Charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych

Tak więc komórki progenitorowe oddziałują ze środowiskiem, aby utrzymać homeostazę tkanek. Korzystając z tego protokołu, możemy zacząć rozumieć, w jaki sposób fibroblasty wpływają na zachowanie komórek progenitorowych przełyku. System kohodowli wykorzystuje najpierw izolowane komórki, które naśladują normalną niszę progenitorową przełyku.

Usunięcie organoidów przed obrazowaniem umożliwia analizę zarówno interakcji komórkowych, jak i morfologii organoidów. Metodę tę można zastosować do ludzkich organoidów przełyku. Na przykład przy użyciu materiałów pochodzących od pacjentów zdrowych lub chorych na raka.

W ten sposób możemy uzyskać wgląd w specyficzną funkcję fibroblastów związanych z rakiem. Dysocjacja komórek nabłonkowych i zrębowych ma kluczowe znaczenie dla uzyskania żywotnych organoidów. Niedostateczne trawienie spowoduje niską wydajność komórek, podczas gdy nadmierne trawienie zmniejszy żywotność komórek i zdolność tworzenia organoidów.

Na początek mechanicznie usuń mięsień zewnętrzny przełyku za pomocą mikroskopu preparacyjnego i kleszczy. Przytrzymaj dystalny koniec rozciętego przełyku za pomocą jednej pary kleszczy, a drugą kleszczami użyj do chwycenia i pociągnięcia mięśnia od dystalnego do bliższego końca przełyku. Usuń i wyrzuć warstwę mięśni.

Aby otworzyć przełyk wzdłużnie, przytrzymaj jeden koniec przełyku i włóż kulkę nożyczek sprężynowych do mikropreparacji do światła, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek. Rozetnij przełyk, trzymając się za koniec i umieść go w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej lub 24-dołkowej płytce. Zanurz otwarty przełyk w 0,5 miligrama na mililitr termolizyny w HBSS i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce kołyskowej przez 15 minut.

Po wyjęciu przełyku z roztworu termolizyny ostrożnie oddziel nabłonek przełyku od zrębu. Przenieś warstwę nabłonkową i zrębową do dwóch oddzielnych 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych z 200 mikrolitrami roztworu dysocjacyjnego w HBSS i umieść je na lodzie. Zmiel nabłonek przełyku za pomocą ostrego skalpela i zbierz zmieloną tkankę z szalki Petriego z 200 mikrolitrami roztworu dysocjacyjnego.

Przenieś go do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj 800 mikrolitrów świeżego roztworu dysocjacyjnego i umieść rurkę z rozdrobnioną warstwą nabłonka na wytrząsarce kołyskowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 60 minut. Pipetować roztwór w górę i w dół około 20 razy za pomocą końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów co 15 minut.

Pokrój warstwę zrębu na drobne kawałki w 1,5-mililitrowej probówce zawierającej 200 mikrolitrów roztworu dysocjacyjnego za pomocą nożyczek do rozwarstwiania i dodaj 800 mikrolitrów świeżego roztworu dysocjacyjnego. Umieść rurkę na wytrząsarce kołyskowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Po 30 minutach inkubacji w przypadku roztworu zrębu i 60 minutach inkubacji w przypadku roztworu nabłonkowego, pipetować roztwór w górę iw dół przez kolejne 20 razy.

Przepuść roztwór zrębu przez sitko o średnicy 70 mikrometrów, a roztwór nabłonkowy przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do nowych mikroprobówek wirówkowych o średnicy 1,5 milimetra. Wirować w temperaturze 300 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant, usuwając nadmiar płynu za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Zawiesić osad w 200 mikrolitrach mieszanki przeciwciał.

Po przeniesieniu mieszaniny do probówki do cytometrii przepływowej inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj trzy mililitry 1% FBS i ponownie wiruj przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś ogniwa w minimum 200 mikrolitrach 1%FBS.

Dodać jeden do 10 000 rozcieńczonych markerów barwienia martwych komórek na pięć minut przed sortowaniem faksem, aby wyizolować żywe komórki. Wymieszaj posortowane komórki nabłonka i fibroblasty w stosunku jeden do dwóch w probówce. Po odwirowaniu w temperaturze 300 G przez pięć minut, wyrzucić supernatant, ostrożnie usuwając go pipetą o pojemności 200 mikrolitrów.

Umyj komórki raz, ponownie zawieszając osad w zimnym, podstawowym podłożu organoidowym i ponownie odwiruj przez pięć minut. Umieść komórki na lodzie i wyrzuć supernatant, ostrożnie usuwając go pipetą o pojemności 200 mikrolitrów. Ponownie zawiesić komórki w 10 mikrolitrach mieszanki matrycowej na kopułę i umieścić probówkę z powrotem na lodzie.

Weź wstępnie podgrzaną 48-dołkową płytkę z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i wykonaj jedną kopułę matrycową na studzienkę. Za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów dodać 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki o niskiej zawartości ER do kopuł matrycy zawierających kokultury organoidów i pożywkę ENR do odpowiednich kopuł matrycowych zawierających tylko organoidy nabłonkowe. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

I przez pierwsze dwa dni uzupełniaj podłoże 10 inhibitorem skał mikromolowych. Usuń pożywkę organoidową i dodaj 200 mikrolitrów lodowatego PBS do kopuł matrycy. Po umieszczeniu płytki na lodzie na pięć do 10 minut, pipetować w górę i w dół i przenieść roztwór do nieprzywierającej probówki o pojemności 0,6 mililitra.

Wirować krótko przez 30 do 60 sekund w temperaturze 100 G, aby organoidy osiadły na dnie. Po usunięciu nadmiaru płynu dodaj lodowaty PBS do probówki i ponownie odwiruj przez 30 do 60 sekund. Usuń nadmiar płynu, jak pokazano wcześniej, i przymocuj organoid za pomocą 200 mikrolitrów zimnego, 4% formaldehydu w roztworze PBS przez 30 minut na lodzie.

Umieść rurkę pionowo, aby organoid opadł i usunął formaldehyd. Dodaj 500 mikrolitrów zimnego PBS, aby zmyć pozostały formaldehyd. Po usunięciu nadmiaru PBS dodać 500 mikrolitrów buforu blokującego.

Umieść rurkę na wytrząsarce kołyskowej na 60 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć bufor blokujący i ponownie zawiesić organoidy w 200 mikrolitrach buforu blokującego z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Umieść organoidy ponownie na noc na wytrząsarce kołyskowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usuń pierwotną mieszaninę przeciwciał i umyj organoidy za pomocą 500 mikrolitrów 0,02% Triton X 100 w PBS przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz to trzy razy. Podobnie usunąć bufor płuczący i dodać 200 mikrolitrów sprzężonego z fluorescencją przeciwciała drugorzędowego do buforu blokującego przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ponownie umyj organoidy za pomocą 0,02% Triton X 100 w PBS, a następnie 500 mikrolitrów PBS. Po usunięciu całego nadmiaru płynu dodać 10 mikrolitrów roztworu klarującego do organoidów i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umieść 0.05 milimetra, dwustronną, lepką przekładkę z czterema dołkami na szkiełku mikroskopowym.

Dodaj 10 mikrolitrów roztworu klarującego z organoidami do jednego dołka i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu przekładki. Pozyskiwanie obrazów za pomocą systemu mikroskopii konfokalnej. Komórki progenitorowe przełyku są sortowane na podstawie ich wysoce zintegrowanej ekspresji beta four i e-kadheryny.

Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej izolacji komórek nabłonka pokazuje procent żywych komórek ze wszystkich pojedynczych komórek. Pokazano tutaj procent wyizolowanych komórek progenitorowych integryny beta cztery i e-kadheryny ze wszystkich żywych komórek. Przedstawione tutaj wykresy cytometrii przepływowej reprezentują procent izolowanych fibroblastów alfa-dodatnich DPP4 + i receptora Pdgf.

Obrazy jasnego pola z organoidami współhodowanymi z fibroblastami dodatnimi receptora Pdgf alfa H2 BEGFP pokazują jądrowy sygnał EGFP. Zdjęcia jasnego pola całej kopuły matrycy w szóstym dniu są pokazane tutaj. Skuteczność formowania organoidów jest przedstawiona na tym obrazie graficznym.

Każda kropka reprezentuje kopułę macierzy, a słupek reprezentuje średnią wszystkich punktów na warunek. Pokazano tutaj jasne pole i obrazy fluorescencyjne współhodowli organoidów szóstego dnia z fibroblastami alfa-dodatnimi receptora Pdgf. Całe obrazy z wierzchowania współhodowanych organoidów pokazują powierzchnie 3D organoidów z fibroblastami wimentyno-dodatnimi owiniętymi wokół organoidu i pozostającymi z nim w bliskim kontakcie.

Barwienie całego mocowania organoidów mono i współhodowanych fibroblastami alfa-dodatnimi receptora Pdgf ujawnia odrębne populacje komórek podstawnych i nadpodstawnych. Na wydajność tworzenia organoidów, jak również na wielkość organoidu, ma wpływ fibroblasty zawarte w kokulturze. Należy spodziewać się różnic i wyników przy użyciu różnych subpopulacji fibroblastów.

Ta sama strategia może być zastosowana do scharakteryzowania fibroblastów związanych z nowotworem zarówno u myszy, jak i ludzi.