Name: Podwzgórzowe neurony kisspeptyny jako cel dla nagrań patch-clamp dla całych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj technikę patch-clamp całokomórkowego do badania aktywności neuronów kisspeptyny w podwzgórzu. Ta metoda elektrofizjologiczna umożliwia precyzyjne pomiary prądów jonowych i właściwości elektrycznych komórek nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Fundację Badawczą São Paulo [numery grantów FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); oraz przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Kod finansowy 001" (HRV).

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Instytutu Nauk Biomedycznych na Uniwersytecie w São Paulo i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi przyjętymi przez Brazylijskie Kolegium Eksperymentów na Zwierzętach.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu wewnętrznego 
	UWAGA: Roztwór wewnętrzny wypełnia mikropipetę z zaciskiem krosowym i styka się z wnętrzem ogniwa (patrz przykład w <silna klasa="xfig">Rysunek 2). Rozwiązania wewnętrzne mogą się różnić w zależności od rodzaju mierzonej aktywności33.
	<ol>
		<li>Wybierz rozwiązanie wewnętrzne, biorąc pod uwagę jego eksperymentalny cel i odpowiedni typ rekordu. Aby zarejestrować potencjał membrany w trybie cęgów prądowych, należy użyć wewnętrznego roztworu składającego się ze 120 mM K-glukonianu, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 3 mM KOH, 10 mM KCl i 4 mM (Mg)-ATP. Zważyć wszystkie sole zgodnie z pożądaną objętością końcową, jak podano w tabeli 1.</li>
		<li>Użyj wystarczającej ilości wody dejonizowanej, aby osiągnąć 90% końcowej objętości roztworu. Ta objętość zapewni wystarczająco dużo miejsca na dostosowanie pH i osmolarności.</li>
		<li>Po dodaniu i dokładnym wymieszaniu wszystkich składników należy za pomocą pH-metru ustawić pH na 7,2-7,3 za pomocą 5 M KOH. Użyj osmometru, aby sprawdzić osmolarność, która powinna wynosić około 275-280 mOsm (w razie potrzeby dostosuj tylko w dół).</li>
		<li>Przygotować wcześniej roztwór wewnętrzny i przechowywać w temperaturze 8 °C. Dodać ATP w dniu eksperymentu. Roztwór wewnętrzny zawierający ATP należy przechowywać w temperaturze -20 °C (1 ml podwielokrotności) przez 3-4 miesiące.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu do krojenia
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór do krojenia zawierający 238 mM sacharozy, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,0 mM NaH2PO4, 10 mM glukozy, 1,0 mM CaCl2 i 5,0 mM MgCl2. Zważyć wszystkie sole zgodnie z pożądaną objętością końcową, jak pokazano w tabeli 2. Dokładna objętość tego roztworu, który ma być przygotowany, będzie zależeć od wielkości komory tnącej.</li>
		<li>Mieszając wszystkie sole w wodzie dejonizowanej, stale nasycaj karbogenem (95%O2 i 5%CO2). Podłącz rurkę polietylenową (średnica zewnętrzna 1.57 mm [OD] x średnica wewnętrzna 1.14 mm [ID]) do cylindra karbogenicznego, aby dostarczyć karbogen do roztworu do krojenia. Trzymać otwarty koniec probówki w zlewce zawierającej roztwór do krojenia.</li>
		<li>Po dokładnym wymieszaniu wszystkich składników dostosuj pH do 7,3 za pomocą 10% kwasu azotowego za pomocą pH-metru. Użyj osmometru, aby sprawdzić osmolarność, która powinna wynosić 290-295 mOsm (w razie potrzeby dostosuj tylko w dół). Następnie schłodzić roztwór do temperatury 0-2 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu CSF do nagrań
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) do zapisów zawierających 124 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 1,2 mMMgSO4, 5 mM glukozy i 2,5 mM CaCl2. Zważyć wszystkie sole zgodnie z pożądaną objętością końcową, podaną w tabeli 3.</li>
		<li>Mieszając wszystkie sole w wodzie dejonizowanej, stale nasycaj karbogenem (95%O2 i 5% CO2), jak opisano w kroku 1.2.2.</li>
		<li>Po dodaniu i wymieszaniu wszystkich składników dostosuj pH do 7,3 (można użyć 10% kwasu azotowego) za pomocą pH-metru. Użyj osmometru, aby sprawdzić osmolarność, która powinna wynosić 290-300 mOsm. Następnie wlać aCSF do zlewki i przechowywać w łaźni wodnej w temperaturze 30 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sekcja mózgu i krojenie
UWAGA: Ponieważ różne struktury mózgu mogą wymagać cięcia w różnych płaszczyznach (wycinki czołowe, strzałkowe lub poziome), dokładne podejście do uzyskania wycinków zależy od obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Zazwyczaj do badania komórek wykazujących ekspresję Kiss1 w AVPV / PeN i ARH (tutaj określanych jako neurony AVPV / PeNKisspeptin i neuronyARH kisspeptyny; <silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B), koronalne wycinki mózgu (200-300 μm) są zwykle wykonywane17,19,20,21,34. Neurony AVPV/PeNKisspeptin znajdują się w odległości od -0,5 do -0,22 mm od bregmy, podczas gdy neuronyARH kisspeptyny znajdują się w odległości od -1,22 do -2,70 mm. Położenie jąder można określić za pomocą stereotaktycznego atlasu mózgu myszy 35 lub atlasu referencyjnego mózgu myszy Allena (http://mouse.brain-map.org/). W tym badaniu wykorzystano dorosłe samice Kiss1-Cre/GFP (stadium diestrus) i samce myszy36.
<ol>
	<li>Usunięcie mózgu
	<ol>
		<li>Przygotuj miejsce sekcji i narzędzia potrzebne do ekstrakcji mózgu: nożyczki do dekapitacji, nożyczki do tęczówki, zakrzywione nożyczki Castroviejo, osteotom, pęseta, szpatułka, bibuła filtracyjna, szalka Petriego, żyletka i klej cyjanoakrylowy.</li>
		<li>Przed wykonaniem plastrów należy przygotować stół, na którym zostanie przeprowadzona sekcja, ponieważ wszystkie kolejne zabiegi muszą być wykonywane szybko. Upewnij się, że masz dostęp do urządzenia do krojenia, takiego jak wibratom.</li>
		<li>Przygotuj komorę rejestracyjną, aby utrzymać plastry mózgu przed pokrojeniem tkanki. Kup komorę nagrywającą o wymiarach wanny 24 mm x 15 mm x 2 mm (dł. x szer. x wys.) marki handlowej (tabela materiałów) lub wykonaj ją we własnym zakresie. 
		UWAGA: Wewnętrzną komorę rekonwalescencyjną można wyprodukować w następujący sposób: wyciąć płytkę 24-dołkową tak, aby dostępnych było dziewięć dołków. Przyklej nylonowy ekran do podstawy dziewięciu studzienek. Z pozostałą częścią płytki studzienki wykonaj podstawę tak, aby dolna część nylonu była wolna. Tak przystosowaną bazę można umieścić w zlewce o pojemności 500 ml zawierającej aCSF (rysunek uzupełniający 1).</li>
		<li>Po przygotowaniu wszystkiego znieczulij zwierzę wziewnym środkiem znieczulającym przy użyciu 4%-5% izofluranu. Znieczulenie musi być zgodne z protokołem zatwierdzonym przez komisję etyczną. Krótko po tym, jak zwierzę jest unieruchomione, wykonaj testy szczypania ogona i łapy, aby upewnić się, że zwierzę jest głęboko znieczulone.</li>
		<li>Szybko odetnij głowy myszom, gdy serce jest nadal aktywne, aby zwiększyć żywotność komórek. Zbierz mózg szybko po ścięciu.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w skórze na szczycie czaszki zwierzęcia, od ogona do rostralu, i usuń skórę głowy z głowy zwierzęcia. Następnie przeciąć płytkę międzyciemieniową wzdłuż szwu strzałkowego nożyczkami do tęczówki i usunąć kość potyliczną. Wsuń osteotom pod kość ciemieniową i delikatnie go wyciągnij, aż mózg zostanie odsłonięty.</li>
		<li>Po odsłonięciu mózgu odwróć głowę do góry nogami, delikatnie opuść mózg, aby uwidocznić nerw trójdzielny z każdej strony, a następnie przetnij nerw trójdzielny za pomocą zakrzywionych nożyczek Castroviejo. Po wizualizacji podwzgórza zidentyfikuj nerw wzrokowy i delikatnie go przetnij. 
		UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas przecinania nerwu wzrokowego, ponieważ pociągnięcie go spowoduje rozerwanie sąsiedniego obszaru podwzgórza zawierającego jądro AVPV/PeN.</li>
		<li>Wytnij najbardziej przednią część płata czołowego i całkowicie usuń mózg. Natychmiast zanurz mózg w roztworze do krojenia, aż do uzyskania plasterków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krojenie próbek mózgu
	<ol>
		<li>Umieść mózg na bibule filtracyjnej (podpartej na szalce Petriego), aby wysuszyć nadmiar roztworu. Następnie za pomocą ostrej żyletki do cięcia wykonaj cięcie koronalne oddzielające pień mózgu z móżdżkiem od reszty tkanki.</li>
		<li>Następnie przyklej ogonową część mózgu do podstawy wibratomu i wypełnij komorę urządzenia do krojenia roztworem do krojenia/aCSF schłodzonym do 0-2 °C. Podczas zabiegu owiń suchy lód wokół komory wibratomowej, aby roztwór do krojenia był zimny.</li>
		<li>Włóż żyletkę do wibratomu i ustaw odpowiednie parametry cięcia urządzenia: prędkość = 3, częstotliwość = 9 i posuw = 250 μm. Użyj akrylowej pipety transferowej (pipeta z odwróconego szkła Pasteura przymocowana do silikonowego smoczka), aby przenieść plastry do komory odzyskiwania (opisanej w kroku 2.1.3) podczas procedury krojenia tkanek. Odczekaj 60 minut na regenerację tkanki po pobraniu plastra.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Uszczelnianie komórek do nagrywania
<ol>
	<li>Upewnij się, że wszystkie elementy wyposażenia (mikroskop, amplifier, digitizer, mikromanipulator i inne) są włączone przed rozpoczęciem nagrywania.</li>
	<li>Napełnij komorę zapisu, marki handlowej (Tabela Materiałów), dołączoną do mikroskopu roztworem aCSF do nagrań. Użyj pompy perfuzyjnej, aby stale perfuzjować aCSF z szybkością 2 ml/min.</li>
	<li>Przenieś interesujący Cię wycinek mózgu (pojedynczo) do komory nagraniowej. Użyj akrylowej pipety transferowej (odwrócona szklana pipeta Pasteura przymocowana do silikonowego smoczka), aby przenieść plastry podwzgórza do komory. Użyj kotwicy plasterka (Tabela materiałów), aby przytrzymać plasterek, aby nie poruszał się podczas perfuzji CSF.</li>
	<li>Umieść plasterek na środku komory rejestracyjnej przymocowanej do mikroskopu. Pozycja warstwy ma kluczowe znaczenie, aby umożliwić dobry widok żądanego obszaru pod mikroskopem i zapewnić doskonały zasięg mikropipety rejestrującej.</li>
	<li>Użyj soczewki obiektywu mikroskopu immersyjnego o małej mocy (10x lub 20x), aby pomóc w ustawieniu wycinka i zlokalizowaniu obszaru zainteresowania.</li>
	<li>Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania zmień soczewkę obiektywu na soczewkę o dużej mocy (63x) i skup się na poziomie tkanki, obserwując endogenne białko fluorescencyjne i kształty komórek w regionie docelowym, aby zlokalizować komórki kisspeptyny na powierzchni wycinka mózgu20.</li>
	<li>Gdy znajduje się możliwa komórka docelowa, zaznacz ją na ekranie komputera kursorem myszy lub rysując format, taki jak kwadrat, nad obszarem zainteresowania. Znacznik ekranowy komputera pomaga wskazać pozycję mikropipety rejestrującej do celi.</li>
	<li>Po ustaleniu dokładnego położenia celi docelowej należy podnieść obiektyw i wprowadzić mikropipetę rejestrującą wypełnioną roztworem wewnętrznym. Umieszczając mikropipetę w uchwycie elektrody, upewnij się, że roztwór wewnętrzny styka się z elektrodą srebrną. 
	UWAGA: Informacje na temat przygotowania, umieszczenia i umiejscowienia mikropipety na uchwycie elektrody można znaleźć na stronie 33.</li>
	<li>Przed zanurzeniem mikropipety w roztworze aCSF, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń do mikropipety, należy zastosować nadciśnienie za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem o pojemności 1-3 ml połączonej z uchwytem mikropipety za pomocą rurki polietylenowej (≈130 cm dłuższej); nanieść prawie 100-200 μl powietrza.</li>
	<li>Za pomocą mikromanipulatora poprowadź mikropipetę poniżej środka obiektywu. Przesuń przyciski na mikromanipulatorze, aby poprowadzić mikropipetę na osi X-Y-Z w kierunku interesującej Cię komórki.</li>
	<li>Ustaw ostrość tak, aby była widoczna końcówka mikropipety i zbliż ostrość do plasterka, ale nie za blisko. Zmniejsz prędkość mikromanipulatora i powoli opuść mikropipetę do płaszczyzny ostrości. Upewnij się, że końcówka mikropipety nie wnika gwałtownie w plasterek, ale raczej powoli opada, aż dotknie powierzchni komórki/obszaru docelowego.</li>
	<li>Zastosuj lekkie nadciśnienie (≈100 μl) za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem o pojemności 1-3 ml podłączonej do uchwytu mikropipety, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia ze ścieżki podejścia.</li>
	<li>Skoncentruj się na celi docelowej i powoli przesuwaj mikromanipulator na osi X-Y-Z, aby zbliżyć mikropipetę do celi docelowej. Po przytknięciu mikropipety do celi można zaobserwować wgłębienie spowodowane ciśnieniem wywieranym przez końcówkę mikropipety (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Po uformowaniu wgłębienia, ze względu na bliskość mikropipety do celi, należy zastosować słabe, krótkie odsysanie przez usta (1-2 s) przez rurkę podłączoną do uchwytu mikropipety, aby wytworzyć uszczelnienie między mikropipetą a celą (uszczelka gigaomowa lub gigapipeta >1 GΩ; <silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Aby utworzyć pieczęć, użyj trybu cęgów napięcia w oprogramowaniu. Szczegółowe informacje na temat formowania uszczelnień można znaleźć na stronie 33.</li>
	<li>Jeśli uszczelnienie pozostaje stabilne (uszczelnienie gigaomowe powinno być stabilne mechanicznie i bez zakłóceń hałasu, określonych przez obserwację przez około 1 min), należy ustawić napięcie podtrzymania na najbliższym fizjologicznym potencjale spoczynkowym interesującego nas ogniwa. W przypadku neuronów podwzgórza kisspeptyny zaleca się -50 mV.</li>
	<li>Zastosuj krótkie odsysanie przez usta (podciśnienie) z mikropipetą przytwierdzoną do komórki, aby przerwać błonę plazmatyczną (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2E). Odpowiednią konfigurację całej komórki uzyskuje się, gdy ssanie odbywa się z wystarczającą siłą, aby pęknięta membrana nie zatkała mikropipety i nie przyciągnęła znacznej części membrany, a nawet komórki.</li>
	<li>Sprawdź używaną instrukcję ustawień systemowych. Użyj oprogramowania (patrz tabela materiałów), aby cyfrowo sprawdzić i obliczyć rezystancję szeregową (SR) oraz pojemność całego ogniwa (wcc).</li>
	<li>W trybie cęgowania napięcia, po zerwaniu błony komórkowej, włącz opcję całego ogniwa i kliknij polecenie Auto odnoszące się do zakładki całe ogniwo. SR i wcc komórki zostaną automatycznie obliczone i natychmiast wyświetlone przez oprogramowanie. Parametry te można również sprawdzić, wykonując test membrany ze wzmacniaczem wymienionym w Tabeli Materiałów33.</li>
	<li>Upewnij się, że sprawdziłeś parametry żywotności komórek. W przypadku neuronów kisspeptyny sprawdź, czy pomiary elektrofizjologiczne wynoszą: SR < 25 mΩ, rezystancja wejściowa > 0,3 GΩ i aktualna wartość bezwzględna < 30 pA (osobiste obserwacje i odniesienie21). Średnia wartość wcc neuronówkisspeptyny AVPV/PeN lub ARHkisspeptyny wynosi ≈ 10-12 pF u myszy z nienaruszonymi gonadami20.</li>
	<li>Monitoruj SR i pojemność ogniwa w stanie ustalonym podczas eksperymentów. Upewnij się, że SR nie zmienia się o więcej niż 20% podczas nagrywania i że pojemność membrany jest stabilna.</li>
	<li>Sprawdź ustawienia oprogramowania. Utwórz konkretne protokoły dla nagrań w zależności od rodzaju eksperymentu. Aby zarejestrować potencjał membrany w trybie cęgowym prądowym, za pomocą sprzętu wymienionego w Tabeli materiałów, filtruj dolnoprzepustowe sygnały elektrofizjologiczne przy 2-4 kHz i analizuj wyniki w trybie offline w oprogramowaniu (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania informacji o oprogramowaniu).</li>
	<li>Po prawidłowym osiągnięciu konfiguracji całego ogniwa zmierz prądy synaptyczne w trybie cęgów napięciowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2G). Rejestruj zmiany spoczynkowego potencjału błonowego (RMP) i indukowane zmiany RMP w trybie cęgów prądowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2H). Zmiany w RMP, takie jak depolaryzacja błony komórkowej, mogą być wywołane przez podanie do kąpieli znanego leku/neuroprzekaźnika (opisanego w kroku 3.2), jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1. 
	UWAGA: W trybie cęgów prądowych można wstrzyknąć prąd dodatni lub ujemny, aby utrzymać napięcie membrany na żądanym napięciu. W przypadku neuronów kisspeptyny zwykle ustawiamy wstrzyknięcie prądu zerowego (I = 0), aby zarejestrować spontaniczną zmianę potencjału błonowego.</li>
</ol>

Nie należy zgłaszać konfliktu interesów.

Opracowanie techniki patch-clamp całokomórkowych wywarło znaczący wpływ na społeczność naukową, ponieważ uważa się, że ma ogromne znaczenie dla rozwoju badań naukowych i umożliwiło dokonanie kilku odkryć. Jego wpływ na naukę był wystarczający, aby osiągnąć kulminację w Nagrodzie Nobla w dziedzinie medycyny w 1991 roku, ponieważ odkrycie to otworzyło drzwi do lepszego zrozumienia, jak funkcjonują kanały jonowe w warunkach fizjologicznych i patologicznych, a także do identyfikacji potencjalnych celów dla środków terapeutyc...

Hodgkin i Huxley dokonali pierwszego wewnątrzkomórkowego zapisu potencjału czynnościowego opisanego w kilku badaniach naukowych. Zapis ten został wykonany na aksonie kałamarnicy, który ma dużą średnicę (~500 μm), co pozwala na umieszczenie mikroelektrody wewnątrz aksonu. Prace te dały ogromne możliwości badań naukowych, których kulminacją było później stworzenie trybu cęgów napięciowych, który został wykorzystany do badania jonowych podstaw generowania potencjału czynnościowego1,2,3,4,5,6,7,8. Z biegiem lat technika ta została udoskonalona i stała się szeroko stosowana w badaniach naukowych6,9. Wynalezienie techniki patch-clamp, które miało miejsce pod koniec lat siedemdziesiątych XX wieku dzięki badaniom zainicjowanym przez Erwina Nehera i Sakmanna, pozwoliło naukowcom rejestrować pojedyncze kanały jonowe i wewnątrzkomórkowe potencjały lub prądy błonowe w praktycznie każdym typie komórki przy użyciu tylko jednej elektrody9,10,11,12. Zapisy patch-clamp mogą być wykonywane na różnych preparatach tkankowych, takich jak hodowane komórki lub wycinki tkanek, w trybie zacisku napięciowego (utrzymywanie błony komórkowej przy ustalonym napięciu, co pozwala na rejestrację, na przykład, prądów zależnych od napięcia i prądów synaptycznych) lub trybie cęgowym (umożliwiającym rejestrację, na przykład, zmian spoczynkowego potencjału błonowego wywołanych prądami jonowymi, potencjały czynnościowe i częstość występowania potencjału postsynaptycznego).
Użycie techniki zacisku krosowego umożliwiło dokonanie kilku znaczących odkryć. Rzeczywiście, przełomowe odkrycia dotyczące właściwości elektrofizjologicznych neuronów kisspeptyny podwzgórza zlokalizowanych w przednio-brzusznych jądrach okołokomorowych i rostralnych jądrach okołokomorowych (AVPV/PeNKisspeptin), znanych również jako rostralny obszar okołokomorowy trzeciej komory (RP3V) i łukowate jądro podwzgórza (ARH kisspeptyna)13,14,15 cieszą się szczególnym zainteresowaniem. W 2010 roku Ducret i in. przeprowadzili pierwsze nagrania neuronów AVPV/PeNKisspeptinu myszy przy użyciu innego narzędzia elektrofizjologicznego, techniki luźnokomórkowego patch-clamp. Badania te dostarczyły elektrycznego opisu neuronów AVPV/PeNKisspeptin i wykazały, że ich wzorce wypalania są zależne od cyklu rujowego16. W 2011 roku Qiu i in. wykorzystali technikę patch-clamp dla całej komórki, aby wykazać, że neuronyARH kisspeptyny wyrażają endogenne prądy rozrusznika serca17. Następnie Gottsch i wsp. wykazali, że neurony kisspeptyny wykazują spontaniczną aktywność i wyrażają zarówno prądy wapniowe typu h (rozrusznik serca), jak i typu T, co sugeruje, że neuronyARH kisspeptyny dzielą właściwości elektrofizjologiczne z innymi neuronami rozrusznika ośrodkowego układu nerwowego18. Ponadto wykazano, że neuronykisspeptyny ARH wykazują dymorficzną szybkość odpalania płciowego i że neurony AVPV/PeNKisspeptin wykazują bimodalny spoczynkowy potencjał błonowy (RMP), na który wpływają wrażliwe na ATP kanały potasowe (KATP)19,20. Ponadto ustalono, że steroidy gonadalne pozytywnie wpływają na spontaniczną aktywność elektryczną neuronów kisspeptyny u myszy19,20,21. Pierwsze prace, które badają właściwości elektrofizjologiczne neuronów kisspeptyny, są wymienione16,17,18,19,20. Od tego czasu w wielu badaniach wykorzystano technikę patch-clamp dla całych komórek, aby wykazać, które czynniki/neuromodulatory są wystarczające do modulowania aktywności elektrycznej neuronów kisspeptyny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.
Biorąc pod uwagę znaczenie tej techniki dla badania neuronów niezbędnych do reprodukcji, wśród innych typów komórek, które nie zostały tutaj omówione, ten artykuł opisuje podstawowe kroki do rozwoju techniki patch-clamp dla całej komórki, takie jak przygotowanie roztworów, preparowanie i krojenie mózgu oraz wykonywanie uszczelnienia błony komórkowej dla nagrań. Ponadto omówiono istotne kwestie dotyczące tej techniki, takie jak jej zalety, ograniczenia techniczne i ważne zmienne, które muszą być kontrolowane w celu uzyskania optymalnej wydajności eksperymentalnej.

<table><tbody><tr><td>Związki do aCSF, roztwory wewnętrzne i do krojenia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>O3777</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>K-glukonian</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 </td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>kwas azotowy</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>225711</td><td>UWAGA</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Air table</td><td>TMC</td><td>63-534</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Komputer</td><td>różny-DIGIDATA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1440 SYSTEM AKWIZYCJI DANYCH O NISKIM POZIOMIE SZUMÓW</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>DD1440</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa pompa perystaltyczna</td><td>Ismatec</td><td>ISM833C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>TMC</td><td>81-333-03</td><td></td></tr><tr><td>Kamera do obrazowania</td><td>Leica</td><td>DFC 365 FX</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>Roe-200</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet Mikroskop</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>DM6000 FS</td><td></td></tr><tr><td>Osteotom</td><td>Bonther sprzęt i Tecnologia/różne</td><td>128</td><td></td></tr><tr><td>Komora regeneracyjna</td><td>Warner Instruments/Aparatura Harvard</td> <td>-</td> <td>może być wykonana we własnym</td></tr><tr><td>zakresie Komora nagraniowa</td><td>Warner Instruments</td><td>640277</td><td></td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Fisher Scientific / różne</td><td>FISH-14-375-10; RYBA-21-401-20</td><td></td></tr><tr><td>Wibratom&nbsp;</td>Kąpiel wodna <td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher Scientific /różne</td><td>Isotemp</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie i systemy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie AxoScope 10</td><td>Oprogramowanie Molecular</td> <td>Devices-Commander</td><td></td></tr> <tr><td>System szerokokątny LAS X</td> <td>Akwizycja i analiza obrazów</td><td></td> <td>Leica-Image</td></tr> <tr><td>Urządzenia molekularne</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Oprogramowanie</td> <td>MULTICLAMP 700B</td> Commander</tr><tr><td>OPROGRAMOWANIE PCLAMP 10 DLA</td><td>WINDOWS Urządzenia molekularne</td><td>Pclamp 10 Standard</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl elektroda, granulka, 1,0 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1309</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiony kleszczyk hemostatyczny</td><td>różny-klej</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>cyjanoakrylowy</td><td>LOCTITE/różne</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do dekapitacji</td><td>różne</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>różne</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Kapilary szklane (mikropipety)</td> <td>World Precision Instruments, Inc</td> Nożyczki do irysów <td>TW150F-4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Akcesoria Bonther i Tecnologia/różne</td><td>65-66</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta szklana Pasteura&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich / różne</td><td>CLS7095B9-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>różne</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>rurki polietylenowe&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0756</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka do preparacji mózgu</td><td>TED PELLA</td><td>TEDP-121-1</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka do wibratomu</td><td>TED PELLA</td><td>TEDP-121-9</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Bonther akcesoria & Tecnologia/różne</td><td>71-72, 48,49; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>smoczek silikonowy</td><td></td> <td>różny-Kotwica</td><td></td></tr> <tr><td>Slice&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0246</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe</td><td>Merck Millipore Ltda</td><td>SLGVR13SL</td><td>Millex-GV 0,22 &mu; m</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/various</td><td>131, 1518</td><td></td></tr></tbody></table>

podwzgórzowe neurony kisspeptyny jako cel dla nagrań patch-clamp dla całych komórek

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Kisspeptyny są niezbędne dla dojrzewania osi podwzgórze-przysadka-gonady (HPG) i płodności. Podwzgórzowe neurony kisspeptyny zlokalizowane w jądrze okołokomorowym przednio-brzusznym i jądrze okołokomorowym rostralnym, a także w jądrze łukowatym podwzgórza, rzutują między innymi na neurony hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH). Wcześniejsze badania wykazały, że sygnalizacja kisspeptyny zachodzi przez receptor Kiss1 (Kiss1r), ostatecznie pobudzając aktywność neuronów GnRH. U ludzi i eksperymentalnych modeli zwierzęcych kisspeptyny są wystarczające do indukowania wydzielania GnRH, a w konsekwencji uwalniania hormonu luteinizującego (LH) i hormonu stymulującego mieszki włosowe (FSH). Ponieważ kisspeptyny odgrywają istotną rolę w funkcjach rozrodczych, naukowcy pracują nad oceną, w jaki sposób wewnętrzna aktywność neuronów kisspeptyny podwzgórza przyczynia się do działań związanych z reprodukcją i zidentyfikowaniem głównych neuroprzekaźników/neuromodulatorów zdolnych do zmiany tych właściwości. Technika klamry krosowej dla całych komórek stała się cennym narzędziem do badania aktywności neuronów kisspeptyny w komórkach gryzoni. Ta eksperymentalna technika pozwala naukowcom rejestrować i mierzyć spontaniczne pobudzające i hamujące prądy jonowe, spoczynkowy potencjał błonowy, wyzwalanie potencjału czynnościowego i inne właściwości elektrofizjologiczne błon komórkowych. W niniejszym badaniu dokonano przeglądu kluczowych aspektów techniki patch-clamp dla całych komórek, znanych jako pomiary elektrofizjologiczne, które definiują neurony kisspeptyny w podwzgórzu, oraz omówiono istotne kwestie dotyczące tej techniki.

Aby zbadać możliwy wpływ ludzkiego rekombinowanego hormonu wzrostu (hGH) na aktywność podwzgórzowych neuronów kisspeptynowych, wykonaliśmy rejestrację metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell w skrawkach mózgu i oceniliśmy, czy hormon ten wywołuje ostre zmiany w aktywności neuronów AVPV/PeNKisspeptin oraz ARHkisspeptin. W badaniu wykorzystano dorosłe samice (w fazie diestrus) i samce myszy Kiss1-Cre/GFP36. Do eksperymentów wybrano zwierzęta z nieusuniętymi gonadami, ponie...

Tutaj prezentujemy protokół do wykonania klamry na całej komórce na wycinkach mózgu zawierających neurony kisspeptyny, głównego modulatora komórek hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH). Dodając wiedzę na temat aktywności neuronów kisspeptyny, to elektrofizjologiczne narzędzie posłużyło jako podstawa znaczących postępów w dziedzinie neuroendokrynologii w ciągu ostatnich 20 lat.

Podwzgórzowe neurony kisspeptyny jako cel dla nagrań patch-clamp dla całych komórek

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

Mierząc właściwości elektrofizjologiczne błon komórkowych, pytanie o główne dowodzi, że można rozwiązać problem modulowania aktywności elektrycznej komórki. Zapis całokomórkowy jest techniką peryferyjną do badania prądów jonowych w poszczególnych komórkach i badania odpowiedzi komórkowej na różne bodźce. Najlepsza wydajność na nagraniach wstępnych z zaciskiem krosowym dla całych komórek zostanie osiągnięta po wielu ćwiczeniach i nauce.Aby rozpocząć sekcję mózgu, wykonaj nacięcie za pomocą nożyczek chirurgicznych w skórze w górnej części czaszki ściętego zwierzęcia od ogona do rostralu i usuń skórę głowy. Następnie przeciąć płytkę międzyciemieniową wzdłuż szwu strzałkowego nożyczkami do tęczówki i usunąć kość potyliczną. Wsuń osteotom pod kość ciemieniową i delikatnie go wyciągnij, aż mózg zostanie odsłonięty.Po odsłonięciu mózgu odwróć głowę do góry nogami. Delikatnie opuść mózg, aby uwidocznić nerw trójdzielny po każdej stronie. Następnie przetnij nerw trójdzielny za pomocą zakrzywionych nożyczek Castroviejo.Po wizualizacji podwzgórza zidentyfikuj nerw wzrokowy i delikatnie go przetnij. Następnie przetnij dalszą przednią część płata czołowego. Usuń mózg i natychmiast zanurz go w roztworze do krojenia, aż do uzyskania plasterków.Aby pokroić próbki mózgu, umieść mózg na bibule filtracyjnej, aby wysuszyć nadmiar roztworu. Następnie za pomocą ostrej żyletki wykonaj cięcie koronalne, oddzielając pień mózgu z móżdżkiem od reszty tkanki. Następnie przyklej część mózgu do podstawy wibratomu i napełnij komorę urządzenia do krojenia roztworem do krojenia lub roztworem CSF schłodzonym do zera do dwóch stopni Celsjusza.Umieść suchy lód wokół komory wibratomowej, aby roztwór do krojenia był zimny podczas zabiegu. Włóż żyletkę do wibratomu i ustaw parametry cięcia urządzenia, takie jak prędkość na trzy, częstotliwość na dziewięć i posuw na 250 mikrometrów. Podczas procedury krojenia tkanek przenieś plastry za pomocą akrylowej pipety transferowej do komory regeneracyjnej i odczekaj 60 minut na odzyskanie tkanki po pobraniu plastrów.Przed rozpoczęciem uszczelniania i nagrywania komórek włącz mikroskop, wzmacniacz, digitizer i mikromanipulator. Zbuduj komorę zapisu dołączoną do mikroskopu za pomocą roztworu CSF. Użyj pompy perfuzyjnej, aby stale perfować aCSF z prędkością dwóch mililitrów na minutę.Sprawdź ustawienia oprogramowania i utwórz określone protokoły dla nagrań w zależności od rodzaju eksperymentu. Przenieś interesujący Cię wycinek mózgu pojedynczo do komory nagraniowej za pomocą akrylowej pipety transferowej. Przytrzymaj plasterek za pomocą kotwicy plasterka, aby nie poruszał się podczas perfuzji CSF.Umieść plasterek na środku komory zapisu za pomocą soczewki obiektywu o małej mocy mikroskopu zanurzeniowego, 10X lub 20X. Pozycja warstwy ma kluczowe znaczenie, aby umożliwić dobry widok żądanego obszaru pod mikroskopem i zapewnić idealne sięgnięcie do mikropipety rejestrującej. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania przełącz soczewkę obiektywu na soczewkę o dużej mocy, 63X i skup się na poziomie tkanki, obserwując endogenne białko fluorescencyjne i kształty komórek w regionie docelowym, aby zlokalizować komórki kisspeptyny na powierzchni wycinka mózgu.Gdy znajduje się możliwa komórka docelowa, zaznacz ją na ekranie komputera kursorem myszy lub rysując format taki jak kwadrat nad obszarem zainteresowania. Znacznik ekranowy komputera pomaga wskazać pozycję pipety rejestrującej do celi. Po ustaleniu dokładnego położenia celi należy podnieść obiektyw i wprowadzić mikropipetę rejestrującą wypełnioną roztworem wewnętrznym do uchwytu elektrody, upewniając się, że roztwór wewnętrzny styka się z elektrodą srebrną.Przed zanurzeniem mikropipety w roztworze aCSF należy zastosować nadciśnienie za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem o pojemności od jednego do trzech mililitrów, połączonej z uchwytem mikropipety za pomocą rurki polietylenowej, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń do mikropipety. Za pomocą mikromanipulatora poprowadź mikropipetę poniżej środka obiektywu. Przesuń przyciski mikromanipulatora, aby poprowadzić oś XYZ mikropipety w kierunku celi zainteresowania.Dostosuj ostrość tak, aby widzieć końcówkę mikropipety i zbliż ostrość, ale nie za blisko plasterka. Zmniejsz prędkość mikropipety i powoli opuść mikropipetę do miejsca ogniskowania, upewniając się, że końcówka mikropipety nie wnika gwałtownie w plasterek, ale powoli opada, aż dotknie powierzchni komórki lub obszaru docelowego. Zastosowanie lekkiego nadciśnienia za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem o pojemności od jednego do trzech mililitrów w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń ze ścieżki podejścia.Powoli przesuwaj mikromanipulator na osi XYZ, aby zbliżyć końcówkę mikropipety i dotknąć celi docelowej, co powoduje wgłębienie pod wpływem przyłożonego ciśnienia. Po ustaleniu wgłębienia za pomocą trybu zacisku napięcia w oprogramowaniu, zastosuj słabe, krótkie ssanie ustami przez jedną do dwóch sekund przez rurkę podłączoną do uchwytu mikropipety, aby wytworzyć uszczelnienie między mikropipetą a celą. Jeśli uszczelnienie pozostaje stabilne mechanicznie bez zakłóceń hałasu przez około minutę, ustaw napięcie podtrzymania na najbliższy fizjologiczny potencjał spoczynkowy interesującego ogniwa.W przypadku kisspeptyny zaleca się neurony podwzgórza minus 50 miliwoltów. Następnie należy zastosować krótkie ssanie doustne, aby przerwać błonę plazmatyczną na końcówce mikropipety uszczelnionej umieszczonej na komórce, tak aby pęknięta błona nie zatkała mikropipety ani nie przyciągnęła znacznej części błony lub komórki. Odpowiednią konfigurację całej komórki można uzyskać, wykonując ssanie z wystarczającą siłą.Sprawdź używaną instrukcję ustawień systemowych. Po przerwaniu błony komórkowej włącz opcję całego ogniwa w trybie cęgów napięciowych i kliknij na polecenie auto odnoszące się do zakładki całego ogniwa. Rezystancja szeregowa ogniwa i pojemność całego ogniwa są automatycznie obliczane i natychmiast wyświetlane przez oprogramowanie.Następnie sprawdź parametry żywotności komórek w oprogramowaniu zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Monitoruj rezystancję szeregową i pojemność ogniwa w stanie ustalonym podczas eksperymentów. Gdy cała konfiguracja ogniwa zostanie prawidłowo osiągnięta, zmierz prądy synaptyczne w trybie cęgów napięciowych.Rejestruj zmiany spoczynkowego potencjału błonowego i indukowane zmiany spoczynkowego potencjału błonowego w bieżącym trybie cęgowania. Możliwy wpływ ludzkiego rekombinowanego hormonu wzrostu na aktywność neuronów kisspeptyny podwzgórza badano za pomocą zapisów klamer całokomórkowych. Podanie ludzkiego rekombinowanego hormonu wzrostu, HGH w dawce 20 mikrogramów na gram, wywołało znaczną hiperpolaryzację spoczynkowego potencjału błonowego w 5 z 12 neuronów kisspeptyny AVPV / PeN i 9 z 14 zarejestrowanych neuronów kisspeptyny ARH.Hiperspolaryzowane neurony kisspeptyny AVPV/PeN i ARH kisspeptyny znacząco zmieniły spoczynkowy potencjał błonowy w porównaniu z komórkami, które nie reagowały. Wpływ na spoczynkowy potencjał błonowy podczas aplikacji HGH nastąpił po znacznym zmniejszeniu rezystancji wejściowej całej komórki o około 0,9 do 0,7 gigaomów na neuronach kisspeptyny AVPV / PeN i 1,7 do 1,0 gigaomów na neuronach kisspeptyny ARH. Podczas idealnych linii mózgowych wykonywanych za pomocą starannego gigasealu i obszaru w komórce za pomocą plaży wymagane są parametry, aby uzyskać najlepsze zapisy całej komórki.Roztwór mikropipety z zarejestrowanej komórki może być pobrany i wykorzystany do RTPCR pojedynczej komórki, co pozwala na molekularną charakterystykę izolowanej komórki. Technika klamry całokomórkowej w połączeniu z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanych zwierząt stanowi przełom w zrozumieniu reprodukcji, umożliwiając zdefiniowanie zwiększonych właściwości neuronów kisspeptyny i są one głównymi modulatorami.

hypothalamic-kisspeptin-neurons-as-target-for-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Film demonstruje metodę badania pobudliwości komórek neuronalnych wyrażających białko fluorescencyjne za pomocą cęgów prądowych dla całych komórek. W trybie cęgowym generowane są potencjały czynnościowe wskazujące na pobudliwość neuronów.

Badanie pobudliwości neuronów fluorescencyjnych za pomocą klamry krosowej dla całych komórek

Film demonstruje protokół do badania interakcji synaptycznych i odpowiedzi neuronalnych w transfekowanym wycinku mózgu hipokampa myszy. Polega na oświetlaniu neuronów czuciowych dalekiego zasięgu w celu wyzwolenia potencjałów czynnościowych i rejestrowaniu powstałych pobudzających potencjałów postsynaptycznych w zarejestrowanym neuronie za pomocą techniki patch-clamp dla całej komórki.

Fotostymulacja i zapisy klamer całokomórkowych neuronów w wycinkach hipokampa myszy

Ten film demonstruje użycie techniki klamry na całe komórki do pomiaru odpowiedzi w neuronach kisspeptyny z transfekowanych mysich wycinków podwzgórza. Proces polega na osiągnięciu konfiguracji całej komórki i zarejestrowaniu zmian potencjału błonowego wywołanych przez badany hormon w trybie cęgowania prądowego.

Określanie testowego wpływu hormonu wzrostu na neurony kisspeptyny za pomocą zacisku łatkowego dla całych komórek

Ten film demonstruje procedurę wykonywania zapisów elektrofizjologicznych w neuronach istoty żelowej (SG) wycinków rdzenia kręgowego, przy użyciu technik całokomórkowych kropek do analizy wzorców uruchamiania neuronów. Metoda ta pozwala na badanie reakcji neuronalnych na bodźce w neuronach SG rdzenia kręgowego.

Zapis klamry krosowej całej komórki w neuronie istoty żelatynowej wycinka rdzenia kręgowego

Wideo z protokołem opisuje tworzenie klamry do rejestracji elektrofizjologicznej z całych komórek z neuronów czuciowych narządu lemieszowo-nosowego (VNO) u myszy. Koronalny wycinek VNO z fluorescencyjnie znakowanymi neuronami czuciowymi umieszcza się w konfiguracji rejestracyjnej. Znakowany neuron jest łatany pipetą rejestrującą w konfiguracji całej komórki w celu zapisu elektrofizjologicznego w odpowiedzi na bodźce chemiczne.

Ustanowienie klamry krosowej dla całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z neuronów czuciowych lemieszowo-nosowych

Sieci korowe są kontrolowane przez mały, ale zróżnicowany zestaw hamujących interneuronów. Funkcjonalne badanie interneuronów wymaga zatem ukierunkowanego rejestrowania i rygorystycznej identyfikacji. Opisano tutaj podejście łączone obejmujące zapisy całych komórek z pojedynczych lub synaptycznie sprzężonych par neuronów z etykietowaniem wewnątrzkomórkowym, analizą morfologiczną post-hoc i immunocytochemiczną.

Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Tutaj prezentujemy protokół oceny funkcjonalnej wielości synaps za pomocą elektrofizjologii klamrów całokomórkowych w ostrych wycinkach mózgu.

Ocena liczebności synaps za pomocą elektrofizjologii patch-clamp całkowych

W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowywania adaptowanych do ciemności skrawków siatkówki mysiej do pomiarów elektrofizjologicznych.

Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Poznaj technikę patch-clamp całokomórkowego do badania aktywności neuronów kisspeptyny w podwzgórzu. Ta metoda elektrofizjologiczna umożliwia precyzyjne pomiary prądów jonowych i właściwości elektrycznych komórek nerwowych.

Podwzgórzowe neurony kisspeptyny jako cel dla nagrań patch-clamp dla całych komórek

Przeglądaj więcej filmów