Name: Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę izolacji i analizy transkryptomu typów komórek korzeniowych Arabidopsis thaliana przy użyciu sortowania komórek aktywowanych fluorescencją oraz sekwencjonowania RNA. Technika ta umożliwia badanie subtelnych różnic ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Utworzyliśmy ten protokół w jednokomórkowym ośrodku multi-omicznym Szkoły Rolnictwa i Biologii Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju i byliśmy wspierani przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 32070608), Shanghai Pujiang Program (Grant nr 20PJ1405800) oraz Shanghai Jiao Tong University (Grant No. Agri-X20200202, 2019TPB05).

Następujący protokół został zoptymalizowany dla nasion A. thaliana typu dzikiego (WT) bez fluorescencji i fluorescencyjnych linii markerowych dla następujących typów komórek korzeniowych: komórki perycyklowe ksylemowo-biegunowe (J0121), początkowe komórki korzenia bocznego, komórki czapeczki korzeniowej bocznej (J3411), komórki endodermy i kory (J0571) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Wszystkie linie markerowe uzyskano ze źródła komercyjnego (patrz Tabela Materiałów), z wyjątkiem linii markera komórki inicjującej boczną inicjację korzenia, która została wygenerowana przez wprowadzenie konstruktu GFP opartego na promotorze GATA23 do rośliny Arabidopsis typu dzikiego zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem14.
1. Przygotowanie materiału roślinnego
<ol>
	<li>Wysterylizuj nasiona A. thaliana WT i nasiona linii markerów fluorescencyjnych, inkubując nasiona w 20% wybielaczu w inkubatorze obrotowym w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Opłucz nasiona w podwójnie destylowanej wodzie (ddH2O) trzy do pięciu razy. Wykonaj ten krok na sterylnej, czystej ławce.</li>
	<li>Nasiona WT i linii reporterowej należy umieścić na pożywce o połowie mocy Murashige i Skoog (MS) z 0,8% agarem (w/v)15. Rośliny uprawiać pionowo przez 5 dni (16 godzin światła w temperaturze 23 °C) po rozwarstwieniu przez 2 dni w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Trwałość
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory protoplastowe2,5, określane jako roztwór A i roztwór B (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór A zawierający 400 mM mannitolu, 0,05% BSA, 20 mM MES (pH 5,7), 10 mM CaCl2 i 20 mM KCl (patrz Tabela Materiałów). Roztwór A przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
		<li>Przygotować roztwór B, dodając 1% (m/v) celulazy R10, 1% (m/v) celulazy RS, 1% (m/v) hemicelulazy, 0,5% (w/v) pektoliazy i 1% (w/v) macerozymu R10 w świeżej porcji roztworu A. Roztwór B należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie rozmrozić roztwór A i roztwór B na lodzie przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
	<li>Odetnij korzenie za pomocą czystego ostrza lub nożyczek i posiekaj korzenie na ~0,5 cm kawałki. Zanurz korzenie w 1,5 ml roztworu B, a następnie delikatnie obracaj (przy około 18 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 1,5-2 godziny.</li>
	<li>Przefiltrować pierwotne protoplasty przez siatkę siatkową o grubości 40 μm (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przepłukać siatkę sitka 1-2 ml roztworu A.</li>
	<li>Połączyć ciecze z kroku 2.4 i kroku 2.5 i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety, ponownie zawiesić osad komórek w 500-600 μl roztworu A, a następnie natychmiast umieścić go na lodzie.</li>
	<li>Przenieś zawieszony roztwór komórek do nowej probówki o pojemności 5 ml w celu sortowania komórek.</li>
</ol>
3. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)
<ol>
	<li>Włącz i zakończ kroki konfiguracji urządzenia w sorterze (patrz Tabela materiałów). Wybierz kanały fluorescencyjne, użyj instalacji WT (bez fluorescencji) jako kontroli, aby określić linię bazową dla autofluorescencji i dostosuj bramkę sortowania w oparciu o intensywność fluorescencji i pojedyncze FSC/SSC (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Dodać 500 μl roztworu A (krok 2.1.1) do probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml, aby zapobiec uszkodzeniu komórek. Zbierz 2 000-3 000 komórek w probówce.</li>
	<li>Po sortowaniu natychmiast umieścić próbki na lodzie, odwirować probówkę zbiorczą zawierającą komórki o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Pobrać 2 μl posortowanych komórek i sprawdzić fluorescencję za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przechowuj posortowane komórki w temperaturze -80 °C lub natychmiast użyj ich do budowy biblioteki (krok 4).</li>
	<li>W przypadku sortowania indeksów jednokomórkowych umieść 96-dołkową płytkę w adapterze. Skalibruj położenie płytki tak, aby kropla wpadła do środkowego otworu płytki. Podczas sortowania wybierz tryb sortowania pojedynczych komórek, wprowadź docelową liczbę posortowanych komórek jako 1 i rozpocznij sortowanie.</li>
</ol>
4. Przygotowanie biblioteki Smart-seq2
<ol>
	<li>W wyniku bardzo małej ilości danych wejściowych należy wykonać konstrukcję biblioteki sekwencyjnej RNA-seq typu jednokomórkowego w środowisku wolnym od zanieczyszczeń. Przed rozpoczęciem eksperymentu wyczyść stół za pomocą środka odkażającego powierzchnię8 (patrz Tabela Materiałów) i 75% etanolu.</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy (mieszanina A) (Tabela 1) przez zmieszanie 0,33 μl 10% Triton X-100, 0,55 μl inhibitora RNazy i 0,22 μl 0,1 M DTT (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 1 μl mieszaniny A do posortowanej próbki i zmielić sterylnym tłuczkiem. Zalecana objętość próbki wynosi ≤0,5 μl; użyć wody wolnej od RNaz, aby uzupełnić objętość do 14 μl. Przenieść każdą próbkę z pojedynczej komórki do cienkościennej probówki PCR o pojemności 0,2 ml.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę B zawierającą 0,44 μl startera reakcji odwrotnej transkrypcji oligo-dT30VN (RT) (100 μM) i 4,4 μl dNTP (10 mM) (tabela 2) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 4,4 μl mieszaniny B do 14 μl próbki w każdej probówce, delikatnie odpipetować w celu wymieszania próbki i inkubować próbkę w temperaturze 72 °C przez 3 minuty. Po inkubacji natychmiast umieść próbki na lodzie, aby zhybrydyzować oligo-dT z ogonem poli A.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę do reakcji odwrotnej transkrypcji (mieszaninę C) (tabela 3) (patrz tabela materiałów). Dodać 21,6 μl mieszaniny C do każdej probówki zawierającej próbki. Włącz program RT na zwykłym urządzeniu do PCR (Tabela 4).</li>
	<li>Przeprowadź reakcję preamplifikacji na lodzie. Przygotować mieszaninę D, łącząc 44 μl 2x mieszaniny polimerazy PCR i 0,88 μl startera IS PCR (10 μM) (tabela 5) (patrz tabela materiałów). Dodać 40,8 μl mieszaniny D do 40 μl produktu reakcji RT i uruchomić program preamplifikacji (Tabela 6).</li>
	<li>Oczyść produkty reakcji preamplifikacji za pomocą kulek Ampure XP (patrz Tabela materiałów). Dodać 48 μl kulek (w stosunku 0,6:1) do każdej próbki z kroku 4.7 i delikatnie wymieszać próbki przez pipetowanie.</li>
	<li>Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Umieścić probówki zawierające próbki o pojemności 1,5 ml na stojaku do separacji magnetycznej na 5 minut. Ostrożnie wyrzucić supernatant z próbek, nie naruszając kulek.</li>
	<li>Umyj kulki poprzez ponowne zawieszenie ich w 200 μl 80% etanolu i umieść próbki na stojaku do separacji magnetycznej (patrz Tabela materiałów) na kolejne 3 minuty przed wyrzuceniem supernatantu zawierającego etanol.</li>
	<li>Suszyć próbki na powietrzu przez 10 minut i przykryć probówkę, aby zapobiec zanieczyszczeniu i zanieczyszczeniu krzyżowemu podczas suszenia na powietrzu.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 20 μl ddH2O, inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie umieścić je na stojaku do separacji magnetycznej na 5 minut.</li>
	<li>Odpipetować 18 μl supernatantu z każdej probówki i przenieść próbki do nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Użyć 1 μl próbki do oceny jakości cDNA za pomocą zestawu do kwantyfikacji DNA, określić rozkład wielkości każdej biblioteki wstępnej za pomocą analizatora fragmentów (patrz tabela materiałów) i przechowywać pozostałą próbkę w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Zbuduj bibliotekę cDNA8 dla sekwencjonowania Illumina16 z produktu prebibliotecznego z kroku 4.13, korzystając z zestawu do przygotowania biblioteki sekwencjonowania (patrz Spis materiałów).</li>
	<li>Oczyść biblioteki (od kroku 4.14) za pomocą koralików Ampure XP, określ ilościowo oczyszczone biblioteki i określ rozkład rozmiaru każdej biblioteki zgodnie z krokiem 4.13. 
	UWAGA: Zbierz równe nanomole każdej biblioteki, upewniając się, że żadna z nich nie ma takiej samej kombinacji indeksu Illumina. W przeciwnym razie, biblioteki mogą być łączone w proporcjach opartych na żądanym wyjściu sekwencjonowania i sekwencjonowane razem na tym samym torze sekwencera Illumina. Ogólnie rzecz biorąc, sekwencjonowanie każdej biblioteki do głębokości 4-6 GB, co daje >10 milionów zmapowanych odczytów, zapewnia 20-30-krotne pokrycie genomu Arabidopsis. Niższe głębokości sekwencjonowania są również dopuszczalne, ale mogą mieć wpływ na znaczenie analizy wyrażeń różnicowych.</li>
</ol>
5. Analiza danych sekwencyjnych RNA
<ol>
	<li>Przytnij surowe odczyty za pomocą Trim-Galore17, a następnie zmapuj do genomu referencyjnego za pomocą hisat218 (daehwankimlab.github.io/hisat2) i usuń zduplikowane fragmenty PCR za pomocą Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).</li>
	<li>Przeprowadź przetwarzanie surowego zliczania, a następnie analizę genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) za pomocą DESeq220 przy użyciu co najmniej trzech powtórzeń biologicznych dla każdej próbki. Wykonaj grupowanie ekspresji genów za pomocą pakietu Pheatmap i wizualizuj na mapie cieplnej wyrażeń. 
	UWAGA: Wartości RPKM (odczyty na kilobazę na milion zmapowanych odczytów) genów i TE (elementów transpozycyjnych) zostały obliczone za pomocą Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) i zwizualizowane w przeglądarce genomu.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).</li>
<li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li>
<li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li>
<li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li>
<li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li>
<li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77(2016).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%26T-seq%3A+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li>
<li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li>
<li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+aux%2FIAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li>
<li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li>
<li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li>
<li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510(2017).</li>
<li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT%2C+StringTie+and+Ballgown%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li>
<li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAsik%3A+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Open+Source+Software%22%5BJournal%5D)">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583(2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li>
<li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li>
<li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139(2016).</li>
<li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li>
<li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół oparty na Smart-seq2 może generować niezawodne biblioteki sekwencjonowania z kilkuset komórek8. Jakość materiału wyjściowego ma zasadnicze znaczenie dla dokładności analizy transkryptomu. FACS jest potężnym narzędziem do przygotowywania komórek będących przedmiotem zainteresowania, ale ta procedura, zwłaszcza etap protoplastingu, musi być zoptymalizowana pod kątem zastosowań roślinnych. Mikrodysekcja wychwytu laserowego (LCM) lub ręcznie wypreparowane komórki mogą być również wykorzystane...

Komórki są podstawową jednostką wszystkich organizmów żywych i pełnią funkcje strukturalne i fizjologiczne. Chociaż komórki w organizmach wielokomórkowych wykazują pozorną synchronizację, komórki różnych typów i poszczególne komórki wykazują różnice w swoich transkryptomach podczas rozwoju i reakcji środowiskowych. Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) zapewnia bezprecedensową moc w zrozumieniu heterogeniczności komórek. Zastosowanie scRNA-seq w naukach o roślinach przyczyniło się do pomyślnego skonstruowania atlasu komórek roślinnych1, zostało wykorzystane do identyfikacji rzadkich taksonów komórkowych w tkankach roślinnych2, dostarczyło wglądu w skład typów komórek w tkankach roślinnych i zostało wykorzystane do identyfikacji tożsamości komórkowej i ważnych funkcji wykorzystywanych podczas rozwoju i różnicowania roślin. Ponadto możliwe jest wnioskowanie o czasoprzestrzennych trajektoriach rozwojowych w tkankach roślinnych1,2,3 w celu odkrycia nowych genów markerowych4 i zbadania funkcji ważnych czynników transkrypcyjnych5 za pomocą scRNA-seq w celu ujawnienia ewolucyjnego zachowania tego samego typu komórek w różnych roślinach3. Stresy abiotyczne są jednym z najważniejszych czynników środowiskowych wpływających na wzrost i rozwój roślin. Badając zmiany w składzie typów komórek w tkankach roślinnych w różnych warunkach leczenia za pomocą sekwencjonowania transkryptomu pojedynczych komórek, można również rozwiązać mechanizm odpowiedzi na stres abiotyczny6.
Potencjał rozwiązania niejednorodności transkrypcyjnej między typami komórek za pomocą sekwencjonowania scRNA zależy od metody izolacji komórek i platformy sekwencjonowania. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest szeroko stosowaną techniką izolowania subpopulacji komórek do sekwencjonowania scRNA w oparciu o rozpraszanie światła i właściwości fluorescencyjne komórek. Opracowanie fluorescencyjnych linii markerowych za pomocą technologii transgenicznej znacznie poprawiło skuteczność izolacji komórek przez FACS7. Przeprowadzenie sekwencjonowania scRNA przy użyciu Smart-seq28 dodatkowo zwiększa zdolność do analizowania niejednorodności komórkowej. Metoda Smart-seq2 ma dobrą czułość wykrywania genów i może wykrywać geny nawet przy niskim poziomie wejściowym transkryptu9. Oprócz zbiorczego zbierania typów komórek, nowoczesne sortowniki komórek zapewniają format sortowania indeksów pojedynczych komórek, umożliwiając analizę transkryptomu w rozdzielczości pojedynczej komórki przy użyciu Smart-seq210 lub innych metod multipleksowania sekwencji RNA, takich jak CEL-seq211. Sortowanie pojedynczych komórek lub typów komórek może być potencjalnie używane w wielu innych dalszych zastosowaniach, takich jak równoległe badania multiomiczne12,13. Przedstawiono tutaj solidny i wszechstronny protokół izolowania typów komórek roślinnych, takich jak komórki perycyklowe ksylemowo-biegunowe, boczne komórki czapeczki korzeniowej, boczne komórki początkowe korzenia, komórki kory i komórki endodermalne od korzeni linii markerowych Arabidopsis thaliana za pomocą FACS. Protokół obejmuje ponadto skonstruowanie biblioteki Smart-seq2 do dalszej analizy transkryptomu.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m sitko</td><td>Sorfa&nbsp;</td><td>622110</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Yeasen</td><td>70101ES76</td><td></td></tr><tr><td>Analizator fragmentów Agilent</td><td>Aglient</td><td>Aglient 5200</td><td></td></tr><tr><td>Agilent zestaw DNA o wysokiej czułości</td><td>Aglient</td><td>DNF-474-0500</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Ampure XP</td><td>BECKMAN</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Betaina</td><td>yuanye</td><td>S18046-100g</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>Mr Muscle</td><td>FnBn83BK</td><td>20% (v/v) wybielacz</td></tr><tr><td>BSA</td><td>sigma</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>yuanye</td><td>S24109-500g</td><td></td></tr><tr><td>Celulaza R10</td><td>Yakult (Japonia)</td><td>9012-54-8</td><td></td></tr><tr><td>Celulaza RS</td><td>Yakult (Japonia)</td><td>9012-54-8</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa (1,5 ml)</td><td>Eppendolf</td><td>30121589</td><td></td></tr><tr><td>DNazy, RNazy, DNA i RNA Odkażanie powierzchni</td><td>Beyotime</td><td>R0127</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (0,1 m)</td><td> Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>100092680</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD FACS Melody</td><td>BD-65745</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Sony</td><td>SH800S</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka filtra&nbsp; (1000 &mikro; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TF112-1000-Q</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka filtra&nbsp; (200 i mikro; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TF140-200-Q</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka filtra (10 &mikro; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TF104-10-Q</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka filtra (100 &micro; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TF113-100-Q</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>Czterowymiarowy mikser obrotowy</td><td>Kylin -Bell</td><td>BE-1100</td><td></td></tr><tr><td>Hemicelulaza</td><td>sigma</td><td>9025-56-3</td><td></td></tr><tr><td>IS Starter</td><td></td><td></td> do PCR <td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3'KAPA</td></tr> <tr><td>HiFi HotStart ReadyMix ( 2X)</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>7958935001</tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R10</td><td>Yakult (Japonia)</td><td>9032-75-1</td><td></td></tr><tr><td>Stojak do separacji magnetycznej</td><td>invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>aladdin</td><td>69-65-8</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>aladdin</td><td>145224948</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>yuanye</td><td>R21455-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówki</td><td>Eppendorf</td><td>Wirówka 5425</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-mini-wirówka</td><td>Titan</td><td>Timi-10k</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Phytotech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Zestaw do przygotowania biblioteki DNA</td><td>illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>oligo-dT30VN starter</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3'PCR</td></tr> <tr><td></td><td>Termocykler</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase</td><td>Yakult (Japonia)</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>Linie znaczników roślin</td><td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1x zestaw do oznaczania DSDN HS</td><td>invitrogen</td><td>Q33231</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 2.0</td><td>invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0382</td><td></td></tr><tr><td>Bezrakowy</td><td>invitrogen</td> wodny <td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>roztwór A</td><td></td><td></td><td>400 mM mannitol, 0,05 % BSA , 20 mM MES (pH 5,7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl</td></tr><tr><td>Roztwór B</td><td></td><td></td><td>1 % (w/v)celulaza R10, 1 % (w/v) celulaza RS, 1 %&nbsp; (w/v)hemicelulaza, 0,5 %&nbsp; (w/v)pektoliaza i 1 %&nbsp; (w/v) Macerozym R10 w świeżej porcji roztworu A</td></tr><tr><td>Sterylny tłuczek</td><td>BIOTREAT</td><td>453463</td><td></td></tr><tr><td>sitko (40 &mikro; m )</td><td>Sorfa&nbsp;</td><td>251100</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza SuperScript IV (200 U/&micro; L)</td><td>invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV buffer (5x)</td><td>invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>probówka (5 mL)</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne probówki do PCR z nakrętkami (0,5 mL)</td><td>AXYGEN</td><td>PCR-05-C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600198-0500</td><td></td></tr><tr><td>TSO primer</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3'Vortex</td></tr> <tr><td></td><td>Titan</td><td>VM-T2</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

W organizmach wielokomórkowych programowanie rozwojowe i reakcje środowiskowe mogą być bardzo rozbieżne w różnych typach komórek, a nawet w obrębie komórek, co jest znane jako heterogeniczność komórkowa. W ostatnich latach izolacja pojedynczych komórek i typów komórek w połączeniu z technikami sekwencjonowania nowej generacji (NGS) stała się ważnymi narzędziami do badania procesów biologicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Jednak izolowanie komórek roślinnych jest stosunkowo trudniejsze ze względu na obecność roślinnych ścian komórkowych, co ogranicza stosowanie podejść jednokomórkowych u roślin. Protokół ten opisuje solidną procedurę izolacji pojedynczych komórek i typów komórek z komórkami roślinnymi opartej na sortowaniu komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), która jest odpowiednia do dalszych analiz multiomicznych i innych badań. Korzystając z linii markerów fluorescencyjnych korzenia rzodkiewnika, pokazujemy, w jaki sposób izolowane są poszczególne typy komórek, takie jak komórki perycyklowe ksylemowo-polowe, początkowe komórki korzenia bocznego, komórki czapeczki korzenia bocznego, komórki kory i komórki endodermalne. Ponadto zapewniona jest skuteczna metoda analizy transkryptomu w dół przy użyciu Smart-seq2. Metoda izolacji komórek i techniki analizy transkryptomu mogą być dostosowane do innych typów komórek i gatunków roślin oraz mają szeroki potencjał aplikacyjny w naukach o roślinach.

Izolacja protoplastów 
Niniejszy protokół jest skuteczny w sortowaniu protoplastów z fluorescencyjnych linii markerowych korzeni A. thaliana. Linie markerowe te zostały opracowane poprzez fuzję białek fluorescencyjnych z genami wykazującymi specyficzną ekspresję w docelowych typach komórek lub przy użyciu linii z pułapką wzmacniacza (Rycina 1). Liczne tkanki i organy zostały poddane analizie w celu wyodrębnienia typów komórek wykazujących ekspresję specyficznych ...

Wykonalność i skuteczność wysokoprzepustowych metod sekwencyjnych scRNA zwiastuje erę jednokomórkowych w badaniach roślinnych. Przedstawiono tutaj solidną i kompletną procedurę izolowania określonych typów komórek korzenia rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) oraz późniejszej budowy i analizy biblioteki transkryptomu.

Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Analiza transkryptomu na pojedynczej komórce lub typach komórek może wykryć subtelną różnicę w ekspresji genów maskowaną przez heterogeniczność, co jest potężnym narzędziem do odkrycia skomplikowanych wewnątrzkomórkowych mechanizmów regulacyjnych. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, a następnie analiza sekwencyjna RN może być przeprowadzane w trybie pojedynczej komórki lub w trybie komórki masowej z wysoką czułością wykrywania transkryptów i kompatybilnością z innymi podejściami multiomicznymi. Osoby, które po raz pierwszy korzystają z tego protokołu, muszą zwrócić uwagę na kilka etapów sortowania protoplastów i przygotowania biblioteki sekwencyjnej RNA.Wraz z Jun Zhang, dr Rongrong Xie, post-doc w naszym laboratorium, pomoże w zademonstrowaniu procedury. Na początek umieść nasiona Arabidopsis thaliana typu dzikiego i fluorescencyjnego w 20% wybielaczu i inkubuj w obrotowym inkubatorze w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby wysterylizować nasiona. Pracując na sterylnej ławce, opłucz nasiona trzy do pięciu razy w wodzie podwójnie destylowanej.Umieść nasiona typu dzikiego i reporterowego na podłożu MS o połowie mocy z agarem 0,8% wagowym na objętość. Rozwarstwiaj rośli

isolation-and-transcriptome-analysis-of-plant-cell-types

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono metodę izolacji specyficznych typów komórek z materiału roślinnego. Technika ta wykorzystuje transgeniczne linie markerowe wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych typach komórek, dysocjację komórkową oraz sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Dodatkowo opracowano układ hodowlany, który umożliwia poddanie siewek Arabidopsis thaliana obróbce przed sortowaniem komórek.

Sortowanie komórek protoplastów roślinnych metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS)

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Źródło: Rufián, J. S. i in. Analiza ekspresji genów strzykawki pseudomonas w tkance roślinnej na poziomie pojedynczych komórek. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje metodę analizy ekspresji genów u patogennych bakterii roślinnych na poziomie pojedynczych komórek, wykorzystując fluorescencyjnie oznaczony czynnik transkrypcyjny. Obrazowanie konfokalne ujawnia heterogeniczność ekspresji genów zjadliwości, podkreślając funkcjonalną różnorodność w populacji bakterii klonalnych.

Analiza ekspresji genów w pojedynczych komórkach z patogenów ekstrahowanych roślinnie

Tutaj prezentujemy protokół do wspomaganej laserem mikrodysekcji określonych typów komórek roślinnych do profilowania transkrypcyjnego. Chociaż protokół jest odpowiedni dla różnych gatunków i typów komórek, nacisk kładziony jest na wysoce niedostępne komórki żeńskiej linii zarodkowej, ważne dla rozmnażania płciowego i apomiktycznego w rodzaju krzyżowych Boechera.

Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Opracowaliśmy prosty i efektywny protokół do przygotowania dużych ilości protoplastów soi do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach.

Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Prezentowany tutaj jest protokół do laserowego mikrodyparowania (LCM) tkanek roślinnych. LCM to mikroskopowa technika izolowania obszarów tkanki w sposób wolny od zanieczyszczeń. Procedura obejmuje utrwalenie tkanek, zatopienie parafiny, cięcie, ekstrakcję LCM i RNA. RNA jest wykorzystywane w dalszej, specyficznej tkankowo, czasowo rozdzielczej analizie transkryptomów.

Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin

Opisujemy prostą, ale wysoce powtarzalną metodę izolowania zewnątrzkomórkowego RNA z powierzchni liści i apoplastu roślin Arabidopsis.

Przewodnik krok po kroku dotyczący izolacji i analizy powierzchni liści i apoplastycznego RNA przy użyciu rozet Arabidopsis

Poznaj metodę izolacji i analizy transkryptomu typów komórek korzeniowych Arabidopsis thaliana przy użyciu sortowania komórek aktywowanych fluorescencją oraz sekwencjonowania RNA. Technika ta umożliwia badanie subtelnych różnic ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek.

Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

Przeglądaj więcej filmów