Zrozumienie wpływu bakteriofagów strefy umiarkowanej na ich lizogeny poprzez transkryptomikę

Profagi to fagi bakteryjne, które zintegrowały się z genomami bakterii. Stosujemy podejście transkryptomiczne, aby kompleksowo zbadać wpływ profagów na biologię ich bakteryjnych gospodarzy.

Metody opisane w niniejszym opracowaniu rozwiązują kluczowy problem spontanicznej indukcji cyklu litycznego profaga. Staranna optymalizacja warunków hodowli umożliwia precyzyjne profilowanie ekspresji genów podczas stanu profagowego.

Profagi występują u większości patogennych bakterii, jednak ich znaczenie zazwyczaj nie jest w pełni zrozumiałe. Narzędzia te mogą pomóc w wyjaśnieniu roli profagów jako regulatorów wielu funkcji bakteryjnych.

Istnieje niemal nieograniczona liczba niezbadanych relacji między profagami a ich gospodarzami. Stanowi to ogromny, niewykorzystany zasób potencjalnych celów terapeutycznych, których identyfikacji mogą pomóc niniejsze protokoły. Głównym wyzwaniem jest znalezienie odpowiednich warunków hodowli, które pozwolą zrównoważyć wzrost lizogenów i spontaniczną indukcję profagów.

Kolejnym znanym wyzwaniem jest utrzymanie integralności RNA na potrzeby dalszych badań.

Aby rozpocząć, należy przygotować świeże kultury lizogenów i gospodarzy wskaźnikowych poprzez zaszczepienie kultur nocnych w 100 ml LB w stosunku 1:100. Inkubować w temperaturze 37°C przy wstrząsaniu z prędkością 180 RPM.

Aby monitorować wzrost lizogenu, co godzinę od momentu inokulacji przez osiem godzin pobieraj próbkę o objętości 1 mL. Wykonaj rozcieńczenia seryjne kultury, dodając 100 µL do 900 µL podłoża LB. Mieszaj w wstrząsarku typu vortex z maksymalną prędkością i kontynuuj serię rozcieńczeń od 10⁻¹ do 10⁻⁹.

Nanieś 10 µL odpowiedniego rozcieńczenia na płytkę z agarem LB. Pozostaw do wyschnięcia i inkubuj w temperaturze 30 °C przez 18 do 24 godzin. Po inkubacji oblicz liczbę kolonii i wyznacz liczbę żywych komórek bakteryjnych, korzystając z podanego wzoru.

Następnie, aby wyliczyć liczbę zakaźnych cząsteczek fagów w próbce czasowej, do stopionego agaru wierzchniego należy dodać 100 µL komórek gospodarza wskaźnikowego opornego na rifampicynę w fazie logarytmicznej oraz rifampicynę. Na zaszczepioną warstwę agaru wierzchniego należy nanieść po 10 µL seryjnych rozcieńczeń kultury lizogenu. Po odparowaniu nanieść próbki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 18 do 24 godzin.

Po inkubacji należy policzyć liczbę placków i obliczyć liczbę zakaźnych cząsteczek fagowych, korzystając z podanego wzoru. Pierwszą kolbę należy oznaczyć jako nieindukowaną, a pozostałe jako indukowane, podając punkty czasowe, w których każda próbka powinna zostać zebrana. Następnie należy przeszczepić lizogenne kultury hodowane przez noc do 80 ml LB w stosunku 1:100 w ośmiu kolbach o pojemności 250 ml.

Inkubuj kolby w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 180 RPM. Po 90 minutach, gdy gęstość optyczna przy 600 nm wyniesie od 0.1 do 0.2, dodaj cztery µL 1% lodowatego kwasu octowego do kolby nieindukowanej. Przenieś 80 mL hodowli z kolby nieindukowanej do 720 mL LB i niezwłocznie dodaj 160 mL roztworu stopującego, a następnie umieść kolbę w lodzie na 30 minut, aby ustabilizować transkrypty RNA.

Następnie do indukowanej, znakowanej kolby zawierającej 80 ml kultury należy dodać norfloksacynę do stężenia końcowego 1 µg/mL. Całość dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 180 RPM przez jedną godzinę. Aby umożliwić regenerację komórek, dodać 80 ml indukowanej kultury do 720 ml LB. Komórki bakterii z każdej kolby należy zbierać co 10 minut w czasie od 0 do 1 godziny poprzez dodanie roztworu zatrzymującego.

Wiruj z prędkością 10 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odlej nadsącz. Następnie ostrożnie resuspenduj osad w pozostałym płynie za pomocą automatycznej pipety z regulacją objętości. Przenieś zawiesinę do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra i wiruj z prędkością 13 000 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odlej pozostały nadsącz i zamknij probówkę do mikrocentryfugi, a następnie gwałtownie zamroź osady w ciekłym azocie. Do każdego zamrożonego osadu dodaj 1 mL Trizolu i zhomogenizuj zawiesinę poprzez pipetowanie.

Po zidentyfikowaniu zestawu genów docelowych, które mogą służyć jako markery dla każdego etapu replikacji w badanym fagu, należy przeprowadzić amplifikację każdego z genów docelowych z DNA genomowego przy użyciu odpowiednich starterów.

Przeprowadź reakcję PCR, stosując warunki amplifikacji opisane w tekście artykułu. Po PCR oczyść każdy amplikon za pomocą zestawu do oczyszczania produktów PCR, a następnie sklonuj je w wektorze do klonowania TA zgodnie z instrukcjami producenta. Zweryfikuj sekwencję każdego sklonowanego produktu za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera.

Po obliczeniu liczby kopii czterech poszczególnych plazmidów, należy przygotować wzorzec matrycy dla każdego genu markerowego poprzez seryjne rozcieńczanie DNA plazmidowego w wodzie wolnej od nukleaz. Do płytki 96-dołkowej należy dodać 1 µL cDNA oraz odpowiednie standardy plazmidowe dla każdego celu, a następnie przeprowadzić ilościową PCR zgodnie z instrukcjami producenta.

Po reakcji PCR należy wykorzystać program Excel do wykreślenia zależności logarytmu liczby kopii DNA od progu cyklu (cycle threshold). Przeprowadź obliczenia regresji liniowej, aby wyznaczyć współczynnik determinacji oraz równanie liniowe. Następnie, korzystając z równania liniowego otrzymanego z regresji, oszacuj liczbę kopii dla każdego celu.

Następnie należy obliczyć wydajność amplifikacji PCR, korzystając z parametrów regresji liniowej krzywej standardowej oraz podanego równania. Po zweryfikowaniu starterów pod kątem ich procentowej wydajności należy obliczyć absolutną liczbę kopii DNA.

Wyliczenie czasowe spontanicznej produkcji profagów LES sugerowało najniższą liczbę PFU na komórkę w drugiej godzinie i najwyższą liczbę PFU na komórkę w szóstej godzinie.

Lizogen był następnie najstabilniejszy po dwóch godzinach, dlatego warunek ten wykorzystano do profilowania qRT-PCR. Zaobserwowano wyraźny wzrost ekspresji genu cro, wczesnego markera replikacji litycznej, z poziomu 2,31 × 10⁹ kopii w kulturach nieindukowanych do 3,02 × 10¹¹ kopii 30 minut po indukcji.

Podobnie białka P i O, markery średniej fazy replikacji litycznej, wykazały również istotną nadekspresję – odpowiednio ze 1,74 × 10⁸ do 1,25 × 10¹⁰ kopii oraz z 6,05 × 10² do 5,68 × 10⁵ kopii. Marker późnej fazy cyklu replikacji litycznej wykazał znaczny wzrost ekspresji w kulturach nieindukowanych do 30 minut po indukcji. spośród przetestowanych kontroli wewnętrznych, gen RPOD wykazał najstabilniejszą ekspresję w porównaniu z genami 16S RNA lub ProC.

W porównaniu z markerami replikacji litycznej, ekspresja genu C-one była stosunkowo stabilna. Niemniej jednak, liczba kopii genu C-one w kulturach nieindukowanych była satysfakcjonująco wysoka w porównaniu z markerami replikacji litycznej.

Żadne wartościowe dane ani interpretacje nie mogą wynikać z błędnie przygotowanej biblioteki RNA.

Kontrola spontanicznej indukcji oraz integralność RNA są najważniejszymi kwestiami. Dynamikę czasową dowolnego genu można badać za pomocą profilowania ekspresji. Dobór odpowiednich warunków eksperymentalnych i punktów czasowych jest istotny dla prawidłowego mapowania odpowiedzi biologicznych na dowolny bodziec.

Technika ta pozwoliła zidentyfikować wcześniej nieznane interakcje pomiędzy dwiema odmiennymi parami profag-gospodarz. Ponieważ większość bakterii posiada niezbadane profagi, podejście to może pomóc w odkryciu wielu nowych celów terapeutycznych lub zastosowań.