Name: Zrozumienie wpływu bakteriofagów strefy umiarkowanej na ich lizogeny poprzez transkryptomikę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę transkryptomiki do badania wpływu profagów na ekspresję genów bakteryjnych. Technika RT-qPCR pozwala profilować geny w stanie lizogenicznym i po indukcji cyklu litycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Stworzenie selektywnego gospodarza wskaźnikowego, wcześniej stosowanego w testach płytek miażdżycowych w celu dokładniejszego określenia ilościowego spontanicznej indukcji faga Stx z E. coli MC1061 37,38,39, opisano tutaj dla faga P. aeruginosa LESΦ2. Dodatkową zaletą tej interwencji jest skrócenie etapów i czasu przetwarzania próbki, umożliwiając w ten sposób jednoczesną ocenę wskaźników spontanicznej indukcji w warunkach wielu hodowli. Istnieje ryzyko powstania innych mutacji podczas tworzenia wariantów opornych na ryfampicynę40; Jednak w tej pracy wyewoluowany szczep został wykorzystany tylko jako gospodarz wskaźnikowy do wyliczania blaszek z kultur będących przedmiotem zainteresowania i nie został uwzględniony w analizie transkryptomicznej. Tak długo, jak selektywny szczep wskaźnikowy pozostaje równie podatny na infekcję przez faga będącego przedmiotem zainteresowania, nie ma obaw o inne nabyte mutacje. Niemniej jednak nie wykryto żadnych różnic w profilach polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych w analizie elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym (PFGE) PAO1WT i PAO1RIF (dane nie pokazane).
Przy wyborze komórek gospodarza rzadko można znaleźć szczep wskaźnikowy, który nie jest już siedliskiem profagów. Na przykład PAO1 jest siedliskiem nitkowatego profaga Pf4. Eksperymentalne kontrole w tym badaniu zostały zaprojektowane tak, aby móc bezpośrednio badać ekspresję genów określonych fagów (w tym przypadku LES profag 2) oraz wpływ tego faga na ekspresję genów bakteryjnych. W porównaniu transkryptów z PAO1 przenoszących LES profag 2 i pozbawionych LES profag 2 (zarówno lizogen, jak i nie-lizogen przenoszą endogenny Pf4), które służą jako kontrola wewnętrzna w celu wykluczenia wpływu Pf4 na gospodarza. Ponadto wykazano, że Pf4 zwykle nie powoduje lizy w komórce gospodarza41 i dlatego nie jest w stanie zakłócić wyników tych eksperymentów.
Powszechnie wiadomo, że staranna kontrola jakości ma zasadnicze znaczenie w przygotowaniu próbki do uzyskania istotnych danych omicznych42. Jednak, jak opisano wcześniej11, dokładna charakterystyka aktywności profagów w przygotowaniu kultur lizogenu do takich badań jest rzadko wykonywana. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nasze systematyczne protokoły przygotowania dobrze kontrolowanego i zoptymalizowanego zestawu kultur do badań transkryptomicznych, aby lepiej zbadać interakcje między bakteriami a fagami o umiarkowanej temperaturze. Synchronizacja populacji była kontrolowana przez poddanie kultury przez co najmniej cztery podwojenia przed potraktowaniem jej indukującym antybiotykiem norfloksacyną. Określając wartość MIC norfloksacyny dla szczepu w badaniu, mogliśmy upewnić się, że stężenie czynnika indukującego było nieco powyżej MIC dla leczenia "indukcyjnego". Leczone komórki rozcieńczono następnie w stosunku 1:10 w celu obniżenia stężenia norfloksacyny poniżej wartości MIC po 1 godzinie leczenia, aby umożliwić komórkom odzyskanie sił i zakończenie procesu replikacji faga, zakończonego lizą komórki i uwolnieniem zakaźnego potomstwa faga. Komórki wchodzą w cykl replikacji litycznej po bodźcu indukcyjnym dopiero wtedy, gdy stężenie norfloksacyny zostanie sprowadzone poniżej wartości MIC w okresie rekonwalescencji. W tym przypadku przekroczenie 1 μg·mL−1 norfloksacyny oznacza, że lek nie może być skutecznie rozcieńczony poniżej MIC, ponieważ MIC dla norfloksacyny dla PAO1 wynosi 0,19 μg·mL−1. Poziom rozcieńczenia induktora musi być zrównoważony z potrzebą odzysku lizogenu i utrzymania gęstości kultury w celu pobrania RNA. Omówione tutaj dane pokazują, że możliwa jest synchronizacja kultur w celu stworzenia próbek, w których dominuje lizogeniczność, zmniejszając w ten sposób szum spowodowany spontaniczną indukcją i umożliwiając wykrycie prawdziwych zmian w ekspresji genów spowodowanych lizogenią. Ponieważ stan lizogeniczny dominuje we wczesnej fazie wykładniczej wzrostu, kiedy gęstość komórek bakteryjnych jest niska, sugerujemy zwiększenie skali kultur w celu zebrania wystarczającej ilości RNA do kolejnych badań ekspresji genów, takich jak RNA-Seq.
Stosowanie norfloksacyny jako czynnika indukującego w celu zmuszenia kultur do cyklu litycznego jest dobrze opisane43,44; Wpłynie to jednak również na ekspresję innych genów bakteryjnych w tym procesie45,46. Aby temu zapobiec, biblioteki RNA z kontrolnych kultur typu dzikiego hodowanych w tych samych warunkach indukujących i nieindukujących powinny być włączone do eksperymentów RNA-Seq. Zastosowanie kontroli wewnętrznej i kluczowych genów markerowych do walidacji etapów replikacji fagów za pomocą qRT-PCR ma również kluczowe znaczenie dla dokładnych porównań. Ilościowe profilowanie RT-PCR nie może być interpretowane poprzez porównanie bezwzględnej liczby transkryptów dla każdego genu w różnych punktach czasowych; Liczy się kształt profilu. Po pierwsze, pobrano próbkę tylko jednego małego regionu w transkryptie dla dowolnego genu,więc nie wiadomo, czy jest to element krótkotrwały, czy długowieczny. Z pewnością mapowanie transkryptów RNA-Seq pokazuje, że gęstość danych mapowania zmienia się znacznie w zależności od długości genu. Po drugie, to kształt profilu ekspresji genów powinien być interpretowany dla genu markerowego związanego z cyklem litycznym lub lizogenicznym stylem życia, a nawet niesprzężonego z obwodami regulatorowymi fagów11. Spontaniczna indukcja jest prawdziwym problemem w hodowli lizogenu i zawsze będzie skutkować ekspresją genów związanych z cyklem litycznym. Jednak profilowanie pokazuje, że geny związane z cyklem replikacji litycznej są tłumione w swojej ekspresji przed indukcją (co najmniej dwa fałdy logarytmiczne) i regulowane w górę po indukcji.
Przeprowadzone wcześniej analizy transkryptomiczne interakcji fagów Stx z E. coli wspierają dokładne zrozumienie genów fagów zaangażowanych w utrzymanie lizogenii i wyzwalanie cyklu litycznego11,17. Obecnie fagi LES P. aeruginosa zostały opisane, ale ich kluczowe funkcje genów są mniej dobrze poznane. Badania transkryptomiczne umożliwią ponowną adnotację profagów LES i poprawią naszą wiedzę na temat genów zaangażowanych w cykl lizogeniczny i lityczny. Powiązanie sekwencji genów z funkcją stanowi główne wyzwanie w badaniach nad nowymi profagami, co dodatkowo podkreśla potrzebę dalszych badań w celu potwierdzenia funkcji genów fagów w celu wytworzenia lepszych narzędzi adnotacji47. Szersze zastosowanie i adaptacja protokołów oraz dodatkowych środków kontroli jakości szczegółowo opisanych w tym artykule wideo może pomóc w ujawnieniu różnych funkcji profagów, a tym samym w ulepszeniu potoków adnotacji i przekształceniu naszego rozumienia biologii fagów i bakterii.

Ostatnio, terapia fagowa w walce z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe1 i edycja genów oparta na CRISPR-Cas2 wzbudziły ponowne zainteresowanie badaniami nad bakteriofagami. Również w tym przypadku postęp w biotechnologii umożliwił dokładniejsze zbadanie interakcji między bakteriami a fagami3. Jednak terapeutyczne zastosowanie fagów ("terapia fagowa") jest utrudnione przez obawy dotyczące fagów działających jako ruchome elementy genetyczne zdolne do poziomego przenoszenia genów wirulencji i oporności4. Rozległość "ciemnej materii"5 (geny o nieznanych funkcjach) jest zarówno niepokojąca, jak i kusząca. Ciemna materia jest uważana za lukę w naszym zrozumieniu biologii fagów i w dużej mierze niewykorzystane źródło narzędzi molekularnych i potencjalnych nowych terapii6. Rozwój wysokoprzepustowych technik sekwencjonowania, wraz z ulepszoną adnotacją genów7,8,9 i nowymi algorytmami składania peptydów10, poprawia wykrywanie, opis i funkcjonalne przewidywanie genów fagów. Jednak nauka jest nadal daleka od walidacji funkcji genów większości fagów w hodowli lub w świecie rzeczywistym.
Sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq) może globalnie mapować ekspresję genów podczas infekcji fagowej i znacznie poprawiło zrozumienie zarówno fagów, jak i elementów bakteryjnych zaangażowanych w cykle lityczne i lizogeniczne11,12. Podczas procesów lizogenicznych genomy fagów strefy umiarkowanej są integrowane z DNA bakterii, stając się profagami13. Globalne eksperymenty z profilowaniem ekspresji genów mogą być wykorzystane do identyfikacji genów ograniczonych do profagów, które są kodowane w genomach fagów strefy umiarkowanej, ale ulegają ekspresji tylko w stanie lizogenicznym11. Takie geny nie kodują białek strukturalnych fagów i nie biorą udziału w żadnych procesach infekcji fagowej. RNA-Seq może być wykorzystany do identyfikacji tych genów, które z większym prawdopodobieństwem wpływają na biologię bakteryjnego gospodarza, poprzez indukowanie wzmocnienia funkcji lub regulację istniejących genów bakteryjnych, co często umożliwia bakteriom przystosowanie się do zmieniającego się środowiska. W związku z tym można badać zdolność profagów do działania jako mikrobiologiczni władcy marionetek, kontrolując szereg funkcji bakteryjnych.
Istnieją dwie główne bariery dla skutecznej analizy ekspresji genów ograniczonych przez profagi. Po pierwsze, kluczową kwestią jest dostępność podatnych hostów. Z definicji profagi są już włączone do swojego specyficznego genomu gospodarza, więc trudno jest znaleźć podatnego żywiciela typu dzikiego, aby porównać globalną ekspresję genów w obecności i pod nieobecność profaga. Można to osiągnąć albo poprzez zakażenie de novo innego podatnego gospodarza, albo usunięcie profaga z oryginalnego izolatu typu dzikiego, bez zakłócania reszty genomu gospodarza. Druga bariera polega na niejednorodnym charakterze populacji lizogenicznych. Niektóre profagi ulegają degradacji poprzez mutację lub rekombinację, stając się "tajemnicze", co oznacza, że są utrwalone w określonym miejscu genomu bakteryjnego. Jednak inne profagi są "aktywne" i mogą być indukowane do replikacyjnego cyklu litycznego spontanicznie lub po ekspozycji na czynniki indukujące. W wielu hodowlach lizogenicznych szybkość spontanicznej indukcji oznacza, że część komórek bakteryjnych zawsze przechodzi replikację fagów litycznych14,15,16. Wysoki poziom ekspresji genów późnych fagów w tych populacjach maskuje niski poziom ekspresji genów związany z ekspresją genów ograniczoną lizogenem11,17. Odsetek lizogenów ulegających spontanicznej indukcji profagów może się różnić w zależności od stanu wzrostu, warunków wzrostu lub innych wyzwalaczy. Dlatego, aby zbadać wpływ profagów na lizogen, spontaniczne zdarzenia indukcji profagów muszą być zminimalizowane w jak największym stopniu poprzez optymalizację warunków wzrostu w celu faworyzowania stanu lizogenicznego.
To badanie informuje o pracach przygotowawczych wykonanych w celu zbadania wpływu zestawu współżyjących profagów z Liverpool Epidemic Strain (LES) Pseudomonas aeruginosa. Aktywne profagi zostały indukowane i wyizolowane z LES i wykorzystane do zakażenia modelowego szczepu gospodarza P. aeruginosa, PAO116,18,19. Całe genomy szczepu P. aeruginosa typu dzikiego, PAO1, i jego lizogenu, PAO1Φ2, zsekwencjonowano (na głębokości 30-krotnego pokrycia) w celu zapewnienia tożsamości szczepu typu dzikiego i potwierdzenia, że lizogen był izogenny. LES wiąże się ze zwiększoną zachorowalnością i śmiertelnością u pacjentów z mukowiscydozą, i LES phages19 zostały zasugerowane, aby pomóc w adaptacji do środowiska płuc mukowiscydozy16,19,20. Pomimo mocnych dowodów na to, że te profagi wpływają na biologię swojego gospodarza20,21, większość funkcji ich genów nie została jeszcze scharakteryzowana, a specyficzne mechanizmy interakcji są słabo poznane. Podejście transkryptomiczne może empirycznie odkryć funkcje genów profagów w kontrolowanym tle gospodarza. Ponieważ spontaniczna indukcja może wpływać na profile ekspresji, w tym artykule opisano, jak zoptymalizować warunki wzrostu, aby sprzyjać stanowi lizogenicznemu. Taka synchronizacja kultur może być zwalidowana za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia poziomów ekspresji kluczowych markerów genetycznych, które są związane z kluczowymi etapami replikacji fagów LES w PAO1. To samo podejście zostało wcześniej wykorzystane do zidentyfikowania ograniczonych profagami funkcji fagów toksyny Shiga, które wpływają na ruchliwość, oporność na kwasy i oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe u Escherichia coli11,17,21,22.

<table><tbody><tr><td>PAO1</td><td></td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>LESB58</td><td></td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>LES Fagi</td><td>indukowane i oczyszczane z LESB58 przy użyciu norfloksacyny.</td><td>To badanie</td><td></td></tr><tr><td>Bulion lizogeniczny (LB)</td> <td>Merck</td><td>1.10285.500</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Merck</td><td>1.10283.500</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Agar Fisher</td><td>A/1080/53</td><td></td></tr><tr><td>Top Agar</td><td>0,4 g Agar + 2,5 g bulionu LB w 100 ml wody; autoklaw i użytkowanie.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ryfampicyna</td><td>Sigma (Zapas: 50 mg/ml w metanolu- Dobrze wymieszać i użyć 0,22 mikro; m filtr do sterylizacji i przechowywania w -20&deg; C do użycia)</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Fisher 1% (v/v) w wodzie</td><td>10060000</td><td></td></tr><tr><td>Norfloxacin</td><td>Sigma (Zapas: 25 mg / ml 1% lodowatego kwasu octowego - dobrze wymieszaj i użyj 0,22 i mikro; m filtr do sterylizacji i przechowywania w -20&deg; C do czasu użycia; Aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, przechowuj jako małe porcje)</td><td>N9890</td><td></td></tr><tr><td>Fenol nasycony buforem cytrynianowym pH 4,3</td><td>Sigma</td><td>P-4682</td><td></td></tr><tr><td>Biologia molekularna Etanol klasy</td><td>Fisher</td><td>16695992</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>12044977</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>11398187</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>17150576</td><td></td></tr><tr><td>Beznukleazowy H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10526945</td><td></td></tr><tr><td>10X TURBO DNase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Qubit RNA HS, BR Zestaw</td><td>Invitrogen</td><td>Q10210</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Agilent RNA 6000 Nano Zestaw</td> do syntezy pierwszej nici <td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>SuperScriptIII</td> Odczynniki <td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Odczynniki do qPCR Bioline Mytaq Red 2X</td><td>BIO-25043</td><td></td></tr> Zestaw do oczyszczania <tr><td>PCR</td><td>Sensifast SYBR Hi Rox</td><td>BIO-92020</td><td></td></tr><tr>Zestaw do<td>PCR</td><td>i żelu Isolate II Zestaw</td> do klonowania i żelu <td>BIO-52060</td><td></td></tr><tr><td>TA</td><td>Zestaw do klonowania TA, z wektorem pCR 2.1, bez kompetentnych komórek</td><td>K202040</td><td></td></tr><tr><td>System StepOne Real Time PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

zrozumienie wpływu bakteriofagów strefy umiarkowanej na ich lizogeny poprzez transkryptomikę

Understanding the Impact of Temperate Bacteriophages on Their Lysogens Through Transcriptomics

Fagi o umiarkowanej temperaturze są zintegrowane jako profagi w większości genomów bakteryjnych. Niektóre profagi są tajemnicze i utrwalone w chromosomie bakteryjnym, ale inne są aktywne i mogą być wywołane do formy replikacyjnej spontanicznie lub przez ekspozycję na czynniki indukujące. Profagi są powszechnie kojarzone ze zdolnością do nadawania komórce gospodarza produkcji toksyn lub innych cech związanych ze zjadliwością. Nowsze badania wykazały, że mogą odgrywać znacznie większą rolę w zmianie fizjologii swoich gospodarzy. Opisana tutaj technika pozwoliła nam zbadać, w jaki sposób profagi wpływają na ekspresję genów w oportunistycznej bakterii Pseudomonas aeruginosa.
W tej pracy, wzrost dzikiego szczepu P. aeruginosa PAO1 został porównany z wzrostem izogenicznych lizogenów przenoszących różne kombinacje profagów z Liverpool Epidemic Strain (LES) LESB58. W hodowli lizogenu pewna część komórek bakteryjnych będzie wspierać replikację bakteriofagów litycznych (indukcja spontaniczna) z wysokim poziomem ekspresji na komórkę genów późnych fagów, takich jak te związane ze składaniem cząstek fagów, maskując w ten sposób niski poziom ekspresji genów związany z ekspresją genów ograniczoną lizogenem. Wpływ spontanicznej indukcji może zatem przesłonić ekspresję genów profagów w populacji lizogenu.
Eksperymenty profilowania wzrostu zostały wykorzystane do zidentyfikowania spontanicznej indukcji, która była minimalna we wczesnej fazie wzrostu wykładniczego. Badanie to opisuje, jak przygotować kultury próbek we wczesnej fazie wzrostu wykładniczego i jak ustawić odpowiednie kontrole pomimo niskiej liczby komórek. Protokoły te zapewniają wiarygodne i powtarzalne porównanie bakterii typu dzikiego i lizogenicznego w różnych warunkach, poprawiając w ten sposób profilowanie transkryptomiczne genomów profów i pomagając w identyfikacji wcześniej nierozpoznanych funkcji profagów.

W niniejszej pracy wykorzystano bezpośrednie wyliczanie czasowe produkcji fagów z kultury lizogenu PAO1 LESΦ2 hodowanej w warunkach nieindukujących, aby określić wpływ spontanicznej indukcji LESΦ2. Gęstość fagów była najniższa, osiągając średnią wartość ~2,61 x 106 jednostek tworzących plaki (PFU)·mL−1 2 h po przesiewie do świeżego medium w wczesnej fazie wzrostu wykładniczego, co sugeruje, że stanem dominującym była lizogenia. Miano LESΦ2 szybko wzrosło do średniej wartości ~2,4 x 108 PFU·mL−1 w ciągu 4 h i osiągnęło najwyższą gęstość po 6 h (średnio ~5,83 x 109 PFU·mL−1; Rycina 4).
Minimalna indukcja spontaniczna była obserwowana podczas wczesnej fazy logarytmicznej wzrostu lizogenu (po 2 h). Jednak mierzalna obecność fagów w pożywce była wynikiem wielu wcześniejszych zdarzeń, w tym: pakowania kwasów nukleinowych do białkowych główek, składania białek w cząsteczki fagowe oraz ekspresji późnych genów fagowych, genów fazy środkowej i wczesnych regulatorowych genów fagowych. Istotne było uchwycenie zainfekowanych komórek przed wystąpieniem zdarzeń replikacyjnych związanych z fagiem; dlatego wybrano czas 90 min na wzrost kultury przed indukcją. Aby uchwycić profil ekspresji genów w próbkach lizogenu PAO1, LESΦ2, pobrano materiał z kultury przed indukcją oraz po indukcji w okresie 90 min, zgodnie z opisem w kroku 3.4. Ten punkt czasowy (90 min) przypada znacznie wcześniej niż wykrycie wysokiego poziomu spontanicznej indukcji rezydentowego profaga za pomocą testu plackowego z kroku 2.3.2. Ponieważ gęstość komórek bakteryjnych we wczesnej fazie wzrostu wykładniczego była niska, objętości kultur zwiększono do 800 mL, aby zapewnić wystarczającą ilość materiału do badań ekspresji genów. Próbki z kultury nieindukowanej i kultur indukowanych pobierano co 10 min, a następnie wyizolowano RNA w celu zmapowania profilu ekspresji kluczowych markerów lizogenii i replikacji litycznej podczas wzrostu bakterii. Całkowite RNA oczyszczono i zweryfikowano pod kątem braku genomowego DNA za pomocą analiz qPCR ukierunkowanych na gen 16S rRNA (krok 6.1). Próbki, które osiągnęły RIN ≥ 9, przeszły kontrolę jakości i zostały przekształcone w cDNA.
Przeanalizowano adnotowany genom LESΦ2 w celu zidentyfikowania genów znanych z udziału w lizogennych i litycznych cyklach replikacji fagów umiarkowanych. Zidentyfikowane geny wykorzystano następnie do walidacji qRT-PCR w celu profilowania ekspresji genów ograniczonych do cyklu lizogennego oraz genów związanych z cyklem litycznym w kulturach indukowanych i nieindukowanych. Ilościowo określono absolutną liczbę kopii DNA i przeprowadzono test znaków Wilcoxona przy użyciu programu R36, aby porównać poziomy ekspresji w kulturach nieindukowanych i indukowanych (Rysunek 5). Zaobserwowano wyraźny wzrost ekspresji genu cro (wczesnego markera replikacji litycznej) z poziomu ~2,31 x 109 kopii w kulturach nieindukowanych do ~3,02 x 1011 kopii 30 min po indukcji (test znaków Wilcoxona: p &lt; 0,01). Podobnie białka O i białka P, które są markerami średniego etapu replikacji litycznej (a według przewidywań uczestniczą w replikacji genomu faga), wykazały również istotny wzrost ekspresji z ~1,74 x 108 do ~1,25 x 1010 kopii (test znaków Wilcoxona: p &lt; 0,01) oraz z ~6,05 x 102 do ~5,68 x 105 kopii (test znaków Wilcoxona: p &lt; 0,01), odpowiednio. Na koniec, strukturalne geny związane z ogonkiem wykorzystano jako późne markery litycznego cyklu replikacji. Ponownie zaobserwowano istotny wzrost ekspresji z ~2,31 x 106 kopii w kulturach nieindukowanych do ~4,38 x 108 kopii 30 min po indukcji (test znaków Wilcoxona: p &lt; 0,01). Zatem dane z ilościowego RT-PCR potwierdziły, że ekspresja genów dobrze ugruntowanych markerów replikacji litycznej przebiegała zgodnie z oczekiwanym trendem, przy czym markery wczesne, średnie i późne wykazywały wielokrotnie różnicową ekspresję w przewidzianej kolejności (Rysunek 5). Ponieważ ekspresja markerów replikacji litycznej uległa zwiększeniu 30 min po regeneracji, punkt ten uznano za odpowiedni reprezentatywny moment czasowy do badania krajobrazu transkryptomicznego aktywnych fagów umiarkowanych i ich gospodarzy bakteryjnych podczas cyklu litycznego.
Zaobserwowaliśmy pewną ekspresję genów litycznych w warunkach bez indukcji, co potwierdza, że zawsze dochodzi do pewnej indukcji spontanicznej, nawet w zoptymalizowanych kulturach, w których liczba lizogenów jest reprezentowana przez najwyższy stosunek CFU do uwolnionych PFU we wczesnej fazie logarytmicznej. Oznacza to, że w danych transkryptomicznych zawsze będzie występował pewien poziom „szumu”, co podkreśla znaczenie starannie przygotowanych kontroli, w tym kultur indukowanych i nieindukowanych. Właściwy wybór genów kontroli wewnętrznej w celu określenia krotności zmian w ekspresji opiera się na dokładnej analizie danych transkryptomicznych w celu zidentyfikowania genów, które są wyrażane na tym samym poziomie zarówno w próbkach nieindukowanych, jak i indukowanych. Nasze wstępne wyniki sugerują, że rpoD był najbardziej wiarygodnym przetestowanym genem kontrolnym i wykazywał najstabilniejszą ekspresję (~1,71 x 105 kopii przed indukcją i ~3,33 x 105 kopii 30 min po indukcji; test znaków rang Wilcoxona: p = 0,3594) w porównaniu do rrn16S lub genów proC (Rysunek 5). Zmienność ekspresji kontroli wewnętrznych doprowadziła do pomiaru bezwzględnej liczby transkryptów. Dalsza analiza danych transkryptomicznych pomoże w wyborze odpowiednich kontroli wewnętrznych do późniejszej walidacji.
W naszym ćwiczeniu z profilowania genów wykorzystano gen cI, ponieważ jest on uznanym markerem lizogenii. W porównaniu do markerów replikacji litycznej, ekspresja genu cI była stosunkowo stabilna (Rycina 5), jednak liczba kopii tego genu w kulturach nieindukowanych była satysfakcjonująco wysoka w porównaniu do markerów replikacji litycznej. Dane te są zgodne z niskimi wartościami PFU w tych samych próbkach, co potwierdza, że wysoka ekspresja represora wiązała się z niższym poziomem produkcji fagów. Przedstawione tutaj dane wykazują, że ekspresja transkryptu cI dla tego konkretnego faga nie ulega istotnemu obniżeniu po indukcji, co ma miejsce w przypadku fagów Stx11,17. Aktywność represora jest zazwyczaj kontrolowana zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i potranslacyjnym, zatem gen represora może być transkrybowany, ale powstałe białko ulega natychmiastowemu autokatalitycznemu cięciu. Wymagane są dalsze eksperymenty w celu walidacji kontroli transkrypcyjnej i potranslacyjnej. Ponadto, na podstawie naszej krzywej wzorcowej, minimalna granica wykrywalności qPCR wydaje się wynosić ~102 kopii.
Łącznie wyniki uzyskane w testach płytkowych i za pomocą qRT-PCR potwierdzają słuszność naszej strategii hodowli i przygotowania próbek RNA w celu uzyskania dobrze kontrolowanego materiału wejściowego do eksperymentów RNA-Seq. Hodowle nieindukowane w wczesnej fazie wykładniczej wykazywały niski poziom spontanicznej indukcji i ekspresji genów litycznych, co sugeruje dominację lizogenii. Z kolei hodowle izolowane 30 min po indukcji wykazały znaczny wzrost ekspresji genów markerowych wskazujących na dominację replikacji litycznej.
<img alt="Schemat eksperymentu z koncentracją rifampicyny przedstawiający probówki z narastającym żółtym zabarwieniem w ciągu 7 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig01.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Protokół tworzenia gospodarza wskaźnikowego opornego na rifampicynę (Utworzono w BioRender.com). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat rozcieńczeń seryjnych dla wyznaczania CFU i PFU; przedstawia kultury komórek lizogennych i wskaźnikowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig02.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Projekt eksperymentalny dla wyznaczania PFU i CFU lizogenu z tej samej próbki. (Utworzono za pomocą BioRender.com) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat podwójnego procesu ekstrakcji RNA dla indukowanych i nieindukowanych kultur bakteryjnych z użyciem norfloksacyny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig03.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schemat doświadczalny pobierania próbek z kultur indukowanych i nieindukowanych do izolacji RNA. (Utworzone w BioRender.com) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres wzrostu bakterii i interakcji z fagami; Log PFU mL⁻¹ w funkcji czasu (h); wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig04.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Czasowe wyliczanie indukcji spontanicznej. Czasowe wyliczanie produkcji spontanicznego profaga LES z wykorzystaniem PFU z lizogenu PAO1 Φ2 wraz z jednoczesnym CFU, n = 8 (dwie powtórzenia biologiczne i cztery techniczne); słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe. Ciemnoczerwone punkty wskazują CFU·mL−1 w LB; ciemnoniebieskie punkty wskazują PFU·mL−1 w LB. Spontaniczne uwalnianie zakaźnego faga φ2 przez lizogeny znajduje się na najniższym mierzalnym poziomie 2 h po inokulacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy pudełkowe pokazujące zmienność liczby kopii DNA w czasie w markerach genowych faga2; wynik eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig05.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Bezwzględna liczba kopii docelowych genów markerowych. Bezwzględna liczba kopii genów markerowych faga potwierdza przewidywane wzorce ekspresji, uzyskane za pomocą RT-qPCR, dla genów, których oczekuje się, że odgrywają istotną rolę w cyklach lizogennych i litycznych. Kropki reprezentują zarówno trzy powtórzenia biologiczne, jak i trzy techniczne (n = 9). (A) Czerwone pudełko reprezentuje marker lizogenii, cI; (B) zielony reprezentuje wczesny marker lityczny, cro; (C,D) niebieski reprezentuje środkowe markery lityczne, geny replikacji DNA; (E) purpurowy reprezentuje późny marker lityczny, geny strukturalne ogonka; (F–H) szary reprezentuje markery gospodarza, które zostały użyte jako kontrole wewnętrzne, a (I) biały reprezentuje gyrazę DNA B, która została użyta jako kontrola indukcji. Ciągłe poziome linie wskazują medianę rozkładu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Startery zaprojektowane w niniejszym badaniu. Podano sekwencje swoistych starterów dla genów markerowych i kontroli wewnętrznych wykorzystanych w niniejszym badaniu, wraz z odpowiadającymi im numerami dostępu NCBI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Efektywność starterów użytych w niniejszym badaniu, obliczona na podstawie krzywej standardowej qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten protokół umożliwia ujawnienie wpływu profagów na ich gospodarzy. Kultury bakteryjne są synchronizowane w warunkach, które najlepiej wspierają stan lizogeniczny, ograniczając spontaniczną indukcję. RT-qPCR jednoznacznie odróżnia geny ograniczone do profagów i te niesprzężone z kontroli fagów od tych, które ulegają ekspresji podczas cyklu replikacji litycznej.

Zrozumienie wpływu bakteriofagów strefy umiarkowanej na ich lizogeny poprzez transkryptomikę

Temperate phages are found integrated as prophages in the majority of bacterial genomes. Some prophages are cryptic and fixed in the bacterial chromosome, ...

Profagi to fagi bakteryjne, które zintegrowały się z genomami bakterii. Stosujemy podejście transkryptomiczne, aby kompleksowo zbadać wpływ profagów na biologię ich bakteryjnych gospodarzy.Metody opisane w niniejszym opracowaniu rozwiązują kluczowy problem spontanicznej indukcji cyklu litycznego profaga. Staranna optymalizacja warunków hodowli umożliwia precyzyjne profilowanie ekspresji genów podczas stanu profagowego.Profagi występują u większości patogennych bakterii, jednak ich znaczenie zazwyczaj nie jest w pełni zrozumiałe. Narzędzia te mogą pomóc w wyjaśnieniu roli profagów jako regulatorów wielu funkcji bakteryjnych.Istnieje niemal nieograniczona liczba niezbadanych relacji między profagami a ich gospodarzami. Stanowi to ogromny, niewykorzystany zasób potencjalnych celów terapeutycznych, których identyfikacji mogą pomóc niniejsze protokoły. Głównym wyzwaniem jest znalezienie odpowiednich warunków hodowli, które pozwolą zrównoważyć wzrost lizogenów i spontaniczną indukcję profagów.Kolejnym znanym wyzwaniem jest utrzymanie integralności RNA na potrzeby dalszych badań.Aby rozpocząć, należy przygotować świeże kultury lizogenów i gospodarzy wskaźnikowych poprzez zaszczepienie kultur nocnych w 100 ml LB w stosunku 1:100. Inkubować w temperaturze 37°C przy wstrząsaniu z prędkością 180 RPM.Aby monitorować wzrost lizogenu, co godzinę od momentu inokulacji przez osiem godzin pobieraj próbkę o objętości 1 mL. Wykonaj rozcieńczenia seryjne kultury, dodając 100 µL do 900 µL podłoża LB. Mieszaj w wstrząsarku typu vortex z maksymalną prędkością i kontynuuj serię rozcieńczeń od 10⁻¹ do 10⁻⁹.Nanieś 10 µL odpowiedniego rozcieńczenia na płytkę z agarem LB. Pozostaw do wyschnięcia i inkubuj w temperaturze 30 °C przez 18 do 24 godzin. Po inkubacji oblicz liczbę kolonii i wyznacz liczbę żywych komórek bakteryjnych, korzystając z podanego wzoru.Następnie, aby wyliczyć liczbę zakaźnych cząsteczek fagów w próbce czasowej, do stopionego agaru wierzchniego należy dodać 100 µL komórek gospodarza wskaźnikowego opornego na rifampicynę w fazie logarytmicznej oraz rifampicynę. Na zaszczepioną warstwę agaru wierzchniego należy nanieść po 10 µL seryjnych rozcieńczeń kultury lizogenu. Po odparowaniu nanieść próbki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 18 do 24 godzin.Po inkubacji należy policzyć liczbę placków i obliczyć liczbę zakaźnych cząsteczek fagowych, korzystając z podanego wzoru. Pierwszą kolbę należy oznaczyć jako nieindukowaną, a pozostałe jako indukowane, podając punkty czasowe, w których każda próbka powinna zostać zebrana. Następnie należy przeszczepić lizogenne kultury hodowane przez noc do 80 ml LB w stosunku 1:100 w ośmiu kolbach o pojemności 250 ml.Inkubuj kolby w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 180 RPM. Po 90 minutach, gdy gęstość optyczna przy 600 nm wyniesie od 0.1 do 0.2, dodaj cztery µL 1% lodowatego kwasu octowego do kolby nieindukowanej. Przenieś 80 mL hodowli z kolby nieindukowanej do 720 mL LB i niezwłocznie dodaj 160 mL roztworu stopującego, a następnie umieść kolbę w lodzie na 30 minut, aby ustabilizować transkrypty RNA.Następnie do indukowanej, znakowanej kolby zawierającej 80 ml kultury należy dodać norfloksacynę do stężenia końcowego 1 µg/mL. Całość dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 180 RPM przez jedną godzinę. Aby umożliwić regenerację komórek, dodać 80 ml indukowanej kultury do 720 ml LB. Komórki bakterii z każdej kolby należy zbierać co 10 minut w czasie od 0 do 1 godziny poprzez dodanie roztworu zatrzymującego.Wiruj z prędkością 10 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odlej nadsącz. Następnie ostrożnie resuspenduj osad w pozostałym płynie za pomocą automatycznej pipety z regulacją objętości. Przenieś zawiesinę do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra i wiruj z prędkością 13 000 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odlej pozostały nadsącz i zamknij probówkę do mikrocentryfugi, a następnie gwałtownie zamroź osady w ciekłym azocie. Do każdego zamrożonego osadu dodaj 1 mL Trizolu i zhomogenizuj zawiesinę poprzez pipetowanie.Po zidentyfikowaniu zestawu genów docelowych, które mogą służyć jako markery dla każdego etapu replikacji w badanym fagu, należy przeprowadzić amplifikację każdego z genów docelowych z DNA genomowego przy użyciu odpowiednich starterów.Przeprowadź reakcję PCR, stosując warunki amplifikacji opisane w tekście artykułu. Po PCR oczyść każdy amplikon za pomocą zestawu do oczyszczania produktów PCR, a następnie sklonuj je w wektorze do klonowania TA zgodnie z instrukcjami producenta. Zweryfikuj sekwencję każdego sklonowanego produktu za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera.Po obliczeniu liczby kopii czterech poszczególnych plazmidów, należy przygotować wzorzec matrycy dla każdego genu markerowego poprzez seryjne rozcieńczanie DNA plazmidowego w wodzie wolnej od nukleaz. Do płytki 96-dołkowej należy dodać 1 µL cDNA oraz odpowiednie standardy plazmidowe dla każdego celu, a następnie przeprowadzić ilościową PCR zgodnie z instrukcjami producenta.Po reakcji PCR należy wykorzystać program Excel do wykreślenia zależności logarytmu liczby kopii DNA od progu cyklu (cycle threshold). Przeprowadź obliczenia regresji liniowej, aby wyznaczyć współczynnik determinacji oraz równanie liniowe. Następnie, korzystając z równania liniowego otrzymanego z regresji, oszacuj liczbę kopii dla każdego celu.Następnie należy obliczyć wydajność amplifikacji PCR, korzystając z parametrów regresji liniowej krzywej standardowej oraz podanego równania. Po zweryfikowaniu starterów pod kątem ich procentowej wydajności należy obliczyć absolutną liczbę kopii DNA.Wyliczenie czasowe spontanicznej produkcji profagów LES sugerowało najniższą liczbę PFU na komórkę w drugiej godzinie i najwyższą liczbę PFU na komórkę w szóstej godzinie.Lizogen był następnie najstabilniejszy po dwóch godzinach, dlatego warunek ten wykorzystano do profilowania qRT-PCR. Zaobserwowano wyraźny wzrost ekspresji genu cro, wczesnego markera replikacji litycznej, z poziomu 2,31 × 10⁹ kopii w kulturach nieindukowanych do 3,02 × 10¹¹ kopii 30 minut po indukcji.Podobnie białka P i O, markery średniej fazy replikacji litycznej, wykazały również istotną nadekspresję – odpowiednio ze 1,74 × 10⁸ do 1,25 × 10¹⁰ kopii oraz z 6,05 × 10² do 5,68 × 10⁵ kopii. Marker późnej fazy cyklu replikacji litycznej wykazał znaczny wzrost ekspresji w kulturach nieindukowanych do 30 minut po indukcji. spośród przetestowanych kontroli wewnętrznych, gen RPOD wykazał najstabilniejszą ekspresję w porównaniu z genami 16S RNA lub ProC.W porównaniu z markerami replikacji litycznej, ekspresja genu C-one była stosunkowo stabilna. Niemniej jednak, liczba kopii genu C-one w kulturach nieindukowanych była satysfakcjonująco wysoka w porównaniu z markerami replikacji litycznej.Żadne wartościowe dane ani interpretacje nie mogą wynikać z błędnie przygotowanej biblioteki RNA.Kontrola spontanicznej indukcji oraz integralność RNA są najważniejszymi kwestiami. Dynamikę czasową dowolnego genu można badać za pomocą profilowania ekspresji. Dobór odpowiednich warunków eksperymentalnych i punktów czasowych jest istotny dla prawidłowego mapowania odpowiedzi biologicznych na dowolny bodziec.Technika ta pozwoliła zidentyfikować wcześniej nieznane interakcje pomiędzy dwiema odmiennymi parami profag-gospodarz. Ponieważ większość bakterii posiada niezbadane profagi, podejście to może pomóc w odkryciu wielu nowych celów terapeutycznych lub zastosowań.

understanding-impact-temperate-bacteriophages-on-their-lysogens

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zrozumienie wpływu umiarkowanych bakteriofagów na ich lizogeny poprzez transkryptomikę

Niniejszy artykuł opisuje procedurę przygotowania znakowanej fluorescencyjnie wersji bakteriofaga lambda, zakażania bakterii E. coli, obserwowania efektów zakażenia pod mikroskopem oraz analizy wyników infekcji.

Śledzenie losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda

Genomika pojedynczych wirusów (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów. Zawiesiny wirusowe mieszaniny różnych szczepów są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej na preparat mikroskopowy z osobnymi studzienkami zawierającymi agarozę, co pozwala na przechwycenie wirionu i ograniczenie fragmentacji genomu podczas dalszej obróbki. Amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana za pomocą wielokrotnej amplifikacji z wypieraniem (MDA), w wyniku czego otrzymuje się...

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp.(2018)This video demonstrates preparation of a bacteriophage lysate containing transducing particles. A donor strain is infected, plaques form, and the soft agar overlay is processed with chloroform to yield a clarified lysate for downstream analysis.

Preparation of Bacteriophage Lysate for Generalized Transduction

Tutaj prezentujemy fenomiczne podejścia do funkcjonalnej charakterystyki domniemanych genów fagowych. Techniki obejmują opracowany test zdolny do monitorowania metabolizmu anabolicznego gospodarza, płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP), oprócz uznanej metody metabolomiki, zdolnej do pomiaru wpływu na metabolizm kataboliczny.

Fenomika fagów: fizjologiczne podejścia do charakterystyki nowych białek wirusowych

Ten protokół opisuje solidną metodę korzystania z ustawień o wysokiej przepustowości do badania skuteczności przeciwbakteryjnej koktajli bakteriofagowych.

Skuteczność bakteriofagów w biokontroli patogenów przenoszonych przez żywność oceniana za pomocą ustawień o wysokiej przepustowości

Zdolność bakteriofaga do przenoszenia DNA między komórkami bakteryjnymi czyni je skutecznymi narzędziami do genetycznej manipulacji ich bakteryjnych gospodarzy. Przedstawiono tutaj metodologię indukcji, odzyskiwania i wykorzystania φBB-1, bakteriofaga Borrelia burgdorferi, do transdukcji heterologicznego DNA między różnymi szczepami krętka boreliozy.

Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów

Bakteriofagi (fagi), wirusy infekujące bakterie, są integralnym składnikiem mikrobiomu jelitowego. Chociaż ci symbiotyczni mieszkańcy napędzają sprawność bakterii i dynamikę populacji, niewiele wiadomo o tym, jak wpływają na homeostazę i choroby jelit. W tym protokole bada się izolowane fagi T4 w modelu mysim, które można dostosować do innych par-bakteria.

Interakcja bakteriofaga T4 i E. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo

Zrozumienie formowania wzorców w móżdżku

Przedstawiamy metodę generowania cDNA z mRNA pochodzącego ze środowiska. W ujęciu ogólnym, najpierw pobiera się całkowity RNA ze środowiska, selektywnie usuwa rRNA, selektywnie amplifikuje mRNA, a następnie sekwencjonuje cDNA zsyntetyzowane z wzbogaconej puli mRNA. Odzyskane sekwencje można poddać adnotacji przy użyciu standardowych technik bioinformatycznych w celu identyfikacji ekspresyjnych genów.

Analiza ekspresji genów w morskich społecznościach drobnoustrojów z wykorzystaniem transkryptomiki środowiskowej

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedury związane z nadekspresją i analizą małych GTPaz w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych z wykorzystaniem techniki mikroiniekcji.

Analiza funkcji małych GTPaz poprzez mikroiniekcję plazmidów do spolaryzowanych komórek nabłonkowych

Poznaj metodę transkryptomiki do badania wpływu profagów na ekspresję genów bakteryjnych. Technika RT-qPCR pozwala profilować geny w stanie lizogenicznym i po indukcji cyklu litycznego.

Zrozumienie wpływu bakteriofagów strefy umiarkowanej na ich lizogeny poprzez transkryptomikę

Przeglądaj więcej filmów