Name: Charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Poznaj metodę kokultur organoidów przełyku z fibroblastami do badania interakcji komórkowych w niszy progenitorowej. Technika umożliwia wizualizację 3D i analizę wpływu fibroblastów na homeostazę tkanek oraz rozwój nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez ERC StG TroyCAN (851241). E.E. jest doktorem habilitowanym Cancerfonden. M.G. jest stypendystą Ragnara Söderberga i młodszym badaczem Cancerfonden. Jesteśmy wdzięczni za pomoc techniczną ze strony głównych placówek Karolinska Institutet, w tym Biomedicum Flow Cytometry Core Facility, Biomedicum Imaging Core (BIC) oraz Comparative Medicine Biomedicum (KMB) animal facility. Dziękujemy członkom laboratorium Genander za uważne przeczytanie i skomentowanie protokołu.

<ol><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Lohmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+murine+esophageal+organoid+culture+method+and+organoid-based+model+of+esophageal+squamous+cell+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia.</a> iScience. 24 (12), 103440(2021).</li>
<li>DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+in+the+mouse+esophagus+implicates+the+presence+of+a+nonquiescent+epithelial+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population.</a> Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).</li>
<li>Kasagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+esophageal+organoid+system+reveals+functional+interplay+between+notch+and+cytokines+in+reactive+epithelial+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The esophageal organoid system reveals functional interplay between notch and cytokines in reactive epithelial changes.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 333-352 (2018).</li>
<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%3A+Origins%2C+definitions%2C+and+functions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts: Origins, definitions, and functions in health and disease.</a> Cell. 184 (15), 3852-3872 (2021).</li>
<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mesenchymal+cell+populations+generate+the+essential+intestinal+BMP+signaling+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient.</a> Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).</li>
<li>Cordero-Espinoza, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+contacts+between+periportal+mesenchyme+and+ductal+epithelium+act+as+a+rheostat+for+liver+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell contacts between periportal mesenchyme and ductal epithelium act as a rheostat for liver cell proliferation.</a> Cell Stem Cell. 28 (11), 1907-1921 (2021).</li>
<li>Pastula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+gastrointestinal+organoid+culture+in+combination+with+nerves+or+fibroblasts%3A+a+method+to+characterize+the+gastrointestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: a method to characterize the gastrointestinal stem cell niche.</a> Stem Cells International. 2016, 3710836(2016).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li>
<li>McGinn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomechanical+switch+regulates+the+transition+towards+homeostasis+in+oesophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A biomechanical switch regulates the transition towards homeostasis in oesophageal epithelium.</a> Nature Cell Biology. 23 (5), 511-525 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Bailey, D., Yang, P., Kim, E., Que, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+stem+cells+of+the+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development and stem cells of the esophagus.</a> Development. 148 (6), (2021).</li>
<li>Ohlund, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+inflammatory+fibroblasts+and+myofibroblasts+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).</li>
<li>Pentinmikko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notum+produced+by+Paneth+cells+attenuates+regeneration+of+aged+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notum produced by Paneth cells attenuates regeneration of aged intestinal epithelium.</a> Nature. 571 (7765), 398-402 (2019).</li>
<li>Janson, D., Rietveld, M., Willemze, R., El Ghalbzouri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+serially+passaged+fibroblasts+on+dermal+and+epidermal+morphogenesis+in+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of serially passaged fibroblasts on dermal and epidermal morphogenesis in human skin equivalents.</a> Biogerontology. 14 (2), 131-140 (2013).</li>
<li>Landry, N. M., Rattan, S. G., Dixon, I. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+maintaining+primary+murine+cardiac+fibroblasts+in+two-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An improved method of maintaining primary murine cardiac fibroblasts in two-dimensional cell culture.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12889(2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiony tutaj protokół ustanawia model in vitro do badania funkcjonalnych interakcji nabłonek przełyku i fibroblasty.
Warstwa nabłonkowa jest oddzielona od zrębu, co pozwala na zoptymalizowany protokół dysocjacji zarówno dla przedziału nabłonkowego, jak i zrębu. Pomimo optymalizacji protokołu dysocjacji nabłonka, grudki tkanek pozostają widoczne. Energiczne pipetowanie w górę i w dół co 15 minut znacznie zmniejsza liczbę i rozmiar grudek. Inne protokoły wykorzystują trypsynę do dalszej dysocjacji warstwy nabłonkowej 5,6. W tym przypadku stosowanie trypsyny lub dalsze wydłużanie czasu dysocjacji nie jest zalecane, ponieważ prowadzi to do zmniejszenia żywotności komórek nabłonka i wydajności tworzenia organoidów. W przeciwieństwie do nabłonka, zrąb łatwo ulega dysocjacji, a 30 minut w roztworze dysocjacyjnym powoduje powstanie zawiesiny jednokomórkowej o żywotności fibroblastów ~90% (ryc. 1E). Wykluczenie w protokole etapu separacji nabłonkowo-stomijnej znacznie wydłuża czas dysocjacji, co skutkuje zmniejszoną żywotnością fibroblastów i niższą wydajnością komórek nabłonkowych. Dodatkowo, oddzielenie nabłonka od zrębu daje możliwość określenia liczby komórek w każdej populacji i wymieszania komórek nabłonkowych i fibroblastów z różnych linii myszy podczas zakładania kokultur.
Badanie funkcji fibroblastów na wzroście organoidów jest powszechnie stosowaną metodą w biologii komórek macierzystych 9,10,11,15,16. Ustalone pożywki do współhodowli są albo uzupełnione DMEM 10% płodową surowicą cielęcą (FCS)9,15, albo pożywką o zredukowanym czynniku wzrostu10,16. W tym protokole pożywka o zredukowanym czynniku wzrostu jest używana do naśladowania warunków panujących w niszy komórek macierzystych in vivo, w której fibroblasty są w dużej mierze w stanie spoczynku. FCS jest surowicą bogatą w czynnik wzrostu, która powoduje aktywację i proliferację fibroblastów w kokulturach, prawdopodobnie odpowiadając stanowi komórki fibroblastów odmiennemu od stanu in vivo. Poprzez wykluczenie FCS i zmniejszenie czynników wzrostu, tak aby sama pożywka (ERlow) nie wspierała wzrostu organoidów i nie stymulowała proliferacji fibroblastów, możliwe jest wyizolowanie wpływu fibroblastów na wzrost organoidów. W tym podłożu NOGGIN jest usuwany, a RSPO redukowane do minimum (10% RPSO). Wykazano, że zarówno NOGGIN, jak i RSPO są niezbędne do wzrostu organoidów przełyku6. EGF został zachowany w pożywce do kohodowli, ponieważ sam w sobie nie wspomaga wzrostu organoidów. Jednak fibroblasty są również zdolne do wspierania wzrostu organoidów w pożywce o obniżonej EGF (ElowRlow; Rysunek 2B,D).
Kokultury organoidów nie mogą być podtrzymywane przez pasażowanie, ponieważ fibroblasty są tracone podczas trypsynizacji. Jednak pasażowanie organoidów zostało uwzględnione w protokole, ponieważ organoidy przełyku mogą być utrzymywane, rozwijane i wykorzystywane do dalszych eksperymentów jako monokultury. Pasażowane organoidy z monokultur mogą być używane do tworzenia kokultur ze świeżo wyizolowanymi fibroblastami. Wadą stosowania komórek pierwotnych jest liczba myszy potrzebnych do założenia wielu kokultur organoidowych. Koncentrując się na małych subpopulacjach fibroblastów, liczba uzyskanych kokultur jest ograniczona. W innych protokołach fibroblasty są najpierw namnażane w hodowli przed użyciem ich do tworzenia kokultur organoidowych10. Jednak fibroblasty zmieniają morfologię i tożsamość podczas pasażu, co wykazano przy użyciu pierwotnych fibroblastów skóry i serca17,18. Konwencjonalne pasażowanie 2D fibroblastów przełyku powoduje zarówno zmiany morfologii, jak i fenotypu, co pokazuje, że wzbogacanie fibroblastów in vitro nie jest odpowiednie dla kokultur mających na celu fenokopię niszy endogennych komórek macierzystych.
Barwienie całego mocowania zapewnia narzędzie do utrzymania i wizualizacji interakcji fibroblast-organoid. Należy zauważyć, że chociaż nie wszystkie organoidy będą miały bezpośrednio przyłączone do nich fibroblasty, większość organoidów ma kontakt z fibroblastami (patrz ryc. 2C). Aby utrzymać interakcje nabłonkowo-fibroblastowe, ważne jest, aby obchodzić się z organoidami ostrożnie i unikać energicznego pipetowania, wirowania i wirowania z dużą prędkością. Optymalna fiksacja jest ważna dla utrzymania architektury tkanki 3D, a także utrzymania endogennej fluorescencji. 30-minutowa fiksacja wystarcza do zachowania sygnału H2BeGFP i jest optymalna dla przeciwciał stosowanych w tym protokole, jednak może się to różnić w zależności od zastosowanych fluoroforów i przeciwciał. Oczyszczanie organoidów zmniejsza rozpraszanie światła i znacznie poprawia wizualizację całej struktury 3D. Ponieważ organoidy są małe, oczyszczanie jest łatwe i szybkie; jednak obrazowanie całych organoidów za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej może być czasochłonne, ponieważ konieczne jest wykonanie wielu stosów Z. Mikroskopy konfokalne, takie jak obracający się dysk, mogą być używane do skrócenia czasu obrazowania.
Ogólnie rzecz biorąc, organoidy przełyku hodowane w obecności fibroblastów stanowią cenne narzędzie do zrozumienia aspektów niszy komórek macierzystych przełyku. Ponadto oczyszczanie całego mocowania zapewnia dostępną metodę wizualizacji interakcji między fibroblastami a organoidami.

Organoidy są używane jako testy 3D in vitro do charakteryzowania komórek macierzystych i progenitorowych, a także do zrozumienia sygnałów sygnałowych pochodzących ze składników komórkowych niszy komórek macierzystych1,2,3,4. Organoidy przełyku myszy zostały po raz pierwszy opisane w 2014 roku, a w kilku artykułach zidentyfikowano czynniki wzrostu, takie jak R-Spondyna (RSPO), NOGGIN i naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), potrzebne do utrzymania i przejścia organoidów przełyku5,6,7, argumentując, że podobne sygnały sygnalizacyjne są wymagane w in vivo odnowa komórek progenitorowych. Jednak czynniki wzrostu są zwykle dodawane w stężeniach niefizjologicznych, co skutkuje warunkami wzrostu organoidów, które niekoniecznie odzwierciedlają środowisko sygnalizacyjne in vivo.
Fibroblasty to heterogeniczne populacje komórek zrębowych, które wspierają właściwości komórek progenitorowych w wielu niszach komórek macierzystych8. Połączenie nabłonkowych komórek progenitorowych i fibroblastów w tej samej kulturze organoidów umożliwia tworzenie organoidów w obniżonych stężeniach egzogennie suplementowanych czynników wzrostu. Opisano systemy kohodowli organoidów z nabłonka jelitowego i wątrobowego, ale protokół ustanawiający kokultury organoidów i fibroblastów przełyku jest nadal znany9,10,11.
W tym protokole przedstawiono dwie strategie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) dla fibroblastów z przełyku, przy użyciu transgenicznych myszyPdgfrα H2BeGFP12 lub myszy typu dzikiego z klasycznym barwieniem przeciwciałami. Różne subpopulacje fibroblastów można izolować za pomocą wybranych markerów powierzchni komórek, zapewniając w ten sposób elastyczność protokołu. Ponadto do scharakteryzowania oddziaływań fibroblast-organoid stosuje się technikę obrazowania fluorescencyjnego 3D zachowującą morfologię organoidów. Oczyszczanie organoidów zapewnia szybką metodę zwiększania głębokości penetracji światła w organoidach, poprawiając wizualizację połączeń organoid-fibroblasty i umożliwiając rekapitulację struktury organoidu w całości. Protokół ten łączy kohodowlę organoidów przełyku z całą strategią obrazowania wierzchowca, umożliwiając funkcjonalną charakterystykę interakcji fibroblast-organoid.

<table><tbody><tr><td>Suplement B-27 (50X), bez surowicy</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Matrigel&nbsp; Matryca błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR</td>) <td>Fisher Scientific</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplement</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson Immuno</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 roztwór</td><td>Merck</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalia, peptydy i białka rekombinowane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI Roztwór</td><td>Thermo Fisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór dysocjacyjny: 0,25 mg/ml Liberase TM, 0,25 mg/ml Dnazy w HBSS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dnaza I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>11284932001</tr><tr><td>Formaldehyd, 37%, z 10-15% metanolem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Mysi Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.47</td><td>SunJin Lab</td><td>#RC147001</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko EGF myszy, CF</td><td>R& Systemy D</td><td>2028-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin-1 mysi</td><td>Peprotech</td><td>315-32</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Niebieski barwnik martwych komórek</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34857</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Plastic & Wyroby szklane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Sitka do komórek sterylnych 40um</td><td>VWR</td><td>15360801</td><td></td></tr><tr><td>Sitka do komórek sterylnych Corning 70um</td><td>VWR</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Menzel Deckgl&auml; ser/ szkiełka nakrywkowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q10143263NR15</td><td></td></tr><tr><td>Probówka reakcyjna SafeSeal, 1,5 mL, PP</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>Probówki mikrowirówkowe o niskiej retencji zatrzaskowe 0,6 ml</td> Szkiełka SuperFrost <td>Thermo Fisher</td><td>3446</td><td></td></tr><tr><td>VWR</td><td></td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,05 mm 4 okrągłe studzienki iSpacer</td><td>SunJin Lab</td><td>#IS204</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 kleszcze, końcówka biologiczna</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Pen</td><td>VectorLaboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe kątowe na bok końcówka kulowa 8mm Krawędź tnąca</td><td>FST</td><td>15033-09</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Stellaris 5&nbsp;</td>Mikroskop separacyjny <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 305</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conjugated Przeciwciała dla FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Przeciwciało anty-mysie CD104 Klon: 346-11A</td><td></td><td>123608 123608</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD26 (DPP-4) APC</td><td>H194-112</td><td>H194-112</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 przeciwciało przeciw myszy/ludzkiemu CD324 (E-kadherynie)</td><td>147310</td><td>147310</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała immunofluorescencyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD104 (&szlig;-integryna 4) Klon: 346-11A</td><td>BioLegend</td><td>553745</td><td></td></tr><tr>Przeciwciała Acris<td>Cytokeratin 14</td><td>(AbD Serotec)</td><td>BP5009</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin13 Klon: EPR3671</td><td>abcam</td><td>ab92551</td><td></td></tr><tr><td>E-kadheryna (CD324) Klon: 2.40E+11</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3195</td><td></td></tr><tr><td>Keratyna 5 Poliklonalne przeciwciało kurczaka, oczyszczone Klon: Poly9059</td><td>BioLegend</td><td>905901</td><td></td></tr><tr><td>p63 Klon: 4a4</td><td>abcam</td><td>ab735</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany anty-KLF4 antybod Klon: EPR20753-25</td><td>abcam</td><td>ab214666</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5733</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-species* z wybranym fluoroforem</td><td>Jackson Immuno</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych

Functional Characterization and Visualization of Esophageal Fibroblasts Using Organoid Co-Cultures

Nabłonkowe komórki macierzyste i progenitorowe przyczyniają się do tworzenia i utrzymywania bariery nabłonkowej przez całe życie. Większość populacji komórek macierzystych i progenitorowych jest ukryta w anatomicznie odrębnych miejscach, co umożliwia ekskluzywne interakcje z sygnałami niszowymi, które utrzymują łodygę. Podczas gdy rozwój nabłonkowych kultur organoidowych stanowi potężne narzędzie do zrozumienia roli komórek macierzystych i progenitorowych w homeostazie i chorobie, interakcja w środowisku niszowym jest w dużej mierze nieobecna, co utrudnia identyfikację czynników wpływających na zachowanie komórek macierzystych. Fibroblasty odgrywają kluczową rolę w kierowaniu losem pnia nabłonka i progenitorów. W artykule przedstawiono kompleksowy protokół kohodowli organoidów i fibroblastów, umożliwiający wyznaczenie subpopulacji fibroblastów w odnowie i różnicowaniu komórek progenitorowych przełyku. W tym protokole opisano metodę izolowania zarówno komórek nabłonkowych, jak i fibroblastów równolegle z przełyku. Przedstawiono odrębne strategie sortowania komórek aktywowane fluorescencją w celu wyizolowania zarówno komórek progenitorowych przełyku, jak i subpopulacji fibroblastów od transgenicznych myszy reporterowych lub dzikich myszy. Protokół ten zapewnia wszechstronne podejście, które można dostosować do izolacji określonych subpopulacji fibroblastów. Ustanawianie i pasażowanie monokultur organoidowych nabłonka przełyku jest zawarte w tym protokole, co umożliwia bezpośrednie porównanie z systemem kokultur. Ponadto opisano metodę oczyszczania 3D, która pozwala na szczegółową analizę obrazu interakcji nabłonek-fibroblasty. Podsumowując, protokół ten opisuje porównawczą i stosunkowo wysokoprzepustową metodę identyfikacji i zrozumienia niszowych składników komórek macierzystych przełyku in vitro.

Przełyk jest podzielony na różne warstwy: nabłonek, blaszka właściwa, błona podśluzowa oraz warstwa mięśniowa zewnętrzna (Ryc. 1A). Fibroblasty znajdują się w błonie podśluzowej i blaszce właściwej, które określa się mianem zrębu. W niniejszym protokole warstwa mięśniowa zewnętrzna jest usuwana mechanicznie (Ryc. 1B), co nie prowadzi do utraty fibroblastów (PdgfrαH2BeGFP+) znajdujących się w zrębie (Ryc. 1C). Przed dysocjacją nabłonek zostaje oddzielony od zrębu, co skutkuje powstaniem dwóch segmentów tkankowych (Ryc. 1B). Rozdzielenie tych dwóch warstw daje możliwość wydłużenia czasu dysocjacji dla bardziej odpornej warstwy nabłonkowej w porównaniu z kruchą warstwą zrębu. W ten sposób opracowano wydajny protokół izolacji, pozwalający na uzyskanie zarówno żywych komórek progenitorowych nabłonka, jak i fibroblastów zrębu (Ryc. 1B). Komórki progenitorowe przełyku są sortowane na podstawie wysokiej ekspresji INTEGRIN-β4 oraz E-CADHERIN (Ryc. 1C,D).
Subpopulacje fibroblastów można izolować, wykorzystując odmienne markery. W niniejszym protokole przedstawiono strategię izolacji fibroblastów opartą na powszechnie stosowanych markerach fibroblastów PDGFRα oraz DPP4 (CD26). Izolacja przeprowadzona za pomocą ekspresji reportera PdgfrαH2BeGFP lub przeciwciała DPP4 wykazuje, że około 50% izolowanych komórek to fibroblasty (Ryc. 1E,F). Dodatkowo 70% fibroblastów PDGFRα+ jest jednocześnie DPP4+, co wskazuje na uzyskanie w znacznym stopniu nakładającej się, lecz nie identycznej populacji fibroblastów. Po wyizolowaniu populacji komórek nabłonkowych i stromy, komórki progenitorowe przełyku są hodowane albo osobno, albo wspólnie z fibroblastami w kopule macierzy. Aby zbadać wkład fibroblastów w tworzenie organoidów, ko-kulturę utrzymuje się w pożywce o zredukowanej zawartości czynników wzrostu (Ryc. 1G).
Komórki progenitorowe przełyku tworzą organoidy w obecności EGF, NOGGIN i RSPO (ENR). Usunięcie NOGGIN oraz zmniejszenie ilości RSPO (25 ng/µL; ERlow) jest wystarczające, aby zapobiec tworzeniu organoidów (Rysunek 2A). Co ciekawe, dodanie fibroblastów DPP4+ lub PDGFRα+ do komórek progenitorowych przełyku w medium ERlow przywraca zdolność do tworzenia organoidów, co wykazuje funkcję wspomagającą obu populacji fibroblastów (Rysunek 2A-D). Wizualizacja transgenu PdgfrαH2BeGFP pokazuje, że fibroblasty pozostają w bliskim kontakcie z nabłonkowymi komórkami progenitorowymi podczas tworzenia organoidów (Rysunek 2A). W 6. dniu fibroblasty PdgfrαH2BeGFP+ są wciąż liczne w kokulturze. Fibroblasty występują w całej kopule, w pobliżu i stykając się z organoidami (pełna strzałka) lub są do nich przytwierdzone (grot strzałki; Rysunek 2D).
Barwienie całego preparatu ukazuje trójwymiarową reprezentację interakcji fibroblastów z organoidami (Rycina 3). Choć możliwe jest przeprowadzenie protokołu barwienia całego preparatu bez użycia roztworu do klarowania, zmniejsza to przezroczystość i penetrację lasera w organoidzie (Rycina 3B, widok z}$). Podczas montowania organoidów dystans pomagają zachować ich morfologię. W przeciwieństwie do tego, nałożenie szkiełka podstawowego bezpośrednio na organoidy (bez dystansu) spłaszcza je, co prowadzi do utraty struktury organoidu (Rycina 3A,B).
Stwierdzono, że zarówno fibroblasty DPP4+, jak i PDGFRα+ otaczają organoidy (Rycyna 3C, Wideo 1 oraz Wideo 2). Różnicowanie organoidów przełyku można oceniać za pomocą różnych markerów. Rycina 4 pokazuje, że opisany protokół barwienia jest odpowiedni zarówno dla keratyn łatwiejszych do barwienia (KRT14/13), jak i dla trudniejszych do barwienia czynników transkrypcyjnych (TRP63/KLF4). Protokół kokultury generuje organoidy o wzorcu różnicowania podobnym do tego, który wykazano in vivo13,14 oraz jaki obserwuje się w organoidach hodowanych w medium ENR; komórki progenitorowe KRT14+ lub TRP63+ tworzą warstwę zewnętrzną, a zróżnicowane komórki KRT13+ lub KLF4+ są skierowane do wewnątrz.
Niniejszy protokół dostarcza narzędzi do badania niszy komórek macierzystych przełyku in vitro oraz wizualizacji interakcji między organoidami a fibroblastami. Dzięki zastosowaniu protokołu izolacji fibroblastów z wykorzystaniem przeciwciał, metoda ta jest adaptowalna i może być używana do badania subpopulacji fibroblastów bez konieczności stosowania myszy transgenicznych.
<img alt="Schemat przekroju przełyku z analizą komórek nabłonkowych i zrębu za pomocą cytometrii przepływowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Izolacja komórek progenitorowych i subpopulacji fibroblastów z przełyku. (A) Schematyczny przegląd różnych warstw przełyku. Zrąb obejmuje błonę właściwą (lamina propria) i błonę podśluzową. (B) Schematyczny przegląd protokołu izolacji. Mięśnie (muscularis externa) są usuwane mechanicznie za pomocą pęsety; pozostała część przełyku jest rozcinana i inkubowana w termolizynie w celu oddzielenia warstwy nabłonkowej od zrębu. Nabłonek i zrąb są rozdzielane, rozdrabniane mechanicznie i trawione enzymatycznie do postaci zawiesin pojedynczych komórek. Rozdzielone komórki są następnie barwione i przygotowywane do FACS. (C) Przekrój przełyku pozbawionego muscularis externa, wykazujący fibroblasty PdgfrαH2BeGFP+ w zrębie. Komórki podwójnie dodatnie dla INTEGRIN-β4 (ITGβ4) i E-KADHERYNY (ECAD) to komórki progenitorowe nabłonka przełyku. Pasek skali = 100 µm. (D) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej z izolacji komórek nabłonkowych, pokazujący odsetek żywych komórek (panel górny) spośród wszystkich pojedynczych komórek. Panel dolny pokazuje odsetek wyizolowanych progenitorowych (Prog.) komórek ITGβ4+ ECAD+ spośród wszystkich żywych komórek. (E) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej z izolacji komórek zrębu, pokazujący odsetek żywych komórek (panel górny lewy). Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej pokazujące odsetek wyizolowanych fibroblastów DPP4+ (Fibr.; panel górny prawy) i fibroblastów Pdgfrα+ (panel dolny lewy) spośród wszystkich żywych komórek. 70% fibroblastów Pdgfrα+ jest również DPP4+ (panel dolny prawy). (F) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej zrębu, pokazujący komórki tylko DPP4+ (2,5%), komórki DPP4+ PDGFRα+ (37,5%) oraz komórki tylko PDGFRα+ (17,7%). Procenty odnoszą się do wszystkich żywych komórek. (G) Same komórki nabłonkowe są wysiewane na kopułkę macierzy w obecności 50 ng/µL EGF, 100 ng/µL NOGGIN i 250 ng/µL RSPO (ENR), lub wspólnie z fibroblastami w obecności EGF i niskiego stężenia RSPO (25 ng/µL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Tworzenie organoidów, ekspresja eGFP, wpływ fibroblastów; mikroskopia, wykres, analiza procesu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne wyniki kokultur organoidów. (A) Obrazy w polu jasnym ukazujące wzrost organoidów od dnia 1. do dnia 6. Obrazy w polu jasnym organoidów w kokulturze z fibroblastami PdgfrαH2BeGFP+ wykazują również jądrowy sygnał eGFP. Pasek skali = 25 µm. (B) Obrazy w polu jasnym całych kopułek macierzy w dniu 6. Lewa kolumna przedstawia kokultury organoidów hodowane w obecności fibroblastów Pdgfrα+ w pożywce ERlow lub ElowRlow. Środkowa kolumna przedstawia kokultury organoidów hodowane w obecności fibroblastów DPP4+ w pożywce ERlow lub ElowRlow. Prawa kolumna przedstawia monokultury organoidów hodowane w pożywce ENR. Pożywka ENR = EGF (50 ng/µL), NOGGIN (100 ng/µL) i RSPO (250 ng/µL). ERlow = EGF i 25 ng/µL RSPO. ElowRlow = 5 ng/µL EGF i 25 ng/µL RSPO. Pasek skali = 500 µm. (C) Wykres przedstawiający wydajność tworzenia organoidów (%) (tj. procent komórek tworzących organoidy w różnych warunkach hodowli). Każda kropka reprezentuje kopułkę macierzy, a słupek reprezentuje średnią wszystkich kropek dla danej warunki. (D) Obraz w polu jasnym i fluorescencyjny organoidów w dniu 6 w kokulturze z fibroblastami PdgfrαH2BeGFP+. Fibroblasty PdgfrαH2BeGFP+ są obecne w całej kopułce, przyczepione do organoidów (grot strzałki) oraz nieprzyczepione, ale w kontakcie z organoidami (pełna strzałka). Pasek skali = 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat metody barwienia komórkowego; wyniki przejaśniania trójwymiarowych sferoidów nowotworowych; obrazowanie mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Protokół barwienia całego preparatu (whole mount) w badaniu oddziaływań między fibroblastami a organoidami. (A) Schematyczny przegląd protokołu immunofluorescencji całego preparatu. AB = przeciwciało. (B) Obraz immunofluorescencyjny barwienia całego preparatu bez przejaśniania, wykazujący zmniejszoną przejrzystość i penetrację światła laserowego w porównaniu do organoidów przejaśnionych. Brak dystansera skutkuje spłaszczeniem organoidu i utratą jego morfologii. (C) Obrazy całego preparatu z kokulturowanych organoidów pokazują powierzchnie 3D organoidów z fibroblastami VIMENTIN+ (Fibr.) owiniętymi wokół organoidu i w bliskim kontakcie z nim. Przekroje 3D i obrazy w płaszczyźnie 2D pokazują światło organoidu. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat hodowli komórkowej 3D przedstawiający monokulturę i kokulturę; analiza ekspresji białek w 3D i 2D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obrazy całych preparatów wykazują odrębne populacje komórek warstwy podstawnej i nadpodstawnej. (A) Barwienie całych preparatów organoidów w monokulturze i kokulturze z fibroblastami PdgfrαH2BeGFP+ wykazujące komórki warstwy podstawnej KRT14+ w warstwie zewnętrznej oraz zróżnicowane komórki nadpodstawne KRT13+. Pasek skali = 50 μm. (B) Barwienie całych preparatów organoidów w monokulturze i kokulturze z fibroblastami PdgfrαH2BeGFP+ wykazujące komórki warstwy podstawnej TRP63+ w warstwie zewnętrznej oraz zróżnicowane komórki nadpodstawne KLF4+. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Tabela opisująca składniki pożywek do hodowli organoidów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Table1_revised_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Wideo 1: PdgfrαH2BeGFP+ fibroblast owinięty wokół organoidu i pozostający z nim w bliskim kontakcie. Film towarzyszy górnemu panelowi Rycina 3CPasek skali w Rycina 3C jest 50 µm, a organoid jest ~120 µm średnicy. VIMENTIN zaznaczono kolorem białym, E-KADHERYNĘ kolorem czerwonym, PdgfrαH2BeGFP w kolorze zielonym, a DAPI w kolorze niebieskim. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%201_Re.avi" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Wideo 2: Fibroblast DPP4+ owinięty wokół organoidu i w bliskim kontakcie z nim.Wideo to stanowi uzupełnienie dolnego panelu Rysunku 3C. Pasek skali na Rysunku 3C wynosi 50 µm, a średnica organoidu to ok. 120 µm. VIMENTIN pokazano w kolorze białym, E-CADHERIN w czerwonym, a DAPI w niebieskim. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%202_RE.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

Współhodowle organoidów i fibroblastów dostarczają modelu do badania niszy komórek macierzystych in vivo. W tym miejscu opisano protokół dla kokultur organoidów i fibroblastów przełyku. Dodatkowo obrazowanie całego mocowania służy do wizualizacji interakcji fibroblast-organoid.

Charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych

Epithelial stem and progenitor cells contribute to the formation and maintenance of the epithelial barrier throughout life. Most stem and progenitor cell ...

Tak więc komórki progenitorowe oddziałują ze środowiskiem, aby utrzymać homeostazę tkanek. Korzystając z tego protokołu, możemy zacząć rozumieć, w jaki sposób fibroblasty wpływają na zachowanie komórek progenitorowych przełyku. System kohodowli wykorzystuje najpierw izolowane komórki, które naśladują normalną niszę progenitorową przełyku.Usunięcie organoidów przed obrazowaniem umożliwia analizę zarówno interakcji komórkowych, jak i morfologii organoidów. Metodę tę można zastosować do ludzkich organoidów przełyku. Na przykład przy użyciu materiałów pochodzących od pacjentów zdrowych lub chorych na raka.W ten sposób możemy uzyskać wgląd w specyficzną funkcję fibroblastów związanych z rakiem. Dysocjacja komórek nabłonkowych i zrębowych ma kluczowe znaczenie dla uzyskania żywotnych organoidów. Niedostateczne trawienie spowoduje niską wydajność komórek, podczas gdy nadmierne trawienie zmniejszy żywotność komórek i zdolność tworzenia organoidów.Na początek mechanicznie usuń mięsień zewnętrzny przełyku za pomocą mikroskopu preparacyjnego i kleszczy. Przytrzymaj dystalny koniec rozciętego przełyku za pomocą jednej pary kleszczy, a drugą kleszczami użyj do chwycenia i pociągnięcia mięśnia od dystalnego do bliższego końca przełyku. Usuń i wyrzuć warstwę mięśni.Aby otworzyć przełyk wzdłużnie, przytrzymaj jeden koniec przełyku i włóż kulkę nożyczek sprężynowych do mikropreparacji do światła, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek. Rozetnij przełyk, trzymając się za koniec i umieść go w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej lub 24-dołkowej płytce. Zanurz otwarty przełyk w 0,5 miligrama na mililitr termolizyny w HBSS i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce kołyskowej przez 15 minut.Po wyjęciu przełyku z roztworu termolizyny ostrożnie oddziel nabłonek przełyku od zrębu. Przenieś warstwę nabłonkową i zrębową do dwóch oddzielnych 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych z 200 mikrolitrami roztworu dysocjacyjnego w HBSS i umieść je na lodzie. Zmiel nabłonek przełyku za pomocą ostrego skalpela i zbierz zmieloną tkankę z szalki Petriego z 200 mikrolitrami roztworu dysocjacyjnego.Przenieś go do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj 800 mikrolitrów świeżego roztworu dysocjacyjnego i umieść rurkę z rozdrobnioną warstwą nabłonka na wytrząsarce kołyskowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 60 minut. Pipetować roztwór w górę i w dół około 20 razy za pomocą końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów co 15 minut.Pokrój warstwę zrębu na drobne kawałki w 1,5-mililitrowej probówce zawierającej 200 mikrolitrów roztworu dysocjacyjnego za pomocą nożyczek do rozwarstwiania i dodaj 800 mikrolitrów świeżego roztworu dysocjacyjnego. Umieść rurkę na wytrząsarce kołyskowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Po 30 minutach inkubacji w przypadku roztworu zrębu i 60 minutach inkubacji w przypadku roztworu nabłonkowego, pipetować roztwór w górę iw dół przez kolejne 20 razy.Przepuść roztwór zrębu przez sitko o średnicy 70 mikrometrów, a roztwór nabłonkowy przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do nowych mikroprobówek wirówkowych o średnicy 1,5 milimetra. Wirować w temperaturze 300 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant, usuwając nadmiar płynu za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Zawiesić osad w 200 mikrolitrach mieszanki przeciwciał.Po przeniesieniu mieszaniny do probówki do cytometrii przepływowej inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj trzy mililitry 1% FBS i ponownie wiruj przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś ogniwa w minimum 200 mikrolitrach 1%FBS.Dodać jeden do 10 000 rozcieńczonych markerów barwienia martwych komórek na pięć minut przed sortowaniem faksem, aby wyizolować żywe komórki. Wymieszaj posortowane komórki nabłonka i fibroblasty w stosunku jeden do dwóch w probówce. Po odwirowaniu w temperaturze 300 G przez pięć minut, wyrzucić supernatant, ostrożnie usuwając go pipetą o pojemności 200 mikrolitrów.Umyj komórki raz, ponownie zawieszając osad w zimnym, podstawowym podłożu organoidowym i ponownie odwiruj przez pięć minut. Umieść komórki na lodzie i wyrzuć supernatant, ostrożnie usuwając go pipetą o pojemności 200 mikrolitrów. Ponownie zawiesić komórki w 10 mikrolitrach mieszanki matrycowej na kopułę i umieścić probówkę z powrotem na lodzie.Weź wstępnie podgrzaną 48-dołkową płytkę z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i wykonaj jedną kopułę matrycową na studzienkę. Za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów dodać 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki o niskiej zawartości ER do kopuł matrycy zawierających kokultury organoidów i pożywkę ENR do odpowiednich kopuł matrycowych zawierających tylko organoidy nabłonkowe. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.I przez pierwsze dwa dni uzupełniaj podłoże 10 inhibitorem skał mikromolowych. Usuń pożywkę organoidową i dodaj 200 mikrolitrów lodowatego PBS do kopuł matrycy. Po umieszczeniu płytki na lodzie na pięć do 10 minut, pipetować w górę i w dół i przenieść roztwór do nieprzywierającej probówki o pojemności 0,6 mililitra.Wirować krótko przez 30 do 60 sekund w temperaturze 100 G, aby organoidy osiadły na dnie. Po usunięciu nadmiaru płynu dodaj lodowaty PBS do probówki i ponownie odwiruj przez 30 do 60 sekund. Usuń nadmiar płynu, jak pokazano wcześniej, i przymocuj organoid za pomocą 200 mikrolitrów zimnego, 4% formaldehydu w roztworze PBS przez 30 minut na lodzie.Umieść rurkę pionowo, aby organoid opadł i usunął formaldehyd. Dodaj 500 mikrolitrów zimnego PBS, aby zmyć pozostały formaldehyd. Po usunięciu nadmiaru PBS dodać 500 mikrolitrów buforu blokującego.Umieść rurkę na wytrząsarce kołyskowej na 60 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć bufor blokujący i ponownie zawiesić organoidy w 200 mikrolitrach buforu blokującego z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Umieść organoidy ponownie na noc na wytrząsarce kołyskowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usuń pierwotną mieszaninę przeciwciał i umyj organoidy za pomocą 500 mikrolitrów 0,02% Triton X 100 w PBS przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz to trzy razy. Podobnie usunąć bufor płuczący i dodać 200 mikrolitrów sprzężonego z fluorescencją przeciwciała drugorzędowego do buforu blokującego przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ponownie umyj organoidy za pomocą 0,02% Triton X 100 w PBS, a następnie 500 mikrolitrów PBS. Po usunięciu całego nadmiaru płynu dodać 10 mikrolitrów roztworu klarującego do organoidów i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umieść 0.05 milimetra, dwustronną, lepką przekładkę z czterema dołkami na szkiełku mikroskopowym.Dodaj 10 mikrolitrów roztworu klarującego z organoidami do jednego dołka i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu przekładki. Pozyskiwanie obrazów za pomocą systemu mikroskopii konfokalnej. Komórki progenitorowe przełyku są sortowane na podstawie ich wysoce zintegrowanej ekspresji beta four i e-kadheryny.Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej izolacji komórek nabłonka pokazuje procent żywych komórek ze wszystkich pojedynczych komórek. Pokazano tutaj procent wyizolowanych komórek progenitorowych integryny beta cztery i e-kadheryny ze wszystkich żywych komórek. Przedstawione tutaj wykresy cytometrii przepływowej reprezentują procent izolowanych fibroblastów alfa-dodatnich DPP4 + i receptora Pdgf.Obrazy jasnego pola z organoidami współhodowanymi z fibroblastami dodatnimi receptora Pdgf alfa H2 BEGFP pokazują jądrowy sygnał EGFP. Zdjęcia jasnego pola całej kopuły matrycy w szóstym dniu są pokazane tutaj. Skuteczność formowania organoidów jest przedstawiona na tym obrazie graficznym.Każda kropka reprezentuje kopułę macierzy, a słupek reprezentuje średnią wszystkich punktów na warunek. Pokazano tutaj jasne pole i obrazy fluorescencyjne współhodowli organoidów szóstego dnia z fibroblastami alfa-dodatnimi receptora Pdgf. Całe obrazy z wierzchowania współhodowanych organoidów pokazują powierzchnie 3D organoidów z fibroblastami wimentyno-dodatnimi owiniętymi wokół organoidu i pozostającymi z nim w bliskim kontakcie.Barwienie całego mocowania organoidów mono i współhodowanych fibroblastami alfa-dodatnimi receptora Pdgf ujawnia odrębne populacje komórek podstawnych i nadpodstawnych. Na wydajność tworzenia organoidów, jak również na wielkość organoidu, ma wpływ fibroblasty zawarte w kokulturze. Należy spodziewać się różnic i wyników przy użyciu różnych subpopulacji fibroblastów.Ta sama strategia może być zastosowana do scharakteryzowania fibroblastów związanych z nowotworem zarówno u myszy, jak i ludzi.

functional-characterization-visualization-esophageal-fibroblasts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje technikę hodowli in vitro do generowania ludzkich organotypowych konstruktów przełyku poprzez kokulturę pierwotnych ludzkich fibroblastów przełyku i płaskonabłonkowych komórek nabłonka w zdecelularowanym rusztowaniu świni. Te modele hodowli 3D naśladują funkcję i fizjologię swoich odpowiedników tkankowych in vivo.

Model hodowli tratwy 3D przełyku: technika hodowli in vitro do generowania modelu błony śluzowej przełyku

Przedstawiamy protokół generowania pierwotnych kultur mysich i ludzkich komórek zrębu przełyku z fenotypem miofibroblastów. Hodowane komórki mają morfologię wrzecionowatą, wykazują ekspresję α-SMA i wimentyny oraz nie mają markerów powierzchni komórek nabłonkowych, krwiotwórczych i śródbłonkowych. Scharakteryzowane komórki zrębu mogą być wykorzystane w badaniach funkcjonalnych oddziaływań nabłonkowo-zrębowych.

Izolacja miofibroblastów z przełyku myszy i człowieka

Ten manuskrypt opisuje produkcję, charakterystykę i potencjalne zastosowania konstruktu przełyku 3D wykonanego z normalnego pierwotnego ludzkiego fibroblastu przełyku i płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych umieszczonych w pozbawionym komórek rusztowaniu wieprzowym. Wyniki wskazują na tworzenie się dojrzałego nabłonka warstwowego podobnego do normalnego ludzkiego przełyku.

Produkcja, charakterystyka i potencjalne zastosowania 3D modelu błony śluzowej przełyku dla człowieka opartego na inżynierii tkankowej

Postępy w technologiach biomateriałów umożliwiają rozwój trójwymiarowych konstruktów wielokomórkowych. Opracowaliśmy protokoły elektroprzędzenia w celu wytworzenia trzech pojedynczych rusztowań do hodowli głównych komórek strukturalnych dróg oddechowych, aby zapewnić model 3D in vitro ściany oskrzelików dróg oddechowych.

Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro

Szczegółowy protokół jest tutaj przedstawiony w celu opisania modelu organoidowego in vitro z ludzkich komórek nabłonka nosa. Protokół posiada opcje pomiarów wymagających standardowego sprzętu laboratoryjnego, z dodatkowymi możliwościami dla specjalistycznego sprzętu i oprogramowania.

Hodowla i obrazowanie ludzkich organoidów nabłonkowych nosa

Ten protokół opisuje kluczowe kroki do wygenerowania i scharakteryzowania mysich organoidów 3D ustno-przełykowych, które reprezentują normalne, przednowotworowe i płaskonabłonkowe zmiany rakowokomórkowe wywołane przez chemiczną kancerogenezę.

Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D

Tutaj dostępny jest protokół hodowli ludzkich organoidów przełykowych i kultury na granicy faz powietrze-ciecz. Kultura granicy faz powietrze-ciecz organoidów przełyku może być wykorzystana do badania wpływu cytokin na barierę nabłonkową przełyku.

Trójwymiarowe modele hodowli komórkowych w celu zbadania bariery nabłonkowej w eozynofilowym zapaleniu przełyku

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Niniejszy protokół opisuje tworzenie i analizę histologiczną modeli organoidów przełyku, które reprezentują różne etapy progresji nowotworu. Metoda ta umożliwia naukowcom badanie zmian w morfologii komórek, organizacji przestrzennej i wzorcach ekspresji markerów molekularnych podczas przejścia od tkanek normalnych do nowotworowych.

Ustalenie i analiza histologiczna organoidów przełyku modelujących progresję od tkanek prawidłowych do nowotworowych

Protokół ten opisuje metodę jednoczesnej izolacji organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakem (CAF) oraz fibroblastów niezwiązanych z nowotworem (CF) u tego samego pacjenta z rakiem płaskonabłonkowym przełyku (ESCC). Wykorzystanie tych materiałów dopasowanych do pacjentów mogłoby uniknąć problemów związanych z zmiennością między pacjentami i zapewnić odpowiednią platformę eksperymentalną dla badań ESCC.

Ustanowienie organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakiem oraz odpowiedników fibroblastów u tego samego pacjenta z rakiem przełyku

Poznaj metodę kokultur organoidów przełyku z fibroblastami do badania interakcji komórkowych w niszy progenitorowej. Technika umożliwia wizualizację 3D i analizę wpływu fibroblastów na homeostazę tkanek oraz rozwój nowotworów.

Charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych

Przeglądaj więcej filmów