Podwzgórzowe neurony kisspeptyny jako cel dla nagrań patch-clamp dla całych komórek

Mierząc właściwości elektrofizjologiczne błon komórkowych, pytanie o główne dowodzi, że można rozwiązać problem modulowania aktywności elektrycznej komórki. Zapis całokomórkowy jest techniką peryferyjną do badania prądów jonowych w poszczególnych komórkach i badania odpowiedzi komórkowej na różne bodźce. Najlepsza wydajność na nagraniach wstępnych z zaciskiem krosowym dla całych komórek zostanie osiągnięta po wielu ćwiczeniach i nauce.

Aby rozpocząć sekcję mózgu, wykonaj nacięcie za pomocą nożyczek chirurgicznych w skórze w górnej części czaszki ściętego zwierzęcia od ogona do rostralu i usuń skórę głowy. Następnie przeciąć płytkę międzyciemieniową wzdłuż szwu strzałkowego nożyczkami do tęczówki i usunąć kość potyliczną. Wsuń osteotom pod kość ciemieniową i delikatnie go wyciągnij, aż mózg zostanie odsłonięty.

Po odsłonięciu mózgu odwróć głowę do góry nogami. Delikatnie opuść mózg, aby uwidocznić nerw trójdzielny po każdej stronie. Następnie przetnij nerw trójdzielny za pomocą zakrzywionych nożyczek Castroviejo.

Po wizualizacji podwzgórza zidentyfikuj nerw wzrokowy i delikatnie go przetnij. Następnie przetnij dalszą przednią część płata czołowego. Usuń mózg i natychmiast zanurz go w roztworze do krojenia, aż do uzyskania plasterków.

Aby pokroić próbki mózgu, umieść mózg na bibule filtracyjnej, aby wysuszyć nadmiar roztworu. Następnie za pomocą ostrej żyletki wykonaj cięcie koronalne, oddzielając pień mózgu z móżdżkiem od reszty tkanki. Następnie przyklej część mózgu do podstawy wibratomu i napełnij komorę urządzenia do krojenia roztworem do krojenia lub roztworem CSF schłodzonym do zera do dwóch stopni Celsjusza.

Umieść suchy lód wokół komory wibratomowej, aby roztwór do krojenia był zimny podczas zabiegu. Włóż żyletkę do wibratomu i ustaw parametry cięcia urządzenia, takie jak prędkość na trzy, częstotliwość na dziewięć i posuw na 250 mikrometrów. Podczas procedury krojenia tkanek przenieś plastry za pomocą akrylowej pipety transferowej do komory regeneracyjnej i odczekaj 60 minut na odzyskanie tkanki po pobraniu plastrów.

Przed rozpoczęciem uszczelniania i nagrywania komórek włącz mikroskop, wzmacniacz, digitizer i mikromanipulator. Zbuduj komorę zapisu dołączoną do mikroskopu za pomocą roztworu CSF. Użyj pompy perfuzyjnej, aby stale perfować aCSF z prędkością dwóch mililitrów na minutę.

Sprawdź ustawienia oprogramowania i utwórz określone protokoły dla nagrań w zależności od rodzaju eksperymentu. Przenieś interesujący Cię wycinek mózgu pojedynczo do komory nagraniowej za pomocą akrylowej pipety transferowej. Przytrzymaj plasterek za pomocą kotwicy plasterka, aby nie poruszał się podczas perfuzji CSF.

Umieść plasterek na środku komory zapisu za pomocą soczewki obiektywu o małej mocy mikroskopu zanurzeniowego, 10X lub 20X. Pozycja warstwy ma kluczowe znaczenie, aby umożliwić dobry widok żądanego obszaru pod mikroskopem i zapewnić idealne sięgnięcie do mikropipety rejestrującej. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania przełącz soczewkę obiektywu na soczewkę o dużej mocy, 63X i skup się na poziomie tkanki, obserwując endogenne białko fluorescencyjne i kształty komórek w regionie docelowym, aby zlokalizować komórki kisspeptyny na powierzchni wycinka mózgu.

Gdy znajduje się możliwa komórka docelowa, zaznacz ją na ekranie komputera kursorem myszy lub rysując format taki jak kwadrat nad obszarem zainteresowania. Znacznik ekranowy komputera pomaga wskazać pozycję pipety rejestrującej do celi. Po ustaleniu dokładnego położenia celi należy podnieść obiektyw i wprowadzić mikropipetę rejestrującą wypełnioną roztworem wewnętrznym do uchwytu elektrody, upewniając się, że roztwór wewnętrzny styka się z elektrodą srebrną.

Przed zanurzeniem mikropipety w roztworze aCSF należy zastosować nadciśnienie za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem o pojemności od jednego do trzech mililitrów, połączonej z uchwytem mikropipety za pomocą rurki polietylenowej, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń do mikropipety. Za pomocą mikromanipulatora poprowadź mikropipetę poniżej środka obiektywu. Przesuń przyciski mikromanipulatora, aby poprowadzić oś XYZ mikropipety w kierunku celi zainteresowania.

Dostosuj ostrość tak, aby widzieć końcówkę mikropipety i zbliż ostrość, ale nie za blisko plasterka. Zmniejsz prędkość mikropipety i powoli opuść mikropipetę do miejsca ogniskowania, upewniając się, że końcówka mikropipety nie wnika gwałtownie w plasterek, ale powoli opada, aż dotknie powierzchni komórki lub obszaru docelowego. Zastosowanie lekkiego nadciśnienia za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem o pojemności od jednego do trzech mililitrów w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń ze ścieżki podejścia.

Powoli przesuwaj mikromanipulator na osi XYZ, aby zbliżyć końcówkę mikropipety i dotknąć celi docelowej, co powoduje wgłębienie pod wpływem przyłożonego ciśnienia. Po ustaleniu wgłębienia za pomocą trybu zacisku napięcia w oprogramowaniu, zastosuj słabe, krótkie ssanie ustami przez jedną do dwóch sekund przez rurkę podłączoną do uchwytu mikropipety, aby wytworzyć uszczelnienie między mikropipetą a celą. Jeśli uszczelnienie pozostaje stabilne mechanicznie bez zakłóceń hałasu przez około minutę, ustaw napięcie podtrzymania na najbliższy fizjologiczny potencjał spoczynkowy interesującego ogniwa.

W przypadku kisspeptyny zaleca się neurony podwzgórza minus 50 miliwoltów. Następnie należy zastosować krótkie ssanie doustne, aby przerwać błonę plazmatyczną na końcówce mikropipety uszczelnionej umieszczonej na komórce, tak aby pęknięta błona nie zatkała mikropipety ani nie przyciągnęła znacznej części błony lub komórki. Odpowiednią konfigurację całej komórki można uzyskać, wykonując ssanie z wystarczającą siłą.

Sprawdź używaną instrukcję ustawień systemowych. Po przerwaniu błony komórkowej włącz opcję całego ogniwa w trybie cęgów napięciowych i kliknij na polecenie auto odnoszące się do zakładki całego ogniwa. Rezystancja szeregowa ogniwa i pojemność całego ogniwa są automatycznie obliczane i natychmiast wyświetlane przez oprogramowanie.

Następnie sprawdź parametry żywotności komórek w oprogramowaniu zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Monitoruj rezystancję szeregową i pojemność ogniwa w stanie ustalonym podczas eksperymentów. Gdy cała konfiguracja ogniwa zostanie prawidłowo osiągnięta, zmierz prądy synaptyczne w trybie cęgów napięciowych.

Rejestruj zmiany spoczynkowego potencjału błonowego i indukowane zmiany spoczynkowego potencjału błonowego w bieżącym trybie cęgowania. Możliwy wpływ ludzkiego rekombinowanego hormonu wzrostu na aktywność neuronów kisspeptyny podwzgórza badano za pomocą zapisów klamer całokomórkowych. Podanie ludzkiego rekombinowanego hormonu wzrostu, HGH w dawce 20 mikrogramów na gram, wywołało znaczną hiperpolaryzację spoczynkowego potencjału błonowego w 5 z 12 neuronów kisspeptyny AVPV / PeN i 9 z 14 zarejestrowanych neuronów kisspeptyny ARH.

Hiperspolaryzowane neurony kisspeptyny AVPV/PeN i ARH kisspeptyny znacząco zmieniły spoczynkowy potencjał błonowy w porównaniu z komórkami, które nie reagowały. Wpływ na spoczynkowy potencjał błonowy podczas aplikacji HGH nastąpił po znacznym zmniejszeniu rezystancji wejściowej całej komórki o około 0,9 do 0,7 gigaomów na neuronach kisspeptyny AVPV / PeN i 1,7 do 1,0 gigaomów na neuronach kisspeptyny ARH. Podczas idealnych linii mózgowych wykonywanych za pomocą starannego gigasealu i obszaru w komórce za pomocą plaży wymagane są parametry, aby uzyskać najlepsze zapisy całej komórki.

Roztwór mikropipety z zarejestrowanej komórki może być pobrany i wykorzystany do RTPCR pojedynczej komórki, co pozwala na molekularną charakterystykę izolowanej komórki. Technika klamry całokomórkowej w połączeniu z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanych zwierząt stanowi przełom w zrozumieniu reprodukcji, umożliwiając zdefiniowanie zwiększonych właściwości neuronów kisspeptyny i są one głównymi modulatorami.