Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

Analiza transkryptomu na pojedynczej komórce lub typach komórek może wykryć subtelną różnicę w ekspresji genów maskowaną przez heterogeniczność, co jest potężnym narzędziem do odkrycia skomplikowanych wewnątrzkomórkowych mechanizmów regulacyjnych. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, a następnie analiza sekwencyjna RN może być przeprowadzane w trybie pojedynczej komórki lub w trybie komórki masowej z wysoką czułością wykrywania transkryptów i kompatybilnością z innymi podejściami multiomicznymi. Osoby, które po raz pierwszy korzystają z tego protokołu, muszą zwrócić uwagę na kilka etapów sortowania protoplastów i przygotowania biblioteki sekwencyjnej RNA.

Wraz z Jun Zhang, dr Rongrong Xie, post-doc w naszym laboratorium, pomoże w zademonstrowaniu procedury. Na początek umieść nasiona Arabidopsis thaliana typu dzikiego i fluorescencyjnego w 20% wybielaczu i inkubuj w obrotowym inkubatorze w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby wysterylizować nasiona. Pracując na sterylnej ławce, opłucz nasiona trzy do pięciu razy w wodzie podwójnie destylowanej.

Umieść nasiona typu dzikiego i reporterowego na podłożu MS o połowie mocy z agarem 0,8% wagowym na objętość. Rozwarstwiaj rośliny przez dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie hoduj je pionowo przez pięć dni w temperaturze 23 stopni Celsjusza w 16-godzinnych cyklach światła i 18-godzinnych ciemności.

Przed eksperymentem delikatnie rozmrozić roztwory protoplastywne zwane roztworem A i roztworem B na lodzie. Odetnij korzenie od roślin za pomocą czystego ostrza lub nożyczek i posiekaj korzenie na około 0,5 centymetra kawałki. Zanurz posiekane korzenie w 1,5 mililitra roztworu B, a następnie delikatnie obracaj w temperaturze pokojowej przez 1,5 do 2 godzin.

Przefiltrować powstałe protoplasty korzeniowe przez siatkę o wielkości 40 mikronów i przepłukać siatkę jednym do dwóch mililitrów roztworu A. Odwirować połączone filtraty w temperaturze 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant za pomocą pipety, ponownie zawiesić osad komórek w 500 do 600 mikrolitrach roztworu A i natychmiast umieścić go na lodzie. W celu sortowania komórek przenieś zawieszony roztwór komórek do nowej pięciomililitrowej probówki.

Napełnij zbiornik płynu osłonowego i sprawdź zbiornik na odpady. Następnie włącz aktywowaną fluorescencją maszynę do sortowania komórek lub FACS. Wykonaj kroki konfiguracji przyrządu i automatycznej kalibracji na sortowniku.

Wybierz kanały fluorescencyjne i użyj rośliny typu dzikiego bez fluorescencji jako podstawowej kontroli. Dostosuj bramkę sortowania w oparciu o intensywność fluorescencji oraz singlety rozproszenia do przodu i rozpraszania bocznego. Po dodaniu 500 mikrolitrów roztworu A do 1,5 mililitrowej probówki zbiorczej rozpocznij sortowanie i zbierz od 2 000 do 3 000 komórek na probówkę.

Po posortowaniu natychmiast umieść próbki na lodzie. Odwirować probówkę zbiorczą zawierającą komórki o sile 300 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut i usunąć supernatant za pomocą pipety. Weź dwa mikrolitry posortowanych komórek i sprawdź fluorescencję za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Przechowuj posortowane komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, jeśli nie zostaną natychmiast użyte. W celu sortowania indeksowego pojedynczych komórek umieść 96-dołkową płytkę z membraną w adapterze. Skalibruj położenie płytki tak, aby kropla wpadła do środkowego otworu płytki.

Usuń membranę z płytki 96-dołkowej i umieść płytkę 96-dołkową w adapterze. Wybierz tryb sortowania pojedynczych komórek podczas sortowania. Wprowadź docelową liczbę posortowanych komórek jako jedną i rozpocznij sortowanie.

Przed rozpoczęciem eksperymentu wyczyść ławkę odkażaczem powierzchni i 75% etanolem. Używaj całego sprzętu tylko do sekwencjonowania przygotowania biblioteki. Po dodaniu jednego mikrolitra świeżo przygotowanej mieszaniny A do posortowanej próbki, zmielić ją sterylnym tłuczkiem.

Używając wody wolnej od RNA, uzupełnić objętość do 14 mikrolitrów. Następnie przenieś każdą próbkę do cienkościennej probówki do PCR o pojemności 0,2 mililitra. Następnie należy przygotować mieszaninę B. Dodać 4,4 mikrolitra w mieszaninie B do każdej probówki PCR zawierającej próbki i wymieszać przez delikatne pipetowanie.

Inkubować próbki w temperaturze 72 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Po inkubacji natychmiast umieść próbki na lodzie w celu hybrydyzacji oligo dT z ogonem poli-A. Przygotować mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji lub mieszaninę C w 21,6 mikrolitrach do każdej probówki zawierającej próbki.

Poddaj próbki reakcji odwrotnej transkrypcji w zwykłym aparacie PCR zgodnie z programem odwrotnej transkrypcji. Dodać 40,8 mikrolitrów świeżo przygotowanej mieszaniny reakcji przed amplifikacją lub mieszaniny D do produktu reakcji odwrotnej transkrypcji i uruchomić program wstępnej amplifikacji. Cykl amplifikacji można określić za pomocą ilościowego PCR, gdy reakcja właśnie wchodzi w fazę wykładniczą.

Aby oczyścić produkty reakcji przed amplifikacją, przenieś wstępnie amplifikowane produkty z probówki PCR do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodać 48 mikrolitrów kulek AMPure XP do każdej próbki i delikatnie wymieszać pipetując przed inkubacją. Umieść 1,5-mililitrowe probówki zawierające próbki i kulki na magnetycznym stojaku separacyjnym na pięć minut.

Ostrożnie wyrzucić supernatant z próbek, nie naruszając kulek. Po ponownym zamieszczeniu ich w 200 mikrolitrach 80% etanolu umieść je na stojaku do separacji magnetycznej na kolejne trzy minuty. Po odrzuceniu etanolu zawierającego sklarowany siak, próbki należy suszyć na powietrzu w probówce przez 10 minut.

Ponownie zawiesić kulki w 20 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie umieść je na stojaku do separacji magnetycznej na pięć minut. Za pomocą pipety przenieś 18 mikrolitrów supernatantu z każdej probówki do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.

Na koniec postępuj zgodnie z krokami opisanymi w tekście, aby scharakteryzować bibliotekę wstępną, a następnie zbuduj bibliotekę, oczyszcz ją i kwantyfikuj. Linie markerów fluorescencyjnych Arabidopsis thaliana zostały opracowane przez fuzję białek fluorescencyjnych z genami ulegającymi ekspresji specyficznie w docelowych typach komórek lub przy użyciu linii pułapek wzmacniających. Oznaczone fluorescencyjnie protoplasty udało się posortować na podstawie intensywności fluorescencji oraz singletów rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego.

Posortowane komórki wizualizowano za pomocą obrazowania w jasnym polu i fluorescencji. Przedstawiono reprezentatywne wyniki biblioteki sekwencjonowania RNA około 2 000 komórek perycyklowych biegunów ksylemowych, komórek pierwotnych korzenia bocznego, komórek endodermy lub kory mózgowej oraz komórek czapeczki korzeniowej bocznej. Biblioteka o małym rozmiarze ze szczytami dimerów startera lub adaptera może być nadal sekwencjonowana po wybraniu rozmiaru.

Biblioteka z nietypowym rozkładem rozmiaru wskazywała na niepowodzenie przygotowania biblioteki. Przeanalizowano wzorce ekspresji genów. Geny wzbogacone w którykolwiek z czterech typów komórek korzeniowych zostały zgrupowane i przedstawione na mapie cieplnej pokazującej specyficzność ekspresji genów wśród różnych typów komórek.

Wysoka jakość i czystość komórek docelowych poprzez prawidłowe bramkowanie i sortowanie oraz zapobieganie degradacji RNA są kluczem do udanej budowy biblioteki. W przypadku sekwencji RNA w trybie pojedynczej komórki opisano ostatnio kilka metod zintegrowanych z unikalnym identyfikatorem molekularnym, które znacznie poprawiły wydajność.