Name: Dielektroforeza indukowana światłem w celu scharakteryzowania zachowania elektrycznego ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj metodę LiDEP do charakteryzacji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia analizę heterogeniczności komórek bez ingerencji w ich stan natywny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez National Science Foundation CAREER award (2048221) za pośrednictwem CBET. Chcielibyśmy podziękować Mo Kebaili z Integrated Nanosystems Research Facility (INRF) UCI. Dodatkowo chcielibyśmy podziękować dr Devinowi Keckowi za pomoc w rozwoju systemu LiDEP.

1. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych LiDEP
UWAGA: Proces produkcji polega na połączeniu trzech warstwowych komponentów: (i) warstwy fotoprzewodzącej z amorficznym krzemem (A:Si) i molibdenem osadzonym na podłożu ze szkła z tlenku indu i cyny (ITO); (ii) warstwa mikrokanalików wycięta z taśmy dwustronnej; oraz (iii) górne podłoże szklane ITO z wywierconymi otworami na wlot i wylot zawiesiny ogniwa.
<ol>
	<li>Powłoka szklana z fotoprzewodzącego tlenku indu i cyny (ITO)
	<ol>
		<li>Podłoże szklane pokryte powłoką ITO (opór 15-20 Ω) należy oczyścić, przepływając po powierzchni azot (N2) z natężeniem przepływu wystarczającym do przemieszczania widocznych cząstek kurzu. Po tym kroku spłucz podłoże acetonem.</li>
		<li>Przenieś szkiełko szklane pokryte ITO do kąpieli w alkoholu izopropylowym, aby zmyć pozostałości acetonu, spłukać wodą DI i ponownie przepuścić gazN2, aż podłoże całkowicie wyschnie.</li>
		<li>Umieść szkiełko szkiełkowe stroną pokrytą powłoką ITO do góry w systemie napylania próżniowego.</li>
		<li>Napylić warstwę molibdenu o grubości 10 nm na podłoże szklane pokryte powłoką ITO (tarcza molibdenowa) z szybkością osadzania 0,7 A/s i czasem osadzania 140 s.</li>
		<li>Dodaj maskę cienia po jednej stronie szklanego podłoża, aby pozostawić 2 mm od krawędzi szklanego podłoża odsłonięte na połączenia elektryczne. Zdeponuj 1 μm A:Si przy użyciu indukcyjnie sprzężonego plazmowo-plazmowego chemicznego osadzania z fazy gazowej (ICP-PECVD), jak opisano w Medjdoub et al.25.</li>
		<li>Wyczyść szkiełko gazemN2, aby usunąć kurz i inne zanieczyszczenia. W przypadku każdego A:Si osadzonego pod maską cienia, zanurz krawędź do znaku 2 mm w 25% w/v roztworze wodorotlenku potasu, aby wytrawić A:Si.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Produkcja urządzeń z chipem LiDEP
	<ol>
		<li>Aby uformować mikrokanalik, należy zaopatrzyć się w taśmę dwustronną (52 mm x 25 mm) i przebić otwory (średnica = 4 mm) w odległości 5-6 mm od krawędzi krótszego wymiaru i wyśrodkowane między dłuższymi bokami taśmy. Użyj skalpela, aby przeciąć dwie proste linie (w odległości 3 mm od siebie) w poprzek otworów. Upewnij się, że arkusze ochronne po obu stronach taśmy dwustronnej są założone podczas całego etapu cięcia mikrokanałów.</li>
		<li>Wywierć dwa otwory o średnicy 3 mm w górnym szkiełku ITO. Taśmę można wyrównać na wierzchu szkła pokrytego ITO, przy czym długa krawędź taśmy wyrównuje się z długą krawędzią szkła. Zaznacz położenie otworu zmywalnym markerem. Upewnij się, że wywiercone otwory pokrywają się z otworami wybitymi w taśmie dwustronnej. Te dwa otwory będą działać jako otwory wlotowe i wylotowe urządzenia mikroprzepływowego.</li>
		<li>Usuń jedną stronę folii ochronnej z taśmy dwustronnej, wyrównaj otwory w taśmie i górnym szkiełku szklanym ITO i dociśnij je do siebie. Delikatnie dociśnij, aby usunąć kieszenie powietrzne, szczególnie w pobliżu mikrokanału. Kieszenie powietrzne mogą pozwalać na przedostawanie się medium lub innych roztworów pod taśmę, co może uszkodzić lub spowodować pleśń w urządzeniu mikroprzepływowym.</li>
		<li>Usuń drugą folię ochronną z taśmy dwustronnej i dociśnij do strony ze szkła ITO pokrytego molibdenem i A: Si. Dopasuj krawędź szkiełka światłoprzewodzącego, która jest przeciwna do strony odstępu 2 mm, do krawędzi taśmy dwustronnej, która jest skierowana w stronę środka górnego szkiełka ITO. Pojawi się kac po górnym szkiełku ITO i szkiełku ITO pokrytym materiałem fotoprzewodzącym.</li>
		<li>Dociśnij płaską powierzchnię, aby zapewnić dobrą przyczepność. Schemat podłoża szklanego i warstw taśmy dwustronnej jest zilustrowany na rysunku Rysunek 1A. Odetnij nadmiar taśmy z boku.</li>
		<li>Nałóż taśmę miedzianą na krawędzie warstwy A i warstwy C, aby połączyć generator funkcyjny. Należy w tym celu owinąć taśmę po stronie ITO lub materiału fotoprzewodzącego, w zależności od tego, czy jest to warstwa A, czy warstwa C, od krawędzi taśmy dwustronnej do około 3 cm na niepowlekaną stronę podłoża szklanego.</li>
		<li>Aby zapewnić pomyślne wykonanie urządzenia, użyj multimetru do przetestowania odczytu rezystancji między powlekanymi szkiełkami obu szklanych podłoży a miedzianą taśmą, która była przymocowana do szkła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie buforu funkcji DEP
	<ol>
		<li>Odmierz 4,25 g sacharozy i umieść ją w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Następnie odmierz 0,15 g glukozy i umieść ją w tej samej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Napełnij stożkową rurkę 25 ml ultraczystej wody, zamknij pokrywkę i wymieszaj. Gdy około połowa sacharozy i glukozy się rozpuszczy, napełnij stożkową rurkę ultraczystą wodą do linii 50 ml. Mieszaj energicznie, aż cała sacharoza i glukoza się rozpuszczą. Roztwór buforowy DEP zawiera 8,5% (m/v) sacharozy i 0,3% (w/v) glukozy.</li>
		<li>Uzyskać 20 ml przygotowanego roztworu sacharozy i glukozy i umieścić go w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Następnie odmierzyć 0,1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i umieścić ją w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej sacharozę i roztwór glukozy. Wirować, aż BSA się rozpuści. Końcowy roztwór buforowy DEP zawiera 0,5% (w/v) BSA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek
	<ol>
		<li>Uzyskać co najmniej 1 x 106 komórek (hMSCs lub HEK 293) zawieszonych w 1 ml pożywki wzrostowej, korzystając z protokołu hodowli komórkowej opisanego w poprzednich badaniach26,27. Umieścić zawiesinę komórek w probówce wirówkowej o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Odwirować komórki HEK 293 przy 201 x g przez 5 minut, a hMSC przy 290 x g przez 10 minut. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml roztworu buforowego DEP z 0,5% BSA. Należy pamiętać, aby nie dodawać roztworu buforowego zbyt szybko, ponieważ mogą tworzyć się pęcherzyki.</li>
		<li>Powtórz proces wirowania jeszcze dwa razy, a następnie ponownie zawieś komórki w buforze DEP z 0,5% BSA w celu scharakteryzowania LiDEP. Podany protokół przygotowania komórek wystarcza na 10 przebiegów. Na przykład jeden test częstotliwości wymaga co najmniej 15 przebiegów, a zatem należy wykonać 2 ml komórek o stężeniu 1 x 106 komórek/ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Charakterystyka LiDEP
<ol>
	<li>Konfiguracja eksperymentalna
	<ol>
		<li>Zbierz następujący sprzęt do zestawu eksperymentalnego do ilościowego określania odpowiedzi komórkowych na LiDEP: laptop, projektor, obiektyw, mikroskop cyfrowy i generator funkcyjny. Użyj laptopa, aby zaprojektować projekcje świetlne (gwiazda, romb, trzy linie i owal) i podłącz go do projektora.</li>
		<li>Użyj projektora jako źródła światła, aby wyświetlić projekcje świetlne na powierzchni fotoprzewodzącej (warstwa C) układu LiDEP. Ustaw go tak, aby światło ze źródła światła (projektora) przepływało przez soczewkę obiektywu 10x do obszaru mikrokanału układu LiDEP. Soczewka obiektywu 10x znajduje się na górze obiektywu projektora. Rysunek uzupełniający 1 przedstawia integrację projektora z systemem LiDEP.</li>
		<li>Podłącz układ LiDEP do generatora funkcyjnego, aby zastosować pole elektryczne prądu przemiennego. Obserwuj komórki doświadczające siły LiDEP, używając mikroskopu cyfrowego do obrazowania i nagrywania wideo. Rysunek 1B przedstawia schemat aparatury eksperymentalnej. Postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych26,27 dla wszystkich testowanych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedury eksperymentalne
	<ol>
		<li>Przepłucz mikrokanał 70% etanolem, a następnie 0,5% roztworem BSA. Ponownie przepłucz mikrokanał 0,5% roztworem BSA jeszcze dwa razy, aby upewnić się, że etanol i poprzednie komórki zostały całkowicie wypłukane. Komórki, które zostały już wystawione na działanie pola DEP, będą reagować inaczej niż świeże komórki i mogą zakłócać gromadzenie danych.</li>
		<li>Usunąć 0,5% roztwór BSA za pomocą pipety i umieścić urządzenie mikroprzepływowe w uchwycie urządzenia.</li>
		<li>Przymocuj zaciski krokodylkowe do każdego z połączeń taśmy miedzianej w urządzeniu. Ustaw generator funkcyjny na żądane napięcie (napięcie od szczytu do szczytu, Vpp) i częstotliwość (Hz). Badany tutaj zakres częstotliwości wynosił od 30 kHz do 20 MHz.</li>
		<li>Dodać 70 μl zawiesiny komórkowej (komórki + roztwór buforowy DEP z 0,5% BSA) do mikrokanału urządzenia. Ze względu na cienkość mikrokanalika (~0,05 mm) może dojść do rozlania z otworów wlotowych i wylotowych. Aby zmniejszyć ilość rozlanego płynu, użyj mniejszej końcówki do pipety i lekko przechyl końcówkę w otworze w kierunku mikrokanału. Każdy roztwór dostępowy (0,5% BSA lub komórki w roztworze) można zetrzeć jednorazowymi chusteczkami papierowymi i wyrzucić do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne.</li>
		<li>Rzutuj żądaną wirtualną geometrię elektrody (w tym przypadku okręgi, romby, gwiazdy i/lub linie równoległe) na chip LiDEP.</li>
		<li>W oprogramowaniu mikroskopu cyfrowego ustaw długość filmu na 3 min. Ustaw minutnik laboratoryjny na 2 min 30 s. Gdy komórki są nieruchome w mikrokanale układu LiDEP, naciśnij Start w oprogramowaniu mikroskopu cyfrowego, aby rozpocząć proces nagrywania wideo.</li>
		<li>Odczekaj 10 sekund, a następnie naciśnij przycisk ON na wyjściu kanału generatora funkcyjnego, aby zastosować pole elektryczne prądu przemiennego, a następnie naciśnij Start, aby włączyć timer. Monitoruj zachowanie funkcji DEP komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego i zapobiegaj drganiom lub ruchom wokół instalacji.</li>
		<li>Gdy timer się wyłączy, naciśnij przycisk ON na wyjściu kanału generatora funkcji. Powoduje to wyłączenie wyjścia kanału generatora funkcyjnego, a pole elektryczne prądu przemiennego nie jest już dostarczane przez elektrody. Zatrzymaj nagrywanie wideo po 3 minutach i zapisz je w mikroskopie cyfrowym do przyszłej analizy.</li>
		<li>Odpipetuj komórki z końcówki wylotowej chipa LiDEP, powoli wpychając 60 μl buforu DEP z 0,5% BSA do mikrokanału i jednocześnie zbierając na wylocie. Kontynuuj, aż w mikrokanale będzie mało komórek lub nie będzie ich wcale.</li>
		<li>Powtarzać kroki 2.2.3-2.2.9, aż wszystkie częstotliwości zostaną przetestowane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mahla, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+applications+in+regenerative+medicine+and+disease+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics.</a> International Journal of Cell Biology. 2016, (2016).</li>
<li>Bhansali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+autologous+bone+marrow-derived+stem+cell+transplantation+in+patients+with+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Efficacy of autologous bone marrow-derived stem cell transplantation in patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Stem Cells and Development. 18 (10), 1407-1416 (2009).</li>
<li>Bouchlaka, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages+are+a+distinct+high+IL-6-producing+subset+that+confer+protection+in+graft-versus-host-disease+and+radiation+injury+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cell-educated macrophages are a distinct high IL-6-producing subset that confer protection in graft-versus-host-disease and radiation injury models.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 23 (6), 897-905 (2017).</li>
<li>Alfaifi, M., Eom, Y. W., Newsome, P. N., Baik, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+therapy+for+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell therapy for liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 68 (6), 1272-1285 (2018).</li>
<li>Oswald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+can+be+differentiated+into+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro.</a> Stem Cells. 22 (3), 377-384 (2004).</li>
<li>Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+stem+cells+derived+from+various+mesenchymal+tissues%3A+superiority+of+synovium+as+a+cell+source%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source.</a> Arthritis and rheumatism. 52 (8), 2521-2529 (2005).</li>
<li>Poirier, J. T. Chapter 5 - Genetic profiling of tumors in PDX models. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoirier%2C+JT+%22In+Patient+Derived+Tumor+Xenograft+Models%3A+Promise%2C+Potential+and+Practice%22">In Patient Derived Tumor Xenograft Models: Promise, Potential and Practice</a>. Uthamanthil, R., Tinkey, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 149-159 (2017).</li>
<li>Sino Biological. Fluorescence-activated cell sorting (FACS). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sinobiological.com/category/fcm-facs-facs">https://www.sinobiological.com/category/fcm-facs-facs</a> (2023).</li>
<li>González-González, M., Vázquez-Villegas, P., García-Salinas, C., Rito-Palomares, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+strategies+and+challenges+for+the+purification+of+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Technology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Current strategies and challenges for the purification of Stem Cells.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 87 (1), 2-10 (2011).</li>
<li>Flanagan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+dielectric+properties+distinguish+stem+cells+and+their+differentiated+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny.</a> Stem Cells. 23 (3), 656-665 (2007).</li>
<li>Vykoukal, J., Vykoukal, D. M., Freyberg, S., Alt, E. U., Gascoyne, P. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+putative+stem+cells+from+adipose+tissue+using+dielectrophoretic+field-flow+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Enrichment of putative stem cells from adipose tissue using dielectrophoretic field-flow fractionation.</a> Lab on a Chip. 8 (8), 1386-1393 (2008).</li>
<li>Adams, T. N. G., Turner, P. A., Janorkar, A. V., Zhao, F., Minerick, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+dielectric+properties+of+human+mesenchymal+stem+cells+and+the+effects+of+charged+elastin-like+polypeptide+copolymer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Characterizing the dielectric properties of human mesenchymal stem cells and the effects of charged elastin-like polypeptide copolymer treatment.</a> Biomicrofluidics. 8 (5), (2014).</li>
<li>Wu, H. W., Lin, C. C., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Stem cells in microfluidics.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), (2011).</li>
<li>Adams, T. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+enrichment+of+fate-biased+human+neural+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free enrichment of fate-biased human neural stem and progenitor cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 152, 111982(2020).</li>
<li>Zhao, K., Larasati,, Duncker, B. P., Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+characterization+and+separation+by+microfluidic+alternating+current+dielectrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Continuous cell characterization and separation by microfluidic alternating current dielectrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6304-6314 (2019).</li>
<li>Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow+sorting+o+stem+cells+and+differentiation+products+based+on+dielectrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow sorting o stem cells and differentiation products based on dielectrophoresis.</a> Lab on a Chip. 15, 1320-1328 (2015).</li>
<li>Khoshmanesh, K., Nahavandi, S., Baratchi, S., Mitchell, A., Kalantar-Zadeh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoretic+platforms+for+bio-microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoretic platforms for bio-microfluidic systems.</a> Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 1800-1814 (2010).</li>
<li>Hoettges, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-second+electrophysiology%3A+Evaluation+of+the+3DEP+platform+for+high-speed%2C+high-accuracy+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ten-second electrophysiology: Evaluation of the 3DEP platform for high-speed, high-accuracy cell analysis.</a> Scientific Reports. 9, 19153(2019).</li>
<li>Hubner, Y., Hoettges, K. F., Kass, G. E. N., Ogin, S. L., Hughes, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+measurements+of+drug+actions+on+Erythrocytes+by+dielectrophoresis%2C+using+a+three-dimensional+electrode+design%5BTitle%5D)+AND+%22IEE+Proceedings+-+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Parallel measurements of drug actions on Erythrocytes by dielectrophoresis, using a three-dimensional electrode design.</a> IEE Proceedings - Nanobiotechnology. 152 (4), 150-154 (2005).</li>
<li>Hoettges, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoresis-activated+multiwell+plate+for+label-free+high-throughput+drug+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment.</a> Analytical Chemistry. 80 (9), 2063-2068 (2008).</li>
<li>Mulhall, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer%2C+pre-cancer+and+normal+oral+cells+distinguished+by+dielectrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cancer, pre-cancer and normal oral cells distinguished by dielectrophoresis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (8), 2455-2463 (2011).</li>
<li>Liao, C. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optically+induced+dielectrophoresis+%28ODEP%29-based+microfluidic+system+for+the+isolation+of+high-purity+CD45neg%2FEPCAMNEG+cells+from+the+blood+samples+of+cancer+patients-Demonstration+and+initial+exploration+of+the+clinical+significance+of+these+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">An optically induced dielectrophoresis (ODEP)-based microfluidic system for the isolation of high-purity CD45neg/EPCAMNEG cells from the blood samples of cancer patients-Demonstration and initial exploration of the clinical significance of these cells.</a> Micromachines. 9 (11), 563(2018).</li>
<li>McGrath, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology-based+stratification+of+pancreatic+tumorigenicity+by+label-free+single-cell+impedance+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology-based stratification of pancreatic tumorigenicity by label-free single-cell impedance cytometry.</a> Analytica Chimica Acta. 1101, 90-98 (2019).</li>
<li>Chiu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically-induced-dielectrophoresis+%28ODEP%29-based+cell+manipulation+in+a+microfluidic+system+for+high-purity+isolation+of+integral+circulating+tumor+cell+%28CTC%29+clusters+based+on+their+size+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%2C+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Optically-induced-dielectrophoresis (ODEP)-based cell manipulation in a microfluidic system for high-purity isolation of integral circulating tumor cell (CTC) clusters based on their size characteristics.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 258, 1161-1173 (2018).</li>
<li>Medjdoub, M., Courant, J. L., Maher, H., Post, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductively+coupled+plasma+-+plasma+enhanced+chemical+vapor+deposition+silicon+nitride+for+passivation+of+InP+based+high+electron+mobility+transistors+%28HEMTs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Material+Science+and+Engineering%3A+B%22%5BJournal%5D)">Inductively coupled plasma - plasma enhanced chemical vapor deposition silicon nitride for passivation of InP based high electron mobility transistors (HEMTs).</a> Material Science and Engineering: B. 80 (1-3), 252-256 (2001).</li>
<li>Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; Normal, human. , ATCC. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/pcs-500-010">https://www.atcc.org/products/pcs-500-010</a> (2023).</li>
<li>293 [HEK-293]. , ATCC. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/crl-1573">https://www.atcc.org/products/crl-1573</a> (2023).</li>
<li>Glasser, H., Fuhr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+cells+under+strong+ac-electric+field-differentiation+between+heating+and+trans-membrane+potential+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry+and+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Cultivation of cells under strong ac-electric field-differentiation between heating and trans-membrane potential effects.</a> Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 47 (2), 301-310 (1998).</li>
<li>Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+flexible+virtual+microchannels+based+on+optically+induced+dielectrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Implementation of flexible virtual microchannels based on optically induced dielectrophoresis.</a> Nanotechnology. 33, 295102(2022).</li>
<li>Schellenberg, J. J., Kao, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+relationship+between+photoconductivity+and+light+intensity+in+solids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">On the relationship between photoconductivity and light intensity in solids.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 21, 1764-1768 (1988).</li>
<li>Aoyagi, Y., Masuda, K., Namba, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explaination+of+light-intensity+dependence+of+photoconductivity+in+zinc+phthalocyanine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Explaination of light-intensity dependence of photoconductivity in zinc phthalocyanine.</a> Journal of Applied Physics. 43, 249-251 (1972).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Badanie heterogeniczności hMSC jest ważne dla ich postępu w terapiach. Prace te stanowią pierwszy krok w kierunku wykorzystania LiDEP jako narzędzia analitycznego do oceny komórek zamieszkania i tłuszczu (hMSC). Zbadaliśmy zależność napięcia od dodatniej odpowiedzi DEP komórek w LiDEP poprzez ilościowe określenie prędkości. Oczekuje się, że wyższe napięcia powinny wytwarzać silniejszą dodatnią siłę DEP i zaobserwowaliśmy ten wzorzec przy zmierzonych prędkościach. Napięcia 10 Vpp i 20 Vpp były wystarczające do manipulowania hMSC za pomocą LiDEP. Niższe napięcia (tj. 5 Vpp) skutkowały wolniejszymi reakcjami ogniw; chociaż nie jest to optymalne rozwiązanie dla komórek hMSC, może być korzystne dla innych typów komórek. Nastąpił zależny od napięcia spadek żywotności hMSC o około 9%. Różni się to nieznacznie od poprzedniej literatury 6,12,28,29, w której zastosowanie tradycyjnych DEP i LiDEP w badaniu komórek biologicznych nie zmniejszyło żywotności komórek. Jednak cel eksperymentalny w każdym badaniu był różny. Glasser i Fuhr monitorowali wzrost adherentnych mysich fibroblastów L929 na metalowych elektrodach w pożywce do hodowli komórkowej28. I odwrotnie, Lu i in. zbadali żywotność nerwowych komórek macierzystych wystawionych na działanie pól elektrycznych prądu przemiennego przez różne okresy czasu12. Adams i wsp. scharakteryzowali właściwości dielektryczne hMSC za pomocą elektrod metalowych12, a Li i wsp. manipulowali komórkami białaczkowymi za pomocą LiDEP29. Różnica między tymi badaniami a naszymi polegała na zastosowaniu BSA, co może być przyczyną obserwowanego przez nas spadku żywotności. Jednak niższa ogólna żywotność może być również spowodowana czasem ekspozycji (2 min 30 s) zastosowanym w ustanowionym tutaj protokole. Czas ten został wybrany, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na wizualizację manipulacji komórkami podczas ekspozycji na niejednorodne pole elektryczne prądu przemiennego.
Metody charakteryzacji ogniw zostały przetestowane za pomocą koloru elektrody w celu określenia możliwości i ograniczeń naszego systemu LiDEP zbudowanego zgodnie z opisem w protokole. W tym konkretnym protokole kolor elektrody może być kontrolowany na podstawie koloru kształtu rzutowanego za pomocą pliku edytora graficznego. Użyliśmy czterech kolorów: białego, żółtego, czerwonego i niebieskiego. Na podstawie odczytów mocy wyjściowej dla każdego koloru, zmierzono, że rzutowane elektrody żółte (#FFFF00) i białe (#FFFFFF) mają wyższą intensywność, co było podstawą do tego, dlaczego kolory te były korzystniejsze do wykorzystania w kolejnych eksperymentach. Dodatkowo, ze względu na ustaloną zależność materiałów fotoprzewodzącychod natężenia światła 30,31, wyniki sugerują, że wydajność urządzeń LiDEP zależy od fotoprzewodzącego A:Si i może być dostrojona poprzez wybór projektowanego koloru elektrody. Kombinację pozytywnych i negatywnych odpowiedzi hMSC w ramach programu DEP zaobserwowano również przy użyciu LiDEP, co jest podobne do zjawiska obserwowanego w tradycyjnych metodach DEP. Przy każdym kolorze elektrody hMSC doświadczały ujemnej siły DEP, dodatniej siły DEP i rotacji komórek, co wskazuje, że próbka komórki była niejednorodna przy jednej częstotliwości (Dodatkowe wideo 1). Zgadza się to z ustaleniami Adamsa i wsp.6, że hMSC wykazują zarówno negatywne, jak i pozytywne zachowanie DEP przy jednej częstotliwości. Warunki te (kolor elektrody, kształt elektrody i materiał fotoprzewodzący) mogą dostarczyć dodatkowych parametrów do wykrywania poziomu niejednorodności w próbkach hMSC.
Na koniec wyniki oceny LiDEP porównano z wynikami analizatora 3DEP jako punkt odniesienia zachowania funkcji DEP hMSC. Zaobserwowano różnicę w zakresie częstości dodatniej odpowiedzi DEP hMSC, ale trendy w danych zebranych za pomocą LiDEP i analizatora 3DEP były ogólnie podobne (tj. dodatnia odpowiedź DEP zmniejszała się wraz ze wzrostem częstości). Kiedy pole elektryczne prądu przemiennego zostało dostarczone do chipa LiDEP i zostało na niego rzucone światło, przewodność w obszarze projekcji światła spadła, tworząc niejednorodne pole elektryczne. W związku z tym charakterystyka źródła światła (tj. natężenie i długość fali) wpływa na oczekiwaną odpowiedź komórek w chipie LiDEP, co widać na podstawie wyników testów napięcia i zmienności koloru elektrody. Inne parametry, które można modyfikować, to materiał warstwy fotoprzewodzącej i przewodność roztworu buforowego DEP. W związku z tym warunki używane do oceny zachowania komórek w trybie DEP muszą być oceniane w oparciu o konfigurację systemu LiDEP. I odwrotnie, w przypadku analizatora 3DEP lub innych metod, które wykorzystują elektrody metalowe do przykładania siły DEP, charakterystyka elektrody jest stała i nie można jej natychmiast zmienić, aby dostosować się do tego, co jest potrzebne dla badanych komórek. Ta zmienność pozytywnego zachowania DEP może być korzystna dla przyszłych badań nad charakterystyką różnych typów komórek w próbkach hMSC, analizą pojedynczych komórek lub sortowaniem komórek. Ponadto, w miarę oddalania się ogniw od wirtualnych elektrod, pole elektryczne prądu przemiennego staje się słabsze. Jednak w przypadku analizatora 3DEP lub innych tradycyjnych trybów DEP, które wykorzystują elektrody metalowe, można zastosować większy obszar pola elektrycznego, co pozwala na manipulowanie większą liczbą komórek. W związku z tym mniej komórek w eksperymencie LiDEP doświadczyło wpływu pola elektrycznego prądu przemiennego w mikrokanaliku chipa LiDEP. Dalsze rozbieżności mogą być spowodowane zmianami wydajności urządzenia w czasie (tj. 2 godziny lub 3 godziny), co jest nadal badane. Stały przepływ wody, etanolu i roztworu buforowego DEP może rozbić powierzchnię warstwy mikrokanalików (tj. materiału fotoprzewodzącego) i należy go wziąć pod uwagę. W przypadku przedłużonego użytkowania jednego układu LiDEP należy również wziąć pod uwagę wydajność urządzenia w czasie w celu charakteryzacji komórek. Modyfikacje parametrów eksperymentalnych w czasie rzeczywistym trwały od kilku sekund do minut. Kolor i geometria elektrody zostały natychmiast dostosowane za pomocą ustawień w oprogramowaniu edytora graficznego. 
Podsumowując, w artykule przedstawiono możliwości LiDEP w zakresie manipulowania i charakteryzowania linii komórkowej z heterogenicznymi populacjami komórek, takimi jak hMSC. Korzystając z tej konfiguracji i opisanego protokołu, byliśmy w stanie osiągnąć pomyślną charakterystykę hMSC w warunkach 20 Vpp i projekcji wirtualnych żółtych elektrod. Przyszłe badania powinny koncentrować się na dostosowaniu czasu ekspozycji hMSC na pole elektryczne prądu przemiennego wytwarzane przez LiDEP, zwiększeniu natężenia światła wirtualnych elektrod oraz ocenie różnych źródeł hMSC (lub innych populacji komórek macierzystych) w celu opracowania katalogu LiDEP sygnatur elektrycznych heterogenicznych populacji komórek macierzystych.

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) są znane ze swoich właściwości immunosupresyjnych1, co doprowadziło do ich zastosowania w terapiach w leczeniu różnych chorób, takich jak cukrzyca typu II2, choroba przeszczep kontra gospodarz3, oraz choroby wątroby4. HMSC są niejednorodne, zawierają subpopulacje komórek, które różnicują się w adipocyty, chondrocyty i osteoblasty. HMSC pochodzą z tkanki tłuszczowej, tkanki pępowinowej i szpiku kostnego, a ich potencjał różnicowania zależy od tkanki pochodzenia i zastosowanego procesu hodowli komórek5. Na przykład, zgodnie z badaniem przeprowadzonym przez Sakaguchi i wsp., hMSC pochodzące z tkanki tłuszczowej są bardziej skłonne do różnicowania się w adipocyty, podczas gdy hMSC pochodzące ze szpiku kostnego są bardziej skłonne do różnicowania się w osteocyty6. Jednak wpływ pochodzenia tkankowego hMSC na ich potencjał różnicowania jest zjawiskiem, które nadal wymaga dalszego zrozumienia. Ponadto zróżnicowane potencjały różnicowania hMSC przyczyniają się do ich nieodłącznej heterogeniczności i stwarzają wyzwania w stosowaniu hMSC w celach terapeutycznych. W związku z tym charakterystyka, a także sortowanie heterogenicznych linii komórek macierzystych ma kluczowe znaczenie dla rozwoju in vitro i klinicznego zastosowania tych komórek. Cytometria przepływowa, złoty standard techniki badania różnic w fenotypach komórkowych, wykorzystuje antygeny powierzchniowe komórek i barwniki fluorescencyjne do znakowania komórek docelowych i charakteryzowania ich na podstawie rozpraszania światła lub charakterystyki fluorescencji specyficznej dla komórki6,7,8. Do wad tej metody należy ograniczona dostępność biomarkerów antygenów na powierzchni komórki, wysoki koszt sprzętu i operacji oraz fakt, że barwienie powierzchni komórki może potencjalnie uszkodzić błonę komórkową i wpłynąć na zastosowania terapeutyczne9,10,11. W związku z tym badanie nowych technik charakterystyki komórek bez naruszania natywnego stanu błony komórkowej może korzystnie wpłynąć na skuteczność kliniczną terapii komórkami macierzystymi.
Dielektroforeza (DEP), metoda charakteryzacji komórek, która nie używa etykiet powierzchniowych, jest przedmiotem obecnej pracy. DEP to bezznacznikowa lub niebarwiąca metoda stosowana na platformach mikroprzepływowych w celu scharakteryzowania heterogenicznych populacji komórek na podstawie ich właściwości elektrycznych. DEP wykorzystuje pole elektryczne prądu przemiennego (AC) w celu zastąpienia barwienia fluorescencyjnego (tj. metody opartej na znacznikach)7. Inne zalety stosowania urządzeń mikroprzepływowych opartych na DEP do charakteryzowania komórek obejmują wykorzystanie małych objętości (mikrolitrów), szybki czas analizy, minimalne wymagania dotyczące przygotowania próbki komórki, minimalne ryzyko zanieczyszczenia próbki, minimalną produkcję odpadów i niski koszt12,13. Kolejną zaletą funkcji DEP jest monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym14,15,16. W przypadku DEP ogniwa w zawiesinie są wystawione na działanie niejednorodnego pola elektrycznego prądu przemiennego wytworzonego za pomocą elektrod i stają się spolaryzowane6. Ta polaryzacja powoduje ruch komórek i umożliwia manipulację komórkami w oparciu o częstotliwość i napięcie przyłożonego pola elektrycznego prądu przemiennego. Dostosowując częstotliwość, zwykle w zakresie od 5 kHz do 20 MHz, komórki mogą być przyciągane lub odpychane od elektrod, co odpowiada odpowiednio dodatniemu i ujemnemu zachowaniu DEP6.
Istnieje wiele trybów charakterystyki DEP, a mianowicie: tradycyjny, frakcjonowanie przepływu w polu i indukowany światłem, zgodnie z klasyfikacją konfiguracji elektrod i/lub strategią operacyjną17. Analizator 3DEP, tradycyjny tryb DEP, zawiera fizyczne elektrody metalowe i monitoruje odpowiedź komórkową na pole elektryczne prądu przemiennego. System ten wykorzystuje chip składający się z mikrostudzienek z wieloma trójwymiarowymi okrągłymi elektrodami i wykrywa zmiany natężenia światła, aby scharakteryzować zachowanie DEP komórki18,19,20,21. Dodatni DEP obserwuje się, gdy ogniwa poruszają się w kierunku krawędzi okrągłych elektrod wzdłuż ścianek mikrostudzienki, co powoduje zwiększenie natężenia światła w środku mikrodołka. Ujemny DEP obserwuje się, gdy komórki skupiają się w środku mikrostudzienki z dala od okrągłych elektrod, co powoduje zmniejszenie natężenia światła w środku mikrostudzienki. Te dwa zjawiska są reprezentowane w <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Tradycyjne metody DEP umożliwiają charakteryzowanie właściwości elektrycznych heterogenicznych populacji komórek18,20,21. Na przykład Mulhall i wsp. wykazali potencjał do rozróżnienia między normalnymi liniami komórkowymi keratynocytów jamy ustnej (HOK) a złośliwymi liniami komórkowymi keratynocytów jamy ustnej (H357) na podstawie różnic w pojemności błony21 przy użyciu analizatora 3DEP. Jednak jednym z ograniczeń tradycyjnych trybów DEP jest stała geometria elektrody. Ze względu na to, że hMSC są niejednorodne, korzystna jest możliwość łatwej modyfikacji geometrii elektrod podczas oceny DEP. Na przykład możliwość modyfikowania elektrod lub układów elektrod w czasie rzeczywistym w celu wychwytywania pojedynczych komórek pozwala na scharakteryzowanie komórek na podstawie prędkości i zachowania DEP. Zastosowanie modyfikacji elektrod w czasie rzeczywistym w ocenach DEP hMSC pozwala na jednokomórkową analizę hMSC zaraz po ich pozyskaniu z tkanki próbki w celu scharakteryzowania niejednorodności populacji próbki.
Aby przezwyciężyć ograniczenia tradycyjnych trybów DEP (tj. stałych elektrod fizycznych) i zbadać nowe możliwości modyfikacji konfiguracji elektrod w czasie rzeczywistym za pomocą zjawiska DEP, zbadano DEP indukowane światłem (LiDEP). LiDEP to nietradycyjny tryb DEP, który manipuluje komórkami za pomocą fotoprzewodzącego urządzenia mikroprzepływowego22,23 poprzez projekcje świetlne, zlokalizowane elektrody wytwarzają niejednorodne pole elektryczne, podobnie jak tradycyjna metoda DEP. Takie podejście pozwala również na elastyczność w geometrii elektrod i przesuwanie elektrod w urządzeniu mikroprzepływowym. Łagodzi to ograniczenia widoczne w przypadku elektrod stałych i daje możliwość uzyskania większej ilości informacji na temat heterogeniczności komórkowej. LiDEP został wykorzystany do wykrywania i analizowania różnych typów komórek w jednorodnych i heterogenicznych populacjach komórek22,23,24. Na przykład Liao i wsp. użyli LiDEP do oddzielenia krążących komórek nowotworowych (CTC) wyrażających moduł adhezji komórek nabłonka (EpCAM neg) od czerwonych krwinek, aby zbadać ich znaczenie w przerzutach raka22. Analiza pojedynczych komórek za pomocą LiDEP została z powodzeniem wykorzystana do scharakteryzowania i manipulowania komórkami nowotworowymi z stratyfikacją rakotwórczości trzustki23 oraz analizą CTC w próbkach przed i po przerzutach24.
Tutaj opisujemy, jak LiDEP może być wykorzystany do manipulowania hMSC za pomocą różnych geometrii elektrod (okrąg, diament, gwiazda i równoległe linie) oraz ustawień systemowych (przyłożone napięcie, natężenie światła i materiał urządzenia mikroprzepływowego), oferując w ten sposób podejście do charakteryzowania zachowania komórek macierzystych pochodzenia ludzkiego za pomocą wirtualnych elektrod.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>10x obiektyw</td><td>AmScope</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>Krzem amorficzny (A:Si)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5130</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>Taśma miedziana</td><td>Zehhe</td><td>BF4964</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza (glukoza)</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop cyfrowy</td><td>Keyence</td><td>VHX-7000</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Insulectro</td><td>FLX000484</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Fetel (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Generator funkcji</td><td>Tektronix</td><td>AFG 31102</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do edycji graficznej</td><td>Microsoft Office Powerpoint</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane powlekane tlenkiem indu i cyny</td><td>MSE Dostarczone</td><td>GL0333</td><td></td></tr><tr><td>L-alanylo-L-glutamina</td><td>ATCC</td><td>PCS-999-034</td><td></td></tr><tr><td>Laptop</td><td>Dell</td><td>Inspiron 14, 2-w-1</td><td></td></tr><tr><td>Mezenchymalna bazowa komórka macierzysta Medium</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-030</td><td></td></tr><tr><td>Mezenchymalny zestaw do wzrostu komórek macierzystych do MSC pochodzących z pępowiny i sznura tłuszczowego</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-040</td><td></td></tr><tr><td>Minimum niezbędne mediaum alfa (MEM a, 1X)</td><td>Giblo</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>Molibden, 99,95%</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EJTMOXX352A4</td><td>Cel rozpylania</td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>P5530</td><td></td></tr><tr><td>Miernik mocy</td><td>Thor Labs</td><td>S130VC/PM400</td><td></td></tr><tr><td>Projektor</td><td>Vecupoi</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Media</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Ten nośnik zawiera L-glutaminę i czerwień fenolową.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>0,40%</td></tr> <tr><td>Neutralizator trypsyny</td><td>Gibco</td><td>R002100</td><td></td></tr><tr><td>System napylania próżniowego</td><td>Denton</td><td>DV-502M</td><td></td></tr></tbody></table>

dielektroforeza indukowana światłem w celu scharakteryzowania zachowania elektrycznego ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Light-Induced Dielectrophoresis for Characterizing the Electrical Behavior of Human Mesenchymal Stem Cells

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) stanowią źródło komórek pochodzących od pacjenta do prowadzenia mechanistycznych badań nad chorobami lub do wielu zastosowań terapeutycznych. Zrozumienie właściwości hMSC, takich jak ich zachowanie elektryczne na różnych etapach dojrzewania, stało się w ostatnich latach ważniejsze. Dielektroforeza (DEP) to metoda, która może manipulować komórkami w niejednorodnym polu elektrycznym, dzięki czemu można uzyskać informacje o właściwościach elektrycznych komórek, takich jak pojemność błony komórkowej i przenikalność. Tradycyjne tryby DEP wykorzystują elektrody metalowe, takie jak elektrody trójwymiarowe, do scharakteryzowania odpowiedzi komórek na DEP. W tym artykule przedstawiamy urządzenie mikroprzepływowe zbudowane z warstwy fotoprzewodzącej zdolnej do manipulowania komórkami za pomocą projekcji świetlnych, które działają jak wirtualne elektrody in situ o łatwo dopasowanej geometrii. Przedstawiono tutaj protokół, który demonstruje to zjawisko, zwane DEP indukowanym światłem (LiDEP), w celu scharakteryzowania hMSC. Pokazujemy, że odpowiedzi komórek indukowane przez LiDEP, mierzone jako prędkości komórek, można zoptymalizować za pomocą różnych parametrów, takich jak napięcie wejściowe, zakresy długości fal projekcji światła i intensywność źródła światła. Przewidujemy, że w przyszłości platforma ta może utorować drogę technologiom, które są wolne od znaczników i umożliwiają charakteryzację w czasie rzeczywistym heterogenicznych populacji hMSC lub innych linii komórek macierzystych.

Testy napięcia oraz koloru elektrod przeprowadzono zgodnie z powyższą procedurą, z niewielkimi zmianami w kroku 2.2.3 i kroku 2.2.10. W teście napięcia kolor elektrod oraz częstotliwość pozostały stałe, a zastosowano wartości 5 Vpp, 10 Vpp i 20 Vpp. W teście koloru elektrod zastosowane napięcie i częstotliwość utrzymano na stałym poziomie 20 Vpp i 30 kHz, a badaniu poddano elektrody projekcyjne w kolorach niebieskim, czerwonym, białym i żółtym (odpowiednio oznaczone kodami kolorów HEX #4472C4, #FF0000, #FFFFFF i #FFFF00). Żywotność komórek sprawdzono poprzez barwienie komórek błękitem trypanu i policzenie liczby komórek żywych i martwych przy użyciu hemocytometru.
Dzięki zastosowaniu układu LiDEP mogliśmy manipulować hMSC i wygenerować krzywe odpowiedzi DEP w zależności od częstotliwości sygnału wejściowego, co stanowi jedną z metod charakteryzacji zachowania elektrycznego komórek. Przeprowadzono serię eksperymentów w celu znalezienia optymalnych warunków pracy poprzez manipulację parametrami takimi jak przyłożone napięcie oraz projektowany kolor elektrod (tzn. kształty o różnych kolorach utworzone w programie do edycji grafiki), aby zaobserwować spójne zachowanie komórek w odpowiedzi na niejednorodne zmienne pole elektryczne AC generowane przez elektrody wirtualne. Dane dotyczące odpowiedzi komórek zebrane przy użyciu LiDEP, czyli nietradycyjnej metody DEP, porównano z wynikami uzyskanymi za pomocą analizatora 3DEP, reprezentującego tradycyjną metodę DEP.
Pierwszy test optymalizacyjny skupiał się na dodatniej odpowiedzi DEP hMSC (tj. przemieszczaniu się komórek w stronę wirtualnej elektrody) w chipie LiDEP. Komórki, które nie wykazywały dodatniej odpowiedzi DEP, albo przejawiały ujemną odpowiedź DEP, oddalając się od wirtualnej elektrody, pozostawały stacjonarne i rotowały, albo nie reagowały na pole elektryczne. Odpowiedź komórek określono ilościowo poprzez śledzenie ich prędkości (µm/s) w programie ImageJ w okresie 2 min 30 s. Do wirtualnej elektrody użyto żółtej owalnej projekcji, a badano przyłożone napięcia 5 Vpp, 10 Vpp oraz 20 Vpp przy stałej częstotliwości 30 kHz. Dla zachowania spójności i zminimalizowania liczby wartości odstających skupiono się na komórkach znajdujących się w odległości 50 µm od wirtualnej elektrody podczas działania pola elektrycznego AC. Napięcie 20 Vpp spowodowało najszybszy ruch komórek HEK 293, przy średniej prędkości 0,035 µm/s, następnie 0,032 µm/s przy 10 Vpp oraz 0,020 µm/s przy 5 Vpp, co oznacza, że komórki te stanowią względnie jednorodną kontrolę. Podobny trend zaobserwowano dla hMSC, które osiągnęły średnią prędkość 0,051 µm/s przy 20 Vpp, 0,036 µm/s przy 10 Vpp i 0,025 µm/s przy 5 Vpp, jak pokazano na Rysunku 2A (tutaj * oznacza p &lt; 0,05). Przy 20 Vpp zaobserwowano, że hMSC doświadczały jednocześnie dodatniej i ujemnej DEP. Nie odnotowano tego przy 10 Vpp i 5 Vpp. Wyniki oceny żywotności hMSC po poddaniu działaniu siły DEP wykazały, że wyższe napięcia prowadziły ogólnie do niższej żywotności komórek: 66% komórek było żywotnych przy 5 Vpp, 58% komórek przy 10 Vpp oraz 57% komórek przy 20 Vpp, jak pokazano na Rysunku 2B (tutaj ** oznacza p &lt; 0,01).
Ponieważ LiDEP jest systemem opartym na optyce, natężenie światła i kolor elektrody są parametrami, które można łatwo dostroić w celu kontrolowania wydajności chipa LiDEP. W niniejszej pracy oceniono wpływ różnych kolorów elektrod (białego, żółtego, czerwonego i niebieskiego), generowanych na podstawie rzutowanego kształtu, na odpowiedzi DEP komórek. Komórki HEK 293 oraz hMSC oceniano przy 20 Vpp i 30 kHz. Wybrano elektrody w kolorach białym, żółtym, czerwonym i niebieskim, jednak oświetlenie przez chip LiDEP było modyfikowane przez warstwę fotoprzewodzącą, która miała kolor czerwono-pomarańczowy. W związku z tym rzutowana biała elektroda wydawała się żółta z białym wnętrzem, czerwona elektroda wydawała się pomarańczowa z czerwonym obrysem, a niebieska elektroda wydawała się jasnozielona (Rysunek 3A-D). Moc wyjściowa dla tych czterech kolorów wynosiła odpowiednio: 77,7 µW ± 0,7 µW, 92,7 µW ± 1,3 µW, 21,9 µW ± 0,2 µW oraz 56,7 µW ± 0,9 µW dla koloru białego, żółtego, czerwonego i niebieskiego. Sugeruje to silnie, że kolory żółty i biały generowały najsilniejsze pole DEP, podczas gdy niebieski i czerwony były słabsze, jak pokazano na Rysunku 3E (tutaj *** oznacza p &lt; 0,001 dla komórek HEK 293, a ** oznacza p &lt; 0,01 dla hMSC). Zaobserwowano również stacjonarny obrót komórek na krawędziach żółtych i białych wirtualnych elektrod podczas przykładania siły DEP. Dla wszystkich wariantów kolorów elektrod wystąpiły jednoczesne ujemne i dodatnie odpowiedzi DEP, co korelowało z wynikami testu napięcia przy 20 Vpp. Dodatkowo, choć prędkość komórek różniła się w zależności od koloru elektrody, prawie wszystkie komórki w obrębie granicy 50 µm zareagowały na LiDEP. Rozmiar hMSC zmierzono na 19,2 µm ± 5,8 µm.
Aby ocenić możliwości LiDEP w porównaniu z DEP z zastosowaniem konwencjonalnych elektrod, przeanalizowano różnice w zachowaniu DEP komórek z użyciem LiDEP oraz komórek analizowanych za pomocą analizatora 3DEP. Odpowiedź DEP hMSC mierzono w roztworze buforu DEP o niskiej przewodności z dodatkiem 0,5% BSA (~100 µS/cm). Aby odwzorować działanie analizatora 3DEP, wyświetlono pojedynczą owalną żółtą elektrodę wirtualną przy napięciu 10 Vpp. Zachowanie DEP hMSC charakteryzowano w zakresie częstotliwości od 30 kHz do 20 MHz. Przy częstotliwościach niższych niż 25 kHz zaobserwowano elektrolizę, która doprowadziła do powstania pęcherzyków powietrza na powierzchni warstwy metalu wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego. W przypadku LiDEP, przy niższych częstotliwościach, hMSC podlegały dodatniej sile DEP, co przedstawiono na Rysunku 4A jako procent komórek przyciąganych do elektrody wirtualnej. Komórki początkowo wykazywały silną dodatnią siłę DEP, która słabła wraz ze wzrostem częstotliwości. Najsilniejsza dodatnia siła DEP występowała w zakresie od 30 kHz do 97 kHz. Po przyłożeniu pola elektrycznego AC przy tych częstotliwościach część komórek przestała reagować, podczas gdy inne wykazały ujemne zachowanie DEP. Tendencja ta odbiega od odpowiedzi zmierzonej za pomocą analizatora 3DEP; w tamtym przypadku dodatnia DEP wzrastała od 37 kHz do 255 kHz i malała od 1 772 kHz do 20 MHz, jak pokazano na Rysunku 4B.
<img alt="Proces dielektroforezy; obejmuje szkło z ITO, schemat mikrokanału, konfigurację generatora funkcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64909/64909fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Układ eksperymentalny dla opisanego tutaj protokołu LiDEP dla hMSC. (A) Schemat i rzeczywiste zdjęcie chipa LiDEP z warstwą fotoprzewodzącą oraz układ eksperymentalny. (B) Reprezentatywne obrazy dodatnich i ujemnych odpowiedzi DEP komórek w analizatorze 3DEP (przy użyciu konwencjonalnych elektrod DEP, góra) oraz schematyczne przedstawienie dodatnich i ujemnych odpowiedzi DEP komórek przy użyciu LiDEP (przy użyciu projekcji światła jako wirtualnych elektrod, dół). (C) Przykłady różnych kształtów, które mogą być projektowane na urządzenie jako wirtualne elektrody. Rycina stworzona w BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64909/64909fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres prędkości i żywotności komórek w zależności od napięcia; zaznaczono istotność statystyczną eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64909/64909fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Charakterystyka odpowiedzi DEP (prędkość) hMSC oraz ich żywotności w określonych warunkach. (A) Zmierzone prędkości dodatnich odpowiedzi DEP hMSC przy napięciach 5 Vpp, 10 Vpp i 20 Vpp. hMSC poruszały się z prędkością 0,051 µm/s przy 20 Vpp, 0,036 µm/s przy 10 Vpp i 0,025 µm/s przy 5 Vpp. (B) Żywotność hMSC po poddaniu działaniu dodatniej siły DEP generowanej przez elektrody wirtualne. Żywotność wyniosła odpowiednio 57%, 58% i 66% dla 20 Vpp, 10 Vpp i 5 Vpp. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (SD). Analiza statystyczna przeprowadzona na zbiorczych zestawach danych z wykorzystaniem testów t (*p &lt; 0,05 oraz **p &lt; 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64909/64909fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wpływ koloru na prędkość komórek; mikroskopia i wykres słupkowy; elektrody w świetle białym, żółtym, czerwonym i niebieskim." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64909/64909fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Porównanie odpowiedzi DEP pomiędzy homogenicznymi (HEK 293) a heterogenicznymi (hMSC) liniami komórkowymi. Pozytywna odpowiedź DEP komórek hMSC na elektrody (A) białe, (B) żółte, (C) czerwone oraz (D) niebieskie przy 20 Vpp i 30 kHz. (E) Odpowiedzi prędkościowe komórek HEK 293 oraz hMSC na elektrody o różnych kolorach. Komórki HEK 293 wykazały najwyższe prędkości przy elektrodach żółtych i czerwonych, wynoszące odpowiednio 0,035 µm/s i 0,033 µm/s. Komórki HEK 293 wykazały najniższą prędkość przy elektrodach niebieskich, wynoszącą 0,027 µm/s. Komórki hMSC wykazały najwyższe prędkości przy elektrodach żółtych i białych, wynoszące odpowiednio 0,068 µm/s i 0,049 µm/s. Komórki hMSC osiągnęły najniższą prędkość przy elektrodach czerwonych, wynoszącą 0,039 µm/s. Słupki błędów reprezentują SD. Analiza statystyczna przeprowadzona na połączonych zestawach danych przy użyciu testów t (*p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01 oraz ***p &lt; 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64909/64909fig03large.jpg" target="_blank">Kilknięcie tutaj pozwala wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy analizy dielektroforezy; częstotliwość względem procentowego dodatniego DEP; porównanie danych; badanie naukowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64909/64909fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Porównanie odpowiedzi DEP hMSC z wykorzystaniem LiDEP i 3DEP.Odpowiedzi DEP hMSC mierzone za pomocą (A) LiDEP i (B) analizatora 3DEP przy 10 Vpp. W przypadku LiDEP zaobserwowano spadek dodatniej odpowiedzi DEP hMSC w zakresie od 30 kHz do 20 MHz. W analizatorze 3DEP komórki wykazały wzrost dodatniego DEP od 37 kHz do 255 kHz oraz spadek dodatniego DEP od 1,772 kHz do 20 MHz. Słupki błędów reprezentują SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64909/64909fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Reprezentacyjne obrazy układu LiDEP zastosowanego w eksperymentach w tym protokole. Przybliżony obraz systemu LiDEP pokazujący integrację projektora. Światło wędruje ze źródła (projektora) przez obiektyw 10x na mikrokanał chipa LiDEP. Obiektyw 10x znajduje się nad soczewką projektora. Każdy element jest ponumerowany na obrazach i wymieniony z boku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64909/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Wideo uzupełniające 1: Reprezentacyjne wideo hMSC reagujących na wirtualne elektrody białą, żółtą, czerwoną i niebieską. Komórki są wizualizowane jako doświadczające dodatniej DEP (poruszające się w kierunku wirtualnej elektrody), doświadczające ujemnej DEP (oddalające się od wirtualnej elektrody), stacjonarne i rotujące lub niewrażliwe na pole elektryczne. hMSC testowano przy 37 kHz i 20 Vpp, a prędkość wideo została zwiększona 20-krotnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64909/Supplemental%20Video%201.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy dielektroforezę indukowaną światłem jako bezznacznikowe podejście do charakteryzowania heterogenicznych linii komórkowych, w szczególności ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC). W artykule opisano protokół wykorzystania i optymalizacji urządzenia mikroprzepływowego z warstwą fotoprzewodzącą w celu scharakteryzowania zachowania elektrycznego hMSC bez zmiany ich stanu natywnego.

Dielektroforeza indukowana światłem w celu scharakteryzowania zachowania elektrycznego ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) offer a patient-derived cell source for conducting mechanistic studies of diseases or for several therapeutic ...

Ten protokół dielektroforezy indukowanej światłem lub LiDEP zapewnia metodę krok po kroku do charakterystyki ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na temat niejednorodności próbek komórek macierzystych. Zaletą LiDEP jest możliwość wprowadzania zmian w konfiguracji wirtualnej elektrody w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na heterogeniczność komórek macierzystych, co nie jest możliwe w przypadku tradycyjnych metod DEP.Nowy użytkownik tej techniki może mieć trudności z zagęszczeniem światła projektora na tyle na urządzeniu mikrofluidycznym, aby utworzyć wirtualną elektrodę. Radzimy ponownie skonfigurować konfigurację, dopóki nie zadziała. W demonstracji procedury pomoże Zuri Rashad, doktorantka z mojego laboratorium.Aby rozpocząć, przygotuj mikrokanał, wybijając otwory o średnicy czterech milimetrów na taśmie dwustronnej około pięciu do sześciu milimetrów od krawędzi krótszego wymiaru i wyśrodkowane między dłuższymi bokami taśmy. Za pomocą skalpela wytnij dwie proste linie w odległości trzech milimetrów od siebie w poprzek otworów, upewniając się, że arkusze ochronne po obu stronach taśmy są założone podczas całego cięcia mikrokanałów. Zaznacz całe miejsce zmywalnym markerem, upewniając się, że wywiercone otwory pokrywają się z otworami wybitymi w taśmie dwustronnej.Te dwa otwory będą używane jako otwory wlotowe i wylotowe urządzenia mikroprzepływowego. Wywierć dwa otwory o średnicy trzech milimetrów w górnym szkiełku ITO. Następnie na wierzchu wywierconego szkła powlekanego ITO umieść długą krawędź taśmy wyrównując się z długą krawędzią szkła.Usuń jedną stronę folii ochronnej z taśmy dwustronnej. Dopasuj otwory taśmy w górnym szkiełku szklanym ITO i delikatnie dociśnij je do siebie, usuwając kieszenie powietrzne, szczególnie w pobliżu mikrokanału. Usuń drugą folię ochronną z taśmy dwustronnej.Dociśnij szkiełko ITO pokryte molibdenem i amorficznym silikonem, dopasowując krawędź szkiełka fotoprzewodzącego przeciwnie do dwumilimetrowej strony odstępu z krawędzią taśmy dwustronnej w kierunku środka górnego szkiełka ITO. W ten sposób istnieje kac między ITO a fotoprzewodzącym szkiełkiem ITO. Dociśnij płaską powierzchnię, aby zapewnić dobrą przyczepność i odetnij nadmiar taśmy po bokach.Aby podłączyć generator funkcyjny, należy przyłożyć taśmę miedzianą do krawędzi warstwy szkła ITO i warstwy szkła ITO pokrytej powłoką fotoprzewodzącą. Owiń taśmę z boku ITO lub materiału przewodzącego światło dzienne od krawędzi taśmy dwustronnej do około trzech centymetrów na niepowlekanej stronie szklanego podłoża. Aby zapewnić pomyślne wykonanie urządzenia, użyj wysokościomierza do przetestowania odczytu rezystancji między powlekanymi szkiełkami obu szklanych podłoży a miedzianą taśmą, która była przymocowana do szkła.Dodaj 25 mililitrów ultraczystej wody do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 4,25 grama sacharozy i 0,15 grama glukozy. Dobrze wymieszaj, aż połowa sacharozy i glukozy się rozpuści i uzupełnij ultraczystą wodą do znaku 50 mililitrów. Następnie energicznie wymieszaj ten bufor DEP aż do całkowitego rozpuszczenia.Umieść 20 mililitrów przygotowanego roztworu sacharozy i glukozy w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Dodać 0,1 grama albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do probówki. Dobrze wirować, aż całe BSA się rozpuści, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5% BSA w buforze DEP.Umieść jeden razy 10 do sześciu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych lub HMSC lub ludzkiej nerki embrionalnej, HEK293 zawieszonej w jednym mililitrze pożywki wzrostowej w 10-mililitrowej probówce wirówkowej. Wirować, komórki HEK293 w temperaturze 201 G przez pięć minut, a HMSC w temperaturze 290 G przez 10 minut. Po odwirowaniu odessać supernatant.01 I delikatnie ponownie zawieś ogniwa w jednym mililitrowym roztworze buforowym DEP z 0,5% BSA. Powtórz wirowanie jeszcze dwa razy i ponownie zawieś komórki w buforze DEP z 0,5% BSA. Przygotuj elementy zestawu eksperymentalnego, takie jak laptop, projektor, obiektyw, mikroskop cyfrowy i generator funkcyjny do ilościowego określania odpowiedzi komórkowych na LiDEP.Umieść soczewkę obiektywu 10x, chip LiDEP i uchwyt na górze obiektywu projektora. Użyj laptopa do zaprojektowania projekcji świetlnych, takich jak gwiazda, diament, trzy linie i owal, a następnie podłącz laptopa do projektora. Podłącz układ LiDEP do generatora funkcyjnego, aby zastosować pole elektryczne prądu przemiennego.Aby zaobserwować komórki, które doświadczają siły LiDEP, użyj mikroskopu cyfrowego do obrazowania zapisu NVIDIA. Po zakończeniu konfiguracji przepłucz mikrokanał 70% etanolem, a następnie przepłucz 0,5% roztworem BSA, aby usunąć etanol z poprzednich komórek. Powtórz płukanie trzy razy, aby zapewnić całkowite wypłukanie, ponieważ wcześniej wystawione komórki na działanie pola DEP będą reagować inaczej niż świeże komórki i mogą zakłócić zbieranie danych.Usunąć 0,5% roztwór BSA za pomocą pipety. Następnie ustaw generator funkcyjny na żądane napięcie i częstotliwość. Ostrożnie dodaj 70 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny komórek do mikrokanalika urządzenia za pomocą mniejszej końcówki pipety, przechylając ją lekko w otworze w kierunku mikrokanału, aby uniknąć rozlania z powodu cienkiego mikrokanału.Wytrzyj roztwór dostępowy jednorazowymi chusteczkami papierowymi i wyrzuć je do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne. Następnie wyświetl żądane okręgi wirtualnej geometrii elektrogeometrycznej, romby, gwiazdy lub równoległe linie na chipie LiDEP. W oprogramowaniu mikroskopu cyfrowego ustaw długość filmu na trzy minuty.Ustaw czasomierz laboratoryjny na dwie minuty i 30 sekund. Gdy komórki znajdą się nieruchomo w mikrokanale układu LiDEP, naciśnij start w oprogramowaniu mikroskopu cyfrowego, aby rozpocząć proces nagrywania wideo. Po 10 sekundach naciśnij przycisk Włącz na wyjściu kanału generatora funkcyjnego, aby przyłożyć pole elektryczne prądu przemiennego i naciśnij start, aby włączyć timer.Monitoruj zachowanie funkcji DEP komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego i zapobiegaj drganiom lub ruchom wokół instalacji. Gdy timer się wyłączy, naciśnij przycisk Włącz na wyjściu kanału generatora funkcyjnego, który wyłącza wyjście kanału, a pole elektryczne prądu przemiennego nie jest już dostarczane przez elektrody. Zatrzymaj nagrywanie wideo po trzech minutach i zapisz je do przyszłej analizy.Odpipetuj komórki z końcówki wylotowej chipa LiDEP, powoli wpychając 60 mikrolitrów bufora DEP z 0,5% BSA do mikrokanału i jednocześnie zbierając wylot. Kontynuuj, aż w mikrokanale będzie mało komórek lub nie będzie ich wcale i powtórz DEP ze wszystkimi częstotliwościami, jak pokazano. Określono reakcje w ramach programu "Cyfrowa Europa" pod względem prędkości dla HMSC i procentu ich żywotności.Pomiary pozytywnych odpowiedzi DEP przy pięciu, 10, i 20 napięciu od szczytu do szczytu lub VPP wykazały, że komórki poruszały się ze średnią prędkością odpowiednio 0,025, 0,036 i 0,051 mikrometra na sekundę. Wyniki dotyczące żywotności HMSC po doświadczeniu z siłą DEP wykazały, że wyższe napięcia na ogół skutkowały niższą żywotnością ogniw, przy czym 57% ogniw było zdolnych do życia przy 20 VPP. Do tego badania wybrano elektrody w kolorze białym, żółtym, czerwonym i niebieskim, ale na oświetlenie przez chip głębokości LiDEP miała wpływ warstwa fotoprzewodząca, która miała czerwono-pomarańczowy kolor.W związku z tym rzutowana biała elektroda wydawała się żółta z białym wnętrzem, czerwona elektroda wydawała się pomarańczowa z czerwonym konturem, a niebieska elektroda wydawała się jasnozielona. Zjawisko to sugeruje, że kolor żółty i biały miały najsilniejsze pole DEP, podczas gdy niebieski i czerwony były słabsze. Odpowiedzi DEP HMC mierzono za pomocą LiDEP w trzech analizatorach głębokości przy 10 VPP.W przypadku LiDEP nastąpił spadek pozytywnej odpowiedzi DEP z 30 kiloherców do 20 megaherców. Z trzech analizatorów komórki zwiększyły się w dodatnim DEP od 37 do 255 kiloherców i zmniejszyły się w dodatnim DEP z 1 772 kiloherców do 20 megaherców. Dwa ważne elementy tej metody to silne źródło światła i solidne połączenie elektryczne, które zapewnia wytwarzanie pola elektrycznego i manipulację ogniwami.Zaobserwowaliśmy wirowanie komórek w odpowiedzi na wirtualne elektrody. Tak więc elektrorotacja jest kolejną metodą analizy komórek, którą można przeprowadzić. Rotacja elektryczna dostarczyłaby informacji na temat heterogeniczności HMSC i rzadkich subpopulacji.

light-induced-dielectrophoresis-for-characterizing-electrical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

To badanie opisuje eksperymentalną platformę do szybkiego charakteryzowania zmodyfikowanych komórek macierzystych i ich zachowań przed ich zastosowaniem w długoterminowych badaniach nad przeszczepami in vivo w celu ratowania i naprawy układu nerwowego.

Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Ten protokół opisuje wytwarzanie systemu hodowli komórek, który umożliwia wysiewanie komórek macierzystych na przewodzącym rusztowaniu polimerowym do stymulacji elektrycznej in vitro, a następnie implantację in vivo rusztowania z komórek macierzystych przy użyciu techniki minimalnie inwazyjnej.

Rusztowanie przewodzące prąd elektryczny do modulacji i dostarczania komórek macierzystych

Ten protokół opisuje przejściową inżynierię genetyczną komórek macierzystych zębów pobranych z ludzkiego mieszków zębowych. Zastosowana strategia modyfikacji niewirusowej może stać się podstawą do udoskonalenia terapeutycznych produktów z wykorzystaniem komórek macierzystych.

Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

Tutaj prezentujemy protokół budowy komory do hodowli komórek, przeznaczonej do wystawiania komórek na różne rodzaje stymulacji elektrycznej, oraz jej zastosowanie w leczeniu mezenchymalnych komórek macierzystych w celu zwiększenia różnicowania osteogennego.

Budowa i zastosowanie komory do stymulacji elektrycznej w celu zwiększenia różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych/zrębowych in vitro

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje wirowanie różnicowe w celu izolowania i charakteryzowania reprezentatywnych EV (egzosomów i mikropęcherzyków) z hodowanych ludzkich MSC. W tym artykule wyjaśniono również dalsze zastosowania tych pojazdów elektrycznych.

Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje zastosowanie aktywowanego fluorescencją sortowania komórek ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu metody sortowania pojedynczych komórek. W szczególności zastosowanie sortowania pojedynczych komórek może osiągnąć 99% czystość komórek immunofenotypowanych z niejednorodnej populacji w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrycznej cytometrii przepływowej.

Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych

Ten protokół opisuje i porównuje dwie reprezentatywne metody różnicowania hiPSC na mezenchymalne komórki zrębu (MSC). Metoda jednowarstwowa charakteryzuje się niższym kosztem, prostszą obsługą i łatwiejszym różnicowaniem osteogennym. Metoda ciał zarodkowych (EBs) charakteryzuje się mniejszym zużyciem czasu.

Porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu

Poznaj metodę LiDEP do charakteryzacji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia analizę heterogeniczności komórek bez ingerencji w ich stan natywny.

Dielektroforeza indukowana światłem w celu scharakteryzowania zachowania elektrycznego ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Dielektroforeza indukowana światłem w celu scharakteryzowania zachowania elektrycznego ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów