Name: TACI: Wtyczka ImageJ do analizy obrazowania 3D wapnia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj wtyczkę TACI do ImageJ do analizy obrazowania wapnia 3D, która koryguje ruch w osi Z i poprawia dokładność pomiarów intensywności neuronów. To narzędzie open-source usprawnia badania neurobiologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A Zeiss LSM 880 w Centrum Obrazowania Fralin został użyty do zebrania danych obrazowania wapnia. Dziękujemy dr Michelle L Olsen i Yuhang Pan za ich pomoc w pracy z oprogramowaniem IMARIS. Dziękujemy dr Lenwoodowi S. Heathowi za konstruktywne komentarze do manuskryptu oraz Stevenowi Giavasisowi za komentarze do pliku README na GitHubie. Praca ta była wspierana przez NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) i NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) do L.N. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu.

1. Obrazowanie wapnia
<ol>
	<li>Przygotowanie larw much 
	UWAGA: Muchy i larwy są utrzymywane w temperaturze 25 °C w cyklu światło:ciemność 12 h:12 h.
	<ol>
		<li>Znieczulić muchy za pomocą CO2. Posortować od 20 do 45 samców i od 20 do 45 samic do każdej fiolki z muchami i pozostawić je na co najmniej 24 h do 48 h, aby doszły do siebie po ekspozycji na CO2 . 
		UWAGA: Ekspozycja much na CO2 powinna trwać jak najkrócej.</li>
		<li>Aby zsynchronizować wiek larw, przenieść muchy do nowych fiolek zawierających granulki drożdży i pozostawić je na 4-8 h w celu zniesienia jaj. Usunąć muchy, przenosząc je do nowych fiolek.</li>
		<li>Zebrać larwy po 72 h, używając 10 mL 20% w/v roztworu sacharozy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja mikroskopu i kontroli temperatury
	<ol>
		<li>Obrazowanie przeprowadzić na mikroskopie konfokalnym (patrz Tabela materiałów) z piezoelektrycznym stolikiem w osi z oraz wkładką do stolika, stosując następujące ustawienia: laser, Argon; tryb skanowania, ramka; rozmiar ramki, 512 x 512; prędkość, maksymalna; kanały/głębokość bitowa, 1/8 Bit; powiększenie, 1,5; z-stack, slice =15, Keep = slice; urządzenia i strategia ostrzenia, Definite focus; ostrzenie, Definite focus on.</li>
		<li>Przymocować moduł chłodzenia Peltiera do radiatora za pomocą pasty termoprzewodzącej, aby zbudować chłodnicę termoelektryczną. Moduł Peltiera jest zasilany z zasilacza 2 A.</li>
		<li>Podłączyć mikroprobę termopary do urządzenia do akwizycji danych w celu rejestracji temperatury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie wapnia
	<ol>
		<li>Przepłukać larwy 3x w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS).</li>
		<li>Nanieść pipetą 75 μL 1x PBS na środek szkiełka przedmiotowego.</li>
		<li>Umieścić jedną lub dwie larwy w 1x PBS i umieścić mikroprobę termopary w pobliżu larw. 
		UWAGA: Odległość między larwami a mikroprobą powinna wynosić ~5 mm. Larwy mogą się poruszać, jeśli mikroproba zostanie umieszczona zbyt blisko nich. Zbyt duża odległość może skutkować niedokładnymi odczytami temperatury.</li>
		<li>Przykryć larwy i mikroprobę termopary szkiełkiem nakrywką. Uszczelnić szkiełko nakrywkę lakierem do paznokci.</li>
		<li>Umieścić szkiełko na stoliku mikroskopu, ustawić ostrość za pomocą obiektywu 25x i umieścić chłodnicę termoelektryczną na szkiełku. 
		UWAGA: Moduł Peltiera jest umieszczany bezpośrednio na szkiełku w miejscu, w którym znajdują się larwy, aby dostarczać bodźce temperaturowe.</li>
		<li>W oprogramowaniu konfokalnym ustawić ostrość na interesujące komórki fluorescencyjne. Dostosować moc lasera, aby uniknąć przesycenia. Ustawić pozycje pierwszego i ostatniego przekroju w ustawieniach z-stack. 
		​UWAGA: Przed rejestracją stosować jak najniższą moc lasera, aby zapobiec fotobleachingowi.</li>
		<li>Jednocześnie rozpocząć skanowanie z-stack i rejestrację temperatury.</li>
		<li>Kontrolować zasilacz zasilający moduł Peltiera, aby zmieniać temperaturę jego powierzchni. Włączyć zasilacz, aby obniżyć temperaturę, i wyłączyć go, aby temperaturę podnieść.</li>
		<li>Zatrzymać skanowanie z-stack i rejestrację temperatury.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza danych z obrazowania wapnia 3D
<ol>
	<li>Wyeksportuj dane z obrazowania wapnia do plików TIFF i zapisz je w folderze o tej samej nazwie, co nazwa bazowa plików TIFF wewnątrz niego. 
	UWAGA: Nazwa pliku nie może zawierać żadnych przecinków.
	<ol>
		<li>Użyj następujących parametrów, aby wyeksportować dane z obrazowania wapnia z programu ZEN (black edition): typ pliku, TIFF; kompresja, LZW; kanały, 2; pozycja Z, wszystkie; czas, wszystkie; faza, 1; region, pełny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalacja
	<ol>
		<li>Pobierz plik TACI-Calcium_Imaging.jar z serwisu Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases).</li>
		<li>Zainstaluj wtyczkę w programie FIJI, klikając w Wtyczki w pasek menu a następnie kliknięcie w Instalacja w menu rozwijanym (Wtyczki | Instaluj). Następnie zrestartuj program FIJI. 
		UWAGA: Należy NIE użycie Wtyczki | Instaluj wtyczkę.</li>
		<li>Uruchom wtyczkę, klikając w Wtyczki a następnie wybór Obrazowanie wapnia TACI (Wtyczki | Obrazowanie wapniowe TACI).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj ZMIANA NAZWY funkcja służąca do konwersji nazw plików TIFF na wymaganą strukturę. 
	UWAGA: Narzędzie wykorzystuje strukturę filename_h#t#z#c#.tif jako domyślną (h# i c# są opcjonalne; #: liczba całkowita dodatnia). Jeśli nazwy plików obrazów nie są zgodne z domyślną strukturą, to ZMIANA NAZWY funkcja musi zostać wykonana.
	<ol>
		<li>Kliknij, aby wybrać folder, w którym obrazy TIFF wymagają zmiany nazwy Przeglądaj foldery.</li>
		<li>Wypełnij informacje dotyczące parametrów. Wymieniono pięć parametrów, w tym Nazwa pliku, Faza, Maksymalna pozycja T, Maksymalna pozycja osi Zi KanałKażdy parametr posiada trzy wartości: Tekst poprzedzający, wartość parametrui Kolejność. 
		UWAGA: Informacje są uwzględniający wielkość literJeśli nazwy plików obrazów zawierają fraza przed parametremuzupełnij frazę jako Poprzedni tekst odpowiadającego parametru. Jeśli nazwy plików obrazów zawierają fraza po wszystkich parametrach, uzupełnij frazę jako Tekst posta.
		<ol>
			<li>Należy upewnić się, aby wprowadzić Nazwa pliku, Maksymalna pozycja Ti Maksymalna pozycja Z oraz że wartości parametrów dla Maksymalna pozycja T i Maksymalna pozycja osi Z zawierać wszystkie cyfry.</li>
			<li>Odczekaj aż Nazwa pliku do automatycznego wypełnienia na podstawie nazwy folderu.</li>
			<li>Jeśli nazwy plików TIFF nie zawierają fazy i kanału, pozostaw wartość odpowiadającego im parametru pusta i wybierz Na w Kolejność.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kliknij Zmień nazwę aby utworzyć folder o tej samej nazwie z przyrostkiem _r. Należy zauważyć, że w folderze nazwy plików TIFF zostały zmienione tak, aby były zgodne z ORGANIZUJ funkcja 
		UWAGA: Do nazw plików obrazów TIFF dodano przyrostek _r.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj ORGANIZUJ funkcja służąca do zapisywania obrazów TIFF z tej samej pozycji z w jednym folderze. 
	UWAGA: Nazwa folderu musi zawierać ta sama nazwa jako nazwa bazowa plików TIFF wewnątrz oraz musi NIE posiadać żadnych przecinków.
	<ol>
		<li>Wybierz folder, w którym mają zostać zorganizowane obrazy TIFF, klikając Przeglądaj foldery.</li>
		<li>Jeśli istnieje plik CSV z parametrami (param.csv), należy poczekać na automatyczne uzupełnienie wartości parametrów. 
		UWAGA: Plik param.csv ma określony wymagany format. Parametry, w tym filename, phase, position_t, position_z, channel oraz is_gray, muszą zostać wpisane w pierwszym wierszu od lewej do prawej, zaczynając od kolumny A. Odpowiednie wartości dla każdego parametru muszą zostać wpisane w drugim wierszu.</li>
		<li>Jeśli plik parametrów CSV (param.csv) nie istnieje, należy ręcznie wprowadzić wartości parametrów. Upewnij się, że wartości parametrów dla Faza i Kanał dołącz listy, podczas gdy wartości parametrów Pozycja T i Pozycja Z powinno być największe liczby pozycji t- i z. Jeśli nazwy plików obrazów nie zawierają informacji o fazie lub kanale, należy wprowadzić Na.</li>
		<li>W razie potrzeby należy utworzyć obrazy TIFF w skali szarości. Pozostaw pole Czy obrazy są w odcieniach szarości? odznacz opcję konwersji obrazów na skalę szarości.</li>
		<li>Kliknij Zorganizuj aby utworzyć folder o tej samej nazwie z przyrostkiem _gray_stacks oraz wygenerować w nim foldery o tej samej nazwie z przyrostkiem _# (#: pozycje z). Należy zauważyć, że pliki TIFF są sortowane do odpowiednich folderów według pozycji z oraz że generowany jest plik o nazwie param.csv, w którym znajdują się parametry i ich wartości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj wtyczki TrackMate w programie FIJI, aby wyekstrahować intensywności fluorescencji wybranych komórek z każdej pozycji z. 
	UWAGA: Ten etap można również zrealizować przy użyciu innego oprogramowania do obrazowania.
	<ol>
		<li>Otwórz obrazy TIFF z folderu z pozycjami z (z-position) w programie FIJI.</li>
		<li>Uruchom program TrackMate, klikając w Wtyczki | Śledzenie | TrackMatei w razie potrzeby dostosuj następujące parametry.
		<ol>
			<li>Zastosowanie Różnica z rozmyciem Gaussa lub detektory LoG.</li>
			<li>Zmień średnica plamki, prógi filtr medianowyDostosuj średnica plamki powinno być zbliżone do średnicy komórek. Jeśli komórki są owalne, należy dostosować średnica plamki powinno być zbliżone do osi mniejszej. 
			UWAGA: Zwiększenie próg pomaga uniknąć rejestrowania szumów tła jako sygnałów, nie wpływając na intensywność sygnałów (Rycina uzupełniająca 1). Jednakże wzrost w próg może pominąć sygnały rzeczywiste (Rysunek uzupełniający 1). Jeśli sygnały są silne, należy użyć filtr medianowy w celu zmniejszenia szumu typu sól i pieprz.</li>
			<li>Ustaw filtry tak, aby usunąć część lub wszystkie nieistotne sygnały. Filtry X i Y są filtrami przestrzennymi. Stosuje się filtry X i Y aby usunąć nieistotne sygnały oddalone od sygnałów rzeczywistych. 
			UWAGA: Po ustawieniu filtrów na jednym obrazie należy koniecznie sprawdzić wszystkie pozostałe obrazy, aby upewnić się, że sygnały rzeczywiste nie zostały usunięte.</li>
			<li>Ustaw maksymalna odległość wiązania, maksymalna odległość zamykania lukii maksymalna przerwa między klatkami przy wypełnianiu lukUstawi lowercase maksymalna odległość wiązania i maksymalna odległość zamykania przerwy być 3x-5x średnicy plamkiszczególnie gdy próbki przemieszczają się w znacznym stopniu w czasie, aby pomóc zmniejszyć liczbę śladów. Ustaw domykanie luk maksymalna przerwa między klatkami do liczba obrazów w stosie.</li>
			<li>Wyeksportuj intensywności fluorescencji obszarów zainteresowania (ROI) do pliku CSV. W przypadku korzystania ze starszej wersji programu TrackMate wybierz Eksportuj statystyki wszystkich plamek w Wybierz działanie okna. Jeśli wersja programu TrackMate to 7.6.1 lub nowsza, należy wybrać Plamki w Opcje wyświetlania okno. Eksportuj lub zapisz interaktywne pliki jako pliki CSV. 
			UWAGA: Oba pliki są interaktywne z oknem obrazu; zaznaczenie obszaru zainteresowania (ROI) wyświetla odpowiadający mu ROI w oknie obrazu. Pliki te zawierają średnie intensywności (MEAN_INTENSITY lub MEAN_INTENSITY_CH1) analizowanych komórek w odpowiadających im punktach czasowych (POSITION_T). Te same identyfikatory TRACK_ID powinny reprezentować te same ROI w różnych punktach czasowych. Nie zawsze jednak tak jest i w razie potrzeby może być wymagana ręczna korekta. Jeśli TrackMate nie rozpozna ROI w niektórych punktach czasowych, punkty te nie są wyświetlane.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznacz intensywność fluorescencji tła i utwórz plik Background_list.csv. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu intensywność tła dla każdej pozycji z szacowano, wykorzystując średnią wartość trzech do pięciu sąsiadujących obszarów (blobs) o tym samym rozmiarze, które nie zawierały sygnałów fluorescencyjnych i pochodziły z różnych punktów czasowych.
	<ol>
		<li>Plik Background_list.csv musi mieć określony format: każda kolumna zawiera informacje o jednym neuronie, zaczynając od Neuronu 0. W wierszu 1 należy wpisać numery neuronów, np. Neuron 0. Następnie należy podać intensywność tła dla każdej analizowanej pozycji z – jeśli dla Neuronu 0 analizowanych jest pięć pozycji z, pod Neuronem 0 należy wpisać pięć wartości intensywności tła. 
		UWAGA: Do analizy TACI wymagany jest plik Background_list.csv EKSTRAKT funkcja. Jeśli tło jest pomijalne, należy dostarczyć plik Background_list.csv zawierający intensywność tła zerowego dla każdego neuronu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj EKSTRAKT funkcja służąca do identyfikacji maksymalnych intensywności fluorescencji dla każdej pozycji t oraz obliczania ΔF/F0 jak pokazano w równaniu (1). 
	<img alt="Wzór na zmianę fluorescencji ΔF/F₀, równowaga statyczna, analiza ilościowa." src="/files/ftp_upload/64953/64953eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">    (1)
	<ol>
		<li>Utwórz folder i nazwij go zgodnie z numerem neuronu, zaczynając od Neuron 0. W folderze zapisz pliki CSV zawierające informacje o fluorescencji odpowiadającego im neuronu. Każdy plik CSV zawiera informacje dla jednej pozycji z, zatem liczba plików CSV odpowiada liczbie analizowanych pozycji z. Nazwij pliki CSV jako Mean_Intensity#.csv (# oznacza pozycję z); każdy plik CSV musi zawierać co najmniej dwie kolumny: POSITION_T oraz MEAN_INTENSITY lub MEAN_INTENSITY_CH1. 
		UWAGA: Należy utworzyć folder dla każdej analizowanej komórki.</li>
		<li>Zapisz plik Background_list.csv oraz foldery utworzone w kroku 2.7.1 w jednym folderze. Wybierz ten folder, klikając w Przeglądaj pliki. 
		UWAGA: Liczba wartości tła w pliku Background_list.csv musi odpowiadać liczbie plików Mean_Intensity#.csv dla każdego neuronu.</li>
		<li>Plik tła jest wypełniany automatycznie. Wypełnij jak największą liczbę pozycji t dla Liczba pozycji T.</li>
		<li>Kliknij Ekstrakt w celu utworzenia folderu z wynikami, zawierającego pliki CSV oraz wykresy dla każdego neuronu. Pliki CSV zawierają informacje o maksymalnej intensywności fluorescencji oraz ΔF/F0 w każdym punkcie t. Wykresy przedstawiają przebiegi zmian ΔF/F w formie wykresów liniowych0 w pozycjach t. 
		UWAGA: W niniejszym badaniu ΔF/F0 obliczono za pomocą równania (1). Pierwszą wartość dla każdej pozycji z wykorzystano jako F0. Jeśli ten F0 jest niewłaściwe20Wtyczka udostępnia pliki, w tym surowe dane dla każdego neuronu, znajdujące się w folderze python_files.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj ŁĄCZENIE funkcja do wyznaczania średniej wartości ΔF/F dla każdego neuronu0, oblicz błąd standardowy średniej (SEM) i przedstaw na wykresie średnią wartość ΔF/F0 w pozycjach t.
	<ol>
		<li>Wybierz folder z wynikami utworzony przez EKSTRAKT funkcja poprzez kliknięcie w Przeglądaj pliki.</li>
		<li>Wypełnij Liczba pozycji T z największą liczbą pozycji t.</li>
		<li>Kliknij Scalanie w celu utworzenia folderu merged_data, zawierającego plik merged_data.csv oraz wykres Average_dF_F0.png. Plik CSV zawiera informacje o średniej i błędzie standardowym średniej (SEM) dla ΔF/F00 w każdej pozycji t. Wykresem jest wykres liniowy średniej wartości ΔF/F0 w pozycjach t.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((jGCaMP8+fast+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Janelia+Research+Campus%22%5BJournal%5D)">jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators.</a> Janelia Research Campus. , (2020).</li>
<li>Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+analysis+-+How+far+have+we+come%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging analysis - How far have we come.</a> F1000Research. 10, 258(2021).</li>
<li>Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analysis+of+genetically+encoded+calcium+indicators+linking+neural+circuits+and+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Korean+Journal+of+Physiology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors.</a> The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).</li>
<li>Stringer, C., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+processing+of+neural+recordings+from+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Computational processing of neural recordings from calcium imaging data.</a> Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NoRMCorre%3A+An+online+algorithm+for+piecewise+rigid+motion+correction+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data.</a> Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).</li>
<li>Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatically+tracking+neurons+in+a+moving+and+deforming+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain.</a> PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517(2017).</li>
<li>Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMC2%3A+A+versatile+algorithm+for+robust+tracking+of+calcium+dynamics+from+individual+neurons+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173(2019).</li>
<li>Delestro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+large-scale+analysis+of+Drosophila+neuronal+calcium+traces+by+automated+tracking+of+single+somata%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata.</a> Scientific Reports. 10, 7153(2020).</li>
<li>Cantu, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZcalcium%3A+Open-source+toolbox+for+analysis+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data.</a> Frontiers in Neural Circuits. 14, 25(2020).</li>
<li>Eglen, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+standard+practices+for+sharing+computer+code+and+programs+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience.</a> Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).</li>
<li>Pachitariu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suite2p%3A+Beyond+10%2C000+neurons+with+standard+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy.</a> bioRxiv. , (2017).</li>
<li>Corder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amygdalar+neural+ensemble+that+encodes+the+unpleasantness+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain.</a> Science. 363 (6424), 276-281 (2019).</li>
<li>Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+calcium+dynamics+from+individual+neurons+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals.</a> PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432(2021).</li>
<li>Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesmerize+is+a+dynamically+adaptable+user-friendly+analysis+platform+for+2D+and+3D+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data.</a> Nature Communications. 12, 6569(2021).</li>
<li>Moein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaSiAn%3A+A+Calcium+Signaling+Analyzer+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool.</a> Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+accurate+extraction+of+in+vivo+calcium+signals+from+microendoscopic+video+data%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data.</a> Elife. 7, 28728(2018).</li>
<li>Neugornet, A., O'Donovan, B., Ortinski, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+effects+of+event+detection+methods+on+the+analysis+and+interpretation+of+Ca%282%2B%29+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 620869(2021).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Fazeli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+tracking+using+StarDist+and+TrackMate%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Automated cell tracking using StarDist and TrackMate.</a> F1000Research. 9, 1279(2020).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ionotropic+receptors+IR21a+and+IR25a+mediate+cool+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila.</a> Elife. 5, 13254(2016).</li>
<li>Omelchenko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cool+and+warm+ionotropic+receptors+control+multiple+thermotaxes+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).</li>
<li>Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expression+atlas+of+variant+ionotropic+glutamate+receptors+identifies+a+molecular+basis+of+carbonation+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing.</a> Nature Communications. 9 (1), 4252(2018).</li>
<li>Hernandez-Nunez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+and+opponent+thermosensors+use+flexible+cross-inhibition+to+orchestrate+thermal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis.</a> Science Advances. 7 (35), (2021).</li>
<li>Klein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+determinants+of+behavioral+dynamics+in+Drosophila+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym badaniu opracowano nową wtyczkę ImageJ, TACI, i opisano przepływ pracy analizujący obrazowanie 3D wapnia. Wiele obecnie dostępnych narzędzi koncentruje się na korekcji ruchu x/y, chociaż ruch na osi z również musi być wyraźnie zdiagnozowany lub skorygowany6. Podczas akwizycji obrazu w żywym organizmie ruch na osi Z jest nieunikniony nawet wtedy, gdy organizm jest unieruchomiony, a niektóre bodźce, takie jak zmiana temperatury, często powodują znaczny dryft z. Zwiększenie wysokości stosów z p...

Poziom wewnątrzkomórkowego wapnia jest precyzyjnym markerem pobudliwości neuronalnej. Obrazowanie wapnia mierzy zmiany w wewnątrzkomórkowym wapniu, aby zrozumieć aktywność neuronalną1. W badaniach neurobiologicznych coraz częściej stosuje się tę metodę ze względu na rozwój technik pomiaru wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, w tym genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI), takich jak GCaMP2,3, które mogą być nieinwazyjnie wyrażane w określonych zestawach neuronów za pomocą podejść genetycznych. Niższe koszty laserów i komponentów mikroskopów przyczyniły się również do zwiększenia wykorzystania obrazowania wapniowego4. Co ważne, obrazowanie wapnia pozwala na rejestrowanie i badanie pojedynczych neuronów, jak również dużych populacji neuronów jednocześnie u swobodnie poruszających się zwierząt5.
Niemniej jednak, analiza danych obrazowania wapnia jest wyzwaniem, ponieważ (1) polega na śledzeniu zmian we fluorescencji poszczególnych komórek w czasie, (2) sygnał fluorescencyjny sporadycznie znika lub pojawia się ponownie z odpowiedziami neuronalnymi, oraz (3) neurony mogą poruszać się we wszystkich kierunkach, szczególnie wewnątrz i na zewnątrz płaszczyzny ogniskowej lub pojawiając się na wielu płaszczyznach4, 6. Ręczna analiza jest czasochłonna i staje się niepraktyczna wraz ze wzrostem długości nagrań i liczby neuronów. Opracowano różne programy komputerowe w celu przyspieszenia procesu analizy obrazowania wapnia. Wcześniej oprogramowanie było projektowane w ograniczonym kontekście eksperymentalnym, co utrudniało jego przyjęcie przez inne laboratoria. Niedawne wysiłki mające na celu spełnienie nowoczesnych standardów udostępniania oprogramowania doprowadziły do opracowania kilku narzędzi, które mogą konsekwentnie analizować dane obrazowania wapnia w różnych grupach7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Jednak większość z tych narzędzi wymaga wiedzy programistycznej i/lub jest zależna od oprogramowania komercyjnego. Brak wiedzy programistycznej i zapory płatne za oprogramowanie powstrzymują badaczy przed stosowaniem tych metod. Co więcej, wiele z tych narzędzi skupia się na korekcji ruchu x/y, chociaż ruch na osi z również musi być wyraźnie zdiagnozowany i skorygowany6. Istnieje zapotrzebowanie na narzędzie obliczeniowe do analizy obrazowania 3D wapnia, które koncentruje się na neuronach wykazujących dryf z i pojawiających się na wielu płaszczyznach z. Idealnie byłoby, gdyby to narzędzie korzystało z oprogramowania typu open source i nie wymagało wiedzy programistycznej, aby inne laboratoria mogły je łatwo przyjąć.
Tutaj opracowaliśmy nową wtyczkę ImageJ, TACI, do analizy danych obrazowania 3D wapnia. Po pierwsze, w razie potrzeby oprogramowanie zmienia nazwę i porządkuje dane obrazowania 3D wapnia według pozycji z. Interesujące komórki są śledzone w każdej pozycji z, a ich intensywność fluorescencji jest wyodrębniana przez TrackMate lub inne narzędzia obliczeniowe. TACI jest następnie stosowany do badania ruchu na osi z. Identyfikuje maksymalną wartość stosu z i używa jej do reprezentowania intensywności komórki w odpowiednim punkcie czasowym. Ten przepływ pracy jest odpowiedni do analizy obrazowania 3D wapnia z ruchem we wszystkich kierunkach i/lub z neuronami nakładającymi się w kierunku bocznym (x/y), ale pojawiającymi się w różnych pozycjach z. Aby zweryfikować ten przebieg pracy, wykorzystano zestawy danych obrazowania 3D wapnia z termowrażliwych neuronów larw much i neuronów grzybowych w mózgu. Warto zauważyć, że TACI jest wtyczką ImageJ o otwartym kodzie źródłowym i nie wymaga żadnej wiedzy programistycznej.

<table><tbody><tr><td>igła do napełniania</td><td>BD</td><td>303129</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>10035-04-8</td><td>Składnik pokarmu dla much</td></tr><tr><td>Dwutlenek węgla</td><td>Airgas</td><td>UN1013</td><td>Rozmiar 200 Stalowy cylinder wysokociśnieniowy</td></tr><tr><td>Zestaw bełkotki CO2</td> Mikroskop konfokalny <td>Genesee</td><td>59-180</td><td></td></tr><tr><td>LSM880</td><td>Zeiss</td><td>4109002107876000</td><td>Odwrócony Axio Observer Z1, wyposażony w 5 laserów, 2 standardowe detektory PMT, 32-kanałowe detektory GaAsP, detektor Airyscan i Definite Ostrość.2.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie DAQami</td><td>Pomiar Obliczenia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Genesee</td><td>62-113</td><td>Składnik pokarmu dla much</td></tr><tr><td>Drosophila Agar</td><td>Genesee</td><td>66-111</td><td>Składnik pokarmu dla much</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>64-17-5</td><td>Składnik pokarmu dla much</td></tr><tr><td>Linia muchowa: Ir21a-Gal4</td><td>Dr. Paul Garrity lab</td><td></td><td>Miły prezent</td></tr><tr><td>Linia muchowa: Ir21a-Gal80</td><td>Dr. Lina Ni lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linia muchowa: Ir68a-Gal4</td><td>Dr. Aravinthan DT Samuel lab</td><td></td><td>Miły prezent</td></tr><tr><td>Linia lotnicza: Ir93a-Gal4</td><td>Dr. Paul Garrity lab</td><td></td><td>Miły prezent</td></tr><tr><td>Linia muchowa: UAS-GCaMP6</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>42750</td><td></td></tr><tr><td>Flypad</td><td>Genesee</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalny regulator z kutego mosiądzu</td><td>Gentec</td><td>G152</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS pH 7,4 (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Zielona rurka Drosophila</td><td>Genesee</td><td>59-124</td><td></td></tr><tr><td>Związek przenoszący ciepło</td><td>MG Chemicals</td><td>860-60G</td><td></td></tr><tr><td>Radiator</td><td>Digi-Key Electronics</td><td>ATS2193-ND</td><td>Zmień rozmiar na 12,9 x 5,5 cm</td></tr><tr><td>Oświetlacz</td><td>AmScope</td><td>LED-6W</td><td></td></tr><tr><td>Nieaktywne suche drożdże</td><td>Genesee</td><td>62-108</td><td>Inkubator do składników pokarmu dla much</td></tr><tr><td></td><td>Pervical</td><td>DR-41VL</td><td>Światło: ciemny cykl: 12h:12h; Temperatura: 25 & Deg; C; wilgotność: 40-50% wilgotności względnej.</td></tr><tr><td>Methyl-4-hydroxybenzoesan</td><td>Thermo Scientific</td><td>126965000</td><td>Pokarm dla much ingrediete</td></tr><tr><td>Szkło z mikro pokrywą</td><td>VWR&</td><td>nbsp; 48382-126</td> Szkiełka mikroskopowe <td>22 x 40 mm</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-544-2</td><td>25 x 75 x 1,0 mm</td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Kleancolor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wąskie fiolki Drosophila</td><td>Genesee</td><td>32-113RL</td><td></td></tr><tr><td>Cel pracy&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>420852-9871-000</td><td>LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Corr DIC M27</td></tr><tr><td>Moduł chłodzący Peltiera</td><td>TE Technology</td><td>TE-127-1.0-0,8</td><td>30 x 30 mm</td></tr><tr><td>Wtyczki</td><td>Genesee</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>Specjaliści</td> od <td>obwodów</td> zasilania <td>CSI1802X</td><td>liniowy zasilacz laboratoryjny 10 V DC 2.0 Amp</td></tr><tr><td>Princeton Artist Brush Nepture</td><td>Princeton Artist Brush Co.</td><td></td><td>Seria 4750, rozmiar 2</td></tr><tr><td>Tetrahydrat L-winianu sodowo-potasowego</td><td>Thermo Scientific</td><td>033241-36</td><td>Składnik pokarmu na muchy</td></tr><tr><td>Wkładka sceniczna&nbsp;</td><td>Wienecke i Sinske</td><td>432339-9030-000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td>Każdy mikroskop stereoskopowy działa</td></tr><tr><td>T-Fitting</td><td>Genesee</td><td>59-123</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do akwizycji danych termopary</td><td>Pomiar Obliczenia</td><td>USB-2001-TC</td><td>Jednokanałowa</td></tr><tr><td>mikrosonda termoparowa</td><td>Physitemp</td><td>IT-24P&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Żółta mąka kukurydziana</td><td>Genesee</td><td>62-101</td><td>Składnik pokarmu dla much</td></tr><tr><td>Etap piezoelektryczny osi Z</td><td>Wienecke i Sinske</td><td>432339-9000-000</td><td></td></tr></tbody></table>

taci: wtyczka imagej do analizy obrazowania 3d wapnia

TACI: An ImageJ Plugin for 3D Calcium Imaging Analysis

Badania w neuronauce ewoluowały, aby wykorzystywać złożone narzędzia obrazowania i obliczeniowe do wydobywania wyczerpujących informacji z zestawów danych. Obrazowanie wapnia jest szeroko stosowaną techniką, która wymaga zaawansowanego oprogramowania w celu uzyskania wiarygodnych wyników, ale wiele laboratoriów ma trudności z przyjęciem metod obliczeniowych podczas aktualizacji protokołów w celu spełnienia nowoczesnych standardów. Trudności wynikają z braku wiedzy programistycznej i opłat za oprogramowanie. Ponadto interesujące komórki wykazują ruchy we wszystkich kierunkach podczas obrazowania wapnia. Opracowano wiele podejść do korygowania ruchu w kierunku bocznym (x/y).
Ten artykuł opisuje przepływ pracy przy użyciu nowej wtyczki ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), do badania ruchu na osi Z w obrazowaniu 3D wapnia. To oprogramowanie identyfikuje maksymalną wartość fluorescencji ze wszystkich pozycji z, w których pojawia się neuron, i wykorzystuje ją do reprezentowania intensywności neuronu w odpowiedniej pozycji t. Dlatego to narzędzie może oddzielać neurony nakładające się na siebie w kierunku bocznym (x/y), ale pojawiające się na różnych płaszczyznach z. Jako wtyczka ImageJ, TACI jest przyjaznym dla użytkownika narzędziem obliczeniowym typu open source do analizy obrazowania 3D wapnia. Zweryfikowaliśmy ten przepływ pracy za pomocą termoczułych neuronów larw much, które wykazywały ruchy we wszystkich kierunkach podczas wahań temperatury, oraz zestawu danych do obrazowania 3D wapnia uzyskanego z mózgu muchy.

Przebieg analizy 3D obrazowania wapnia 
W niniejszym badaniu opracowaliśmy nowy plugin do programu ImageJ o nazwie TACI oraz opisaliśmy procedurę śledzenia dryftu w osi z i analizy 3D obrazowania wapnia, która pozwala precyzyjnie określić odpowiedzi poszczególnych komórek pojawiających się w wielu pozycjach z (Rycina 1). Narzędzie to posiada cztery funkcje: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT oraz MERGE. Po pierwsz...

TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) to wtyczka ImageJ o otwartym kodzie źródłowym do analizy obrazowania 3D wapnia, która bada ruch na osi z i identyfikuje maksymalną wartość każdego stosu z, aby reprezentować intensywność komórki w odpowiednim punkcie czasowym. Może rozdzielać neurony nakładające się na siebie w kierunku bocznym (x/y), ale na różnych płaszczyznach z.

TACI: Wtyczka ImageJ do analizy obrazowania 3D wapnia

Research in neuroscience has evolved to use complex imaging and computational tools to extract comprehensive information from data sets. Calcium imaging ...

Podczas zapisu obrazowania wapnia komórki poruszają się we wszystkich kierunkach. Opracowano wiele narzędzi do korekcji ruchu X i Y, ale ruch na osi Z również musi być wyraźnie zdiagnozowany i skorygowany. TACI to przyjazna dla użytkownika wtyczka J do obrazów o otwartym kodzie źródłowym.Sprawdza dryft Z i analizuje obrazowanie 3D wapnia z ruchem we wszystkich kierunkach. Po przygotowaniu larw much opłucz je trzykrotnie w PBS. Odpipetować 75 mikrolitrów PBS na środek szklanego szkiełka.Umieść jedną lub dwie larwy w PBS i umieść sondę mikropary termopary w pobliżu larw. Przykryj larwy i mikrosondę termopary szklanym szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij je lakierem do paznokci. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu.Znajdź ostrość za pomocą obiektywu 25 razy i umieść termo-elektryczną lodówkę na szkiełku. W oprogramowaniu konfokalnym skup się na interesujących nas komórkach fluorescencyjnych. Dostosuj moc lasera, aby uniknąć przesycenia i ustaw pierwszą i ostatnią pozycję plasterka w ustawieniu stosu Z.Jednocześnie rozpocznij skanowanie stosu Z i rejestrację temperatury. Kontroluj zasilanie, które zasila Peltiera, aby zmienić temperaturę powierzchni Peltiera. Następnie zatrzymaj skanowanie stosu Z i rejestrację temperatury.Po pobraniu słoika z kropkami do obrazowania wapnia TACI zainstaluj wtyczkę na Fidżi, klikając wtyczki na pasku menu, a następnie zainstaluj w menu rozwijanym. Następnie uruchom ponownie Fiji i uruchom wtyczkę, klikając wtyczki i wybierając obrazowanie wapnia TACI. Wybierz funkcję zmiany nazwy, aby przekonwertować nazwy plików TIFF na wymaganą strukturę.Wybierz folder, w którym obrazy TIFF wymagają zmiany, klikając przycisk Przeglądaj foldery i poczekaj, aż nazwa pliku zostanie wypełniona automatycznie, używając nazwy folderu. sprawdź maksymalną pozycję T i maksymalną pozycję Z. Upewnij się, że wartości parametrów dla maksymalnej pozycji T i maksymalnej pozycji Z zawierają wszystkie cyfry.Wprowadź pozycję każdego parametru w kolejności. Jeśli nazwy plików TIFF nie zawierają frazy i kanału, pozostaw odpowiednią wartość parametru pustą i wybierz NA w kolejności. Jeśli jest jakiś posttext, dodawany do parametru posttext.Kliknij przycisk Zmień nazwę, aby utworzyć folder o tej samej nazwie, a następnie podkreślenie R. Zwróć uwagę, że nazwy plików TIFF zostały zrestrukturyzowane w folderze, aby były zgodne z funkcją organizowania. Następnie użyj funkcji organizowania, aby zapisać obrazy TIFF w tej samej pozycji Z w jednym folderze. Wybierz folder, w którym obrazy T wymagają uporządkowania, klikając przycisk Przeglądaj foldery.Jeśli plik CSV z parametrami istnieje, poczekaj, aż wartości parametrów zostaną wypełnione automatycznie. Jeśli plik CSV z parametrami nie istnieje, ręcznie wypełnij wartości parametrów. Upewnij się, że wartości parametrów fazy i kanału zawierają litery, jeśli są obecne, podczas gdy wartości parametrów pozycji T i pozycji Z powinny być największymi liczbami pozycji T i Z.Jeśli nazwy plików obrazu nie zawierają fazy lub kanału, wprowadź NA. Następnie w razie potrzeby utwórz obrazy TIFF w skali szarości, upewniając się, że pole R images gray (Szare) nie jest zaznaczone. Kliknij przycisk Organizuj, aby utworzyć folder o tej samej nazwie, po którym następują stosy szarych podkreśleń, oraz aby wygenerować foldery o tej samej nazwie, po której następuje podkreślenie i numer pozycji Z w folderze. Następnie zwróć uwagę, że pliki TIFF są posortowane w odpowiednich folderach według pozycji Z i że zostanie wygenerowany plik o nazwie param dot CSV, w którym można znaleźć parametry i ich wartości.Teraz użyj trackmate na Fidżi, aby wyodrębnić intensywność fluorescencji interesujących komórek z każdej pozycji Z. Otwórz obrazy TIFF w folderze pozycji Z na Fidżi i uruchom TRACKMATE, klikając wtyczki i wybierając śledzenie, a następnie Trackmate. Dostosuj parametry za pomocą detektorów DOG lub LOG.Zmień próg średnicy plamy i filtr mediany. Ustaw filtry, aby usunąć nieistotne sygnały. Ustaw maksymalną odległość łączenia, maksymalną odległość zamykania odstępu i maksymalny odstęp zamykania odstępu.Eksportuj intensywności fluorescencji obszarów zainteresowania do pliku CSV. Dla każdego neuronu utwórz folder i nazwij go za pomocą numeru neuronu. Zaczynając od neuronu zero.Zapisz pliki CSV zawierające informacje o fluorescencji odpowiedniego neuronu w folderze. Nazwij pliki CSV jako średnią intensywność Z pozycja numer kropka CSV i dołącz co najmniej dwie kolumny, pozycję T i średnią intensywność lub średni kanał intensywności jeden. Utwórz plik CSV z listą podkreśleń w tle, który zawiera informacje o wszystkich neuronach w określonym formacie, zaczynając od zera neuronu.Wypełnij numery neuronów, takie jak neuron zero w wierszu pierwszym. Następnie podaj intensywność tła dla każdej analizowanej pozycji Z. Jeśli cztery pozycje Z są analizowane dla neuronu zero, wypełnij cztery wartości intensywności tła poniżej neuronu zero.Zapisz utworzoną listę tła w pliku CSV z kropką i folderami zawierającymi pliki CSV z informacjami o fluorescencji w jednym folderze. Otwórz TACI i wybierz funkcję wyodrębniania. Następnie wybierz folder, klikając przeglądaj pliki.Plik w tle jest wypełniany automatycznie. Wypełnij największą liczbę pozycji T dla liczby pozycji T. Kliknij przycisk Wyodrębnij, aby utworzyć folder wyników zawierający pliki CSV i wykresy każdego neuronu.Pliki CSV zawierają maksymalną intensywność fluorescencji oraz deltę F powyżej zera w każdej pozycji T. Wykresy są wykresami liniowymi pozycji delta F powyżej F zero w stosunku do T. Korzystając z funkcji scalania, uśrednij deltę F przez F zero ze wszystkich neuronów.Oblicz SEM i wykreśl średnią deltę F powyżej F zero nad pozycjami T. Wybierz folder wyników utworzony przez funkcję wyodrębniania, klikając przeglądaj pliki. Wypełnij liczbę pozycji T największą liczbą pozycji T.Kliknij przycisk Scal, aby utworzyć scalony folder danych, zawierający plik CSV scalonych podkreślonych danych i wykres PNG z uśrednionym podkreśleniem DF z zerową kropką. Plik CSV zawiera informacje o średniej i SEM delta F nad F zero w każdej pozycji T. Wykres jest wykresem liniowym średniej delty F powyżej F zero nad pozycjami T.Obrazowanie wapnia chłodnych komórek larw much wykazujących ekspresję GCaMP six M prawie nie wykazuje fluorescencji w stanie nieaktywnym w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Jednak wewnątrzkomórkowy poziom wapnia gwałtownie wzrósł w temperaturze 10 stopni Celsjusza. Poziom wapnia gwałtownie spadał, gdy temperatura wzrastała.Obrazowanie wapniowe neuronów mózgu muchy wyrażających GCaMP sześć F w czasie 0,1 wykazało fluorescencję w czterech z siedmiu neuronów, a intensywność tych neuronów zmniejszała się z czasem. W obecności ósemki wiele neuronów rozjaśniało się. Fluorescencja 10 neuronów wzrosła jednocześnie w punkcie czasowym 92, co sugeruje, że te grzybowe neurony reagują na zapach ośmiokątny.TACI może oddzielać nakładające się na siebie komórki. Na tym obrazie projekcji maksymalnej zidentyfikowano dwa nakładające się na siebie neurony. Neurony te zostały rozdzielone w widoku orthro, co wskazuje, że neurony te pojawiły się w różnych pozycjach Z.Pomarańczowa komórka pokazała najsilniejszy sygnał na Z 7, podczas gdy niebieska komórka miała najsilniejszy sygnał na Z 10. Zmiana fluorescencji tych dwóch komórek ujawniła opóźnioną, ale silną aktywację pomarańczowej komórki. Podczas ekstrakcji maksymalna wartość fluorescencji ze wszystkich pozycji Z, w których pojawia się neuron, jest używana do reprezentowania intensywności neuronu przy odpowiednim osadzaniu.W przypadku korzystania z TACI do analizy dużej liczby neuronów, pewna rejestracja w pozycjach Z musi zostać uwzględniona w nowej funkcji, która ma zostać opracowana w sposób zorganizowany z informacjami o fluorescencji. TACI zapewnia przyjazne dla użytkownika podejście obliczeniowe typu open source do analizy obrazowania kapsułek 3D w celu sprawdzenia ruchu komórek na osi Z, gdy pojedyncze komórki pojawiają się w wielu pozycjach Z.

taci-an-imagej-plugin-for-3d-calcium-imaging-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Szczegółowe metody obrazowania Ca2+ o wysokiej rozdzielczości w mięśniach gładkich w obrębie izolowanych organów, obejmujące: przygotowanie tkanki, akwizycję obrazu oraz analizę danych.

Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca2+ w mięśniach gładkich

Źródło: Łukasz, D., et al. Obrazowanie in vivo wapnia komórek rzęsatych linii bocznej u larw danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje obrazowanie na żywo napływu wapnia do komórek rzęsatych linii bocznej sparaliżowanej transgenicznej larwy danio pręgowanego przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Mechaniczna stymulacja wiązek włosów za pomocą impulsów płynu indukuje wnikanie wapnia przez kanały mechanotransdukcji i kanały bramkowane napięciem, co jest wizualizowane w czasie...

Obrazowanie dynamiki wapnia w komórkach rzęsatych linii bocznej larw danio pręgowanego

Tutaj zademonstrowany jest nowatorski protokół analizy interesujących regionów, oparty na sortowaniu najlepiej dopasowanych elips przypisanych do regionów pozytywnego sygnału w dwuwymiarowych sekwencjach obrazów poklatkowych. Algorytm ten może umożliwić badaczom kompleksową analizę fizjologicznych sygnałów Ca2 + przy minimalnym wkładzie użytkownika i stronniczości.

Automatyczna analiza dynamicznych sygnałów Ca2+ w sekwencjach obrazów

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Ten artykuł opisuje kwantyfikację hemocytometru i mikrofotografii migracji/inwazji za pomocą dwóch nowych wtyczek ImageJ o otwartym kodzie źródłowym: Kalkulatora Stężenia Komórek i Licznika Testu Migracji.  Ponadto opisano w nim protokoły akwizycji i kalibracji obrazu, a także szczegółowo omówiono wymagania wejściowe wtyczek.

Zautomatyzowana kwantyfikacja i analiza procedur zliczania komórek za pomocą wtyczek ImageJ

Ten artykuł opisuje dwie nowatorskie wtyczki ImageJ do analizy obrazów 'Clock Scan'. Wtyczki te rozszerzają funkcjonalność oryginalnego programu Visual Basic 6 i, co najważniejsze, udostępniają program dużej społeczności badawczej, łącząc go z bezpłatnym pakietem oprogramowania do analizy obrazu ImageJ.

Protokół skanowania zegara do analizy obrazu: wtyczki ImageJ

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Prezentujemy proces tworzenia segmentacji i kwantyfikacji kości beleczkowych dla obrazów 2D i 3D na podstawie zewnętrznej granicy kości za pomocą wtyczki ImageJ. Podejście to jest bardziej wydajne i dokładne niż obecne podejście do ręcznego ręcznego konturowania i zapewnia kwantyfikację warstwa po warstwie, która nie jest dostępna w obecnym oprogramowaniu komercyjnym.

Segmentacja i kwantyfikacja kości beleczkowych wspomagana granicami zewnętrznymi za pomocą wtyczki Imagej

Danio pręgowany to modelowy system, który posiada wiele cennych cech, w tym przejrzystość optyczną, szybki rozwój zewnętrzny oraz, co szczególnie ważne dla dziedziny słuchu i równowagi, zewnętrznie zlokalizowane czuciowe komórki rzęsate. W tym artykule opisano, w jaki sposób transgeniczny danio pręgowany może być używany do oznaczania zarówno mechanosensacji komórek rzęsatych, jak i funkcji presynaptycznych in toto.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek rzęsatych w linii bocznej u larw danio pręgowanego

Genetycznie kodowane wskaźniki Ca2+ (GECI) radykalnie zmieniły sposób wykonywania obrazowania in situ Ca2+. Aby zmaksymalizować odzysk danych z takich nagrań, wymagana jest odpowiednia analiza sygnałów Ca2+. Protokoły przedstawione w tym artykule ułatwiają kwantyfikację sygnałów Ca2+ zarejestrowanych in situ przy użyciu mapowania czasoprzestrzennego i analizy opartej na cząstkach.

Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ in situ

Ten protokół przedstawia kroki do pozyskiwania i analizy fluorescencyjnych obrazów wapnia z perycytów otaczających mózg oraz danych o przepływie krwi z pobliskich naczyń krwionośnych u znieczulonych myszy. Techniki te są przydatne do badań nad fizjologią komórek szkieletowych i mogą być dostosowane do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki.

Obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo

Poznaj wtyczkę TACI do ImageJ do analizy obrazowania wapnia 3D, która koryguje ruch w osi Z i poprawia dokładność pomiarów intensywności neuronów. To narzędzie open-source usprawnia badania neurobiologiczne.

TACI: Wtyczka ImageJ do analizy obrazowania 3D wapnia

Przeglądaj więcej filmów