Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili

Protokół ten koncentruje się na ilościowym określeniu oddychania mitochondrialnego neutrofili myszy i ludzi, a także neutrofilopodobnych komórek HL60 za pomocą analizatora metabolicznego strumienia zewnątrzkomórkowego. Ta metoda pozwala nam określić ilościowo funkcję mitochondriów w neutrofilach w warunkach normalnych i chorobowych. Jest to prosta technika, która może dostarczyć informacji na temat funkcji mitochondriów komórek w odpowiedzi na leki lub dowolny stan chorobowy.

Ponieważ różne komórki mają różną mitochondrialną wydolność oddechową, optymalizacja gęstości wysiewu komórek i stężenia odczynników musi być wykonana dokładnie, aby uzyskać wysokiej jakości wyniki. Aby rozpocząć test metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego, weź wkład z czujnikiem umieszczony na specjalnie zaprojektowanej 96-dołkowej płytce i przenieś 200 mikrolitrów pożywki kalibracyjnej do każdej studzienki leżącej pod spodem płytki. Ostrożnie podnieś wkład i płytkę z kalibrem i umieść je na noc w inkubatorze bez dwutlenku węgla nawilżonym w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu nawodnienia.

Następnie, w zależności od typu komórki, pokryj 96-dołkową płytkę specjalną powłoką, aby zapewnić adhezję komórek. Następnie dwukrotnie umyj płytki 200 mikrolitrami sterylnego PBS. Przygotować pożywkę do oznaczania w DMEM z jednym milimolowym pirogronianem, 10-milimolową glukozą i dwiema milimolowymi glutaminami.

Pozyskać mysie i ludzkie komórki neutrofilowe zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu. W przypadku neutrofili pobranych od myszy dostosuj gęstość komórek do 1,1 razy 10 do szóstych komórek na mililitr, dodając pożywkę testową. Następnie wysiewaj 180 mikrolitrów zawiesiny neutrofili myszy na studzienkę do przygotowanej 96-dołkowej płytki.

Podobnie dostosuj gęstość ludzkich komórek neutrofilowych do 2,2 razy 10 do szóstych komórek na mililitr za pomocą pożywki testowej. W dniu testu należy ręcznie policzyć neutrofile podobne do HL60 za pomocą hemocytometru. Następnie odwirować zróżnicowane lub niezróżnicowane komórki HL60 w temperaturze 300G w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Umyj komórki raz DMEM i ponownie zawiesij je w pożywce testowej, aby osiągnąć gęstość komórek 1,39 razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Następnie wysiewaj 180 mikrolitrów zróżnicowanych lub niezróżnicowanych komórek HL60 na wstępnie przygotowanej 96-dołkowej płytce zawierającej próbki neutrofili myszy i ludzi. Na koniec dodaj kompletną pożywkę do narożnych dołków płytki do hodowli komórkowej pozbawionej komórek w celu korekcji tła podczas wysiewu.

Odwirować płytkę w temperaturze 300G w temperaturze pokojowej przez trzy minuty bez przerwy, aby zapewnić prawidłowe przyleganie komórek na dnie płytki. Na koniec inkubować płytkę przez godzinę, aby wstępnie zrównoważyć komórki z podłożem testowym. Otwórz zestaw do testu wysiłkowego mitochondriów i przygotuj odczynniki zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie załaduj wkład odczynnikami, zaczynając od przygotowanej oligomycyny do portu A, FCCP do portu B, a mieszaniny rotenonu i antymycyny A do portu C do wstrzykiwań. Napełnij nieużywane porty 20 mikrolitrami pożywki testowej. Zrównoważ system testowy w temperaturze 37 stopni Celsjusza co najmniej pięć godzin przed testem, otwierając oprogramowanie Wave i klikając kartę Grzałka włączona.

Po osiągnięciu temperatury w lewym dolnym rogu oprogramowania Wave pojawia się stan gotowy. Otwórz szablon zestawu do testowania stresu mitochondrialnego w oprogramowaniu. Wybierz strategie wstrzykiwania po lewej stronie, a następnie kliknij przycisk Dodaj i nazwij warunek wstrzyknięcia jako neutrofile ludzkie, neutrofile myszy lub HL60.

Wybierz port A do D, klikając na każdy, a następnie kliknij Dodaj związek i wprowadź oligomycynę lub FCCP lub rotenon/antymycynę A o odpowiednich stężeniach. Wybierz opcję Obróbka wstępna po lewej stronie, a następnie kliknij przycisk Dodaj i nazwij je osobno CD18 i Cell Tak. Wybierz Typ komórki po lewej stronie.

Następnie kliknij Dodaj i nazwij je neutrofile ludzkie, neutrofile myszy oraz HL60 lub DHL60 z odpowiednią gęstością karmienia. Zdefiniuj grupy, klikając Dodaj grupę. Następnie kliknij na podkreśloną definicję.

Kliknij na Mapę tablic w górnym menu, aby obserwować wszystkie grupy z definicjami po lewej stronie i mapą tablic po prawej stronie. Przeciągnij i upuść, aby dodać każdą studnię do grupy, zachowując cztery narożne studzienki jako tło. Aby skonfigurować protokół, wybierz zakładkę Protokół w górnym menu i zdefiniuj trzy cykle mieszaniny linii podstawowej, oligomycyny, FCCP, rotenonu i antymycyny A, ustawiając czas mieszania na trzy minuty, odpoczynek na minuty zerowe, a pomiar na siedem minut.

Przejdź do strony Uruchom test, podaj informacje podsumowujące projekt w celach informacyjnych, a następnie kliknij przycisk Rozpocznij uruchamianie. Podaj lokalizację, w której chcesz zapisać pliki, aby wszystkie wyniki zostały zapisane po zakończeniu testu. Następnie ponownie kliknij Start Uruchom.

Po automatycznym załadowaniu testu poczekaj, aż taca się otworzy, aby umieścić wkład czujnika i płytkę o kalibrze 200 mikrolitrów. Ustaw kierunek kodu kreskowego kasety skierowany w prawo. Uruchom kalibrację, klikając przycisk Jestem gotowy, co zajmuje około 20 minut.

Po kalibracji kliknij Otwórz tacę, zastąp płytkę płytką z zasiewem komórek i kliknij Jestem gotowy, aby kontynuować test. Po zakończeniu testu dane są automatycznie zapisywane. Eksportuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego lub innego pliku oprogramowania analitycznego.

Narysuj wykres i przeanalizuj dane. Reprezentatywna dynamika wskaźnika zużycia tlenu lub OCR wskazała na zmiany w oddychaniu mitochondrialnym w neutrofilach mysich i ludzkich, a także w niezróżnicowanych i zróżnicowanych komórkach HL60 w odpowiedzi na oligomycynę, FCCP oraz mieszaninę rotenonu i antymycyny A. Wartości OCR zmniejszyły się we wszystkich komórkach po leczeniu oligomycyną z powodu hamowania kanału protonowego syntazy ATP. Leczenie FCCP zwiększyło przepływ elektronów i zużycie tlenu w celu przywrócenia wartości OCR i osiągnięcia maksymalnego oddychania.

Mieszanina rotenonu i antymycyny A zablokowała kompleksy 1 i 3 łańcucha transportu elektronów, prowadząc do eliminacji oddychania mitochondrialnego. Zmniejszone oddychanie mitochondrialne zaobserwowano w komórkach HL60 po różnicowaniu ukierunkowanym na neutrofile. Stwierdzono, że zróżnicowane komórki HL60 mają znacznie niższe podstawowe oddychanie mitochondrialne, oddychanie sprzężone z wyciekiem protonów, oddychanie sprzężone z ATP i oddychanie niemitochondrialne.

Wzrost maksymalnego oddychania zróżnicowanych komórek HL60 nie był istotny, natomiast wolna wydolność oddechowa uległa znacznemu zwiększeniu. Upewnij się, że ogniwa znajdują się na dole płytki, ponieważ wkład czujnika nie powinien mieć żadnych przeszkód ze względu na pływające ogniwa podczas odczytu wartości OCR. Technika ta pomogłaby naukowcom w badaniu wpływu leków lub dysfunkcji mitochondriów w badaniach związanych z neutrofilami.