Name: Kwantyfikacja stresu replikacyjnego w komórkach raka jajnika za pomocą immunofluorescencji jednoniciowego DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji do kwantyfikacji jednoniciowego DNA jako markera stresu replikacyjnego w komórkach raka jajnika. Technika ta umożliwia szybkie, wysokoprzepustowe badania z zastosowaniem automatycznej analizy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PV jest wspierane przez Inaugural Pedal the Cause Grant przez Alvin J. Siteman Cancer Center poprzez The Foundation for Barnes-Jewish Hospital, Pilot Research Grant od Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research, Cancer Research Grant od Mary Kay Ash Foundation i V-Foundation. NR jest wspierany przez grant szkoleniowy NIH Cell and Molecular Biology T32 dla Washington University w St. Louis.

UWAGA: Linia komórkowa raka jajnika, OVCAR3, została użyta w tych krokach, ale ten protokół ma szerokie zastosowanie do wielu innych linii komórkowych, w tym tych pochodzących ze źródeł innych niż jajnikowe. Schemat protokołu jest pokazany w Rysunek 2.
1. Powlekanie komórek
<ol>
	<li>Wykonaj szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną.
	<ol>
		<li>Dodać autoklawizowane szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z roztworem poli-L-lizyny i umieścić na kołysce na 15 minut.</li>
		<li>Odessać roztwór do kaptura do hodowli tkankowej. Umyj szkiełka nakrywkowe, dodając sterylną wodę i umieść probówkę zawierającą szkiełka nakrywkowe z powrotem na bujaku na 5 minut. Powtórz ten krok prania trzy razy.</li>
		<li>Rozprowadź powlekane szkiełka nakrywkowe na sterylnym naczyniu i odessaj pozostałą wodę. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowych przez 1 godzinę lub do momentu, gdy nie pozostaną żadne kropelki wody. Po wyschnięciu zamknij naczynie parafilmem i umieść w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić jedno szkiełko nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną w każdym dołku płytki 24-dołkowej. Stosowanie szkiełek nakrywkowych z polilizyny ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia odklejaniu się komórek od szkiełek nakrywkowych na etapie przed ekstrakcją.</li>
	<li>Trypsynizuj komórki OVCAR3, gdy osiągną 70%-80% konfluencji.
	<ol>
		<li>Aby wytrypsynizować 10-centymetrowe naczynie hodowlane, które jest zlewające się w 70%-80%, odessać pożywkę z płytki i przemyć 5-7 ml PBS.</li>
		<li>Odessać PBS, dodać 1 ml 0,25% trypsyny i umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 8-10 minut lub do momentu, gdy komórki oderwą się od dna płytki.</li>
		<li>Zebrać komórki z 5-10 ml pożywki i dodać do stożkowej probówki.</li>
		<li>Policz komórki ręcznie za pomocą hemocytometru, stosując standardowe procedury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć 25 000 komórek/ml i dodać 1 ml komórek na szkiełkach nakrywkowych z poli-L-lizyny umieszczonych w dołkach płytek 24-dołkowych. Dla każdej innej linii komórkowej określ liczbę tak, aby komórki zlewały się w około 70%-80% po trzech podwojeniach populacji.</li>
	<li>Hoduj komórki w pożywce hodowlanej w standardowych warunkach.</li>
</ol>
2. Pulsujące komórki z IdU
<ol>
	<li>Aby komórki prawidłowo rozprzestrzeniły się na szkiełkach nakrywkowych, wystarczy jedno podwojenie populacji. Po jednym podwojeniu populacji, pulsuj komórki 10 μM 5-jodo-2'-deoksyurydyną (IdU) (patrz Tabela materiałów na temat odtwarzania IdU) dla dwóch kolejnych podwojeń populacji. 
	UWAGA: Próbowaliśmy różnych analogów tymidyny, w tym bromodeoksyurydyny (BrdU), 5-chloro-2′-deoksyurydyny (CIdU) i IdU. Spośród trzech analogów, IdU zapewnia najlepszy stosunek sygnału do szumu. Obrazy porównawcze komórek pulsujących trzema różnymi analogami są pokazane na Rysunek 3. Zalecamy stosowanie dwóch kontroli ujemnych: (i) próbki pulsacyjnej bez IdU oraz (ii) kontroli bez przeciwciał pierwotnych. Jeśli konieczne jest oszacowanie powstawania ssDNA w związku z danym leczeniem, zalecamy dodanie leku po pierwszej rundzie podwojenia IdU.</li>
	<li>Po pulsowaniu z IdU przez dwa podwojenia populacji, zbierz komórki do obrazowania.
	<ol>
		<li>Zastąp podłoże lodowatym 0,5% PBSTx (PBS + 0,5% Triton X-100) na lodzie przez 5 minut. Ten etap wstępnej ekstrakcji pomaga uwolnić białka cytoplazmatyczne i niezwiązane z chromatyną, pozostawiając nienaruszone białka związane z chromatyną. Niektóre linie komórkowe mogą łatwo odkleić się podczas wstępnej ekstrakcji. W takim scenariuszu można użyć 0,5% buforu CSK (10 mM PIPES (pH 6,8), 100 mM NaCl, 300 mM sacharozy, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA i 0,5% Triton X-100).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Fiksacja
<ol>
	<li>Odessać PBSTx i inkubować przez 15 minut z 3% PFA (tabela materiałów) w temperaturze pokojowej, a następnie trzy do czterech płukań 1x PBS. Stałe ogniwa można utrzymywać w temperaturze 4 °C do czasu podjęcia dalszych kroków. 
	UWAGA: PFA jest wysoce toksyczny i rakotwórczy. Unikać kontaktu ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Wykonaj wszystkie czynności z PFA w dygestoriach i odpowiednio zutylizuj materiały.</li>
</ol>
4. Przepuszczalność i blokowanie
<ol>
	<li>Po utrwaleniu należy przepuszczać komórki za pomocą 0,5% PBSTx na lodzie przez 5 minut. Użyj wystarczającej objętości, aby pokryć całe szkiełko nakrywkowe (zwykle od 500 μl do 1 ml).</li>
	<li>Umyj komórki trzy do czterech razy 0,2% PBST (1X PBS + 0,2% Tween-20) w temperaturze pokojowej. Jeden ml PBST wystarcza do umycia każdej studzienki. Wykonuj pranie tyłem do siebie bez żadnych inkubacji.</li>
	<li>Zassać PBST i zablokować próbki za pomocą 5% BSA (Tabela Materiałów) wykonanej w 1x PBS (bufor blokujący) na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
5. Barwienie immunologiczne przeciwciałem IdU
<ol>
	<li>Do barwienia immunologicznego przygotuj wilgotną komorę (mokry ręcznik papierowy na płaskim dnie Tupperware). Przykryj pokrywkę płytki 24-dołkowej parafilmem, umieść w wilgotnej komorze i połóż szkiełka nakrywkowe na pokrywie płytki.</li>
	<li>Przygotuj pierwszorzędowe przeciwciało myszy anty-BrdU (tabela materiałów), rozcieńczając je w stosunku 1:200 w buforze blokującym z kroku 4.2.Wcześniej wykazano, że przeciwciało anty-BrdU wykrywa IdU.</li>
	<li>Dodać 60 μl rozcieńczenia przeciwciał IdU na wierzch szkiełek nakrywkowych. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, należy użyć mniejszej ilości roztworu przeciwciał, jeśli szkiełka nakrywkowe zostaną odwrócone na kroplę (20-25 μl) roztworu przeciwciał o rozcieńczeniu 1:200 pipetowaną na parafilm. Zmniejsza to również prawdopodobieństwo wyschnięcia roztworu podczas inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 1 h inkubacji odessać przeciwciało pierwszorzędowe. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytce 24-dołkowej i umyj je czterokrotnie 0,2% PBST.</li>
	<li>W przypadku przeciwciała wtórnego należy użyć tej samej wilgotnej komory, która została opisana w kroku 5.1. Rozcieńczyć sprzężone przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszom (tabela materiałów) w buforze blokującym (1:200). Dodać 60 μl przeciwciała drugorzędowego do szkiełek nakrywkowych i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę. To przeciwciało drugorzędowe jest wrażliwe na światło.</li>
	<li>Odessać przeciwciało wtórne. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytce 24-dołkowej i przemyj czterokrotnie 0,2% PBST.</li>
	<li>Oznacz szkiełka mikroskopowe i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą nośnika montażowego DAPI (tabela materiałów). Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. 24-godzinna inkubacja jest zalecana, jeśli podłoże montażowe wymaga utwardzenia lub utwardzenia. 
	UWAGA: Preparaty można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem pod mikroskopem fluorescencyjnym. Reprezentatywny obraz jest pokazany w Rysunek 4.</li>
</ol>
6. Automatyczna kwantyfikacja ognisk IdU
UWAGA: Siła tego testu polega na możliwości zautomatyzowania analizy w celu szybkiej i efektywnej kwantyfikacji. Przedstawiamy tutaj zautomatyzowany potok analizy, który można wykorzystać do ilościowego określenia ognisk IdU w danym polu obrazu. Ważne jest, aby wszystkie zdjęcia w ramach danego eksperymentu były wykonane przy tych samych ustawieniach ekspozycji; W przeciwnym razie kwantyfikacja nie będzie wiarygodna. Wartościowe może być również włączenie niebarwionej kontroli jako kontroli negatywnej, przynajmniej po raz pierwszy w tym eksperymencie (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). Poniższy protokół jest specyficzny dla oprogramowania do analizy ogólnej sieciowej usługi informacyjnej, ale te same zasady można również zastosować do innego oprogramowania komercyjnego.
<ol>
	<li>Na karcie Widok przejdź do pozycji Formanty analizy | Eksplorator analiz. Spowoduje to otwarcie nowego okna bocznego o nazwie Eksplorator analizy. Kliknij Utwórz nowy | Analiza ogólna 3. Spowoduje to otwarcie oprogramowania do tworzenia schematów blokowych Eksploratora analiz.</li>
	<li>Przejdź do zakładki Źródła i przeciągnij polecenie Kanały z menu po lewej stronie do obszaru roboczego. Dwa kanały dla ognisk DAPI i IdU automatycznie pojawią się jako pola binarne (pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 5 jako pola z czerwonymi konturami).</li>
	<li>Przejdź do karty Przetwarzanie wstępne i przeciągnij polecenie Kontrast lokalny z menu po lewej stronie do obszaru roboczego. Połącz kontrast lokalny z kanałem ognisk IdU. Z karty Segmentacja przeciągnij polecenie Threshold (po jednym dla każdego kanału).</li>
	<li>Połącz każdy kanał z poleceniem Threshold. Aby wyeliminować wszelkie jądra na obramowaniu obrazu, przejdź do zakładki Przetwarzanie binarne, przeciągnij polecenie Touching Borders i połącz się z progiem DAPI.</li>
	<li>Scal dane z dwóch kanałów za pomocą polecenia Agreguj elementy podrzędne na karcie Pomiar. Zdefiniuj kanał DAPI jako nadrzędny (A), a kanał ognisk jako podrzędny (B). Z menu rozwijanego w poleceniu Agreguj elementy podrzędne wybierz opcję, że element podrzędny znajduje się wewnątrz elementu nadrzędnego. Ten krok pomaga policzyć liczbę ognisk (potomnych) na jądro (rodzica).
	<ol>
		<li>Aby wyeksportować dane w formacie tabelarycznym, kliknij polecenie Modyfikuj kolumny na karcie Zarządzanie danymi. Z menu rozwijanego w poleceniu Modify Columns (Modyfikuj kolumny) wybierz DAPI-ID (pomaga to przypisać unikalny numer do każdego jądra na danym obrazie) i IdU count (podaje liczbę ognisk IdU w każdym jądrze). Aby wyeksportować dane w formacie CSV, użyj polecenia Tabela do pliku CSV na karcie Odwołanie. GA3 można teraz zapisać z opisowym tytułem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu analizy otwórz obraz w oprogramowaniu.
	<ol>
		<li>Otwórz kartę Eksplorator analizy, tak jak w kroku 6.1, i znajdź nowo utworzony GA3. Kliknij dwukrotnie plik GA3, co otworzy nowe okno o nazwie GA3 Wizard, w którym można ustawić próg dla kanałów DAPI i IdU.</li>
		<li>Za pomocą suwaka w oknie ustaw minimalny i maksymalny próg dla każdego kanału, a tym samym zdefiniuj sygnał. Dobra wartość progowa to taka, w której granice dla każdego jądra i ogniska IdU są wyraźnie określone. Po spełnieniu wartości progowych zachowaj te liczby do analizowania wszystkich plików w danym eksperymencie.</li>
		<li>Kliknij przycisk Uruchom, aby uzyskać liczbę ognisk IdU/na jądro. 
		UWAGA: Oprogramowanie generuje tabelę ognisk dla każdego jądra, która może być następnie wykorzystana do dowolnych celów graficznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tubbs, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+damage+as+a+source+of+genomic+instability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer.</a> Cell. 168 (4), 644-656 (2017).</li>
<li>Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+deficiency%3A+Exploiting+the+fundamental+vulnerability+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).</li>
<li>Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+repair+in+ovarian+cancer%3A+Unlocking+the+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity.</a> Journal of Ovarian Research. 11, 50(2018).</li>
<li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+grade+serous+ovarian+carcinomas+originate+in+the+fallopian+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube.</a> Nature communications. 8, 1093(2017).</li>
<li>Kroeger, P. T., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+heterogeneity+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer.</a> Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).</li>
<li>Patch, A. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+characterization+of+chemoresistant+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer.</a> Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).</li>
<li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repertoire+of+mutational+signatures+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The repertoire of mutational signatures in human cancer.</a> Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).</li>
<li>Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+uncoupling+of+MCM+helicase+and+DNA+polymerase+activities+activates+the+ATR-dependent+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint.</a> Genes & Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).</li>
<li>Toledo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+prohibits+replication+catastrophe+by+preventing+global+exhaustion+of+RPA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA.</a> Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).</li>
<li>Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Walking+a+tightrope%3A+The+complex+balancing+act+of+R-loops+in+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability.</a> Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).</li>
<li>Cejka, P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+end+resection%3A+Mechanism+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA end resection: Mechanism and control.</a> Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).</li>
<li>Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+molecular+mechanisms+of+recombinational+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410(2015).</li>
<li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRIMPOL+ready%2C+set%2C+reprime%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li>
<li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REV1-Pol%CE%B6+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR%3A+An+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATR: An essential regulator of genome integrity.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li>
<li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCNE1+copy+number+is+a+biomarker+for+response+to+combination+WEE1-ATR+inhibition+in+ovarian+and+endometrial+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports.+Medicine%22%5BJournal%5D)">CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models.</a> Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394(2021).</li>
<li>Konstantinopoulos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Replication+stress+biomarker+is+associated+with+response+to+gemcitabine+versus+combined+gemcitabine+and+ATR+inhibitor+therapy+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer.</a> Nature Communications. 12, 5574(2021).</li>
<li>Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+but+concerted+roles+of+ATR%2C+DNA-PK%2C+and+Chk1+in+countering+replication+stress+during+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase.</a> Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).</li>
<li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li>
<li>da Costa, A. A. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+replication+stress+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting replication stress in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).</li>
<li>Chen, R., Wold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+protein+A%3A+Single-stranded+DNA%27s+first+responder%3A+Dynamic+DNA-interactions+allow+replication+protein+A+to+direct+single-strand+DNA+intermediates+into+different+pathways+for+synthesis+or+repair%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair.</a> BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).</li>
<li>Bhat, K. P., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPA+and+RAD51%3A+Fork+reversal%2C+fork+protection%2C+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).</li>
<li>Maréchal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPA-coated+single-stranded+DNA+as+a+platform+for+post-translational+modifications+in+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response.</a> Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).</li>
</ol>

Jak wspomniano w protokole, cenne jest uwzględnienie kilku eksperymentalnych kontroli kontrolnych, aby upewnić się, że test działa. Należą do nich próbka bez IdU, a także próbka bez przeciwciał pierwotnych. Obie kontrole ujemne powinny dać komórki, które są barwione przez DAPI, ale nie zawierają sygnału IdU.
W oparciu o warunki eksperymentalne i zastosowane linie komórkowe, mogą być potrzebne różne rozcieńczenia przeciwciał w celu uzyskania najlepszego sygnału fluorescencyjnego. Zbyt duża iloś...

Genomowe DNA jest często narażone na wielokrotne ataki z różnych endogennych i egzogennych źródeł1. Częstość uszkodzeń endogennych bezpośrednio koreluje z poziomami produktów ubocznych przemiany materii, takich jak reaktywne formy tlenu lub aldehydy, które są z natury wyższe w wielu typach nowotworów, w tym w raku jajnika2,3. Konieczne jest, aby uszkodzenia DNA zostały skutecznie rozwiązane; W przeciwnym razie może sprzyjać zmianom genotoksycznym, a w konsekwencji mutagenezie. Zdolność komórek do naprawy zmian genotoksycznych zależy od funkcjonalności bezbłędnych szlaków naprawy DNA i skutecznej regulacji progresji cyklu komórkowego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Warto zauważyć, że wiele nowotworów jajnika ma funkcjonalnie inaktywujące mutacje w p53, a zatem mają wadliwy punkt kontrolny G1/S, co prowadzi komórki do inicjacji replikacji DNA pomimo obecności nienaprawionych zmian genomowych4,5. Stopień uszkodzenia DNA w raku jajnika jest dodatkowo spotęgowany przez obserwację, że ponad 50% surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości (HGSOC) ma defekty rekombinacji homologicznej za pośrednictwem BRCA1 i BRCA2, bezbłędnego szlaku naprawy DNA, a około 20% ma amplifikację w genie CCNE1, który przedwcześnie wpycha komórki G1 do fazy S6. Razem wysoka częstotliwość endogennych uszkodzeń DNA, wadliwe punkty kontrolne i nieprawidłowo działające szlaki naprawcze wykładniczo zwiększają akumulację zmian genomowych w raku jajnika. Zmiany te mogą stanowić przeszkodę w postępie krytycznych procesów komórkowych, takich jak replikacja i transkrypcja DNA. Jak omówiono poniżej, takie przeszkody katalizują wytwarzanie jednoniciowego DNA (ssDNA) w komórkach.
Podwójna helisa DNA jest kluczowa dla ochrony genomu przed wieloma procesami mutaginnymi, takimi jak spontaniczne depurination i depryryminacja, aktywność deaminaz cytozynowych i oksydacyjne uszkodzenia DNA1,7. W przeciwieństwie do tego, ssDNA jest bardzo podatne na te zdarzenia mutacyjne. Wiele procesów zachodzących w komórkach może prowadzić do powstania ssDNA (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). Należą do nich:
(i) Zatrzymanie maszynerii replikacji DNA: Prowadzi to do rozłączenia helikazy DNA i polimerazy, pozostawiając odcinki ssDNA8,9.
(ii) Zatrzymanie maszynerii transkrypcyjnej: Uporczywe zatrzymanie polimerazy RNA prowadzi do generowania trójniciowych hybrydowych struktur DNA/RNA zwanych R-loopami. Tworzenie pętli R odsłania przemieszczone, nietranskrybowane DNA jako pojedynczą nić10.
(iii) End-resection DNA: Inicjacja naprawy ukierunkowanej na homologię wymaga wytworzenia 3' ssDNA, aby katalizować poszukiwanie sekwencji homologicznej11.
(iv) D-loop: Inwazja nici podczas rekombinacji homologicznej może spowodować przemieszczenie nici komplementarnej bez matrycy, co skutkuje ssDNA12.
(v) Przerwy sprzężone z replikacją: Podczas replikacji DNA, synteza opóźnionych nici odbywa się w sposób nieciągły, w wyniku czego najpierw generowane są fragmenty Okazaki, a następnie ligowane. Opóźnienie lub defekt w przetwarzaniu fragmentów Okazaki może również skutkować powstawaniem ssDNA. Wreszcie, jeśli widełki replikacyjne na nici wiodącej napotkają zmianę powodującą zahamowanie, polimerazę DNA i prymazę, PRIMPOL może ponownie zagruntować syntezę w dalszej części, pozostawiając lukę w ssDNA po13,14.
Najwyraźniej większość tych zdarzeń ma miejsce, gdy maszyneria replikacji DNA napotyka uszkodzenia genomowe lub podczas naprawy sprzężonej z replikacją, co sugeruje, że większe uszkodzenia DNA prowadzą do zwiększenia poziomu ssDNA. Ponieważ wiele z tych zdarzeń jest związanych z replikacją, tworzenie ssDNA jest uważane za marker "stresu replikacyjnego" w komórkach15,16.
Tutaj opisujemy test, który może być użyty do wiarygodnego ilościowego określenia ssDNA w komórkach. Prostota, odtwarzalność i korzyści kosztowe tego podejścia sprawiają, że można je wykorzystać do oceny odpowiedzi replikacyjno-stresowej w komórkach. Nowe badania wykazały, że poziom ssDNA może być również predyktorem odpowiedzi na chemioterapię, taką jak inhibitory enzymów PARP1/2, ATR i kinaza Wee117,18,19,20,21. Inhibitory te są stosowane w schemacie leczenia kilku HGSOCs22. Dlatego test ten może być również przydatnym narzędziem do przewidywania odpowiedzi chemioterapeutycznych w komórkach raka jajnika.

<table><tbody><tr><td>3% Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Fisher Scientific NC0179595</td><td></td><td>10 g sacharozy + 100 ml 10X PBS + woda, aby uzyskać objętość do 925 ml. Dodaj 75 ml 40% PFA bez metanolu, wymieszaj i przygotuj porcje 50 ml przed przechowywaniem Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza; C</td></tr><tr><td>5-jodo-2'-deoksyurydyna (IdU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I7125-5G</td><td>MW = 354,10 g/mol. Dla zapasu 10 mM: rozpuścić 3,541 mg IdU w 1 ml 1 N ciekłym amoniaku Przechowywanie: Przechowywane w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>Przechowywanie: Przechowywać w 4 stopniach; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32766</td><td>Światłoczułe - przechowywać w ciemności Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>Wytwarzane przez dodanie określonej masy do objętości PBS Przechowywanie: Przechowywać w 4 stopniach; C</td></tr><tr><td>Okrągłe szkło osłonowe&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NIS GA3&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td>77010604</tr><tr><td>Pożywka wzrostowa OVCAR3</td><td>ATCC</td><td>HTB-161</td><td>: RPMI uzupełniona L-glutaminą, 0,01 mg/ml insuliny bydlęcej; płodowa surowica bydlęca do końcowego stężenia 20% i 1X Pen Strep Przechowywanie: Zamrażanie Pożywki: pożywka wzrostowa + 5% DMSO i przechowywane w temperaturze -80 & stopni; C</td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4832-50ML</td><td>Przechowywanie: Przechowywać w 4 stopniach; C</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Anti Blaknięcie Mountant z DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36962</td><td>Przechowywanie: Przechowywać w 4 stopniach; C</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0,25%</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td>Przechowywanie: Przechowywać w 4 stopniach; C</td></tr><tr><td>Woda, sterylnie filtrowana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W3500-6X500ML</td><td>Przechowywanie: Przechowywać w 4 stopniach; Z</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja stresu replikacyjnego w komórkach raka jajnika za pomocą immunofluorescencji jednoniciowego dna

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Stres związany z replikacją jest cechą charakterystyczną wielu nowotworów jajnika. Stres replikacyjny może pochodzić z wielu źródeł, w tym pęknięć dwuniciowych, konfliktów transkrypcji-replikacji lub amplifikowanych onkogenów, co nieuchronnie prowadzi do powstania jednoniciowego DNA (ssDNA). Kwantyfikacja ssDNA stanowi zatem okazję do oceny poziomu stresu replikacyjnego w różnych typach komórek i w różnych warunkach lub zabiegach uszkadzających DNA. Pojawiające się dowody sugerują również, że ssDNA może być predyktorem odpowiedzi na leki chemioterapeutyczne, które mają na celu naprawę DNA. W tym miejscu opisujemy szczegółową metodologię opartą na immunofluorescencji do ilościowego oznaczania ssDNA. Metodologia ta polega na znakowaniu genomu analogiem tymidyny, a następnie wykrywaniu analogu na chromatynie w oparciu o przeciwciała w warunkach niedenaturujących. Odcinki ssDNA można uwidocznić jako ogniska pod mikroskopem fluorescencyjnym. Liczba i intensywność ognisk bezpośrednio korelują z poziomem ssDNA obecnego w jądrze. Opisujemy również zautomatyzowany potok do ilościowego określania sygnału ssDNA. Metoda jest szybka i powtarzalna. Co więcej, prostota tej metodologii sprawia, że jest ona podatna na zastosowania o wysokiej przepustowości, takie jak badania przesiewowe leków i genetyki.

Reprezentatywne obrazy oraz kwantyfikacja ognisk IdU w jądrach pochodzących z komórek nieleczonych oraz komórek traktowanych 0,5 mM hydroksymocznikiem przez 24 h zostały przedstawione na Ryc. 4. Oba rodzaje jąder są barwione i możliwe do zidentyfikowania w kanale DAPI. Analiza tych obrazów polega na określeniu liczby ognisk w każdym jądrze. Liczba ognisk jest proporcjonalna do stopnia stresu replikacyjnego.
<img alt="Sche...

Tutaj opisujemy metodę opartą na immunofluorescencji, która pozwala na ilościowe określenie poziomów jednoniciowego DNA w komórkach. Ta skuteczna i powtarzalna metoda może być wykorzystana do badania stresu replikacyjnego, powszechnej cechy w kilku nowotworach jajnika. Dodatkowo test ten jest kompatybilny z automatycznym potokiem analizy, co dodatkowo zwiększa jego wydajność.

Kwantyfikacja stresu replikacyjnego w komórkach raka jajnika za pomocą immunofluorescencji jednoniciowego DNA

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Nasz protokół przedstawia wysoce wydajną i łatwą do odtworzenia metodę ilościowego oznaczania jednoniciowego DNA, który jest markerem stresu replikacyjnego w różnych liniach komórkowych. Dodatkowo jego prostota pozwala na tworzenie aplikacji i ekranów o wysokiej przepustowości. W szczególności metoda ta pozwala na szybkie ilościowe określenie stresu replikacyjnego, który jest cechą charakterystyczną wielu nowotworów jajnika.Jest również podatny na oprogramowanie do automatycznej analizy hosta, co jeszcze bardziej zwiększa wydajność. Jednoniciowe DNA jest obecnie aktywnie rozważane jako biomarker odpowiedzi na chemioterapię ukierunkowaną na szlaki naprawy DNA. W związku z tym ta metoda ma duże zastosowanie w tym scenariuszu.Stres replikacyjny występuje poza kontekstem raka jajnika lub nowotworów z niedoborem BRCA1, BRCA2. W związku z tym metoda ta może być stosowana do szerokiej gamy innych typów komórek lub kontekstów chorobowych. Na początek wykonaj szkiełka nakrywkowe pokryte polilizyną, dodając autoklawowane szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 milimetrów i roztwór polilizyny do 50-mililitrowej stożkowej rurki i umieść na kołysce na 15 minut.Odessać roztwór na kapturze do hodowli tkankowych. Umyj szkiełka nakrywkowe, dodając sterylną wodę i umieść rurkę zawierającą szkiełka nakrywki z powrotem na wahaczu na pięć minut. Po trzykrotnym umyciu szkiełek nakrywkowych należy odessać wodę z rurki i rozprowadzić szkiełka nakrywkowe na sterylnym naczyniu.Odessać pozostałą wodę i pozostawić ją do wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowej przez godzinę lub do momentu, gdy nie pozostaną żadne kropelki wody. Po wyschnięciu uszczelnij naczynie Parafilmem i umieść je w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Aby zapobiec odklejaniu się komórek od szkiełek nakrywkowych podczas etapu wstępnej ekstrakcji, należy umieścić po jednym szkiełku nakrywkowym pokrytym polilizyną w każdym dołku płytki 24-dołkowej.Gdy komórki OVCAR3 osiągną zbieżność od 70 do 80%, odessać pożywkę z płytki i umyć komórki 5 do 7 mililitrami PBS. Odessać PBS z płytki. Po zassaniu PBS dodaj 1 mililitr 0,25% trypsyny i umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 8 do 10 minut lub do momentu, gdy komórki oderwą się od dna płytki.Zbierz komórki z 5 do 10 mililitrami pożywki i dodaj zawiesinę komórek do stożkowej probówki. Policz komórki ręcznie za pomocą hemocytometru, stosując standardowe procedury. Następnie rozcieńczyć zawiesinę komórkową i uzyskać liczbę, która da od 70 do 80% zbiegu po trzech populacjach.Dodać 1 mililitr zawiesiny komórek na polilizynowych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych w dołkach 24-dołkowej płytki i hodować komórki w pożywce hodowlanej w standardowych warunkach. Po podwojeniu jednej populacji odessać istniejące pożywki z płytki i pulsować komórki 10 mikromolowymi IdU w celu uzyskania dwóch kolejnych podwojeń populacji. Aby zebrać komórki, zastąp podłoże lodowatym 0,5% PBSTx na lodzie przez pięć minut.W celu utrwalenia komórek należy odessać PBSTx i inkubować komórki przez 15 minut z 3% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej. Po trzech do czterech praniach z PBS utrzymuj stałe ogniwa w temperaturze 4 stopni Celsjusza do dalszego użycia. Po utrwaleniu przepuszczaj komórki za pomocą 0,5% PBSTx na lodzie przez pięć minut, upewniając się, że pokryłeś całe szkiełko nakrywkowe.Po trzykrotnym lub czterokrotnym umyciu komórek 1 mililitrem 0,2% PBST w temperaturze pokojowej, należy zassać PBST i zablokować próbki za pomocą 5% BSA wykonanego w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Do barwienia immunologicznego przygotuj jednolitą komorę, kładąc mokry ręcznik papierowy na płaskim dnie Tupperware. Przykryj pokrywę płytki 24-dołkowej preparatem Parafilm.Umieść go w nawilżonej komorze i połóż szkiełka nakrywkowe na pokrywie talerza. Dodać 60 mikrolitrów rozcieńczonego pierwszorzędowego przeciwciała mysiego anty-BrdU na wierzch szkiełka nakrywkowego. Alternatywnie, w celu zmniejszenia wysychania przeciwciała i użycia mniejszej objętości, należy umieścić kroplę rozcieńczonego przeciwciała na Parafilmie i odwrócić na nią szkiełko nakrywkowe.Następnie inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji odessać przeciwciało pierwszorzędowe. Umieść szkiełka z powrotem na płytce 24-dołkowej i umyj je czterokrotnie 0,2% PBST.Dodać rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe na szkiełku nakrywkowym, jak pokazano wcześniej, i inkubować przez godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej. Oznacz szkiełko mikroskopowe i zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełkach za pomocą medium montażowego DAPI. Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, jeśli podłoże montażowe wymaga utwardzenia lub utwardzenia.Jądra pochodzące z komórek nietraktowanych i traktowanych 0,5 milimolowym hydroksymocznikiem były barwione i identyfikowalne w kanałach DAPI i IdU. Analiza tych obrazów polega na ilościowym określeniu liczby ognisk w każdym jądrze. Liczba ognisk jest proporcjonalna do stopnia naprężenia replikacyjnego.Ważne jest, aby wziąć pod uwagę czas podwojenia wybranej linii komórkowej, ponieważ czas pulsacji IdU może się różnić w dłuższych lub krótszych okresach podwajania. Alternatywnie możemy sondować komórki pod kątem białka replikacyjnego A, aby potwierdzić wyniki i ocenić różne reakcje na stres replikacyjny w komórkach. Technika ta jest stosowana w przypadku wielu linii komórkowych w połączeniu z dowolnym czynnikiem indukującym uszkodzenia DNA w celu zbadania akumulacji pojedynczego szczepu DNA.Dzięki temu ta metoda jest szeroko dostępna i możliwa do zastosowania.

quantifying-replication-stress-ovarian-cancer-cells-using-single

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisana jest ilościowa metoda analizy czasu replikacji chromosomów. Metoda wykorzystuje inkorporację BrdU w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu oceny czasu replikacji chromosomów ssaków. Technika ta pozwala na bezpośrednie porównanie przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Film demonstruje oparte na immunofluorescencji podejście do ilościowego określania stresu replikacyjnego w komórkach nowotworowych. Komórki poddane działaniu hydroksymocznika wytwarzają jednoniciowy DNA, wykrywany za pomocą immunofluorescencji. Liczba ognisk zielonej fluorescencji wskazuje na poziom stresu replikacyjnego w komórkach nowotworowych.

Metoda oparta na immunofluorescencji do ilościowego określania stresu replikacyjnego w komórkach nowotworowych

Prezentujemy swobodnie dostępny przepływ pracy stworzony do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych w określonych przedziałach komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Ten przyjazny dla użytkownika przepływ pracy został zaprojektowany na oprogramowaniu open source Icy i wykorzystuje również funkcje ImageJ. Potok jest przystępny cenowo bez wiedzy z zakresu analizy obrazu.

Substructure Analyzer: Przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej

Reakcja na uszkodzenia DNA wywołana promieniowaniem, aktywowana przez wiązkę neutronów używaną w terapii wychwytywania neutronów borowych (BNCT), nie została w pełni ustalona. Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku do wykrywania ognisk indukowanych promieniowaniem (RIF) białek naprawczych poprzez barwienie immunofluorescencyjne w liniach komórkowych ludzkiego raka jelita grubego po napromieniowaniu wiązką zmieszaną z neutronami.

Obrazowanie immunofluorescencyjne uszkodzeń DNA i ognisk naprawczych w ludzkich komórkach raka jelita grubego

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

W obecnym protokole pokazujemy, jak wizualizować dwuniciową resekcję końca DNA podczas fazy S/G2 cyklu komórkowego przy użyciu metody opartej na immunofluorescencji.

Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

Obecny protokół opisuje metody oceny białek naprawiających uszkodzenia DNA w organoidach raka jajnika pochodzących od pacjentek. Obejmuje to kompleksowe metody galwanizacji i barwienia, a także szczegółowe, obiektywne procedury kwantyfikacji.

Wizualizacja białek naprawiających uszkodzenia DNA w organoidach raka jajnika pochodzących od pacjentki za pomocą testów immunofluorescencyjnych

Utrzymanie integralności genomu oocytu jest niezbędne do zapewnienia genetycznej wierności powstałego zarodka. W tym miejscu przedstawiamy dokładny protokół wykrywania pęknięć dwuniciowych DNA w żeńskich komórkach rozrodczych ssaków.

Wykrywanie dwuniciowych pęknięć DNA w oocytach myszy

Poniższy protokół przedstawia wykrywanie jednoniciowych ognisk DNA w fazie G1 cyklu komórkowego za pomocą synchronizacji cyklu komórkowego, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego RPA2.

Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego

Poznaj metodę immunofluorescencji do kwantyfikacji jednoniciowego DNA jako markera stresu replikacyjnego w komórkach raka jajnika. Technika ta umożliwia szybkie, wysokoprzepustowe badania z zastosowaniem automatycznej analizy.

Kwantyfikacja stresu replikacyjnego w komórkach raka jajnika za pomocą immunofluorescencji jednoniciowego DNA

Przeglądaj więcej filmów