Rozwój szczepów gatunków Leishmania z konstytutywną ekspresją eGFP
21 kwietnia 2023
Tutaj opisujemy metodologię używaną do generowania szczepów L. panamensis i L. donovani wyrażających gen eGFP jako stabilny zintegrowany transgen za pomocą systemu pLEXSY. Transfekowane pasożyty klonowano poprzez ograniczenie rozcieńczenia, a klony o najwyższej intensywności fluorescencji u obu gatunków wybrano do dalszego wykorzystania w testach przesiewowych leków.
Protokół ten ma kluczowe znaczenie dla generowania szczepów, które można wykorzystać w wysokoprzepustowych testach przesiewowych w celu oceny potencjału i tradycyjnej aktywności cząsteczek Procedurę zademonstrują Juana Quintero i Laura Pineda, asystentki naukowe z mojego laboratorium. Na początek amplifikuj gen docelowy za pomocą polimerazy o wysokiej wierności, aby zachować sekwencję kodującą. Dodać startery do mieszaniny reakcyjnej w końcowym stężeniu 0,2 mikromola i uruchomić protokół cykliczny PCR, jak opisano w manuskrypcie.
Oczyść amplifikowany fragment PCR za pomocą konwencjonalnego zestawu do oczyszczania produktu PCR. Aby przyciąć końce produktu eGFP PCR, należy przeprowadzić reakcję z enzymem Kpn I zgodnie z instrukcjami producenta i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie dodać 100 milimolów chlorku sodu i 10 jednostek Bgl II do reakcji i inkubować przez 15 minut.
Po strawieniu oczyść reakcję, jak pokazano wcześniej. Następnie należy przetrawić wektor ekspresyjny pLEXSY z Bgl II i Kpl I po sekwencyjnym trawieniu, jak pokazano wcześniej. Zligować 100 nanogramów strawionego wektora pLEXSY i 28 nanogramów strawionego eGFP w 20 mikrolitrowej reakcji zawierającej bufor ligazy i trzy jednostki ligazy DNA T4.
Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przekształcić kompetentne komórki Escherichia coli za pomocą produktu ligacji przy użyciu standardowych protokołów transformacji. Umieść przekształcone komórki w agarze z ampicyliną LB i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby wybrać rekombinowane klony.
Po przeprowadzeniu badań przesiewowych kolonii, oczyść plazmidowe DNA z dodatniego klonu w celu późniejszej transfekcji za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji plazmidu. Aby wytworzyć zlinearyzowane fragmenty plazmidu, należy pobrać co najmniej 10 mikrogramów oczyszczonego plazmidu pLEXSY eGFP i trawić go za pomocą SWA1 przez trzy do czterech godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji ciepło dezaktywuje produkt trawienia w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut.
Następnie uruchom produkt wytrawiania w elektroforezie w żelu agarozowym, aby oddzielić powstałe fragmenty. Oczyść kasetę z odciągiem pokarmu za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu agarozowego zgodnie z instrukcjami producenta. Hoduj kultury pasożytów, aż będzie wystarczająca liczba promastigotów w fazie logarytmicznej lub wczesnej fazie stacjonarnej.
W razie potrzeby należy zebrać zawartość wielu kolb hodowlanych. Odwirować kulturę pasożyta w temperaturze 2 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić osad w buforze do elektroporacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać stężenie od jednego razy 10 do ósmego pasożyta na mililitr i trzymać go na lodzie przez 10 minut.
Jednocześnie probówki do wstępnego schładzania z 2 do 10 mikrogramami zlinearyzowanego pLEXSY eGFP konstruują 50 mikrolitrów wody lub 10 milimolowy bufor tris o pH 8,0 i kuwety do elektroporacji o średnicy dwóch milimetrów. Następnie dodaj 350 mikrolitrów wstępnie schłodzonych pasożytów do probówki ze zlinearyzowanym plazmidem i przenieś całe 400 mikrolitrów do kuwety do elektroporacji na lodzie. Elektroportuj komórki pasożyta plazmidem i równolegle komórki pasożyta bez plazmidowego DNA jako kontrolę negatywną.
Umieść kuwetę na lodzie na 10 minut. Przenieś elektroporowane pasożyty do pięciu mililitrów odpowiedniej pożywki hodowlanej i inkubuj w temperaturze 26 stopni Celsjusza przez 20 godzin. Około 20 godzin po elektroporacji obserwuj kultury pod mikroskopem i dodaj odpowiedni selektywny antybiotyk w zależności od użytego plazmidu pLEXSY.
Śledź kultury pod mikroskopem, aż pojawi się wyraźna różnica między pasożytami elektroporowanymi z plazmidowym DNA i bez niego. Aby zweryfikować fluorescencję pasożyta za pomocą cytometrii przepływowej, odwirować jeden mililitr kultury w fazie stacjonarnej przy 2 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po dwukrotnym umyciu komórek w PBS, ponownie zawieś końcowe granulki w jednym mililitrze PBS.
Uruchom próbki i zbierz 20 000 zdarzeń z prędkością 0,5 mikrolitra na sekundę. Ustaw wartości wzmocnienia dla jednego kanału rozproszenia do przodu, rozproszenia bocznego i fluorescencji odpowiednio na 225,0, 200,0 i 520,0. Utwórz bramkę G1 zawierającą populację pasożyta.
Przefiltruj kanał FL1 przez tę bramkę, aby określić autofluorescencję promastigoty i ustaw bramkę zakresu G2 dla kanału FL1. Uruchom transfekowane pasożyty, aby sprawdzić, czy występuje fluorescencja. Zapisz procent pasożytów w G1, które są fluorescencyjne i średnią intensywność fluorescencji w G2. Oczyść genomowe DNA z dwóch do pięciu mililitrów hodowli pasożytów w fazie stacjonarnej za pomocą konwencjonalnej ekstrakcji chloroformem fenolowym lub za pomocą komercyjnego zestawu.
Wykonaj diagnostyczny PCR dla pLEXSY-sat2.1 przy użyciu protokołu cyklicznego opisanego w manuskrypcie. Po potwierdzeniu fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej należy przygotować rozcieńczenie rekombinowanych pasożytów w stężeniu pięciu promastigotów na mililitr. Dodać 100 mikrolitrów tego rozcieńczenia do każdego dołka płytki 96-dołkowej i pozostawić płytkę w spokoju przez co najmniej 12 godzin.
Podążaj za płytką pod mikroskopem przy minimalnym powiększeniu 100X, aż zostaną wykryte studzienki z rozwojem pasożytów. Kiedy studzienka jest pełna pasożytów, użyj zawartości do zaszczepienia pięciomililitrowej kultury. Gdy kultury wysiewane przez klony osiągną fazę stacjonarną, sprawdź fluorescencję za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej.
Wybierz klony z 98% do 99% pasożytów fluorescencyjnych i najwyższą średnią intensywnością fluorescencji w testach in vitro i in vivo. Colony PCR komórek E. coli przekształconych za pomocą konstruktu pLEXSY eGFP wygenerował produkt 859 par zasad. Całkowite trawienie plazmidu za pomocą SWA1 spowodowało powstanie dwóch fragmentów, fragmentu pary zasad o długości 2,9 kilo zawierającego wszystkie niezbędne elementy do replikacji i selekcji w E. coli oraz fragmentu pary zasad o długości od siedmiu do ośmiu kilozasad reprezentujących zlinearyzowaną kasetę ekspresyjną, która jest używana do transfekcji.
Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że 82% transfekowanych pasożytów L. panamensis wykazywało ekspresję eGFP. Po selekcji poliklonalnej 98,44% pasożytów L. donovani analizowanych za pomocą cytometrii przepływowej było fluorescencyjnych w porównaniu z 82,0% pasożytów L. panamensis. Udana integracja pLEXSY eGFP z locus SSU zaowocowała produktem o wartości 2,3 kilopary zasad w diagnostycznym PCR.
Klony o najwyższym odsetku pasożytów fluorescencyjnych i średniej intensywności fluorescencji wybrano do dalszego wykorzystania w testach przesiewowych leków. Metoda ta pozwala na wytwarzanie rekombinowanych pasożytów Leishmania z
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodologię generowania szczepów L. panamensis oraz L. donovani wykazujących ekspresję eGFP jako stabilnego zintegrowanego transgenu. Transfekcyjne pasożyty są klonowane metodą rozcieńczeń ograniczających, a następnie wybierane są klony o najwyższej intensywności fluorescencji do testów przesiewowych leków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Inżynieria genetyczna
- Przesiewy leków
Wstęp
- Gatunki Leishmania są istotnymi patogenami.
- eGFP służy jako przydatny marker do śledzenia ekspresji genów.
- Przesiewy wysokoprzepustowe są niezbędne w procesie odkrywania leków.
- Stabilna integracja transgenu jest kluczowa dla uzyskania spójnych wyników.
Cel badania
- Opracowanie szczepów L. panamensis i L. donovani do przesiewowych badań nad lekami.
- Wykorzystanie systemu pLEXSY w celu stabilnej integracji genów.
- Zwiększenie wydajności analiz wysokoprzepustowych.
Zastosowane metody
- Amplifikacja genu docelowego przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności.
- Oczyszczanie produktu PCR za pomocą standardowego zestawu.
- Przycinanie końców produktu PCR eGFP za pomocą enzymów Kpn I i Bgl II.
- Klonowanie transfekowanych pasożytów metodą rozcieńczeń ograniczających.
Główne wyniki
- Pomyślna generacja fluorescencyjnych szczepów L. panamensis oraz L. donovani.
- Identyfikacja klonów o wysokiej intensywności fluorescencji.
- Ustanowienie niezawodnej metody przesiewowej dla leków.
- Demonstracja protokołu przez asystentów badawczych.
Wnioski
- System pLEXSY jest skuteczny w stabilnej integracji transgenów.
- Przesiewy wysokoprzepustowe mogą zostać usprawnione dzięki zastosowaniu tych szczepów.
- Niniejsza metodologia stanowi podstawę dla przyszłych wysiłków w zakresie odkrywania leków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Stabilna integracja eGFP w szczepach Leishmania umożliwia wysokoprzepustowy, ilościowy screening leków przeciwko zarówno L. donovani, jak i L. panamensis. Możliwość ta eliminuje krytyczne wąskie gardło w procesie odkrywania leków przeciwpasożytniczych, zapewniając solidne i powtarzalne odczyty do oceny związków. Podejście to wspiera selekcję portfolio oraz pewność prognostyczną na wczesnych etapach odkrywania i identyfikacji związków wiodących.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośredni pomiar żywotności pasożytów i odpowiedzi na leki z wykorzystaniem intensywności fluorescencji.
- Umożliwia walidację funkcjonalną celów molekularnych w gatunkach Leishmania istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez umożliwienie śledzenia ekspresji transgenu w czasie rzeczywistym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia ustandaryzowaną, skalowalną platformę do wysokoprzepustowego przesiewu związków.
- Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki dzięki pomiarowi fluorescencji metodą cytometrii przepływowej.
- Umożliwia szybki wybór optymalnych klonów do opracowania testów i dalszych etapów analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele przesiewowe in vitro do klinicznie istotnych gatunków Leishmania.
- Wspiera ciągłość procesu od wczesnego etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez umożliwienie integracji testów in vivo i in vitro.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne dzięki zapewnieniu stabilnej, konstytutywnej ekspresji markerów w modelach pasożytniczych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejsza metoda pozycjonuje zmodyfikowane szczepy Leishmania jako wielokrotnego użytku platformę obejmującą wczesną fazę odkrywania, identyfikację wiodących związków oraz badania przedkliniczne.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez i badanie szlaków sygnałowych poprzez ilościowe odczyty fluorescencji.
- Przesiewanie: Zapewnia zwalidowane szczepy gotowe do testów w celu powtarzalnej oceny związków.
- Analityka: Wspiera statystyczne porównywanie efektów działania leków z wykorzystaniem danych z cytometrii przepływowej.
- Badania translacyjne: Łączy badania in vitro i in vivo dzięki spójnej ekspresji markerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy standaryzowany zasób dla bieżących i przyszłych kampanii przesiewowych przeciwpasożytniczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów przesiewowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową w portfelach wczesnej fazy.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko i rozwój kandydatów na leki przeciwpasożytnicze.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie klonowania molekularnego, hodowli pasożytów oraz analizy z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.
- Wymagany jest dostęp do aparatury do PCR, elektroporacji oraz detekcji fluorescencji.
- Konieczna jest standaryzacja kryteriów bramkowania (gatingu) i selekcji dla walidacji klonów pomiędzy zespołami.
- Możliwa jest konieczność adaptacji metody dla różnych gatunków Leishmania lub pokrewnych modeli pierwotniaków.
- Niezawodność testu zależy od stabilnej integracji transgenu i spójnej ekspresji fluorescencji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:27
Amplification and Insertion of the eGFP Gene into the pLEXSY‐2.1 Vector
2:39
Linearization of the pLEXSY Expression Plasmid
3:26
Transfection of L. panamensis and L. donovani by Electroporation
5:00
Polyclonal Selection in Culture
6:41
Confirmation of Genomic Integration
7:09
Cloning by Limiting Dilution
8:12
Results: Confirmation of eGFP Cassette Expression and Chromosomal Insertion
9:40
Conclusion
