Name: Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do jednoczesnej oceny podziałów komórkowych, fenotypu powierzchniowego i pokrewieństwa komórek hematopoetycznych na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować członkom Institut Curie Flow Facility za pomoc w przygotowaniu eksperymentów z cytometrią przepływową. Pragniemy również podziękować za wkład pozostałych członków Zespołu Perié w liczne dyskusje. Dziękujemy dr Julii Marchingo i prof. Philowi Hodgkinowi (Walter i Eliza Hall Institute of Medical Research) za podzielenie się swoim protokołem multipleksowania barwników podziału komórkowego na limfocytach. Dziękujemy biobankowi krwi pępowinowej szpitala Saint Louis za udostępnienie zasobów biologicznych niezbędnych do opracowania tego protokołu. Badanie było wspierane przez grant ATIP-Avenir z CNRS i Bettencourt-Schueller Foundation (dla L.P.), granty z Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (dla L.P. i A.D.), Idex Paris-Science-Lettres Program (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (dla L.P.), Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, dla L.P.) oraz grant ITMO MIIC (21CM044, dla L.P.). Oprócz finansowania z Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 ERC StG 758170-Microbar (do L.P.), A.D. otrzymało stypendium od Fondation de France.

<ol><li>Ginhoux, F., Yalin, A., Dutertre, C. A., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+immunology%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-cell immunology: Past, present, and future.</a> Immunity. 55 (3), 393-404 (2022).</li>
<li>Ke, M., Elshenawy, B., Sheldon, H., Arora, A., Buffa, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+RNA-sequencing%3A+A+powerful+yet+still+challenging+technology+to+study+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Single cell RNA-sequencing: A powerful yet still challenging technology to study cellular heterogeneity.</a> Bioessays. 44 (11), 2200084(2022).</li>
<li>Regev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+cell+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The human cell atlas.</a> Elife. 6, 27041(2017).</li>
<li>Laurenti, E., Göttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li>
<li>Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).</li>
<li>Loughran, S. J., Haas, S., Wilkinson, A. C., Klein, A. M., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+commitment+of+hematopoietic+stem+cells+and+progenitors%3A+insights+from+recent+single+cell+and+lineage+tracing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Lineage commitment of hematopoietic stem cells and progenitors: insights from recent single cell and lineage tracing technologies.</a> Experimental Hematology. 88, 1-6 (2020).</li>
<li>Perié, L., Duffy, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retracing+the+in+vivo+haematopoietic+tree+using+single-cell+methods%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Retracing the in vivo haematopoietic tree using single-cell methods.</a> FEBS Letters. 590 (22), 4068-4083 (2016).</li>
<li>Yu, V. W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+underlies+cell-autonomous+heterogeneous+behavior+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory underlies cell-autonomous heterogeneous behavior of hematopoietic stem cells.</a> Cell. 167 (5), 1310-1322 (2016).</li>
<li>Ganuza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifelong+haematopoiesis+is+established+by+hundreds+of+precursors+throughout+mammalian+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lifelong haematopoiesis is established by hundreds of precursors throughout mammalian ontogeny.</a> Nature Cell Biology. 19 (10), 1153-1163 (2017).</li>
<li>Naik, S. H., Schumacher, T. N., Perié, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+barcoding%3A+A+technical+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Cellular barcoding: A technical appraisal.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 598-608 (2014).</li>
<li>Quek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+distinct+leukemic+stem+cells+in+human+CD34+%E2%88%92+acute+myeloid+leukemia+are+arrested+at+a+hemopoietic+precursor-like+stage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetically distinct leukemic stem cells in human CD34 − acute myeloid leukemia are arrested at a hemopoietic precursor-like stage.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (8), 1513-1535 (2016).</li>
<li>Karamitros, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+the+continuum+of+human+lympho-myeloid+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals the continuum of human lympho-myeloid progenitor cells.</a> Nature Immunology. 19 (1), 85-97 (2018).</li>
<li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li>
<li>Delaney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-mediated+expansion+of+human+cord+blood+progenitor+cells+capable+of+rapid+myeloid+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution.</a> Nature Medicine. 16 (2), 232-236 (2010).</li>
<li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li>
<li>Guo, B., Huang, X., Lee, M. R., Lee, S. A., Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+PPAR-%CE%B3+3+signaling+expands+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+enhancing+glycolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antagonism of PPAR-γ 3 signaling expands human hematopoietic stem and progenitor cells by enhancing glycolysis.</a> Nature Medicine. 24 (3), 360-367 (2018).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAD-booster+nicotinamide+riboside+potently+stimulates+hematopoiesis+through+increased+mitochondrial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The NAD-booster nicotinamide riboside potently stimulates hematopoiesis through increased mitochondrial clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li>
<li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nov%2FCCN3+enhances+cord+blood+engraftment+by+rapidly+recruiting+latent+human+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Nov/CCN3 enhances cord blood engraftment by rapidly recruiting latent human stem cell activity.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 527-541 (2020).</li>
<li>Horwitz, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omidubicel+vs+standard+myeloablative+umbilical+cord+blood+transplantation%3A+results+of+a+phase+3+randomized+study%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Omidubicel vs standard myeloablative umbilical cord blood transplantation: results of a phase 3 randomized study.</a> Blood. 138 (16), 1429-1440 (2021).</li>
<li>Weinreb, C., Rodriguez-Fraticelli, A., Camargo, F. D., Klein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+on+transcriptional+landscapes+links+state+to+fate+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation.</a> Science. 367 (6479), 3381(2020).</li>
<li>Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+cell+fate+control+by+continuous+single-cell+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Understanding cell fate control by continuous single-cell quantification.</a> Blood. 133 (13), 1406-1414 (2019).</li>
<li>Tario, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+staining+and+proliferation+modeling+methods+for+cell+division+monitoring+using+cell+tracking+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4287(2012).</li>
<li>Marchingo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+stimuli+independently+sum+to+regulate+an+inherited+clonal+division+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">T-cell stimuli independently sum to regulate an inherited clonal division fate.</a> Nature Communications. 7, 13540(2016).</li>
<li>Horton, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+division+tracking+dyes+for+proliferation-based+clonal+lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed division tracking dyes for proliferation-based clonal lineage tracing.</a> Journal of Immunology. 201 (3), 1097-1103 (2018).</li>
<li>Lehmann, E. L., Romano, J. P., Casella, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLehmann%2C+EL+%22Testing+statistical+hypotheses%22">Testing statistical hypotheses</a>. , Springer. New York. 784(2005).</li>
<li>Tak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSPCs+display+within-family+homogeneity+in+differentiation+and+proliferation+despite+population+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">HSPCs display within-family homogeneity in differentiation and proliferation despite population heterogeneity.</a> Elife. 10, 360624(2021).</li>
<li>Sommerkamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+multipotent+progenitor+5+cells+are+located+at+the+interphase+between+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse multipotent progenitor 5 cells are located at the interphase between hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 137 (23), 3218-3224 (2021).</li>
<li>Kato, K., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+CD34%2B+hematopoietic+stem+cells+from+human+peripheral+blood+by+high-gradient+magnetic+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of CD34+ hematopoietic stem cells from human peripheral blood by high-gradient magnetic cell sorting.</a> Cytometry. 14 (4), 384-392 (1993).</li>
<li>Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+gradient+magnetic+cell+separation+with+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">High gradient magnetic cell separation with MACS.</a> Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).</li>
<li>Doulatov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+map+of+the+human+progenitor+hierarchy+shows+the+origin+of+macrophages+and+dendritic+cells+in+early+lymphoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development.</a> Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).</li>
<li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li>
<li>Laurenti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK6+levels+regulate+quiescence+exit+in+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+in+patients+with+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Davison, A. C., Hinkley, D. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavison%2C+AC+%22Bootstrap+Methods+and+their+Application%22">Bootstrap Methods and their Application</a>. , Cambridge University Press. (1997).</li>
<li>Horton, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+reveals+B+cell+antibody+class+switching+is+stochastic%2C+cell-autonomous%2C+and+tuneable%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing reveals B cell antibody class switching is stochastic, cell-autonomous, and tuneable.</a> Immunity. 55 (10), 1843-1855 (2022).</li>
<li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+routes+of+lineage+development+reshape+the+human+blood+hierarchy+across+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct routes of lineage development reshape the human blood hierarchy across ontogeny.</a> Science. 351 (6269), 2116(2016).</li>
<li>Grinenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+can+differentiate+into+restricted+myeloid+progenitors+before+cell+division+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells can differentiate into restricted myeloid progenitors before cell division in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 1898(2018).</li>
<li>Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+flow+cytometry%3A+Helping+to+make+sense+of+high-dimensional+immunology+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Computational flow cytometry: Helping to make sense of high-dimensional immunology data.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów istotnego dla tej pracy. Grantodawcy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu pracy do publikacji.

Test MultiGen jest wysokoprzepustowym, łatwym do wykonania i niedrogim badaniem, które odegrało istotną rolę w badaniu limfocytów23,24,35 oraz mysich komórek krwiotwórczych26,27. Przedstawiamy tutaj nowy rozwój tej metody, który pozwala na rozszyfrowanie ex vivo wczesnej fazy determinacji ludzkich HSPC na poziomie pojedynczych komórek przy użyciu krótkoterminowej hodowli (Rycina 6). Systemy hodowli pojedynczych komórek ex vivo są zazwyczaj stosowane do oceny długoterminowego losu HSPC w procesie przekształcania się w dojrzałe komórki, jednak niektóre ścieżki różnicowania zachodzą wcześniej niż inne36, co może potencjalnie zniekształcać analizę w stronę mniejszej liczby możliwych losów. Ponadto systemy hodowli te zazwyczaj pomijają informacje o podziałach podczas determinacji losu komórki. Wykazano, że pierwsze etapy determinacji mogą zachodzić już na początku hodowli, czasami bez podziału26,37, co sprawia, że krótkoterminowa hodowla i śledzenie podziałów są niezbędne do badania wczesnej determinacji losu. Poprzez jednoczesne śledzenie losu, podziałów i pokrewieństwa, test ten pozwala zrozumieć rolę pierwszego podziału i decyzji o losie komórki w ludzkich HSPC. Dzięki temu badaniu możliwe jest określenie, po ilu podziałach zachodzi proces determinacji, jaka jest równowaga między samoodnawianiem a różnicowaniem dla tych wczesnych progenitorów oraz w jaki sposób właściwości te są dziedziczone w kolejnych generacjach. Z naszej wiedzy jest to jedyny test pozwalający na tego typu pomiary dla ludzkich HSPC z rozdzielczością pojedynczej komórki. Ponadto, stosując różne kombinacje barwników do podziałów komórkowych, zwiększyliśmy przepustowość analizy, co czyni ten test cennym narzędziem do szybkiego generowania dużych zbiorów danych. Kombinacje barwników pozwalają śledzić kilka rodzin w tych samych dołkach, zwiększając liczbę komórek dostępnych do analizy w hodowli krótkoterminowej. Liczbę kombinacji można potencjalnie zwiększyć jeszcze bardziej via dodanie innych barwników (np. barwnika żółtego) lub zmianę stosunku CFSE do CTV. Jednakże ogranicza to liczbę innych parametrów, które można analizować.
<img alt="Schemat procesu sortowania komórek: barwienie barwnikami, barwienie przeciwciałami, analiza danych, analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Schematyczne przedstawienie protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby pomyślnie przeprowadzić analizę, ze względu na dużą liczbę dołków oraz niewielką liczbę komórek do analizy, konieczne jest wykonanie analizy cytometrycznej na analizatorze wyposażonym w czytnik płytek. Nowa generacja analizatorów stołowych jest szczególnie dostosowana do tego testu, ponieważ większość z nich posiada mniejszą objętość martwą, co redukuje procent strat komórek. Gwarantuje to z kolei wyższą wydajność w odzyskiwaniu całej zawartości każdego dołka, co przekłada się na szacowaną wydajność w zakresie 70%26. Oszacowanie utraty komórek podczas akwizycji w cytometrii przepływowej jest kluczowe dla analizy każdej pojedynczej rodziny. Na przykład, przy założeniu braku śmierci komórek i zliczeniu liczby podziałów, możliwe jest oszacowanie liczby komórek dla każdej rodziny. Niemniej jednak, zaleca się przeprowadzenie eksperymentów potwierdzających, w szczególności w celu oszacowania śmierci komórek w testowanych warunkach hodowli oraz eksperymentalnego pomiaru wskaźnika odzysku przy użyciu określonej liczby komórek.
Jednym z kluczowych etapów tego protokołu jest przypisanie pików. Jak już wspomniano, dobra jakość rozkładu pików jest silnie zależna od wyizolowania bardzo wąskich pików podczas sortowania komórek. Niemniej jednak, przypisanie prawidłowej liczby podziałów wyłącznie na podstawie rozkładu jest wciąż trudne. Ponieważ sortowanie komórek i analiza cytometrii przepływowej są wykonywane na dwóch różnych urządzeniach, bezpośrednie porównanie intensywności każdego sygnału nie jest możliwe, w związku z czym może być trudno określić, czy pierwszy pik zaobserwowany po prawej stronie histogramu to pik 0 czy pik 1. W tym zakresie możliwe jest kilka rozwiązań; jednym ze sposobów jest przeprowadzenie eksperymentu ortogonalnego w celu dokładnego zmierzenia liczby podziałów wykonanych przez te komórki (np. obrazowanie żywych komórek). Inną możliwością jest po prostu policzenie liczby komórek w studzience pod odwróconym mikroskopem w świetle przechodzącym przed przeprowadzeniem analizy cytometrii przepływowej. Pozwoli to wywnioskować średnią liczbę podziałów (przy założeniu braku śmierci komórek). Ostatecznie, rozwiązaniem post-hoc w celu przypisania pików jest wykrycie nietypowej liczby „rodzin niemożliwych”; rodziny te składają się z większej niż możliwa liczby komórek na generację (np. pięć komórek w generacji 2 lub dwie komórki w generacji 1 i jedna komórka w generacji 2). Możliwość wykluczenia rodzin niemożliwych jest zakodowana w etapie analizy statystycznej i flaguje taką rodzinę jako niemożliwą. Jeśli częstotliwość występowania tych błędów jest zbyt wysoka, można zasadnie założyć, że przypisanie pików wymaga rewizji.
W niniejszym protokole przedstawiono kilka przykładów reprezentacji i analizy danych dla przeprowadzonego testu, ponieważ stało się to niezbędnym etapem w generowaniu i interpretacji dużych zbiorów danych38. Pierwszym przykładem jest mapa ciepła (heatmap) przedstawiająca całość wszystkich analizowanych komórek, uporządkowanych według rodzin. Jest to wydajne narzędzie do badania ogólnych właściwości danych i wyciągania potencjalnych wniosków: czy rodziny składają się z wielu typów komórek, czy mają tendencję do homogeniczności składu? Czy rodziny obejmują wiele pokoleń, czy dzielą się głównie taką samą liczbą razy? Ta analiza eksploracyjna musi zostać następnie uzupełniona o bardziej specyficzne wykresy i testy statystyczne. Można ją wykorzystać do ilościowej oceny symetrycznego i asymetrycznego determinowania losu komórek, różnicowania bez podziału, równowagi między samoodnawianiem a różnicowaniem oraz liczby podziałów dla określonego losu determinacji. Podczas planowania eksperymentu kluczowe jest dostosowanie czasu hodowli komórek do rodzaju stawianego pytania; na przykład w przypadku dwóch pierwszych pytań (równowaga symetryczna/asymetryczna oraz różnicowanie bez podziału), zaplanowanie bardzo krótkich etapów hodowli pozwala na izolację dużej liczby rodzin, które wykonały tylko jeden podział lub nie dzieliły się wcale26. Z kolei dłuższe eksperymenty umożliwiają zbadanie liczby podziałów wymaganych do konkretnej determinacji komórkowej, ponieważ pozwalają na pobranie próbek rodzin na różnych etapach różnicowania. Niemniej jednak metoda ta nie jest przeznaczona do hodowli długoterminowych (2-3 tygodnie), ponieważ rozcieńczanie barwnika komórkowego nie pozwala na dokładne śledzenie więcej niż siedmiu lub ośmiu podziałów22. W konsekwencji narzędzie to jest dostosowane głównie do badania wczesnej determinacji progenitorów krwiotwórczych i nie służy do wyciągania wiarygodnych wniosków na temat długoterminowych właściwości różnicowania tych komórek.
Ramy statystyczne opracowano specjalnie do analizy tego typu danych w oparciu o koncepcję permutacji26. Było to konieczne ze względu na zaobserwowaną zależność rodzinną w rozkładzie typów komórek oraz w liczbie wykonanych podziałów. Innymi słowy, komórki należące do tej samej rodziny z większym prawdopodobieństwem wykazują podobne fenotypy i dzielą się taką samą liczbę razy. Choć szczegółowa analiza wykracza poza zakres niniejszej pracy, dostarczony zestaw testów statystycznych powinien być wystarczający do oceny różnych warunków.
Podsumowując, niniejszy protokół stanowi wartościowe narzędzie do oceny dynamiki komórkowej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych ex vivo w sposób szybki i niedrogi. Dzięki swojej elastyczności i wszechstronności w zakresie punktów czasowych, warunków hodowli oraz analizowanych typów HSPCs, pozwala on na testowanie różnych warunków eksperymentalnych. Jako analiza oparta na cytometrii przepływowej, może zostać wdrożona w większości laboratoriów i nie wymaga rozległej wiedzy wstępnej, co czyni ją odpowiednią metodą do badań przesiewowych i eksperymentów pilotażowych.

Ostatnia dekada była naznaczona światowym rozprzestrzenianiem się jednokomórkowych podejść do biologii komórkowej i molekularnej. Podążając śladami genomiki pojedynczej komórki1,2, obecnie możliwe jest badanie wielu składników pojedynczej komórki (np. DNA, RNA, białek), dzięki nowym technikom -omicznym pojedynczych komórek, które rozwijają się każdego roku. Techniki te rzuciły światło na stare i nowe pytania w dziedzinach immunologii, neurobiologii, onkologii i innych, zarówno przy użyciu komórek organizmu ludzkiego, jak i modelowego3. Podkreślając różnice między poszczególnymi komórkami, -omika pojedynczej komórki skłoniła do zdefiniowania nowego modelu hematopoezy, skoncentrowanego na heterogeniczności hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) i odchodzącego od klasycznego modelu dyskretnych jednorodnych populacji4,5.
Jedną z niewielu wad wszystkich technik -omicznych jest zniszczenie interesującej komórki, co uniemożliwia ocenę jej funkcjonalności. Z drugiej strony, inne metody jednokomórkowe, takie jak test przeszczepu pojedynczej komórki i technologie śledzenia linii, zapewniają odczyt funkcjonalności komórki przodka poprzez ocenę losu poszczególnych komórek in vivo6,7. Technologie śledzenia linii polegają na oznaczaniu interesującej komórki dziedzicznym genetycznym 7 lub fluorescencyjnym label8,9, co pozwala na śledzenie losu wielu pojedynczych komórek w tym samym czasie. Jednak charakterystyka komórek wyjściowych jest zwykle ograniczona do ograniczonej liczby parametrów, takich jak ekspresja kilku białek powierzchniowych oceniana za pomocą cytometrii przepływowej10. Ponadto technologie śledzenia linii pojedynczych komórek wymagają pracochłonnego wykrywania znacznika komórkowego, zwykle za pomocą sekwencjonowania lub obrazowania DNA/RNA. W szczególności ten ostatni punkt ogranicza liczbę warunków, które można przetestować w jednym eksperymencie.
Inną klasą metod, które są używane do badania funkcjonalności pojedynczych komórek, są systemy hodowli komórkowych ex vivo pojedynczych HSPC. Łatwe do wykonania, te złote standardy obejmują sortowanie pojedynczych komórek do 96-dołkowych naczyń do hodowli komórkowych, a po hodowli, charakteryzując fenotyp potomstwa komórki, zazwyczaj za pomocą cytometrii przepływowej lub analizy morfologicznej. Testy te były najczęściej używane do scharakteryzowania długoterminowego różnicowania HSPC w dojrzałe komórki, zwykle po 2-3 tygodniach hodowli11,12. Alternatywnie, zostały one wykorzystane do próby utrzymania i rozbudowy ex vivo HSPCs13,14,15,16,17,18, z obietnicą korzyści medycznych dla przeszczepu ludzkich komórek macierzystych19. Wreszcie, wykorzystano je do zbadania wczesnego zaangażowania HSPC przy użyciu hodowli krótkoterminowej20, przy czym głównym czynnikiem ograniczającym jest niska liczba komórek generowanych w tej hodowli. Jedną z wad tych różnych rodzajów testów ex vivo jest to, że tylko częściowo odzwierciedlają one złożoność in vivo; mimo to są jednym z rzadkich sposobów badania różnicowania ludzkiego HSPC.
Jedną z brakujących informacji w istniejących metodach jednokomórkowych (pojedyncza komórka-omika, śledzenie linii i hodowla ex vivo) jest dokładne wykrywanie podziałów komórkowych, niezbędny parametr do rozważenia podczas badania dynamiki HSPC21. Prostym sposobem oceny liczby podziałów za pomocą cytometrii przepływowej jest użycie rozpuszczalnych "barwników białkowych", takich jak ester sukcynimidylowy dioctanu 5-(i 6)-karboksyfluoresceiny (CFSE)<klasa sup="xref">22. Te barwniki podziałowe dyfundują wewnątrz cytoplazmy barwionych komórek i rozcieńczają się o połowę i przechodzą do dwóch komórek potomnych przy każdym podziale komórki, co pozwala wyliczyć do 10 podziałów. Łącząc kilka barwników podziałowych, możliwe jest wysiewanie wielu indywidualnych przodków w tej samej studzince, ponieważ każdy pojedynczy barwnik umożliwia separację różnych potomków. Jest to zasada stojąca za użyciem barwników komórkowych do klonalnego multipleksowania i śledzenia podziałów, która została po raz pierwszy wprowadzona dla mysich limfocytów23,24.
Tutaj prezentujemy rozwój testu MultiGen do użytku z mysimi i ludzkimi HSPC. Pozwala na jednoczesne badanie wielu pojedynczych komórek pod kątem ich właściwości różnicowania, podziału i pokrewieństwa ex vivo. Ten wysokoprzepustowy, łatwy do wykonania i niedrogi test pozwala jednocześnie zmierzyć fenotyp komórkowy, liczbę przeprowadzonych podziałów oraz pokrewieństwo komórek i pokrewieństwo klonalne z innymi komórkami w studni. Może być wykorzystany do ilościowej oceny symetrycznego i asymetrycznego zaangażowania losu, równowagi między samoodnawianiem a zróżnicowaniem oraz liczby podziałów niezbędnych dla danego losu zobowiązania. Protokół wymaga aktywowanego fluorescencją sortownika komórek (FACS) i cytometru przepływowego z czytnikiem płytek, a także sprzętu niezbędnego do przeprowadzenia hodowli komórkowej. Oprócz protokołu technicznego do wykonania testu na ludzkich HSPC, zapewniamy również szczegółowe ramy analizy, w tym testy statystyczne niezbędne do oceny właściwości komórkowych związanych z koncepcją rodziny komórek25. Protokół ten został już z powodzeniem wykorzystany do opisania mysiego przedziału HSPC26,27.
Poniższy protokół wykorzystuje magnetycznie wzbogacone komórki CD34+ jako materiał wyjściowy28. W ten sposób możliwe jest skuteczne barwienie i izolowanie ludzkich HSPC z różnych źródeł krwi (np. krwi pępowinowej, szpiku kostnego, krwi obwodowej). Ważne jest, aby nie odrzucać frakcji CD34-, ponieważ będzie ona używana jako część protokołu do ustawiania różnych typów kontroli eksperymentalnych. Wspomniane ilości i objętości komórek można skalować w górę lub w dół, zgodnie z eksperymentalnym przepływem pracy i potrzebami. Podobnie, protokół można dostosować do badania różnych typów komórek progenitorowych, po prostu modyfikując przeciwciała używane do etapów sortowania komórek i cytometrii przepływowej.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek polipropylenowych 1,5 ml</td><td>vWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Probówki polipropylenowe 15 ml</td><td>vWR</td><td>734-0451</td><td></td></tr><tr><td>probówki polipropylenowe 50 ml</td><td>vWR</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka hodowlana z dnem w kształcie litery U&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Lin APC</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-7776-72</td><td>Rozcieńczenie 1/40</td></tr><tr><td>ARIA III</td><td>BD</td><td></td><td>Można zastąpić dowolnym sorterem FACS zdolnym do sortowania pojedynczych komórek na 96-dołkowej płytce</td></tr><tr><td>Ester boksyfluoresceiny sukcynimidylowej (CFSE)</td><td>Life Technologies</td><td>C34570</td><td></td></tr><tr><td>Ślad komórek Fioletowy (CTV)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki kompensacyjne&nbsp;</td><td>BD</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62948-36</td><td>Przygotuj roztwór 0,5 M w sterylizowanej wodzie</td></tr><tr><td>Blok FC Fc1.3216</td><td>BD</td><td>564220</td><td>Rozcieńczenie 1/50</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Dutscher</td><td>S1900-500C</td><td>Batch S00CH</td></tr><tr><td>FlowJo v10.8.1</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD10 PerCP-5.5, klon HI10a</td><td>Biolegend</td><td>312216</td><td>Rozcieńczenie 1/20</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD123 BUV395, klon 7G3</td><td>BD</td><td>564195</td><td>Rozcieńczenie 1/15</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD34 APC-Cy7, klon 581</td><td>Biolegend</td><td>343513</td><td>Rozcieńczenie 1/40</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD38 BV650, klon HB7</td><td>Biolegend</td><td>356620</td><td>Rozcieńczenie 1/40</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD45RA AF700, klon HI100</td><td>BD</td><td>560673</td><td>Rozcieńczenie 1/20</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD45RA PE-Cy7, klon HI100</td><td>BD</td><td>560675</td><td>Rozcieńczenie 1/20</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD90 PE, klon 5E10</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td>Rozcieńczenie 1/20</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) 1X</td><td>Life Technologies</td><td>10010001</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne stożkowe rurki polipropylenowe 12x75 mm</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZE5&nbsp;</td><td>Biorad</td><td></td><td>Można zastąpić dowolnym analizatorem cytometrii przepływowej wyposażonym w czytnik płytek</td></tr> <tr><td>Laboratory przygotowany</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td> do <td>hodowli komórkowych Zależy od konkretnego eksperymentu. Codziennie przygotowuj świeże i przechowuj w temperaturze +4 stopni; C do czasu użycia</td></tr><tr><td>DMEM + 10% FBS</td><td></td><td></td><td>Może być przechowywany w sterylnych warunkach, w temperaturze +4 &deg; C do 1 roku. Aby przygotować 500 ml, dodaj 50 ml FBS do 450 ml DMEM</td></tr><tr><td>PBS 1X + EDTA 0,1%</td><td></td><td></td><td>Może być przechowywany w sterylnych warunkach, w temperaturze pokojowej, do 1 roku. Aby przygotować 500 ml, dodaj 3,42 ml EDTA 0,5 M do 500 ml PBS 1X</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> do barwienia <td>Może być przechowywany w sterylnych warunkach, w temperaturze +4 & deg; C do 1 roku. Aby przygotować 500 ml, dodaj 2 ml EDTA 0,5 M i 1 ml FBS do 500 ml PBS 1X</td></tr></tbody></table>

jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Niewiele technik może jednocześnie ocenić fenotyp i los tej samej komórki. Większość obecnych protokołów używanych do charakteryzowania fenotypu, mimo że są w stanie generować duże zbiory danych, wymaga zniszczenia komórki będącej przedmiotem zainteresowania, co uniemożliwia ocenę jej funkcjonalnego losu. Heterogeniczne systemy różnicowania biologicznego, takie jak hematopoeza, są zatem trudne do opisania. Opierając się na barwnikach śledzących podział komórek, opracowaliśmy protokół jednoczesnego określania pokrewieństwa, liczby podziałów i statusu różnicowania dla wielu pojedynczych komórek progenitorowych hematopoetycznych. Protokół ten pozwala na ocenę potencjału różnicowania ex vivo mysich i ludzkich komórek progenitorowych hematopoetycznych, wyizolowanych z różnych źródeł biologicznych. Co więcej, ponieważ opiera się na cytometrii przepływowej i ograniczonej liczbie odczynników, może szybko wygenerować dużą ilość danych na poziomie pojedynczej komórki w stosunkowo niedrogi sposób. Zapewniamy również potok analityczny do analizy pojedynczych komórek w połączeniu z solidnymi ramami statystycznymi. Ponieważ protokół ten umożliwia powiązanie podziałów i różnicowania komórek na poziomie pojedynczej komórki, może być wykorzystany do ilościowej oceny symetrycznego i asymetrycznego zaangażowania w los, równowagi między samoodnawianiem a różnicowaniem oraz liczby podziałów dla danego losu zaangażowania. Podsumowując, protokół ten może być wykorzystany w projektach eksperymentalnych mających na celu rozwikłanie różnic biologicznych między krwiotwórczymi komórkami progenitorowymi z perspektywy pojedynczej komórki.

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

Niewiele metod pozwala na szybką ocenę funkcjonalności krwiotwórczych komórek progenitorowych. Protokół ten mierzy wpływ pierwszych podziałów komórkowych na los i zaangażowanie komórki. Protokół ten pozwala na jednoczesny pomiar podziału i różnicowania na poziomie pojedynczej komórki i z wysoką przepustowością bez konieczności skomplikowanej i rozległej manipulacji.Ta metoda jest odpowiednia dla każdej populacji hematopoetycznej, którą można utrzymać w kulturze. Można go więc łatwo zastosować do biologii raka, immunologii i biologii rozwoju. Na początek podajcie 250 mikrolitrów frakcji CD34 + równo w czterech 15-mililitrowych probówkach polipropylenowych.Oznacz probówki zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Porcjować 250 mikrolitrów frakcji CD34 na kolejne cztery 15-mililitrowe probówki polipropylenowe i oznaczyć probówki. Przygotuj roztwory CFSE high i CSFE low zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu.Dodać 250 mikrolitrów wysokiego roztworu CFSE do probówki CF i CV, 250 mikrolitrów niskiego roztworu CFSE do probówki VC i 250 mikrolitrów zmodyfikowanego roztworu Eagle Medium lub DMEM firmy Dulbecco bez płodowej surowicy bydlęcej lub FBS do probówki VI. Aby zapewnić skuteczne mieszanie zawiesiny komórek w barwniku komórkowym, należy nachylić probówkę o 90 stopni i osadzać roztwory CFSE na ściance rurki. Następnie trzymaj probówkę pionowo i wymieszaj trzy lub cztery razy, aby zapewnić szybkie wymieszanie roztworów CFSE z ponownie zawieszonymi komórkami.Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem minut. Po inkubacji dodaj pięć mililitrów DMEM zawierającego 10% FBS i umieść probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Wirować probówki z natężeniem 300 g przez pięć minut.Usunąć supernatant przez aspirację bez naruszania osadu i przemyć osad pięcioma mililitrami PBS, ETDA. Ponownie odkręć probówki i wyrzuć supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 40 mikrolitrach PBS, ETDA. Aby wybarwić komórki CD34+, przygotuj główną mieszankę przeciwciał w pojedynczej probówce o pojemności 0,5 mililitra.Dodać siedem mikrolitrów z głównej mieszanki przeciwciał do każdego z czterech warunków CD34+. Ponownie zawiesić komórki w buforze barwiącym, używając około 500 mikrolitrów każda dla kulek w komórkach CD34 + i jednego mililitra dla probówek CD34. W przypadku sortowania komórek ustaw strategię bramkowania, tworząc diagramy wykresów punktowych.Najpierw zwizualizuj komórki na wykresie punktowym FSCA i SSCA i kliknij dwukrotnie narzędzie do bramkowania wielokątów, aby wybrać populację z niskim rozrzutem bocznym. Oznacz tę nowo utworzoną bramę jako Komórki. Na poniższym wykresie kropkowym, FSCA kontra FSCH, kliknij wykres prawym przyciskiem myszy i wybierz komórki bramki z menu rozwijanego, klikając je.Użyj tego samego narzędzia do bramkowania, aby wybrać ciasne populowanie po przekątnej między dwiema osiami. Oznacz tę bramkę jako pojedyncze komórki. Na trzecim wykresie kropkowym, APC kontra FSH-H, wyświetl populację pojedynczych komórek i bramuj komórki ujemne pod kątem ekspresji linii APC.Oznacz tę nowo utworzoną populację jako Lineage Negative. Na czwartym wykresie, CFSE kontra CTV, wyświetl populację Lineage Negative i utwórz cztery oddzielne bramki, po jednej dla każdej kombinacji barwników. Brama VI jest pokazana tutaj jako przykład.Użyj piątego i szóstego wykresu, aby zidentyfikować interesujących nas przodków. Hojnie bramkujemy CD34+CD38-populacja i CD34+CD38+na piątym poletku. Następnie wybierz populację CD34+CD38 na szóstym wykresie i narysuj trzy bramki dla LMPP, HSC i MPP.Uruchom frakcje CD34+, rejestrując co najmniej 5 000 zdarzeń w bramce pojedynczej komórki. Dostosuj bramkę dla każdej kombinacji barwników, ustawiając ciasną bramkę, aby wybrać jednorodną populację. Przygotuj szablon sortowania płyt, korzystając z układu Sortowanie eksperymentalne.Studzienki o nazwie CD34 zawierają od 5 000 do 10 000 komórek posortowanych na bramce CF, CV, VC, VI. Studzienki zbiorcze zawierają 500 komórek posortowanych na bramce CD34 + CD38 - Studzienki z pojedynczymi komórkami zawierają tylko jedno zdarzenie na kombinację barwnika podziału komórek na studzienkę, więc w sumie cztery zdarzenia na studzienkę. Następnie zacznij od sortowania CD34-CF w trybie czystości plonu.Kliknij przycisk Nabierz, a następnie przycisk Sortuj. Kliknij przycisk Pobierz, a następnie przycisk Sortuj, upewniając się, że jako stopień czystości zaznaczono 0160. Na koniec posortuj interesujące Cię komórki, po jednej komórce na studzienkę, w czystości pojedynczej komórki, upewniając się, że zaznaczyłeś opcję Sortowanie indeksów.Odwirować płytkę o sile 300 g przez pięć minut i usunąć supernatant poprzez szybkie odwrócenie płytki pod pokrywą nad ręcznikiem papierowym. Dodać osiem mikrolitrów stałego buforu do studzienek od A1 do A4, a następnie dodać osiem mikrolitrów mieszanki do pozostałych studzienek. Umyj komórki, dodając 100 mikrolitrów buforu barwiącego na studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej.Odwirować i usunąć supernatant przed ponownym zawieszeniem komórek w 85 mikrolitrach buforu barwiącego. Rozpocznij analizę na cytometrze przepływowym w trybie Akwizycji, korzystając z dedykowanego szablonu i klikając Niestandardowy. Po wybraniu interesujących nas fluoroforów z listy, ustaw ustawienie płytki zgodnie z szablonem płytki skorygowanym o liczbę studzienek zawierających co najmniej jedną komórkę.Zaznacz opcję Mieszanie i wybierz 100 mikrolitrów jako limit objętości akwizycji. Następnie ustaw szybkość akwizycji nie większą niż jeden mikrolitr na sekundę, ponieważ niższa prędkość poprawia całkowitą objętość analizowaną na studzienkę. Aby uzyskać reprezentatywne bramkowanie, połącz różne studzienki zbiorcze w jednym pliku.Po kliknięciu opcji Concatenate Populations (Połącz populacje) wybierz opcję All uncompensated parameters (Wszystkie nieskompensowane parametry) z menu Parameters (Parametry), a następnie kliknij przycisk Concatenate (Łącz). Przekaż połączony plik do obszaru roboczego, a następnie zastosuj macierz wynagrodzeń metodą przeciągnij i upuść. Etykiety komórek z CV i VC wymagają przekształconej wartości.Kliknij Narzędzia i Pochodna parametr, aby uzyskać przekształconą wartość. Wklej wskazaną formułę w polu formuły. Zastosuj bramkowanie do każdego koloru z osobna jako wykres histogramu.Dla CF i VI ustaw CFSE-A i CTV-A odpowiednio na osi X. W przypadku CV i VC ustaw nowo wyprowadzony parametr na osi X, a następnie ustaw bramki odpowiadające każdemu pikowi. Zastosuj bramkowanie do każdej pojedynczej komórki.Upewnij się, że dodano parametr pochodny do każdego analizowanego dołka. Ręcznie zweryfikuj każdą bramkę kolorów dla każdej studzienki, aby wykryć zdarzenia, które są nieprawidłowo przypisane do danego szczytu. Analiza cytometrii przepływowej po hodowli komórkowej wymaga precyzyjnego bramkowania w celu ustalenia pokrewieństwa każdej pojedynczej komórki wraz z fenotypowaniem komórkowym.Definiowanie i przypisywanie pików jest kluczowym aspektem analizy cytometrii przepływowej. Histogramy przedstawiają dwa przykłady rodzin rozłożonych na wielu szczytach, jeden z dwoma podobnymi szczytami intensywności i jeden z dwoma różnymi szczytami intensywności. Przedstawiono tutaj różne rodzaje reprezentacji danych i testów statystycznych dla dwóch oddzielnych eksperymentów przeprowadzonych po 72 godzinach dla HSC i MPP.Mapa cieplna dla stanu Różnicowanie HSC reprezentuje różne rodziny komórek, zarówno pod względem losów komórek, jak i podziałów komórkowych. Histogram porównujący losy rodzin komórek pochodnych HSC i MPP przedstawiono tutaj. Dla obu typów komórek porównanie warunku GT i zróżnicowania warunku jest wyświetlane wraz z testami statystycznymi wykonanymi dla MPP.Przedstawiono tutaj histogramy porównujące procentową liczbę rodzin komórek na pokolenie oraz rodzaj symetrii lub asymetrii losów dla pierwszego podziału. Rozkład losów MPP na pokolenie i zróżnicowanie warunków są pokazane tutaj. Ta procedura wymaga zbiorczego izolowania komórek w celu ustalenia odpowiedniej strategii bramkowania.Dlatego lepiej jest rozpocząć barwienie od co najmniej 10 000 komórek. Połączenie tej metody z pomiarami ciągłymi, takimi jak obrazowanie żywych komórek, może być bardzo skuteczne, ponieważ obie metody razem mogą dostarczyć szczegółowego opisu wczesnych progenitorów dynamiki komórki. Podejście to zostało po raz pierwszy opracowane dla biologii limfocytów T przez Hopkins Labs.Ta wersja, dostosowana do komórek macierzystych krwi, jest obecnie rozszerzana na raka i biologię komórek macierzystych.

simultaneous-assessment-kinship-division-number-phenotype-via-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące przeprowadzania konkurencyjnych eksperymentów z przeszczepem szpiku kostnego myszy w celu zbadania funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych/progenitorowych bez wcześniejszego oczyszczania komórek macierzystych przez sortowanie komórek.

Konkurencyjne przeszczepy w celu oceny sprawności hematopoetycznych komórek macierzystych

Podczas gdy infiltrujące makrofagi są stale rekrutowane do tkanek dorosłych z krążących prekursorów, makrofagi rezydentne zasiewają swoją tkankę podczas rozwoju, gdzie są utrzymywane bez dalszego wkładu ze strony przodków. Niedawno zidentyfikowano prekursorów rezydujących makrofagów. W tym miejscu przedstawiono metody genetycznego mapowania losów rezydentnych przodków makrofagów.

Identyfikacja przodków erytromieloidów i ich potomstwa w zarodku myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Kwantyfikacja komórek pochodzących od dawcy jest wymagana do monitorowania wszczepienia po przeszczepie komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Połączenie sortowania komórek opartego na cytometrii przepływowej, testu tworzenia kolonii i późniejszej analizy krótkich powtórzeń tandemowych można zastosować do oceny proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych w przedziale erytroidalnym.

Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

Tutaj prezentujemy metodologię analizy klonalnej prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych podczas rozwoju embrionalnego u myszy. Łączymy sortowanie indeksowe pojedynczych komórek z zarodkowego regionu aorta-gonad-śródnercze z kohodowlą i przeszczepem komórek śródbłonka, aby scharakteryzować właściwości fenotypowe i potencjał wszczepienia pojedynczych prekursorów krwiotwórczych.

Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

Przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji markerów komórek macierzystych białaczki na pierwotnych komórkach ostrej białaczki szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów.

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Tutaj opisujemy nowatorską metodę cytometrii przepływowej do prospektywnej izolacji wczesnych prekursorów erytroidalnych (BFU-e) i erytroidalnych tworzących kolonie (CFU-e) bezpośrednio ze świeżego szpiku kostnego i śledziony myszy. Protokół ten, opracowany na podstawie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, jest pierwszym, który izoluje wszystkie erytroidalne komórki progenitorowe tkanki o wysokiej czystości.

Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do jednoczesnej oceny podziałów komórkowych, fenotypu powierzchniowego i pokrewieństwa komórek hematopoetycznych na poziomie pojedynczych komórek.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (Wideo) | JoVE Journal

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Przeglądaj więcej filmów