Dielektroforeza indukowana światłem w celu scharakteryzowania zachowania elektrycznego ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Ten protokół dielektroforezy indukowanej światłem lub LiDEP zapewnia metodę krok po kroku do charakterystyki ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na temat niejednorodności próbek komórek macierzystych. Zaletą LiDEP jest możliwość wprowadzania zmian w konfiguracji wirtualnej elektrody w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na heterogeniczność komórek macierzystych, co nie jest możliwe w przypadku tradycyjnych metod DEP.

Nowy użytkownik tej techniki może mieć trudności z zagęszczeniem światła projektora na tyle na urządzeniu mikrofluidycznym, aby utworzyć wirtualną elektrodę. Radzimy ponownie skonfigurować konfigurację, dopóki nie zadziała. W demonstracji procedury pomoże Zuri Rashad, doktorantka z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć, przygotuj mikrokanał, wybijając otwory o średnicy czterech milimetrów na taśmie dwustronnej około pięciu do sześciu milimetrów od krawędzi krótszego wymiaru i wyśrodkowane między dłuższymi bokami taśmy. Za pomocą skalpela wytnij dwie proste linie w odległości trzech milimetrów od siebie w poprzek otworów, upewniając się, że arkusze ochronne po obu stronach taśmy są założone podczas całego cięcia mikrokanałów. Zaznacz całe miejsce zmywalnym markerem, upewniając się, że wywiercone otwory pokrywają się z otworami wybitymi w taśmie dwustronnej.

Te dwa otwory będą używane jako otwory wlotowe i wylotowe urządzenia mikroprzepływowego. Wywierć dwa otwory o średnicy trzech milimetrów w górnym szkiełku ITO. Następnie na wierzchu wywierconego szkła powlekanego ITO umieść długą krawędź taśmy wyrównując się z długą krawędzią szkła.

Usuń jedną stronę folii ochronnej z taśmy dwustronnej. Dopasuj otwory taśmy w górnym szkiełku szklanym ITO i delikatnie dociśnij je do siebie, usuwając kieszenie powietrzne, szczególnie w pobliżu mikrokanału. Usuń drugą folię ochronną z taśmy dwustronnej.

Dociśnij szkiełko ITO pokryte molibdenem i amorficznym silikonem, dopasowując krawędź szkiełka fotoprzewodzącego przeciwnie do dwumilimetrowej strony odstępu z krawędzią taśmy dwustronnej w kierunku środka górnego szkiełka ITO. W ten sposób istnieje kac między ITO a fotoprzewodzącym szkiełkiem ITO. Dociśnij płaską powierzchnię, aby zapewnić dobrą przyczepność i odetnij nadmiar taśmy po bokach.

Aby podłączyć generator funkcyjny, należy przyłożyć taśmę miedzianą do krawędzi warstwy szkła ITO i warstwy szkła ITO pokrytej powłoką fotoprzewodzącą. Owiń taśmę z boku ITO lub materiału przewodzącego światło dzienne od krawędzi taśmy dwustronnej do około trzech centymetrów na niepowlekanej stronie szklanego podłoża. Aby zapewnić pomyślne wykonanie urządzenia, użyj wysokościomierza do przetestowania odczytu rezystancji między powlekanymi szkiełkami obu szklanych podłoży a miedzianą taśmą, która była przymocowana do szkła.

Dodaj 25 mililitrów ultraczystej wody do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 4,25 grama sacharozy i 0,15 grama glukozy. Dobrze wymieszaj, aż połowa sacharozy i glukozy się rozpuści i uzupełnij ultraczystą wodą do znaku 50 mililitrów. Następnie energicznie wymieszaj ten bufor DEP aż do całkowitego rozpuszczenia.

Umieść 20 mililitrów przygotowanego roztworu sacharozy i glukozy w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Dodać 0,1 grama albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do probówki. Dobrze wirować, aż całe BSA się rozpuści, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5% BSA w buforze DEP.

Umieść jeden razy 10 do sześciu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych lub HMSC lub ludzkiej nerki embrionalnej, HEK293 zawieszonej w jednym mililitrze pożywki wzrostowej w 10-mililitrowej probówce wirówkowej. Wirować, komórki HEK293 w temperaturze 201 G przez pięć minut, a HMSC w temperaturze 290 G przez 10 minut. Po odwirowaniu odessać supernatant.

01 I delikatnie ponownie zawieś ogniwa w jednym mililitrowym roztworze buforowym DEP z 0,5% BSA. Powtórz wirowanie jeszcze dwa razy i ponownie zawieś komórki w buforze DEP z 0,5% BSA. Przygotuj elementy zestawu eksperymentalnego, takie jak laptop, projektor, obiektyw, mikroskop cyfrowy i generator funkcyjny do ilościowego określania odpowiedzi komórkowych na LiDEP.

Umieść soczewkę obiektywu 10x, chip LiDEP i uchwyt na górze obiektywu projektora. Użyj laptopa do zaprojektowania projekcji świetlnych, takich jak gwiazda, diament, trzy linie i owal, a następnie podłącz laptopa do projektora. Podłącz układ LiDEP do generatora funkcyjnego, aby zastosować pole elektryczne prądu przemiennego.

Aby zaobserwować komórki, które doświadczają siły LiDEP, użyj mikroskopu cyfrowego do obrazowania zapisu NVIDIA. Po zakończeniu konfiguracji przepłucz mikrokanał 70% etanolem, a następnie przepłucz 0,5% roztworem BSA, aby usunąć etanol z poprzednich komórek. Powtórz płukanie trzy razy, aby zapewnić całkowite wypłukanie, ponieważ wcześniej wystawione komórki na działanie pola DEP będą reagować inaczej niż świeże komórki i mogą zakłócić zbieranie danych.

Usunąć 0,5% roztwór BSA za pomocą pipety. Następnie ustaw generator funkcyjny na żądane napięcie i częstotliwość. Ostrożnie dodaj 70 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny komórek do mikrokanalika urządzenia za pomocą mniejszej końcówki pipety, przechylając ją lekko w otworze w kierunku mikrokanału, aby uniknąć rozlania z powodu cienkiego mikrokanału.

Wytrzyj roztwór dostępowy jednorazowymi chusteczkami papierowymi i wyrzuć je do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne. Następnie wyświetl żądane okręgi wirtualnej geometrii elektrogeometrycznej, romby, gwiazdy lub równoległe linie na chipie LiDEP. W oprogramowaniu mikroskopu cyfrowego ustaw długość filmu na trzy minuty.

Ustaw czasomierz laboratoryjny na dwie minuty i 30 sekund. Gdy komórki znajdą się nieruchomo w mikrokanale układu LiDEP, naciśnij start w oprogramowaniu mikroskopu cyfrowego, aby rozpocząć proces nagrywania wideo. Po 10 sekundach naciśnij przycisk Włącz na wyjściu kanału generatora funkcyjnego, aby przyłożyć pole elektryczne prądu przemiennego i naciśnij start, aby włączyć timer.

Monitoruj zachowanie funkcji DEP komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego i zapobiegaj drganiom lub ruchom wokół instalacji. Gdy timer się wyłączy, naciśnij przycisk Włącz na wyjściu kanału generatora funkcyjnego, który wyłącza wyjście kanału, a pole elektryczne prądu przemiennego nie jest już dostarczane przez elektrody. Zatrzymaj nagrywanie wideo po trzech minutach i zapisz je do przyszłej analizy.

Odpipetuj komórki z końcówki wylotowej chipa LiDEP, powoli wpychając 60 mikrolitrów bufora DEP z 0,5% BSA do mikrokanału i jednocześnie zbierając wylot. Kontynuuj, aż w mikrokanale będzie mało komórek lub nie będzie ich wcale i powtórz DEP ze wszystkimi częstotliwościami, jak pokazano. Określono reakcje w ramach programu "Cyfrowa Europa" pod względem prędkości dla HMSC i procentu ich żywotności.

Pomiary pozytywnych odpowiedzi DEP przy pięciu, 10, i 20 napięciu od szczytu do szczytu lub VPP wykazały, że komórki poruszały się ze średnią prędkością odpowiednio 0,025, 0,036 i 0,051 mikrometra na sekundę. Wyniki dotyczące żywotności HMSC po doświadczeniu z siłą DEP wykazały, że wyższe napięcia na ogół skutkowały niższą żywotnością ogniw, przy czym 57% ogniw było zdolnych do życia przy 20 VPP. Do tego badania wybrano elektrody w kolorze białym, żółtym, czerwonym i niebieskim, ale na oświetlenie przez chip głębokości LiDEP miała wpływ warstwa fotoprzewodząca, która miała czerwono-pomarańczowy kolor.

W związku z tym rzutowana biała elektroda wydawała się żółta z białym wnętrzem, czerwona elektroda wydawała się pomarańczowa z czerwonym konturem, a niebieska elektroda wydawała się jasnozielona. Zjawisko to sugeruje, że kolor żółty i biały miały najsilniejsze pole DEP, podczas gdy niebieski i czerwony były słabsze. Odpowiedzi DEP HMC mierzono za pomocą LiDEP w trzech analizatorach głębokości przy 10 VPP.

W przypadku LiDEP nastąpił spadek pozytywnej odpowiedzi DEP z 30 kiloherców do 20 megaherców. Z trzech analizatorów komórki zwiększyły się w dodatnim DEP od 37 do 255 kiloherców i zmniejszyły się w dodatnim DEP z 1 772 kiloherców do 20 megaherców. Dwa ważne elementy tej metody to silne źródło światła i solidne połączenie elektryczne, które zapewnia wytwarzanie pola elektrycznego i manipulację ogniwami.

Zaobserwowaliśmy wirowanie komórek w odpowiedzi na wirtualne elektrody. Tak więc elektrorotacja jest kolejną metodą analizy komórek, którą można przeprowadzić. Rotacja elektryczna dostarczyłaby informacji na temat heterogeniczności HMSC i rzadkich subpopulacji.