Wytwarzanie i utrzymywanie indukowanych przez naczelnych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z moczu

IPSC naczelnych są przydatne, ale często trudne do uzyskania ze względu na kwestie etyczne i techniczne. Protokół ten zapewnia najbardziej dostępną ścieżkę do generowania i utrzymywania IPSC naczelnych. Wykorzystanie komórek moczowych jako głównego źródła IPSC ma dużą zaletę, ponieważ można je uzyskać w całkowicie nieinwazyjny sposób, bez żadnych specjalnych technik.

Procedurę zademonstruje Jessica Radmer, doktorantka z Wolfgang M.S.Laboratory. Na początek odwiruj probówkę zawierającą mocz o sile 400 g przez 10 minut. Następnie ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając około jednego mililitra w probówce i ponownie zawiesić w niej osad.

Przemyć komórki, dodając 10 mililitrów buforu do przemywania moczu zawierającego amfoterycynę i ostrożnie wymieszać zawiesinę za pomocą pipety serologicznej. Po odwirowaniu ostrożnie zassać supernatant, pozostawiając w probówce mniej niż 0,2 mililitra. Zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze pierwotnego podłoża moczu zawierającego amfoterycynę na 50 mililitrów wstępnie przetworzonego moczu.

Usunąć żelatynę i dodać jeden mililitr zawiesiny do studzienki z 12-dołkową płytką pokrytą żelatyną. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Aby przygotować 12-dołkową płytkę pokrytą matrycą membrany podstawnej, dodaj 500 mikrolitrów matrycy membrany podstawnej na studzienkę.

Przesuń płytkę, aby rozprowadzić płyn i inkubować go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji zastąp matrycę błony podstawnej 900 mikrolitrami pożywki REMC i przechowuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza do czasu użycia. Oblicz objętość wirusów Sendai potrzebną do wielokrotności infekcji wynoszącej pięć, korzystając z równania.

Szybko rozmrozić elementy zestawu do przeprogramowania Sendai w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj pożywkę REMC w sumie 100 mikrolitrów do probówki przed dodaniem obliczonej objętości wirusów Sendai i wymieszaniem. Po dysocjacji komórek moczowych zgodnie z opisem w manuskrypcie, policz komórki za pomocą licznika komórek i przenieś żądaną liczbę komórek do probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Otrzymać osad przez odwirowanie i ponownie zawiesić go w 100 mikrolitrach przygotowanej mieszaniny wirusów Sendai. Inkubować probówkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu zakażenia zawiesiną. Po inkubacji dodać REMC do łącznej ilości jednego mililitra przed wysianiem zawiesiny komórkowej na 12-dołkowej płytce pokrytej matrycą błony podstawnej.

Po transdukcji należy zmieniać pożywkę co drugi dzień, aż do rozwoju indukowanych kolonii pluripotencjalnych komórek macierzystych lub IPSC z przełączeniem na pożywkę generacji PSC w piątym dniu. Gdy kolonie IPSC osiągną wystarczająco duże rozmiary, aby można było przejść przez grudki, odessać pożywkę z hodowanych komórek i ostrożnie umyć komórki 500 mikrolitrami DPBS. Po usunięciu DPBS dodaj 500 mikrolitrów 0,5 milimolowego EDTA do studzienki i inkubuj przez dwie do pięciu minut.

Uważnie obserwuj komórki pod mikroskopem, aż kolonie zaczną się odłączać. Kiedy krawędzie kolonii zaczną się odklejać, a szczeliny między komórkami staną się widoczne, usuń EDTA i ostrożnie dodaj 500 mikrolitrów DPBS. Zassać DPBS i przepłukać studzienkę 500 mikrolitrami pożywki hodowlanej PSC za pomocą pipety P-1000.

Pipetuj w górę iw dół, aby rozproszyć kolonie w kępy o odpowiedniej wielkości. W zależności od konfluencji, pożądanej gęstości wysianych komórek i preferencji klonalnej IPSC, przenieś od 1/10 do 1/50 zawiesiny grudek komórkowych do nowych studzienek. Delikatnie przesuń talerz kilka razy do przodu i do tyłu, aby równomiernie rozprowadzić grudki w studzience.

Inkubuj płytkę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby grudki mogły się przymocować. Zmieniaj podłoże co dwa do trzech dni, aż kolonie urosną wystarczająco duże, aby można było je pasować. Po izolacji można zobaczyć komórki płaskonabłonkowe i różne mniejsze okrągłe komórki, które zostały wydalone z moczem.

Można zobaczyć pierwsze przylegające komórki proliferujące, które wyrastają w duże kolonie, które można pasażować. Można zaobserwować dwa różne typy komórek, z których jeden ma fenotyp podobny do nabłonka, a drugi wykazuje fenotyp bardziej mezenchymalny o wydłużonym kształcie. Po pierwszym pasażu komórki moczu rosną jako monowarstwa.

Podczas generowania IPSC można zaobserwować pewne przylegające komórki, które zaczynają wykazywać zmiany morfologiczne, co wskazuje na przeprogramowanie komórek. Co więcej, komórki, które tworzą kolonie, wykazują typową morfologię embrionalnych komórek macierzystych. Wszystkie wygenerowane IPSC mają typową morfologię kolonii przypominającą embrionalne komórki macierzyste, charakteryzującą się ciasno upakowanymi komórkami o wyraźnie zaznaczonych krawędziach.

Immunocytochemię wykorzystano do zbadania ekspresji markerów związanych z pluripotencją w gorylach IPSC. Ponadto analiza cytometrii przepływowej wykazała, że analizowane IPSC orangutanów są dodatnie dla TRA-1-60. Co więcej, goryle IPSC są w stanie różnicować się w linie endodermy, mezodermy i ektodermy.

Zwiększona liczba zróżnicowanych komórek oraz utrata integralności i jednorodności granic wskazują na słabą jakość IPSC. Natomiast wyraźne granice, szczelne upakowanie komórkowe i wydatne jąderka oznaczają wysokiej jakości IPSC. Ze względu na zmienność koronalną należy zoptymalizować warunki specyficzne dla klonu, takie jak współczynnik podziału, czas pasażu i wielkość kępy, aby utrzymać zdrowy wzrost IPSC naczelnych.

W ramach kontroli jakości ustalonych IPSC, oprócz sprawdzania ekspresji genów markerowych, można zweryfikować prepotencję poprzez bezpośrednią lub pośrednią indukcję różnicowania, taką jak różnicowanie EV in vitro.