturze pokojowej na około 30 minut. Powtórz ten krok, używając jednego mililitra 50% etanolu, a następnie 20% etanolu.

Zastąp jeden mililitr 20% etanolu jednym mililitrem wody destylowanej, odwróć kilkakrotnie probówkę zawierającą próbki liścienia i pozostaw na około 30 minut. Usuń całą wodę destylowaną z probówki i natychmiast dodaj około 200 mikrolitrów roztworu barwiącego błękit toluidynowy O lub TBO na około dwie minuty. Usuń roztwór barwiący TBO tak dokładnie, jak to możliwe, a następnie natychmiast umyj próbki kilka razy, dodając jeden mililitr świeżej wody destylowanej.

W okapie z przepływem laminarnym ostrożnie przesadź od 10 do 12 jednodniowych sadzonek rzodkiewnika z każdej z dwóch przygotowanych płytek do 24-dołkowej płytki zawierającej 1,5 mililitra połowy MS płynnego podłoża w każdej studzience. Dodać sam bufor HCL o stężeniu 50 milimolowym tris lub dwa różne stężenia peptydu do każdej studzienki zawierającej kiełki kiełkujące na połówkach MS na płytkach agarowych. Delikatnie wymieszaj sadzonki z samym buforem lub roztworem peptydu za pomocą pipety i uszczelnij płytkę taśmą z mikroporami.

Inkubować płytkę testową w warunkach długiego dnia przez pięć do siedmiu dni w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Przenieś sadzonkę ze studni na szkiełko przykrywkowe i wypreparuj liścienie sadzonki. Ułóż abaksjalną stronę liścienia za pomocą kleszczy i pokrój ją na małe kawałki.

Weź kolejne czyste szkiełko mikroskopowe i umieść na nim kroplę roztworu jodku propidyny. Umieść jeden z małych kawałków liścienia w kropli za pomocą kleszczy i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe. Nałóż dodatkowy roztwór jodku propidyny na krawędź szkiełka nakrywkowego, aby usunąć wszelkie powstałe pęcherzyki powietrza.

Zobrazuj odbąbkową stronę liścienia za pomocą mikroskopu konfokalnego i porównaj obrazy z obrazami z sadzonek wyhodowanych w połowie pożywki MS zawierającej tylko bufor. Pokazano tutaj obrazy liścieni Abaxial z 10-dniowych siewek trzech genotypów Arabidopsis, typu dzikiego, wyciszonej linii STOMAGEN i mutantów epf1 epf2. W tym przypadku wyciszona linia STOMAGEN reprezentuje genotypy z małą liczbą aparatów szparkowych, a mutanty epf1 epf2 reprezentują genotypy z dużą liczbą aparatów szparkowych.

Do analizy ilościowej fenotypu naskórka wykorzystano reprezentatywne obrazy naskórka liścieni z 10-dniowych siewek typu dzikiego, tmm i linii transgenicznych zawierających indukowany estradiolem konstrukt nadekspresji epf2 lub epf1. Reprezentatywne obrazy konfokalne naskórka liścia typu dzikiego i epf2 hodowanego przez sześć do siedmiu dni w roztworze buforowym oraz naskórka liścienia epf2 wyhodowanego z dwiema różnymi partiami peptydów epf2 pokazano na tym rysunku. Wykonując tę procedurę, upewnij się, że wyciąłeś jeden z liścieni z pojedynczej sadzonki, która już rośnie równomiernie z innymi sadzonkami.

Wybierz również sadzonkę, która nie dotyka podłoża MS, aby ograniczyć zmienność. Inną kwestią, o której należy pamiętać, jest to, że nie należy umieszczać więcej niż pięciu liścieni w jednej probówce do mikrowirówki. Delikatnie przesuń tubkę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie plam TBO wokół liścieni, aby dobrze je zabarwić.

Biorąc pod uwagę, że w roztworze peptydowym znajduje się wiele peptydów strukturalnych, ta metoda testu biologicznego będzie bardzo przydatna do identyfikacji prawidłowo sfałdowanych i bioaktywnych form peptydu oraz ich funkcji biologicznych.