Kwantyfikacja stresu replikacyjnego w komórkach raka jajnika za pomocą immunofluorescencji jednoniciowego DNA

Nasz protokół przedstawia wysoce wydajną i łatwą do odtworzenia metodę ilościowego oznaczania jednoniciowego DNA, który jest markerem stresu replikacyjnego w różnych liniach komórkowych. Dodatkowo jego prostota pozwala na tworzenie aplikacji i ekranów o wysokiej przepustowości. W szczególności metoda ta pozwala na szybkie ilościowe określenie stresu replikacyjnego, który jest cechą charakterystyczną wielu nowotworów jajnika.

Jest również podatny na oprogramowanie do automatycznej analizy hosta, co jeszcze bardziej zwiększa wydajność. Jednoniciowe DNA jest obecnie aktywnie rozważane jako biomarker odpowiedzi na chemioterapię ukierunkowaną na szlaki naprawy DNA. W związku z tym ta metoda ma duże zastosowanie w tym scenariuszu.

Stres replikacyjny występuje poza kontekstem raka jajnika lub nowotworów z niedoborem BRCA1, BRCA2. W związku z tym metoda ta może być stosowana do szerokiej gamy innych typów komórek lub kontekstów chorobowych. Na początek wykonaj szkiełka nakrywkowe pokryte polilizyną, dodając autoklawowane szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 milimetrów i roztwór polilizyny do 50-mililitrowej stożkowej rurki i umieść na kołysce na 15 minut.

Odessać roztwór na kapturze do hodowli tkankowych. Umyj szkiełka nakrywkowe, dodając sterylną wodę i umieść rurkę zawierającą szkiełka nakrywki z powrotem na wahaczu na pięć minut. Po trzykrotnym umyciu szkiełek nakrywkowych należy odessać wodę z rurki i rozprowadzić szkiełka nakrywkowe na sterylnym naczyniu.

Odessać pozostałą wodę i pozostawić ją do wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowej przez godzinę lub do momentu, gdy nie pozostaną żadne kropelki wody. Po wyschnięciu uszczelnij naczynie Parafilmem i umieść je w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Aby zapobiec odklejaniu się komórek od szkiełek nakrywkowych podczas etapu wstępnej ekstrakcji, należy umieścić po jednym szkiełku nakrywkowym pokrytym polilizyną w każdym dołku płytki 24-dołkowej.

Gdy komórki OVCAR3 osiągną zbieżność od 70 do 80%, odessać pożywkę z płytki i umyć komórki 5 do 7 mililitrami PBS. Odessać PBS z płytki. Po zassaniu PBS dodaj 1 mililitr 0,25% trypsyny i umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 8 do 10 minut lub do momentu, gdy komórki oderwą się od dna płytki.

Zbierz komórki z 5 do 10 mililitrami pożywki i dodaj zawiesinę komórek do stożkowej probówki. Policz komórki ręcznie za pomocą hemocytometru, stosując standardowe procedury. Następnie rozcieńczyć zawiesinę komórkową i uzyskać liczbę, która da od 70 do 80% zbiegu po trzech populacjach.

Dodać 1 mililitr zawiesiny komórek na polilizynowych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych w dołkach 24-dołkowej płytki i hodować komórki w pożywce hodowlanej w standardowych warunkach. Po podwojeniu jednej populacji odessać istniejące pożywki z płytki i pulsować komórki 10 mikromolowymi IdU w celu uzyskania dwóch kolejnych podwojeń populacji. Aby zebrać komórki, zastąp podłoże lodowatym 0,5% PBSTx na lodzie przez pięć minut.

W celu utrwalenia komórek należy odessać PBSTx i inkubować komórki przez 15 minut z 3% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej. Po trzech do czterech praniach z PBS utrzymuj stałe ogniwa w temperaturze 4 stopni Celsjusza do dalszego użycia. Po utrwaleniu przepuszczaj komórki za pomocą 0,5% PBSTx na lodzie przez pięć minut, upewniając się, że pokryłeś całe szkiełko nakrywkowe.

Po trzykrotnym lub czterokrotnym umyciu komórek 1 mililitrem 0,2% PBST w temperaturze pokojowej, należy zassać PBST i zablokować próbki za pomocą 5% BSA wykonanego w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Do barwienia immunologicznego przygotuj jednolitą komorę, kładąc mokry ręcznik papierowy na płaskim dnie Tupperware. Przykryj pokrywę płytki 24-dołkowej preparatem Parafilm.

Umieść go w nawilżonej komorze i połóż szkiełka nakrywkowe na pokrywie talerza. Dodać 60 mikrolitrów rozcieńczonego pierwszorzędowego przeciwciała mysiego anty-BrdU na wierzch szkiełka nakrywkowego. Alternatywnie, w celu zmniejszenia wysychania przeciwciała i użycia mniejszej objętości, należy umieścić kroplę rozcieńczonego przeciwciała na Parafilmie i odwrócić na nią szkiełko nakrywkowe.

Następnie inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji odessać przeciwciało pierwszorzędowe. Umieść szkiełka z powrotem na płytce 24-dołkowej i umyj je czterokrotnie 0,2% PBST.

Dodać rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe na szkiełku nakrywkowym, jak pokazano wcześniej, i inkubować przez godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej. Oznacz szkiełko mikroskopowe i zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełkach za pomocą medium montażowego DAPI. Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, jeśli podłoże montażowe wymaga utwardzenia lub utwardzenia.

Jądra pochodzące z komórek nietraktowanych i traktowanych 0,5 milimolowym hydroksymocznikiem były barwione i identyfikowalne w kanałach DAPI i IdU. Analiza tych obrazów polega na ilościowym określeniu liczby ognisk w każdym jądrze. Liczba ognisk jest proporcjonalna do stopnia naprężenia replikacyjnego.

Ważne jest, aby wziąć pod uwagę czas podwojenia wybranej linii komórkowej, ponieważ czas pulsacji IdU może się różnić w dłuższych lub krótszych okresach podwajania. Alternatywnie możemy sondować komórki pod kątem białka replikacyjnego A, aby potwierdzić wyniki i ocenić różne reakcje na stres replikacyjny w komórkach. Technika ta jest stosowana w przypadku wielu linii komórkowych w połączeniu z dowolnym czynnikiem indukującym uszkodzenia DNA w celu zbadania akumulacji pojedynczego szczepu DNA.

Dzięki temu ta metoda jest szeroko dostępna i możliwa do zastosowania.