Pomiar lokalnych naprężeń tkanek w ścięgnach za pomocą cyfrowej korelacji obrazu o otwartym kodzie źródłowym

Protokół ten umożliwia pomiary miejscowych naprężeń tkanek w obrębie ścięgna podczas obciążenia. Przydatne jest zrozumienie, jak ścięgna zachowują się mechanicznie i dostosowują się do środowiska obciążenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że zastosowane oprogramowanie jest publicznie dostępne online i dostarcza informacji zwrotnych na temat dokładności pomiaru, nawet jeśli prawdziwe szczepy tkanek są nieznane.

Pomiar lokalnych naprężeń tkanek w ścięgnie jest cenny, aby zrozumieć, w jaki sposób komórki przebudowują tkankę podczas zwyrodnienia i naprawy ścięgien. Tę procedurę zademonstrują Stanton Godshall, student studiów licencjackich, i Krishna Pedaprolu, doktorant w moim laboratorium. Po wybarwieniu pobranych ścięgien Achillesa w DTAF, przenieś tkankę z roztworu DTAF do roztworu DRAQ5 i inkubuj tkanki w ciemnym miejscu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Umieść ścięgno w uchwytach urządzenia do obciążania rozciągającego. Przed zamontowaniem uchwytów w urządzeniu załadowczym należy użyć suwmiarki cyfrowej, aby zmierzyć odległość między mocowaniem kości piętowej a przeciwległym uchwytem. Zamontuj uchwyty w urządzeniu ładującym zawierającym PBS, aby utrzymać nawodnienie tkanek.

Wyrównaj ścięgno tak dobrze, jak to możliwe, z osią x lub y obrazów mikroskopowych, tak aby wyjścia odkształcenia X i Y algorytmu odpowiadały osi ścięgna. Wstępnie obciążyć ścięgno jednym gramem naprężenia. W razie potrzeby fotowybielaj zestaw czterech linii oddalonych od siebie o 80 mikronów w środkowej części tkanki i powtórz proces na lewej i prawej krawędzi w pobliżu uchwytów.

Zmiana odległości między liniami w każdym regionie tkanki jest wtórnym pomiarem lokalnych szczepów tkanek, który można wykorzystać do walidacji danych. Następnie, za pomocą mikroskopu konfokalnego, uzyskaj wolumetryczne obrazy fluorescencji DTAF i DRAQ5 przy jednym gramie obciążenia wstępnego. Wykonaj rampę naprężenia do 2% naprężenia z prędkością 0,5% na sekundę.

Należy pamiętać, że szybkość odkształcania i wielkość odkształcenia przyrostowego można regulować. Po odciążeniu tkanki przez 10 minut, wykonaj kolejny obraz wolumetryczny tkanki po deformacji. Powtórz ten proces dla tylu przyrostów odkształcenia, ile jest pożądane.

Aby utworzyć cyfrowo przekształcone obrazy, pobierz kod digital_strain. m z GitHub. Po pobraniu otwórz i uruchom kod.

Po wyświetleniu monitu wprowadź żądane wartości maksymalnego zastosowanego odkształcenia, zastosowanego przyrostu odkształcenia i współczynnika Poissona przed naciśnięciem przycisku OK. Następnie, po ponownym wyświetleniu monitu, wybierz niezdeformowany obraz referencyjny. Dla każdego przyrostu odkształcenia wyświetlana jest nakładka obrazu referencyjnego i przekształconego obrazu. Cyfrowo przekształcone obrazy zostaną zapisane w katalogu o nazwie cyfrowo przekształcone X procent odkształcenia, gdzie X jest przyrostem odkształcenia.

Otwórz skrypt o wyświetlanej nazwie i kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć analizę obrazu. Po wyświetleniu monitu zmień wartości rozszerzonej korelacji obrazu cyfrowego Lagrange'a lub parametrów ALDIC zgodnie z potrzebami. Po wyświetleniu monitu zaznacz pole wyboru tak, aby automatycznie zapisać wartość średnią, odchylenie standardowe i mapę 2D dla żądanej kolekcji zmiennych.

Po wyświetleniu monitu wybierz żądane zmienne, takie jak odkształcenie X, odkształcenie Y, odkształcenie ścinające, uszkodzone regiony i tak dalej, a następnie naciśnij OK. Postępując zgodnie z następnym monitem, wybierz folder, który zawiera projekcje Z o maksymalnej intensywności o zmienionej nazwie. Oprogramowanie automatycznie wykonuje przyrostowy ALDIC w celu określenia pól odkształceń zdeformowanych obrazów. Po wyświetleniu monitu kliknij lewym przyciskiem myszy, aby utworzyć czteropunktowy wielokąt w celu zdefiniowania obszaru zainteresowania do pomiaru odkształceń.

Folder wyników śledzenia jądrowego, którego nazwę można zmienić, dostosowując linie 555 i 556, przechowuje wszystkie określone wcześniej wykresy. Folder ten zawiera również arkusz kalkulacyjny o nazwie results, w którym przechowywane są wszystkie określone wcześniej średnie i odchylenia standardowe. Podczas walidacji przy użyciu cyfrowo odkształconych obrazów, algorytm ALDIC konsekwentnie zaniżał średnie odkształcenie X, a wielkość błędu rosła wraz ze wzrostem zastosowanego odkształcenia.

Szczep Y był również w większości niedoceniany. Jednak we wszystkich przypadkach wielkość błędu odkształcenia była bardzo mała. Odchylenie standardowe obliczonego odkształcenia X i Y, choć o niskiej wielkości, wzrastało wraz ze wzrostem zastosowanego odkształcenia.

Analiza złych regionów wykazała, że liczba uszkodzonych regionów z nieprawidłowymi obliczeniami odkształcenia na cyfrowo przekształconych obrazach analizowanych przy użyciu metody kumulatywnej rosła konsekwentnie po 6% zastosowanym odkształceniu, podczas gdy ilość przyrostowa pozostała na poziomie 1%W jednej z czterech próbek, która została potraktowana jako wartość odstająca, prawie połowa obrazu została zidentyfikowana jako zła przy maksymalnym przyrostu odkształcenia. Szczepy X obliczone przez ALDIC były większe niż te wyznaczone na podstawie PBL, różnica mieściła się w granicach 0,005, co jest podobne do odchylenia standardowego dla danych PBL uśrednionych dla wszystkich próbek. Określenie wielkości i rozkładów przestrzennych lokalnych odkształceń w ścięgnach pod wpływem obciążenia rozciągającego wykazało, że we wszystkich próbkach odkształcenie X konsekwentnie pozostawało poniżej zastosowanych odkształceń.

Średnie odkształcenie w kierunku Y wynosiło w przybliżeniu zero dla wszystkich przyrostów, ale odchylenie standardowe było wysokie. Średnie odkształcenie ścinające rosło równomiernie we wszystkich przyrostach odkształcenia. Najważniejszą kwestią, o której należy pamiętać, jest zapisanie obrazów przed zastosowaniem większego obciążenia.

Obrazy, jeśli nie zostaną zapisane, zostaną utracone i nie będzie można ich odzyskać. Chociaż technika ta została specjalnie zwalidowana do pomiaru naprężeń tkanek w obrębie ścięgien, może dostarczyć informacji na temat biologii mechanicznej i mechaniki wielu innych tkanek zwierzęcych i ludzkich.