Name: Identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:05:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Poznaj metody fenotypowania aparatów szparkowych w Arabidopsis bez toksycznych chemikaliów. Techniki barwienia toluidynowym niebieskim O umożliwiają analizę rozwoju naskórka i odpowiedzi na peptydy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania zostały sfinansowane przez program Discovery Kanadyjskiej Rady ds. Zasobów Naturalnych i Inżynierii (NSERC) oraz Concordia University. K.B. jest wspierany przez National Overseas Scholarship z Indii.

1. Barwienie liścieni Arabidopsis za pomocą TBO
<ol>
	<li>Sterylizacja nasion i warunki wzrostu
	<ol>
		<li>Wysterylizuj ~30 nasion Arabidopsis na genotyp w probówce do mikrowirówki, dodając 1 ml roztworu do sterylizacji nasion (33% komercyjnego wybielacza, 0,1% Triton X-100) i delikatnie kołysz przez 10-12 minut w temperaturze pokojowej (RT). 
		UWAGA: Wysterylizuj ~30 nasion akcesji Arabidopsis typu dzikiego Columbia (Col-0) i/lub ~60 nasion roślin transgenicznych zawierających chemicznie indukowany gen (np. Est::EPF27), aby użyć transgenicznych sadzonek wyhodowanych na 1/2 płytkach Murashige i Skoog (MS) (2,16 g/L zawierających 0,8% agaru [w/v]) bez induktora (np. β-estradiolu) jako kontroli (<silna klasa="xfig">Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Usuń roztwór sterylizacyjny, umyj nasiona czterokrotnie 1 ml sterylnej wody w okapie z przepływem laminarnym i zawieś je ponownie w ~200 μl sterylnego 0,1% agaru.</li>
		<li>Wysiewaj ~30 nasion na genotyp na płytkach agarowych 1/2 MS lub płytkach agarowych 1/2 MS zawierających induktor (np. 10 μM β-estradiolu) w celu chemicznej indukcji transgenu (np. Est::EPF27) za pomocą pipety i uszczelnij taśmą mikroporową. 
		UWAGA: Nasiona muszą być równomiernie rozłożone na talerzu, aby uniknąć umieszczania ich w bliskiej odległości, ponieważ uniemożliwi to równomierny wzrost sadzonek.</li>
		<li>Rozwarstwić nasiona, umieszczając płytki w temperaturze 4 °C bez światła przez 3-5 dni, aby zsynchronizować kiełkowanie.</li>
		<li>Po stratyfikacji inkubować płytki w komorze wzrostowej w temperaturze 22 °C pod światłem 120 μmol·m−2·s−1 z fotoperiodem 16 godzin światła i 8 godzin ciemności przez 10 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek i barwienie TBO liścieni Arabidopsis
	<ol>
		<li>Po 10 dniach od wykiełkowania ostrożnie wybierz i wytnij jeden z liścieni z poszczególnych siewek, które rosną równomiernie z innymi sadzonkami na talerzu, aby ograniczyć zmienność. 
		UWAGA: Liścienie pobiera się z 10-dniowych siewek, ponieważ nie mają włosków i niedojrzałych komórek naskórka, co upraszcza interpretację fenotypów naskórka.</li>
		<li>Umieścić każdy liścienie w probówce do mikrowirówki zawierającej 1 ml roztworu utrwalającego (9:1 etanol do kwasu octowego) za pomocą kleszczy i pozostawić próbkę w roztworze utrwalającym na noc, co najmniej w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: W takim stanie próbki mogą być przechowywane w tym stanie przez okres do kilku lat. Obraz Rysunek 2E został pobrany z próbki liścienia, która była przechowywana w roztworze utrwalającym przez ponad 3 lata. Ważne jest, aby trzymać liścienie w roztworze utrwalającym natychmiast po pokrojeniu i umieszczać nie więcej niż pięć liścieni w każdej probówce mikrowirówki w celu późniejszego przygotowania jednorodnej próbki.</li>
		<li>Usuń roztwór utrwalający i dodaj 1 ml 70% etanolu. Po kilkukrotnym odwróceniu probówki, probówkę z próbkami należy pozostawić w temperaturze RT na ~ 30 min.</li>
		<li>Powtórzyć krok 1.2.3, używając 1 ml 50% etanolu, a następnie 20% etanolu.</li>
		<li>Zastąp 1 ml 20% etanolu 1 ml wody destylowanej, a następnie pozostaw probówkę zawierającą próbki liścienia na ~30 minut po kilkukrotnym odwróceniu probówki. 
		UWAGA: Próbki mogą pozostawać w wodzie destylowanej dłużej niż 24 godziny, ale nie jest to zalecane do uzyskiwania dobrej jakości obrazów (dobrze wybarwionych obrazów dla różnych typów komórek naskórka) do analizy ilościowej.</li>
		<li>Usuń całą wodę destylowaną z probówki. Następnie natychmiast dodać ~200 μl roztworu barwiącego TBO (0,5% TBO wH2O, przefiltrowany) przez ~2 min. 
		UWAGA: Upewnij się, że każda próbka liścienia jest równomiernie wystawiona na działanie roztworu TBO, delikatnie przesuwając probówki podczas inkubacji. Aby zapobiec nadmiernemu barwieniu TBO (czas barwienia jest niezbędny i może być zmienny dla każdego genotypu), nie należy przetwarzać więcej niż sześciu probówek zawierających próbki na raz.</li>
		<li>Usuń roztwór barwiący TBO tak dokładnie, jak to możliwe, a następnie natychmiast umyj próbki kilka razy, dodając 1 ml świeżej wody destylowanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie i analiza danych
	<ol>
		<li>Weź szkiełko mikroskopowe i dodaj kroplę 15% glicerolu (~50 μL). Umieść liścienie stroną aosiową do góry w 15% glicerolu na szkiełku za pomocą cienkich kleszczyków. Następnie delikatnie przykryj go szkiełkiem nakrywkowym, aby wszelkie powstałe pęcherzyki powietrza można było usunąć z próbki.</li>
		<li>Zobrazuj abaksjalną stronę naskórka liścienia za pomocą mikroskopu jasnego pola (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1 i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2), a następnie zbadaj fenotyp naskórka, licząc liczbę aparatów szparkowych i innych typów komórek naskórka.</li>
		<li>Dla każdego genotypu oblicz fenotyp naskórka, korzystając z następujących wzorów opisanych przez Jangra et al.17: 
		Wskaźnik szparkowy (%) = (liczba aparatów szparkowych/całkowita liczba komórek naskórka) × 100 
		Gęstość aparatów szparkowych (mm−2) = Liczba aparatów szparkowych/Powierzchnia (mm2) 
		UWAGA: Należy zobrazować co najmniej osiem liścieni (N = 8) dla każdego genotypu i udokumentować fenotyp naskórka każdego genotypu, porównując go z fenotypem rośliny typu dzikiego i/lub roślin transgenicznych wykazujących ekspresję chemicznie indukowanego transgenu uprawianego bez induktora.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Testy biologiczne dla peptydów szparkowych
UWAGA: Procedura testów biologicznych jest pokazana w Rysunek 3.
<ol>
	<li>Sterylizacja nasion i warunki wzrostu
	<ol>
		<li>Wysterylizuj ~ 25 nasion do każdego zabiegu, jak powyżej, i wysiej około połowy nasion na każdą z dwóch płytek agarowych 1/2 MS w okapie z przepływem laminarnym. 
		UWAGA: Użyj genotypu z wysokimi i/lub niskimi komórkami naskórka (np. epf22) zamiast używać tła typu dzikiego (np. Col-0), aby łatwo wykryć aktywność biologiczną peptydów na wzorcu i różnicowaniu komórek naskórka (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
		<li>Warstwować nasiona przez 3 dni w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
		<li>Wyjąć każdą z dwóch płytek w odstępach ~10 godzin i inkubować nasiona na płytkach w temperaturze 22 °C w świetle 120 μmol·m−2·s−1 z fotoperiodem 16 godzin światła i 8 godzin ciemności przez 1 dzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie peptydowe i obrazowanie
	<ol>
		<li>W okapie z przepływem laminarnym ostrożnie przesadź 10-12 jednodniowych sadzonek rzodkiewnika z każdej z dwóch przygotowanych płytek do 24-dołkowej płytki zawierającej 1,5 ml 1/2 MS płynnego podłoża w każdej studzience (~ 20 sadzonek na studzienkę). 
		UWAGA: Czas leczenia sadzonek peptydami ma kluczowe znaczenie dla fenotypowych wyników leczenia peptydami, dlatego należy przygotować nasiona na dwóch oddzielnych płytkach, aby uzyskać dwa różne etapy rozwoju sadzonek do zabiegu.</li>
		<li>Dodaj sam bufor (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) lub dwa różne stężenia peptydu (zazwyczaj 1 μM i 2,5 μM peptydu w 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) do każdej studzienki zawierającej ~ 20 jednodniowych sadzonek Arabidopsis kiełkujących na 1/2 MS płytek agarowych. 
		UWAGA: Wyjmij porcje roztworu peptydu z zamrażarki i przechowuj je w temperaturze pokojowej przez kilka minut przed zabiegiem. Peptydy przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C są stabilne przez kilka lat, ale należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania, przechowując roztwór peptydu w małych porcjach.</li>
		<li>Po delikatnym wymieszaniu sadzonek z samym buforem lub roztworem peptydów za pomocą pipety, uszczelnij płytkę taśmą z mikroporami. Inkubować płytkę testową w warunkach długiego dnia (16 godzin fotoperiodu, 120 μmol·m−2·s−1 światła) przez 5-7 dni w temperaturze 22 °C. 
		UWAGA: Nie pozwól, aby sadzonki rosły zbyt blisko siebie, aby każda sadzonka miała równomierną ekspozycję na roztwór peptydu. Delikatnie obracaj płytkę przez 2-3 godziny przed inkubacją płytki w komorze wzrostowej, aby zwiększyć napowietrzenie.</li>
		<li>Przenieś każdą sadzonkę ze studzienki zawierającej sam bufor lub peptyd na szkiełku przykrywającym i rozetnij liścienie sadzonki. Ułóż abaksjalną stronę liścienia za pomocą kleszczy i pokrój ją na małe kawałki.</li>
		<li>Weź kolejne czyste szkiełko mikroskopowe i umieść na nim kroplę roztworu jodku propidyny (~25 μL, 2 mg/ml w H2O).</li>
		<li>Umieść jeden z małych kawałków liścienia w kropli roztworu jodku propidyny za pomocą kleszczy i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe. Nałóż dodatkowy roztwór jodku propydyny na krawędź szkiełka nakrywkowego, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które się utworzyły.</li>
		<li>Zobrazuj stronę abaksjalną liścienia za pomocą mikroskopu konfokalnego i porównaj obrazy z obrazami z sadzonek wyhodowanych na pożywce 1/2 MS zawierającej tylko bufor. 
		UWAGA: Obrazy przedstawione w Rysunek 4 zostały pobrane z wild-type Col-0 lub epf22,5 sadzonek, które zostały potraktowane tylko buforem (Rysunek 4A, B) lub dwiema partiami roztworu peptydu EPF2 (Rysunek 4C-F) i były przechowywane w temperaturze -80 °C przez 1 rok.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+peptide+gene+EPF1+enforces+the+stomatal+one-cell-spacing+rule%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule.</a> Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).</li>
<li>Hara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cell+density+is+autoregulated+via+a+secretory+peptide%2C+EPIDERMAL+PATTERNING+FACTOR+2+in+Arabidopsis+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves.</a> Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).</li>
<li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+density+is+controlled+by+a+mesophyll-derived+signaling+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule.</a> Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).</li>
<li>Sugano, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomagen+positively+regulates+stomatal+density+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis.</a> Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).</li>
<li>Hunt, L., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+peptide+EPF2+controls+asymmetric+cell+divisions+during+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development.</a> Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).</li>
<li>Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signalling+peptide+EPFL9+is+a+positive+regulator+of+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development.</a> New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).</li>
<li>Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+of+ligand-receptor+pairs+specifying+stomatal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning.</a> Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).</li>
<li>Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+patterning+and+differentiation+by+synergistic+interactions+of+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases.</a> Science. 309 (5732), 290-293 (2005).</li>
<li>Nadeau, J. A., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stomatal+distribution+on+the+Arabidopsis+leaf+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface.</a> Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+function+of+Arabidopsis+SERK+family+receptor-like+kinases+in+stomatal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning.</a> Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).</li>
<li>Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+stomatal+initiation+is+controlled+by+MAPK-mediated+regulation+of+the+bHLH+SPEECHLESS%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS.</a> Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).</li>
<li>Yang, M., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+too+many+mouths+and+four+lips+mutations+affect+stomatal+production+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).</li>
<li>Theunissen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+studying+grass+leaf+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An improved method for studying grass leaf epidermis.</a> Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).</li>
<li>Venkata, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((crw1--A+novel+maize+mutant+highly+susceptible+to+foliar+damage+by+the+western+corn+rootworm+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle.</a> PLoS One. 8 (8), 71296(2013).</li>
<li>Tucker, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+small+RNA+pathways+promote+the+mitotic+events+of+megagametogenesis+during+female+reproductive+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis.</a> Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).</li>
<li>Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NMR+structure+of+stomagen+reveals+the+basis+of+stomatal+density+regulation+by+plant+peptide+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones.</a> Nature Communications. 2, 512(2011).</li>
<li>Jangra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplicated+antagonistic+EPF+peptides+optimize+grass+stomatal+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation.</a> Development. 148 (16), (2021).</li>
<li>Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xylem+and+phloem+transcriptomes+from+secondary+tissues+of+the+Arabidopsis+root-hypocotyl%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl.</a> Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).</li>
<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+inflorescence+architecture+by+intertissue+layer+ligand-receptor+communication+between+endodermis+and+phloem%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).</li>
<li>Tameshige, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+peptide+and+its+receptors+shape+the+auxin+response+pattern+and+leaf+margin+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis.</a> Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).</li>
<li>Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+signaling+specificity+in+Arabidopsis+by+spatially+restricted+buffering+of+ligand-receptor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions.</a> The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).</li>
<li>Uchida, N., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plant+vascular+stem+cells+by+endodermis-derived+EPFL-family+peptide+hormones+and+phloem-expressed+ERECTA-family+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).</li>
<li>Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EPFL+Signals+in+the+boundary+region+of+the+SAM+restrict+its+size+and+promote+leaf+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation.</a> Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przedstawione tutaj dwie metody analizy fenotypowej służące do identyfikacji i charakterystyki genów kontrolujących wzorzec i różnicowanie aparatów szparkowych są wygodnymi i wiarygodnymi testami, ponieważ protokoły nie wymagają stosowania peelingów naskórka i specjalistycznego sprzętu (które są czasochłonne i wymagają specjalnego szkolenia w zakresie przygotowania próbki), ale dają wysokiej jakości obrazy do ilościowej analizy fenotypów naskórka.
Ograniczeniem tej techniki analizy fenotypowej...

Prawidłowe tworzenie wzorów i różnicowanie aparatów szparkowych roślin jest kluczowe dla ich funkcji w dwóch podstawowych procesach biologicznych, fotosyntezie i transpiracji, i jest egzekwowane przez szlaki sygnałowe peptydów EPF. U rzodkiewnika trzy wydzielane peptydy bogate w cysteinę, EPF1, EPF2 i STOMAGEN/EPFL9, kontrolują różne aspekty rozwoju aparatów szparkowych i są odbierane przez składniki receptorów na powierzchni komórki, w tym kinazy receptorowe z rodziny ERECTA (ER, ERL1 i ERL2), SERK i TMM1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. To rozpoznanie prowadzi następnie do obniżenia poziomu czynników transkrypcyjnych, które promują różnicowanie aparatów szparkowych przez proces zależny od MAPK11. Odkrycie tych podstawowych genów aparatów szparkowych osiąga się przede wszystkim dzięki fenotypowym badaniom przesiewowym mutantów wykazujących defekty naskórka. W artykule przedstawiono stosunkowo proste i skuteczne metody fenotypowania do wizualizacji aparatów szparkowych i innych komórek naskórka, które są niezbędne do identyfikacji i scharakteryzowania potencjalnych genów kontrolujących wzorzec i różnicowanie aparatów szparkowych.
Obserwacja szczegółów naskórka roślinnego zazwyczaj odbywa się za pomocą peelingów naskórka z lub bez barwienia barwnikiem, takim jak błękit toluidynowy O (TBO) lub safranina12,13,14. Jednak głównym wyzwaniem tych metod jest to, że wymagają specjalistycznego szkolenia, aby obrać naskórek liścia bez rozdzierania tkanek oraz uważnie obserwować i analizować dane dotyczące wzorów, unikając jednocześnie obrazów wykonanych z różnych części liścia. Zabiegi chemiczne mające na celu oczyszczenie próbek tkanek za pomocą odczynników, takich jak roztwory czyszczące na bazie hydratu chloralu, są również szeroko stosowane w przypadku różnych materiałów biologicznych8,15; Zabiegi te generują wiele informacji fenotypowych, dostarczając wysokiej jakości obrazów, ale wymagają również użycia niebezpiecznych chemikaliów (np. formaldehydu, hydratu chloralu). W artykule przedstawiono po raz pierwszy stosunkowo łatwą i wygodną metodę fenotypowania, która daje obrazy wystarczające do analizy ilościowej, ale nie wymaga użycia niebezpiecznych substancji chemicznych i skórek liści naskórka do przygotowania próbki. Naskórek liścienia barwiony TBO jest również idealny do badania rozwoju aparatów szparkowych, ponieważ brak trichomów i mniejszy gradient rozwojowy w liścieniach pozwalają na prostą i łatwą interpretację fenotypów naskórka.
Szparkowe peptydy EPF należą do grupy specyficznych dla roślin, bogatych w cysteinę peptydów, które mają stosunkowo duże dojrzałe rozmiary i wewnątrzcząsteczkowe wiązania dwusiarczkowe między konserwatywnymi resztami cysteiny. Prawidłowe fałdowanie konformacyjne ma kluczowe znaczenie dla ich funkcji biologicznej, ale peptydy bogate w cysteinę, które są wytwarzane w wyniku syntezy chemicznej lub heterologicznego systemu rekombinacji, mogą być nieaktywne i są mieszaniną zarówno prawidłowo złożonych, jak i rozłożonych peptydów3,7,16. W związku z tym badania przesiewowe bioaktywnych peptydów, które odgrywają rolę w kontrolowaniu rozwoju aparatów szparkowych, były bardzo trudnym zadaniem. Manuskrypt ten dodatkowo opisuje test biologiczny w celu lepszej identyfikacji i charakterystyki bioaktywnych peptydów szparkowych. W tej metodzie sadzonki Arabidopsis są hodowane na wielodołkowej płytce zawierającej pożywkę z potencjalnymi peptydami i bez nich przez 6-7 dni. Następnie naskórek liścienia jest obrazowany za pomocą mikroskopu konfokalnego. Ogólnie rzecz biorąc, aby wyraźnie zobrazować aktywność biologiczną potencjalnych peptydów w rozwoju aparatów szparkowych, genotypy, które wytwarzają więcej i/lub mniej komórek linii szparkowej, takie jak mutant epf2, który wytwarza więcej komórek naskórka, oraz linia STOMAGEN-ami, która nadaje zmniejszoną gęstość komórek naskórka2,4,5, są używane jako dodatek do Arabidopsis typu dzikiego kontroli (Col-0) dla testów biologicznych.
Ogólnie rzecz biorąc, dwa przedstawione tutaj protokoły mogą być używane do szybkiej i efektywnej oceny różnych fenotypów naskórka oraz do badania przesiewowego małych peptydów i hormonów, które odgrywają rolę w kontrolowaniu i rozwoju aparatów szparkowych.

<table><tbody><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 18 mm x 18 mm</td><td>VWR</td><td>16004-326</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe sterylne płytki z pokrywką</td><td>VWR</td><td>CA62406-183</td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna 3M Micropore</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027-761</td><td>Mikroporowata taśma chirurgiczna papierowa służąca do uszczelniania płytek MS</td></tr><tr><td>76 x 26 mm Szkiełko mikroskopowe</td><td>TLG</td><td>GEW90-2575-03</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, &ge; 99.8%&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td></td></tr><tr><td>Bleech</td><td>Wybielacz domowy (np. Clorox)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td>Nikon C2 obsługiwany przez NIS-Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Greenfield</td><td>P210EAAN</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>Open-srouce</td> <td>(Fidżi to tylko) ImageJ v2.1/1.5.3j</td><td>Pobrane z https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>Kleszcze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka witamin Gamborg</td><td>Cassson Labs</td><td>GBL01-100ML</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Komory wzrostu</td><td>Conviron,&nbsp; model E15</td><td></td><td>16h cykl świetlny, ustawiony na 21&deg; C o natężeniu światła 120 &mikro; mol&middot; m-2&middot; s-1.</td></tr><tr><td>Lampy</td><td>HD Supply</td><td>25272</td><td>Świetlówki&nbsp; lampy w komorach wzrostowych, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-155</td><td>Probówki, w których umieszcza się nasiona Arabidopsis thaliana w celu przeprowadzenia sterylizacji</td></tr><tr><td>Mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Eclipse TiE wyposażony w aparat cyfrowy DsRi2</td></tr><tr><td>Murashige i sole bazalne Skoog&nbsp;</td><td>Cassson Labs</td><td>MSP01-1LT</td><td>Sklep pod adresem 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Szalka Petriego 100 mm x 20 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11Z</td><td>Szalki Petriego, do których wlewa się pożywkę MS w celu hodowli Arabidopsis thaliana</td></tr><tr><td>Jodek propidium&nbsp;</td><td>VWR</td><td>39139-064</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-916-5A</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>BioShop</td><td>SUC700.5</td><td></td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris podstawa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

Aparaty szparkowe to małe pory na powierzchni roślin lądowych, które biorą udział w wymianie gazowej i uwalnianiu pary wodnej, a ich funkcja jest kluczowa dla produktywności i przetrwania roślin. W związku z tym zrozumienie mechanizmów, za pomocą których rozwijają się aparaty szparkowe i tworzą wzór, ma ogromną wartość agronomiczną. W artykule opisano dwie metody fenotypowe z wykorzystaniem liścieni Arabidopsis, które można wykorzystać do scharakteryzowania genów kontrolujących rozwój i wzorce aparatów szparkowych. W pierwszej kolejności przedstawiono procedury analizy fenotypów aparatów szparkowych przy użyciu liścieni barwionych błękitem toluidyny O. Metoda ta jest szybka i niezawodna oraz nie wymaga stosowania peelingów naskórkowych, które są szeroko stosowane do analiz fenotypowych, ale wymagają specjalistycznego przeszkolenia. Ze względu na obecność wielu reszt cysteiny, identyfikacja i wytwarzanie bioaktywnych peptydów EPF, które odgrywają rolę w rozwoju aparatów szparkowych, było wyzwaniem. W związku z tym przedstawiono drugą procedurę stosowaną do identyfikacji ligandów szparkowych i monitorowania ich aktywności biologicznej za pomocą testów biologicznych. Główną zaletą tej metody jest to, że stosunkowo łatwo daje powtarzalne dane, jednocześnie zmniejszając ilość roztworu peptydowego i czas potrzebny do scharakteryzowania roli peptydów w kontrolowaniu wzorca i rozwoju aparatów szparkowych. Ogólnie rzecz biorąc, te dobrze zaprojektowane protokoły zwiększają efektywność badania potencjalnych regulatorów szparkowych, w tym peptydów wydzielniczych bogatych w cysteinę, które wymagają bardzo złożonych struktur do swojej aktywności.

Różne transgeniczne rośliny oraz mutanty pod kątem szparyk, znane z mniejszej lub większej gęstości oraz grupowania się szpar (epf22,5, epf1 epf22,5, tmm12, linia z wyciszonym genem STOMAGEN4 oraz linie transgeniczne niosące estradiol-indukowalny konstrukt nadekspresyjny Est::EPF1 lub Est::EPF2<sup class=...

Ten artykuł opisuje dwie metody fenotypowania bez użycia peelingów naskórka do scharakteryzowania genów kontrolujących rozwój aparatów szparkowych. Pierwsza metoda pokazuje, jak analizować fenotyp aparatów szparkowych przy użyciu naskórka roślinnego barwionego błękitem O-toluidyny. Druga metoda opisuje, w jaki sposób identyfikować ligandy szparkowe i monitorować ich aktywność biologiczną.

Identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant ...

Dwie przedstawione tutaj metody analizy fenotypowej oferują wysokiej jakości obrazy, które są wystarczające do przeprowadzenia ilościowej analizy fenotypowej i wykazania odpowiedzi fenotypowych na leczenie peptydami ze szczegółami naskórka. W związku z tym te dwie metody można wykorzystać do zrozumienia wzorca i rozwoju komórek naskórka. Te dwie metody są stosunkowo łatwymi i niezawodnymi technikami, ponieważ nie wymagają żadnych toksycznych chemikaliów ani kawałka naskórka, które są szeroko stosowane do analizy fenotypowej naskórka.Techniki te są jednak skomplikowane i wymagają specjalistycznego szkolenia. Na początek ostrożnie wybierz i wytnij jeden z liścieni z poszczególnych sadzonek, które rosną równomiernie z innymi sadzonkami na talerzu, aby ograniczyć zmienność. Umieścić każdy liścienie w probówce mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr roztworu utrwalającego za pomocą kleszczy i pozostawić próbkę w roztworze utrwalającym na noc w temperaturze pokojowej.Usuń roztwór utrwalający i dodaj jeden mililitr 70% etanolu. Odwrócić probówkę kilka razy i pozostawić probówkę zawierającą próbki w temperaturze pokojowej na około 30 minut. Powtórz ten krok, używając jednego mililitra 50% etanolu, a następnie 20% etanolu.Zastąp jeden mililitr 20% etanolu jednym mililitrem wody destylowanej, odwróć kilkakrotnie probówkę zawierającą próbki liścienia i pozostaw na około 30 minut. Usuń całą wodę destylowaną z probówki i natychmiast dodaj około 200 mikrolitrów roztworu barwiącego błękit toluidynowy O lub TBO na około dwie minuty. Usuń roztwór barwiący TBO tak dokładnie, jak to możliwe, a następnie natychmiast umyj próbki kilka razy, dodając jeden mililitr świeżej wody destylowanej.W okapie z przepływem laminarnym ostrożnie przesadź od 10 do 12 jednodniowych sadzonek rzodkiewnika z każdej z dwóch przygotowanych płytek do 24-dołkowej płytki zawierającej 1,5 mililitra połowy MS płynnego podłoża w każdej studzience. Dodać sam bufor HCL o stężeniu 50 milimolowym tris lub dwa różne stężenia peptydu do każdej studzienki zawierającej kiełki kiełkujące na połówkach MS na płytkach agarowych. Delikatnie wymieszaj sadzonki z samym buforem lub roztworem peptydu za pomocą pipety i uszczelnij płytkę taśmą z mikroporami.Inkubować płytkę testową w warunkach długiego dnia przez pięć do siedmiu dni w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Przenieś sadzonkę ze studni na szkiełko przykrywkowe i wypreparuj liścienie sadzonki. Ułóż abaksjalną stronę liścienia za pomocą kleszczy i pokrój ją na małe kawałki.Weź kolejne czyste szkiełko mikroskopowe i umieść na nim kroplę roztworu jodku propidyny. Umieść jeden z małych kawałków liścienia w kropli za pomocą kleszczy i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe. Nałóż dodatkowy roztwór jodku propidyny na krawędź szkiełka nakrywkowego, aby usunąć wszelkie powstałe pęcherzyki powietrza.Zobrazuj odbąbkową stronę liścienia za pomocą mikroskopu konfokalnego i porównaj obrazy z obrazami z sadzonek wyhodowanych w połowie pożywki MS zawierającej tylko bufor. Pokazano tutaj obrazy liścieni Abaxial z 10-dniowych siewek trzech genotypów Arabidopsis, typu dzikiego, wyciszonej linii STOMAGEN i mutantów epf1 epf2. W tym przypadku wyciszona linia STOMAGEN reprezentuje genotypy z małą liczbą aparatów szparkowych, a mutanty epf1 epf2 reprezentują genotypy z dużą liczbą aparatów szparkowych.Do analizy ilościowej fenotypu naskórka wykorzystano reprezentatywne obrazy naskórka liścieni z 10-dniowych siewek typu dzikiego, tmm i linii transgenicznych zawierających indukowany estradiolem konstrukt nadekspresji epf2 lub epf1. Reprezentatywne obrazy konfokalne naskórka liścia typu dzikiego i epf2 hodowanego przez sześć do siedmiu dni w roztworze buforowym oraz naskórka liścienia epf2 wyhodowanego z dwiema różnymi partiami peptydów epf2 pokazano na tym rysunku. Wykonując tę procedurę, upewnij się, że wyciąłeś jeden z liścieni z pojedynczej sadzonki, która już rośnie równomiernie z innymi sadzonkami.Wybierz również sadzonkę, która nie dotyka podłoża MS, aby ograniczyć zmienność. Inną kwestią, o której należy pamiętać, jest to, że nie należy umieszczać więcej niż pięciu liścieni w jednej probówce do mikrowirówki. Delikatnie przesuń tubkę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie plam TBO wokół liścieni, aby dobrze je zabarwić.Biorąc pod uwagę, że w roztworze peptydowym znajduje się wiele peptydów strukturalnych, ta metoda testu biologicznego będzie bardzo przydatna do identyfikacji prawidłowo sfałdowanych i bioaktywnych form peptydu oraz ich funkcji biologicznych.

identification-genes-involved-stomatal-development-via-epidermal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy prosty i powtarzalny protokół badania odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe bakterie. Metoda ta minimalizuje uszkadzanie i manipulację liściem w porównaniu do wcześniej opisanego zastosowania preparatów z naskórka liści.

Ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Odkrycie, w jaki sposób fizjologia i morfologia są ze sobą powiązane, pozwala na głębsze zrozumienie mechanistycznego funkcjonowania liści roślin. Przedstawiono zarówno procedurę wyprowadzania parametrów regulacji aparatów szparkowych na podstawie pomiarów przewodności aparatów szparkowych, jak i korelacje z tradycyjnymi funkcjonalnymi cechami liści.

Powiązanie przewodnictwa aparatów szparkowych z cechami funkcjonalnymi liści

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak monitorować dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie na powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie, pokazując kropki PATROL1 oznaczonej GFP, białka transportującego błonę, w korze komórkowej kompleksu szparkowego u Arabidopsis thaliana.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Ten protokół opisuje metodę przygotowania wzbogaconych komórek ochronnych aparatów szparkowych, która jest przydatna do badań fizjologicznych i innych badań biologicznych.

Taśma szparkowa Tape-Peel: ulepszona metoda przygotowania próbki komórek ochronnych

Udostępniamy metodę identyfikacji modulatorów transpiracji dolistnej poprzez zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe biblioteki złożonej.

Identyfikacja nowych regulatorów transpiracji roślin za pomocą wielkoskalowych badań termowizyjnych u Helianthus annuus

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Tutaj prezentujemy prostą metodę bezpośredniej obserwacji i automatycznego pomiaru reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych wraz z potokiem analizy obrazu przeznaczonym do obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie.

Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)

Protokół ten przedstawia porównawczą metodę oceny cech szparkowych i naskórkowych u dwóch odrębnych gatunków za pomocą peelingów naskórnych, technik oczyszczania oraz analizy obrazowej wspomaganej przez AI. Celem jest umożliwienie wysokoprzepustowej, powtarzalnej ilościowej identyfikacji struktur komórkowych leżących u podstaw funkcji szparków szparkowych dla zastosowań rolniczych oraz szerokich badań roślinnych.

Charakteryzacja cech szparków szparkowych i naskórka za pomocą peelingów, oczyszczania oraz analizy obrazów opartej na AI

Poznaj metody fenotypowania aparatów szparkowych w Arabidopsis bez toksycznych chemikaliów. Techniki barwienia toluidynowym niebieskim O umożliwiają analizę rozwoju naskórka i odpowiedzi na peptydy.

Identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka

Przeglądaj więcej filmów