TACI: Wtyczka ImageJ do analizy obrazowania 3D wapnia

Podczas zapisu obrazowania wapnia komórki poruszają się we wszystkich kierunkach. Opracowano wiele narzędzi do korekcji ruchu X i Y, ale ruch na osi Z również musi być wyraźnie zdiagnozowany i skorygowany. TACI to przyjazna dla użytkownika wtyczka J do obrazów o otwartym kodzie źródłowym.

Sprawdza dryft Z i analizuje obrazowanie 3D wapnia z ruchem we wszystkich kierunkach. Po przygotowaniu larw much opłucz je trzykrotnie w PBS. Odpipetować 75 mikrolitrów PBS na środek szklanego szkiełka.

Umieść jedną lub dwie larwy w PBS i umieść sondę mikropary termopary w pobliżu larw. Przykryj larwy i mikrosondę termopary szklanym szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij je lakierem do paznokci. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu.

Znajdź ostrość za pomocą obiektywu 25 razy i umieść termo-elektryczną lodówkę na szkiełku. W oprogramowaniu konfokalnym skup się na interesujących nas komórkach fluorescencyjnych. Dostosuj moc lasera, aby uniknąć przesycenia i ustaw pierwszą i ostatnią pozycję plasterka w ustawieniu stosu Z.

Jednocześnie rozpocznij skanowanie stosu Z i rejestrację temperatury. Kontroluj zasilanie, które zasila Peltiera, aby zmienić temperaturę powierzchni Peltiera. Następnie zatrzymaj skanowanie stosu Z i rejestrację temperatury.

Po pobraniu słoika z kropkami do obrazowania wapnia TACI zainstaluj wtyczkę na Fidżi, klikając wtyczki na pasku menu, a następnie zainstaluj w menu rozwijanym. Następnie uruchom ponownie Fiji i uruchom wtyczkę, klikając wtyczki i wybierając obrazowanie wapnia TACI. Wybierz funkcję zmiany nazwy, aby przekonwertować nazwy plików TIFF na wymaganą strukturę.

Wybierz folder, w którym obrazy TIFF wymagają zmiany, klikając przycisk Przeglądaj foldery i poczekaj, aż nazwa pliku zostanie wypełniona automatycznie, używając nazwy folderu. sprawdź maksymalną pozycję T i maksymalną pozycję Z. Upewnij się, że wartości parametrów dla maksymalnej pozycji T i maksymalnej pozycji Z zawierają wszystkie cyfry.

Wprowadź pozycję każdego parametru w kolejności. Jeśli nazwy plików TIFF nie zawierają frazy i kanału, pozostaw odpowiednią wartość parametru pustą i wybierz NA w kolejności. Jeśli jest jakiś posttext, dodawany do parametru posttext.

Kliknij przycisk Zmień nazwę, aby utworzyć folder o tej samej nazwie, a następnie podkreślenie R. Zwróć uwagę, że nazwy plików TIFF zostały zrestrukturyzowane w folderze, aby były zgodne z funkcją organizowania. Następnie użyj funkcji organizowania, aby zapisać obrazy TIFF w tej samej pozycji Z w jednym folderze. Wybierz folder, w którym obrazy T wymagają uporządkowania, klikając przycisk Przeglądaj foldery.

Jeśli plik CSV z parametrami istnieje, poczekaj, aż wartości parametrów zostaną wypełnione automatycznie. Jeśli plik CSV z parametrami nie istnieje, ręcznie wypełnij wartości parametrów. Upewnij się, że wartości parametrów fazy i kanału zawierają litery, jeśli są obecne, podczas gdy wartości parametrów pozycji T i pozycji Z powinny być największymi liczbami pozycji T i Z.

Jeśli nazwy plików obrazu nie zawierają fazy lub kanału, wprowadź NA. Następnie w razie potrzeby utwórz obrazy TIFF w skali szarości, upewniając się, że pole R images gray (Szare) nie jest zaznaczone. Kliknij przycisk Organizuj, aby utworzyć folder o tej samej nazwie, po którym następują stosy szarych podkreśleń, oraz aby wygenerować foldery o tej samej nazwie, po której następuje podkreślenie i numer pozycji Z w folderze. Następnie zwróć uwagę, że pliki TIFF są posortowane w odpowiednich folderach według pozycji Z i że zostanie wygenerowany plik o nazwie param dot CSV, w którym można znaleźć parametry i ich wartości.

Teraz użyj trackmate na Fidżi, aby wyodrębnić intensywność fluorescencji interesujących komórek z każdej pozycji Z. Otwórz obrazy TIFF w folderze pozycji Z na Fidżi i uruchom TRACKMATE, klikając wtyczki i wybierając śledzenie, a następnie Trackmate. Dostosuj parametry za pomocą detektorów DOG lub LOG.

Zmień próg średnicy plamy i filtr mediany. Ustaw filtry, aby usunąć nieistotne sygnały. Ustaw maksymalną odległość łączenia, maksymalną odległość zamykania odstępu i maksymalny odstęp zamykania odstępu.

Eksportuj intensywności fluorescencji obszarów zainteresowania do pliku CSV. Dla każdego neuronu utwórz folder i nazwij go za pomocą numeru neuronu. Zaczynając od neuronu zero.

Zapisz pliki CSV zawierające informacje o fluorescencji odpowiedniego neuronu w folderze. Nazwij pliki CSV jako średnią intensywność Z pozycja numer kropka CSV i dołącz co najmniej dwie kolumny, pozycję T i średnią intensywność lub średni kanał intensywności jeden. Utwórz plik CSV z listą podkreśleń w tle, który zawiera informacje o wszystkich neuronach w określonym formacie, zaczynając od zera neuronu.

Wypełnij numery neuronów, takie jak neuron zero w wierszu pierwszym. Następnie podaj intensywność tła dla każdej analizowanej pozycji Z. Jeśli cztery pozycje Z są analizowane dla neuronu zero, wypełnij cztery wartości intensywności tła poniżej neuronu zero.

Zapisz utworzoną listę tła w pliku CSV z kropką i folderami zawierającymi pliki CSV z informacjami o fluorescencji w jednym folderze. Otwórz TACI i wybierz funkcję wyodrębniania. Następnie wybierz folder, klikając przeglądaj pliki.

Plik w tle jest wypełniany automatycznie. Wypełnij największą liczbę pozycji T dla liczby pozycji T. Kliknij przycisk Wyodrębnij, aby utworzyć folder wyników zawierający pliki CSV i wykresy każdego neuronu.

Pliki CSV zawierają maksymalną intensywność fluorescencji oraz deltę F powyżej zera w każdej pozycji T. Wykresy są wykresami liniowymi pozycji delta F powyżej F zero w stosunku do T. Korzystając z funkcji scalania, uśrednij deltę F przez F zero ze wszystkich neuronów.

Oblicz SEM i wykreśl średnią deltę F powyżej F zero nad pozycjami T. Wybierz folder wyników utworzony przez funkcję wyodrębniania, klikając przeglądaj pliki. Wypełnij liczbę pozycji T największą liczbą pozycji T.

Kliknij przycisk Scal, aby utworzyć scalony folder danych, zawierający plik CSV scalonych podkreślonych danych i wykres PNG z uśrednionym podkreśleniem DF z zerową kropką. Plik CSV zawiera informacje o średniej i SEM delta F nad F zero w każdej pozycji T. Wykres jest wykresem liniowym średniej delty F powyżej F zero nad pozycjami T.

Obrazowanie wapnia chłodnych komórek larw much wykazujących ekspresję GCaMP six M prawie nie wykazuje fluorescencji w stanie nieaktywnym w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Jednak wewnątrzkomórkowy poziom wapnia gwałtownie wzrósł w temperaturze 10 stopni Celsjusza. Poziom wapnia gwałtownie spadał, gdy temperatura wzrastała.

Obrazowanie wapniowe neuronów mózgu muchy wyrażających GCaMP sześć F w czasie 0,1 wykazało fluorescencję w czterech z siedmiu neuronów, a intensywność tych neuronów zmniejszała się z czasem. W obecności ósemki wiele neuronów rozjaśniało się. Fluorescencja 10 neuronów wzrosła jednocześnie w punkcie czasowym 92, co sugeruje, że te grzybowe neurony reagują na zapach ośmiokątny.

TACI może oddzielać nakładające się na siebie komórki. Na tym obrazie projekcji maksymalnej zidentyfikowano dwa nakładające się na siebie neurony. Neurony te zostały rozdzielone w widoku orthro, co wskazuje, że neurony te pojawiły się w różnych pozycjach Z.

Pomarańczowa komórka pokazała najsilniejszy sygnał na Z 7, podczas gdy niebieska komórka miała najsilniejszy sygnał na Z 10. Zmiana fluorescencji tych dwóch komórek ujawniła opóźnioną, ale silną aktywację pomarańczowej komórki. Podczas ekstrakcji maksymalna wartość fluorescencji ze wszystkich pozycji Z, w których pojawia się neuron, jest używana do reprezentowania intensywności neuronu przy odpowiednim osadzaniu.

W przypadku korzystania z TACI do analizy dużej liczby neuronów, pewna rejestracja w pozycjach Z musi zostać uwzględniona w nowej funkcji, która ma zostać opracowana w sposób zorganizowany z informacjami o fluorescencji. TACI zapewnia przyjazne dla użytkownika podejście obliczeniowe typu open source do analizy obrazowania kapsułek 3D w celu sprawdzenia ruchu komórek na osi Z, gdy pojedyncze komórki pojawiają się w wielu pozycjach Z.