Name: Wytwarzanie i utrzymywanie indukowanych przez naczelnych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z moczu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj protokół generowania i utrzymywania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z moczu u naczelnych. Ta nieinwazyjna metoda wykorzystuje wirusy Sendai do reprogramowania komórek i umożliwia badania w medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez DFG EN 1093/5-1 (numer projektu 458247426). M.O. był wspierany przez JSPS Overseas Research Fellowship. Wszystkie figury zostały stworzone z BioRender.com. Cytometrię przepływową wykonano przy pomocy Core Facility Flow Cytometry w Centrum Biomedycznym w Monachium. Chcielibyśmy podziękować Makoto Shida i Tomoyo Muto z ASHBi, Uniwersytetu w Kioto, za wsparcie w zakresie filmowania.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Komórki iPS są cennymi typami komórek, ponieważ umożliwiają wytwarzanie niedostępnych w inny sposób typów komórek in vitro. Ponieważ materiały wyjściowe do przeprogramowania, na przykład fibroblasty, nie są łatwo dostępne dla wszystkich gatunków naczelnych, w niniejszej pracy przedstawiono protokół wytwarzania iPSC z komórek pochodzących z moczu. Komórki te można uzyskać w sposób nieinwazyjny, nawet z niesterylnych próbek moczu naczelnych, poprzez uzupełnienie pożywki hodowlanej antybiotykami o szerokim spektrum...

Porównania genomiczne naczelnych ludzkich i niebędących ludźmi (NHP) są kluczowe dla zrozumienia naszej historii ewolucyjnej i ewolucji cech specyficznych dla człowieka1. Ponadto porównania te pozwalają na wnioskowanie o funkcji poprzez identyfikację konserwatywnych sekwencji DNA2, np. w celu nadania priorytetu wariantom związanym z chorobą3. Porównania fenotypów molekularnych, takich jak poziomy ekspresji genów, mają kluczowe znaczenie dla lepszej interpretacji porównań genomowych i odkrycia, na przykład, komórkowych różnic fenotypowych. Co więcej, mają one - podobnie jak porównania na poziomie DNA - potencjał do wnioskowania o znaczeniu funkcjonalnym, a tym samym do lepszej interpretacji istotnych z medycznego punktu widzenia zmian u ludzi4. Włączenie kompleksowych molekularnych danych fenotypowych do tych badań porównawczych wymaga odpowiednich zasobów biologicznych (tj. komórek ortologicznych różnych gatunków). Jednak względy etyczne i praktyczne utrudniają lub uniemożliwiają dostęp do takich porównywalnych komórek, zwłaszcza w trakcie opracowywania. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pozwalają na generowanie takich niedostępnych typów komórek in vitro5,6, są eksperymentalnie dostępne i były używane do porównań z naczelnymi6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Aby wygenerować iPSC, należy zdobyć podstawowe komórki, które mają zostać przeprogramowane. Komórki wyizolowane z moczu mają tę zaletę, że można je nieinwazyjnie pobrać od naczelnych i że można je łatwo przeprogramować, prawdopodobnie ze względu na ich profile molekularne podobne do komórek macierzystych15. Warunki hodowli niezbędne do utrzymania iPSC naczelnych są równie ważne jak przeprogramowanie; Klasycznie rzecz biorąc, hodowla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych wymagała niezdefiniowanej, opartej na surowicy pożywki i kohodowli mysich fibroblastów embrionalnych - tak zwanych komórek żywicielskich - które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i rusztowania dla embrionalnych komórek macierzystych (ESC)16. Od czasu opracowania chemicznie zdefiniowanych i wolnych od karmy systemów hodowli17,18, obecnie dostępne na rynku są różne opcje pożywek i matryc hodowlanych iPSC. Jednak większość z tych warunków hodowli została zoptymalizowana pod kątem ludzkich ESC i iPSC, a zatem może działać gorzej w hodowli NHP iPSC. W tym protokole wideo podajemy instrukcje dotyczące generowania i utrzymywania ludzkich i NHP iPSC pochodzących z hodowli komórek moczowych.
Od czasu pierwszego doniesienia o generowaniu iPSC przez wymuszoną ekspresję zdefiniowanych czynników w fibroblastach w 2006 roku, metoda ta została zastosowana do wielu różnych typów komórek różnego pochodzenia19,20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31,32. Wśród nich w sposób całkowicie nieinwazyjny można pozyskać tylko komórki pochodzące z moczu. Opierając się na wcześniej opisanym protokole przez Zhou et al.33, można izolować i namnażać komórki z moczu naczelnych nawet z niesterylnych próbek, uzupełniając antybiotyki o szerokim spektrum działania15. Warto zauważyć, że komórki pochodzące z moczu pobrane za pomocą tego protokołu wykazują wysoki potencjał do wytwarzania iPSC w krótszym czasie (kolonie stają się widoczne w ciągu 5-15 dni) niż konwencjonalne przeprogramowanie fibroblastów (20-30 dni, z naszego doświadczenia) i przy wystarczająco wysokim wskaźniku sukcesu. Te komórki pochodzące z moczu zostały sklasyfikowane jako mieszana populacja komórek podobnych do mezenchymalnych komórek macierzystych i komórek nabłonka pęcherza moczowego, co spowodowało wysoką wydajność przeprogramowania15.
Oprócz różnic w komórkach pierwotnych, metody przeprogramowania do generowania iPSC również różnią się w zależności od celu użycia. Konwencjonalne procedury przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych przeprowadzono poprzez nadekspresję czynników przeprogramowujących za pomocą wektorów retrowirusowych lub lentiwirusowych, co pozwoliło na integrację egzogennego DNA w genomie5,34,35. Aby utrzymać genomowo wygenerowane iPSC w stanie nienaruszonym, naukowcy opracowali szeroką gamę systemów nieintegracyjnych - wektor PiggyBac z akcyzą36,37, wektor epizodyczny38,39, nieintegrujące wektory wirusowe, takie jak Sendai virus40 i adenovirus41, transfekcja mRNA42, transfekcja białka43,44, oraz leczenie związkami chemicznymi45. Ze względu na wydajność i łatwość obsługi, w tym protokole stosowane są wektory przeprogramowania oparte na wirusie Sendai. Zakażenie komórek pierwotnych przeprowadza się w 1-godzinnej hodowli zawiesinowej komórek i wirusów przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 5 przed posiewem. Ten zmodyfikowany krok może zwiększyć prawdopodobieństwo kontaktu między powierzchniami komórek a wirusami, w porównaniu z konwencjonalną metodą, w której wirusy są dodawane bezpośrednio do przylegającej hodowli komórkowej, a tym samym dać więcej kolonii iPSC15.
Przenikanie ludzkich i NHP pluripotencjalnych komórek macierzystych może odbywać się poprzez pasaż kępowy i pasażowanie jednokomórkowe. Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) jest ekonomicznym środkiem chelatującym, który wiąże jony wapnia i magnezu, a tym samym zapobiega adhezyjnej aktywności kadheryny i integryny. EDTA jest również stosowany jako łagodny, selektywny odczynnik dysocjacyjny, ponieważ niezróżnicowane komórki odrywają się przed komórkami zróżnicowanymi z powodu różnych cząsteczek adhezyjnych. Całkowita dysocjacja indukuje masywną śmierć komórek iPSC naczelnych poprzez hiperaktywację miozyny za pośrednictwem hiperaktywacji miozyny za pośrednictwem Rho/Rho-bound coiled-coil zawierającej kinazę białkową (Rho / Rock). Dlatego uzupełnienie pożywki hodowlanej inhibitorem Rho/Rock jest niezbędne w eksperymentach, które wymagają pojedynczych komórek w zawiesinie46,47. W tym protokole zalecamy pasażowanie brył jako rutynową metodę pasażowania i zalecamy pasażowanie pojedynczych komórek tylko wtedy, gdy jest to konieczne, np. gdy wymagane jest zasiewanie określonej liczby komórek lub podczas podklonowania.

<table><tbody><tr><td>Accumax&trade; roztwór do odłączania komórek (Roztwór odłączający)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCR006</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B Roztwór</td><td>Merck</td><td>A2941-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało myszy anty-ludzkie TRA-1-60&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60064</td><td>Rozcieńczenie: 1/200</td></tr><tr><td>Przeciwciało sprzężone z PE anty-ludzkie TRA-1-60&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-122-965</td><td>Rozcieńczenie: 1/50</td></tr><tr><td>Bambanker&trade; (Medium do zamrażania komórek)</td><td>Nippon Genetics</td><td>BB01</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>Płytka wielodołkowa do hodowli komórkowych, 12-dołkowa CELLSTAR</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Countess&trade; II automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>CryoKing&reg; Probówki 1,5 mL z kodem kreskowym 2D (Cryotubes)</td><td>Sued-Laborbedarf</td><td>52 95-0213</td><td>Do zamrażania można używać różnych rodzajów krioprobówek. Probówki z kodami kreskowymi 2D mają tę zaletę, że informacje o próbce mogą być przechowywane w bazie danych z unikalnymi informacjami o probówkach.</td></tr><tr><td>CytoTune&handel; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (Wirus GFP Sendai)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16519</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune&trade;-iPS 2.0 Zestaw do przeprogramowania wirusa Sendai (Zestaw do przeprogramowania wirusa Sendai)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 4',6-diamidyno-2'-fenyloindolowy dichlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glukoza</td><td>TH. Geyer</td><td>L0102</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 w L-glutaminie</td><td>Fisher Scientific</td><td>15373541</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwciało wtórne, Alexa Fluor&trade; 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>Rozcieńczenie: 1/500</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor&trade; 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21207</td><td>Rozcieńczenie: 1/500</td></tr><tr><td>DPBS bez wapnia bez magnezu</td><td>TH. Geyer</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane poliklonalne przeciwciało królika EpCAM (22 HCLC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>710524</td><td>Rozcieńczenie: 1/500</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 15 ml stożkowe dno</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml stożkowe dno</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, Brazylia (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V10.8.2</td><td>FlowJo&nbsp;</td><td></td><td></td>663441</tr><tr><td>Żelatyna ze skóry wieprzowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex&handel; Matryca membrany podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu bez LDEV, z kwalifikacją hESC,</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&trade; Suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 Heracell&trade; 240i</td><td>Fisher Scientific</td><td>16416639</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus HeraSafe Szafa bezpieczeństwa</td><td>Kendro</td><td>51017905</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF, premium klasa</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-749</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>Fidżi</td><td>Wersja 2.9.0</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirowania PP, 1,5 ml</td><td>Nerbe Plus</td><td>04-212-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon eclipse TE2000-S</td><td>Nikon</td><td>TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-alfa-Fetoproteinowe</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB1368</td><td>Rozcieńczenie: 1/100</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-alfa-aktynowe mięśni gładkich</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB1420</td><td>Rozcieńczenie: 1/100</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-beta-III tubuliny</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB1195</td><td>Rozcieńczenie: 1/100</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; 1</td><td>STEMCELL Technolgies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4903S</td><td>Rozcieńczenie: 1/400</td></tr><tr><td>Normocure&trade; (Odczynnik przeciwdrobnoustrojowy)</td><td>Invivogen</td><td>ant-noc</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 Przeciwciało królika&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>2750S</td><td>Rozcieńczenie: 1/400</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10.000 U/ml) (PS)</td><td>Thermo Fisher Scientific 15140122</td><td></td><td>Mieszanka penicyliny-streptomycyny zawiera 100 U/ml penicyliny i 100 &mikro; g/ml Streptomycyny.</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki PDGF-AB</td><td>PeproTech</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa z chłodzeniem</td><td>SIGMA&nbsp;</td><td>4-16KS</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże nabłonkowe nabłonka nerek</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-030</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzrostu komórek nabłonka nerki</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-040</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 (L1D6A2) Mysi mAb # 4900</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4900S</td><td>Rozcieńczenie: 1/400</td></tr><tr><td>SSEA4 (MC813) MAb myszy</td><td>NEB</td><td>4755S</td><td>Rozcieńczenie: 1/500</td></tr><tr><td>StemFit&reg; Basic02</td><td>Nippon Genetics</td><td>3821.00</td><td>Produkcja tej pożywki została przerwana, zamiast tego należy użyć StemFit Basic04CT dla ludzkich linii komórkowych lub StemFit Basic03 dla naczelnych innych niż ludzie.</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&handel; Wybierz enzym (1x), bez czerwieni fenolowej (enzym dysocjacyjny)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna Precyzja GP 05</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632, sól dichlorowodorku (inhibitor skały)</td><td>Biozol</td><td>BYT-ORB153635</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> do rozcieńczania przeciwciał <td>Aby zapoznać się z kompozycją, patrz suplement tabela S1</td></tr><tr><td>Bufor blokujący</td><td></td><td></td><td>Skład patrz tabela uzupełniająca S1</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td> REMC <td>Skład patrz tabela uzupełniająca S1</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td> pierwotna moczu <td>Skład patrz tabela uzupełniająca S1</td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana PSC</td> Skład patrz tabela uzupełniająca S1 Pożywka <td></td><td></td> PSC <td>Skład patrz tabela uzupełniająca S1</td></tr><tr><td>Pożywka wytwarzająca PSC</td><td></td><td></td><td>Skład znajduje się w tabeli uzupełniającej S1</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> do przemywania moczu <td>W celu zapoznania się ze składem zob. tabela uzupełniająca S1</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i utrzymywanie indukowanych przez naczelnych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z moczu

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Międzygatunkowe podejście do badania pluripotencjalnych komórek macierzystych naczelnych i ich pochodnych jest kluczowe dla lepszego zrozumienia molekularnych i komórkowych mechanizmów choroby, rozwoju i ewolucji. Aby zwiększyć dostępność indukowanych przez naczelnych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), w artykule przedstawiono nieinwazyjną metodę generowania ludzkich i innych naczelnych z komórek pochodzących z moczu oraz ich utrzymania przy użyciu metody hodowli bez karmienia.
Próbka moczu może być pobrana z niesterylnego środowiska (np. klatki zwierzęcia) i potraktowana koktajlem antybiotykowym o szerokim spektrum działania podczas pierwotnej hodowli komórek, aby skutecznie zmniejszyć zanieczyszczenie. Po namnażaniu się komórek pochodzących z moczu, iPSC są generowane za pomocą zmodyfikowanej metody transdukcji dostępnego na rynku systemu wektorów wirusa Sendai. Pierwsze kolonie iPSC mogą być widoczne już po 5 dniach, a najwcześniej po 10 dniach. Rutynowe pasażowanie grudek z bezenzymatycznym buforem dysocjacyjnym wspiera pluripotencję generowanych iPSC przez ponad 50 pasaży.

Podczas izolowania komórek z moczu ludzi i NHP można zidentyfikować różne typy komórek bezpośrednio po izolacji. Wraz z moczem wydalane są komórki płaskie, a także różne mniejsze komórki obłe; mocz kobiet zawiera znacznie więcej komórek płaskich niż mocz mężczyzn (Rycyna 1B - dzień 0; Rycina uzupełniająca S1). Po 5 dniach hodowli w podstawowym medium do moczu można zaobserwować pierwsze adherentne komórki proliferujące (Rycina 1A,B </str...

Obecny protokół opisuje metodę izolacji, ekspansji i przeprogramowania ludzkich i nieludzkich komórek pochodzących z moczu naczelnych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), a także instrukcje dotyczące konserwacji nowo wygenerowanych iPSC bez konieczności dostarczania pokarmu.

Wytwarzanie i utrzymywanie indukowanych przez naczelnych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z moczu

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

IPSC naczelnych są przydatne, ale często trudne do uzyskania ze względu na kwestie etyczne i techniczne. Protokół ten zapewnia najbardziej dostępną ścieżkę do generowania i utrzymywania IPSC naczelnych. Wykorzystanie komórek moczowych jako głównego źródła IPSC ma dużą zaletę, ponieważ można je uzyskać w całkowicie nieinwazyjny sposób, bez żadnych specjalnych technik.Procedurę zademonstruje Jessica Radmer, doktorantka z Wolfgang M.S.Laboratory. Na początek odwiruj probówkę zawierającą mocz o sile 400 g przez 10 minut. Następnie ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając około jednego mililitra w probówce i ponownie zawiesić w niej osad.Przemyć komórki, dodając 10 mililitrów buforu do przemywania moczu zawierającego amfoterycynę i ostrożnie wymieszać zawiesinę za pomocą pipety serologicznej. Po odwirowaniu ostrożnie zassać supernatant, pozostawiając w probówce mniej niż 0,2 mililitra. Zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze pierwotnego podłoża moczu zawierającego amfoterycynę na 50 mililitrów wstępnie przetworzonego moczu.Usunąć żelatynę i dodać jeden mililitr zawiesiny do studzienki z 12-dołkową płytką pokrytą żelatyną. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Aby przygotować 12-dołkową płytkę pokrytą matrycą membrany podstawnej, dodaj 500 mikrolitrów matrycy membrany podstawnej na studzienkę.Przesuń płytkę, aby rozprowadzić płyn i inkubować go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji zastąp matrycę błony podstawnej 900 mikrolitrami pożywki REMC i przechowuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza do czasu użycia. Oblicz objętość wirusów Sendai potrzebną do wielokrotności infekcji wynoszącej pięć, korzystając z równania.Szybko rozmrozić elementy zestawu do przeprogramowania Sendai w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj pożywkę REMC w sumie 100 mikrolitrów do probówki przed dodaniem obliczonej objętości wirusów Sendai i wymieszaniem. Po dysocjacji komórek moczowych zgodnie z opisem w manuskrypcie, policz komórki za pomocą licznika komórek i przenieś żądaną liczbę komórek do probówki o pojemności 1,5 mililitra.Otrzymać osad przez odwirowanie i ponownie zawiesić go w 100 mikrolitrach przygotowanej mieszaniny wirusów Sendai. Inkubować probówkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu zakażenia zawiesiną. Po inkubacji dodać REMC do łącznej ilości jednego mililitra przed wysianiem zawiesiny komórkowej na 12-dołkowej płytce pokrytej matrycą błony podstawnej.Po transdukcji należy zmieniać pożywkę co drugi dzień, aż do rozwoju indukowanych kolonii pluripotencjalnych komórek macierzystych lub IPSC z przełączeniem na pożywkę generacji PSC w piątym dniu. Gdy kolonie IPSC osiągną wystarczająco duże rozmiary, aby można było przejść przez grudki, odessać pożywkę z hodowanych komórek i ostrożnie umyć komórki 500 mikrolitrami DPBS. Po usunięciu DPBS dodaj 500 mikrolitrów 0,5 milimolowego EDTA do studzienki i inkubuj przez dwie do pięciu minut.Uważnie obserwuj komórki pod mikroskopem, aż kolonie zaczną się odłączać. Kiedy krawędzie kolonii zaczną się odklejać, a szczeliny między komórkami staną się widoczne, usuń EDTA i ostrożnie dodaj 500 mikrolitrów DPBS. Zassać DPBS i przepłukać studzienkę 500 mikrolitrami pożywki hodowlanej PSC za pomocą pipety P-1000.Pipetuj w górę iw dół, aby rozproszyć kolonie w kępy o odpowiedniej wielkości. W zależności od konfluencji, pożądanej gęstości wysianych komórek i preferencji klonalnej IPSC, przenieś od 1/10 do 1/50 zawiesiny grudek komórkowych do nowych studzienek. Delikatnie przesuń talerz kilka razy do przodu i do tyłu, aby równomiernie rozprowadzić grudki w studzience.Inkubuj płytkę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby grudki mogły się przymocować. Zmieniaj podłoże co dwa do trzech dni, aż kolonie urosną wystarczająco duże, aby można było je pasować. Po izolacji można zobaczyć komórki płaskonabłonkowe i różne mniejsze okrągłe komórki, które zostały wydalone z moczem.Można zobaczyć pierwsze przylegające komórki proliferujące, które wyrastają w duże kolonie, które można pasażować. Można zaobserwować dwa różne typy komórek, z których jeden ma fenotyp podobny do nabłonka, a drugi wykazuje fenotyp bardziej mezenchymalny o wydłużonym kształcie. Po pierwszym pasażu komórki moczu rosną jako monowarstwa.Podczas generowania IPSC można zaobserwować pewne przylegające komórki, które zaczynają wykazywać zmiany morfologiczne, co wskazuje na przeprogramowanie komórek. Co więcej, komórki, które tworzą kolonie, wykazują typową morfologię embrionalnych komórek macierzystych. Wszystkie wygenerowane IPSC mają typową morfologię kolonii przypominającą embrionalne komórki macierzyste, charakteryzującą się ciasno upakowanymi komórkami o wyraźnie zaznaczonych krawędziach.Immunocytochemię wykorzystano do zbadania ekspresji markerów związanych z pluripotencją w gorylach IPSC. Ponadto analiza cytometrii przepływowej wykazała, że analizowane IPSC orangutanów są dodatnie dla TRA-1-60. Co więcej, goryle IPSC są w stanie różnicować się w linie endodermy, mezodermy i ektodermy.Zwiększona liczba zróżnicowanych komórek oraz utrata integralności i jednorodności granic wskazują na słabą jakość IPSC. Natomiast wyraźne granice, szczelne upakowanie komórkowe i wydatne jąderka oznaczają wysokiej jakości IPSC. Ze względu na zmienność koronalną należy zoptymalizować warunki specyficzne dla klonu, takie jak współczynnik podziału, czas pasażu i wielkość kępy, aby utrzymać zdrowy wzrost IPSC naczelnych.W ramach kontroli jakości ustalonych IPSC, oprócz sprawdzania ekspresji genów markerowych, można zweryfikować prepotencję poprzez bezpośrednią lub pośrednią indukcję różnicowania, taką jak różnicowanie EV in vitro.

generation-maintenance-primate-induced-pluripotent-stem-cells-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Aby odkryć najwcześniejsze mechanizmy molekularne leżące u podstaw inicjacji raka prostaty, desperacko potrzebne są nowatorskie i innowacyjne systemy i podejścia do modelowania ludzi.  Potencjał mezenchymy zatok układu moczowo-płciowego przed gruczołem krokowym (UGSM) do indukowania pluripotencjalnych populacji komórek macierzystych do tworzenia ludzkiego nabłonka prostaty jest potężnym narzędziem eksperymentalnym w badaniach nad prostatą.

Tworzenie ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego za pomocą rekombinacji tkankowej mezenchymy zatok moczowo-płciowych gryzoni i ludzkich komórek macierzystych

Ten protokół zawiera szczegółowe procedury izolacji komórek pochodzących z moczu od pacjentów z dystrofią mięśniową; ich skuteczne i szybkie przeprogramowanie poprzez transdukcję wirusa Sendai.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów z dystrofią mięśniową: skuteczne przeprogramowanie komórek pochodzących z moczu bez integracji

W tym badaniu generujemy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach.

Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów

Proponujemy protokół przeprogramowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Poprzez posiew transdukowanych komórek krwi na płytkach pokrytych matrycą za pomocą wirowania, iPSC są z powodzeniem indukowane z komórek pływających. Technika ta sugeruje prosty i skuteczny protokół przeprogramowania komórek, takich jak PBMC i CBMC.

Indukowane pluripotencjalne wytwarzanie komórek macierzystych z komórek krwi za pomocą wirusa Sendai i wirowania

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Ten manuskrypt opisuje dwuetapowy protokół generowania specyficznych dla pacjenta podocytów z fibroblastów skóry poprzez episomalne przeprogramowanie w indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) i późniejsze różnicowanie w podocyty.

Generowanie podocytów pochodzących od pacjenta z biopsji skóry

Poznaj protokół generowania i utrzymywania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z moczu u naczelnych. Ta nieinwazyjna metoda wykorzystuje wirusy Sendai do reprogramowania komórek i umożliwia badania w medycynie regeneracyjnej.

Wytwarzanie i utrzymywanie indukowanych przez naczelnych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z moczu

Przeglądaj więcej filmów