Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Niewiele metod pozwala na szybką ocenę funkcjonalności krwiotwórczych komórek progenitorowych. Protokół ten mierzy wpływ pierwszych podziałów komórkowych na los i zaangażowanie komórki. Protokół ten pozwala na jednoczesny pomiar podziału i różnicowania na poziomie pojedynczej komórki i z wysoką przepustowością bez konieczności skomplikowanej i rozległej manipulacji.

Ta metoda jest odpowiednia dla każdej populacji hematopoetycznej, którą można utrzymać w kulturze. Można go więc łatwo zastosować do biologii raka, immunologii i biologii rozwoju. Na początek podajcie 250 mikrolitrów frakcji CD34 + równo w czterech 15-mililitrowych probówkach polipropylenowych.

Oznacz probówki zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Porcjować 250 mikrolitrów frakcji CD34 na kolejne cztery 15-mililitrowe probówki polipropylenowe i oznaczyć probówki. Przygotuj roztwory CFSE high i CSFE low zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu.

Dodać 250 mikrolitrów wysokiego roztworu CFSE do probówki CF i CV, 250 mikrolitrów niskiego roztworu CFSE do probówki VC i 250 mikrolitrów zmodyfikowanego roztworu Eagle Medium lub DMEM firmy Dulbecco bez płodowej surowicy bydlęcej lub FBS do probówki VI. Aby zapewnić skuteczne mieszanie zawiesiny komórek w barwniku komórkowym, należy nachylić probówkę o 90 stopni i osadzać roztwory CFSE na ściance rurki. Następnie trzymaj probówkę pionowo i wymieszaj trzy lub cztery razy, aby zapewnić szybkie wymieszanie roztworów CFSE z ponownie zawieszonymi komórkami.

Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem minut. Po inkubacji dodaj pięć mililitrów DMEM zawierającego 10% FBS i umieść probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Wirować probówki z natężeniem 300 g przez pięć minut.

Usunąć supernatant przez aspirację bez naruszania osadu i przemyć osad pięcioma mililitrami PBS, ETDA. Ponownie odkręć probówki i wyrzuć supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 40 mikrolitrach PBS, ETDA. Aby wybarwić komórki CD34+, przygotuj główną mieszankę przeciwciał w pojedynczej probówce o pojemności 0,5 mililitra.

Dodać siedem mikrolitrów z głównej mieszanki przeciwciał do każdego z czterech warunków CD34+. Ponownie zawiesić komórki w buforze barwiącym, używając około 500 mikrolitrów każda dla kulek w komórkach CD34 + i jednego mililitra dla probówek CD34. W przypadku sortowania komórek ustaw strategię bramkowania, tworząc diagramy wykresów punktowych.

Najpierw zwizualizuj komórki na wykresie punktowym FSCA i SSCA i kliknij dwukrotnie narzędzie do bramkowania wielokątów, aby wybrać populację z niskim rozrzutem bocznym. Oznacz tę nowo utworzoną bramę jako Komórki. Na poniższym wykresie kropkowym, FSCA kontra FSCH, kliknij wykres prawym przyciskiem myszy i wybierz komórki bramki z menu rozwijanego, klikając je.

Użyj tego samego narzędzia do bramkowania, aby wybrać ciasne populowanie po przekątnej między dwiema osiami. Oznacz tę bramkę jako pojedyncze komórki. Na trzecim wykresie kropkowym, APC kontra FSH-H, wyświetl populację pojedynczych komórek i bramuj komórki ujemne pod kątem ekspresji linii APC.

Oznacz tę nowo utworzoną populację jako Lineage Negative. Na czwartym wykresie, CFSE kontra CTV, wyświetl populację Lineage Negative i utwórz cztery oddzielne bramki, po jednej dla każdej kombinacji barwników. Brama VI jest pokazana tutaj jako przykład.

Użyj piątego i szóstego wykresu, aby zidentyfikować interesujących nas przodków. Hojnie bramkujemy CD34+CD38-populacja i CD34+CD38+na piątym poletku. Następnie wybierz populację CD34+CD38 na szóstym wykresie i narysuj trzy bramki dla LMPP, HSC i MPP.

Uruchom frakcje CD34+, rejestrując co najmniej 5 000 zdarzeń w bramce pojedynczej komórki. Dostosuj bramkę dla każdej kombinacji barwników, ustawiając ciasną bramkę, aby wybrać jednorodną populację. Przygotuj szablon sortowania płyt, korzystając z układu Sortowanie eksperymentalne.

Studzienki o nazwie CD34 zawierają od 5 000 do 10 000 komórek posortowanych na bramce CF, CV, VC, VI. Studzienki zbiorcze zawierają 500 komórek posortowanych na bramce CD34 + CD38 - Studzienki z pojedynczymi komórkami zawierają tylko jedno zdarzenie na kombinację barwnika podziału komórek na studzienkę, więc w sumie cztery zdarzenia na studzienkę. Następnie zacznij od sortowania CD34-CF w trybie czystości plonu.

Kliknij przycisk Nabierz, a następnie przycisk Sortuj. Kliknij przycisk Pobierz, a następnie przycisk Sortuj, upewniając się, że jako stopień czystości zaznaczono 0160. Na koniec posortuj interesujące Cię komórki, po jednej komórce na studzienkę, w czystości pojedynczej komórki, upewniając się, że zaznaczyłeś opcję Sortowanie indeksów.

Odwirować płytkę o sile 300 g przez pięć minut i usunąć supernatant poprzez szybkie odwrócenie płytki pod pokrywą nad ręcznikiem papierowym. Dodać osiem mikrolitrów stałego buforu do studzienek od A1 do A4, a następnie dodać osiem mikrolitrów mieszanki do pozostałych studzienek. Umyj komórki, dodając 100 mikrolitrów buforu barwiącego na studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej.

Odwirować i usunąć supernatant przed ponownym zawieszeniem komórek w 85 mikrolitrach buforu barwiącego. Rozpocznij analizę na cytometrze przepływowym w trybie Akwizycji, korzystając z dedykowanego szablonu i klikając Niestandardowy. Po wybraniu interesujących nas fluoroforów z listy, ustaw ustawienie płytki zgodnie z szablonem płytki skorygowanym o liczbę studzienek zawierających co najmniej jedną komórkę.

Zaznacz opcję Mieszanie i wybierz 100 mikrolitrów jako limit objętości akwizycji. Następnie ustaw szybkość akwizycji nie większą niż jeden mikrolitr na sekundę, ponieważ niższa prędkość poprawia całkowitą objętość analizowaną na studzienkę. Aby uzyskać reprezentatywne bramkowanie, połącz różne studzienki zbiorcze w jednym pliku.

Po kliknięciu opcji Concatenate Populations (Połącz populacje) wybierz opcję All uncompensated parameters (Wszystkie nieskompensowane parametry) z menu Parameters (Parametry), a następnie kliknij przycisk Concatenate (Łącz). Przekaż połączony plik do obszaru roboczego, a następnie zastosuj macierz wynagrodzeń metodą przeciągnij i upuść. Etykiety komórek z CV i VC wymagają przekształconej wartości.

Kliknij Narzędzia i Pochodna parametr, aby uzyskać przekształconą wartość. Wklej wskazaną formułę w polu formuły. Zastosuj bramkowanie do każdego koloru z osobna jako wykres histogramu.

Dla CF i VI ustaw CFSE-A i CTV-A odpowiednio na osi X. W przypadku CV i VC ustaw nowo wyprowadzony parametr na osi X, a następnie ustaw bramki odpowiadające każdemu pikowi. Zastosuj bramkowanie do każdej pojedynczej komórki.

Upewnij się, że dodano parametr pochodny do każdego analizowanego dołka. Ręcznie zweryfikuj każdą bramkę kolorów dla każdej studzienki, aby wykryć zdarzenia, które są nieprawidłowo przypisane do danego szczytu. Analiza cytometrii przepływowej po hodowli komórkowej wymaga precyzyjnego bramkowania w celu ustalenia pokrewieństwa każdej pojedynczej komórki wraz z fenotypowaniem komórkowym.

Definiowanie i przypisywanie pików jest kluczowym aspektem analizy cytometrii przepływowej. Histogramy przedstawiają dwa przykłady rodzin rozłożonych na wielu szczytach, jeden z dwoma podobnymi szczytami intensywności i jeden z dwoma różnymi szczytami intensywności. Przedstawiono tutaj różne rodzaje reprezentacji danych i testów statystycznych dla dwóch oddzielnych eksperymentów przeprowadzonych po 72 godzinach dla HSC i MPP.

Mapa cieplna dla stanu Różnicowanie HSC reprezentuje różne rodziny komórek, zarówno pod względem losów komórek, jak i podziałów komórkowych. Histogram porównujący losy rodzin komórek pochodnych HSC i MPP przedstawiono tutaj. Dla obu typów komórek porównanie warunku GT i zróżnicowania warunku jest wyświetlane wraz z testami statystycznymi wykonanymi dla MPP.

Przedstawiono tutaj histogramy porównujące procentową liczbę rodzin komórek na pokolenie oraz rodzaj symetrii lub asymetrii losów dla pierwszego podziału. Rozkład losów MPP na pokolenie i zróżnicowanie warunków są pokazane tutaj. Ta procedura wymaga zbiorczego izolowania komórek w celu ustalenia odpowiedniej strategii bramkowania.

Dlatego lepiej jest rozpocząć barwienie od co najmniej 10 000 komórek. Połączenie tej metody z pomiarami ciągłymi, takimi jak obrazowanie żywych komórek, może być bardzo skuteczne, ponieważ obie metody razem mogą dostarczyć szczegółowego opisu wczesnych progenitorów dynamiki komórki. Podejście to zostało po raz pierwszy opracowane dla biologii limfocytów T przez Hopkins Labs.

Ta wersja, dostosowana do komórek macierzystych krwi, jest obecnie rozszerzana na raka i biologię komórek macierzystych.