Skalowalna transfekcja protoplastów mezofilu kukurydzy

Hello.Today pokażemy Ci protokół, który protoplastuje miliony komórek mezofilu kukurydzy i przekształca je z wysoką wydajnością. Głównymi etapami protokołu są najpierw trawienie i usuwanie ściany komórkowej rośliny, uwalnianie protoplastów, a następnie przekształcenie protoplastu za pomocą PEG. Dużą różnicą między tym protokołem a innymi jest skala transformacji.

Większość protokołów kończy się od 1 000 do 10 000 przekształconych protoplastów. Jednak nasz protokół daje miliony przekształconych protoplastów kukurydzy. Tutaj mamy sadzonki kukurydzy uprawiane w ciemności przez dziewięć do 11 dni po wykiełkowaniu.

Pokrój sadzonki tuż nad poziomem gleby i umieść w wodzie. Trzymaj rośliny w ciemności, gdy nie są używane. Wybierz drugi i trzeci liść każdej sadzonki, uważając, aby wykluczyć liście z brązowymi lub uszkodzonymi obszarami.

Wybierz od 12 do 16 liści i odetnij centymetr od końcówek. Następnie wytnij 10-centymetrowy odcinek z każdego liścia. Ułóż sekcje liści jeden na drugim, tak aby podstawowe końce były razem.

Zacisnąć wiązkę razem na podstawowym końcu za pomocą spinacza do segregatora. Ułóż wiązkę liści na kawałku białego papieru. Pokrój plastry liści o szerokości od 0,5 do jednego milimetra.

Ważne jest, aby kroić cienkie, spójne plasterki. Po odcięciu części wiązki liści przenieś plastry do roztworu enzymu. Nie pozwól, aby materiał wysechł.

Delikatnie zakręć roztworem enzymu, aby zwilżyć materiał. Umieść folię na zlewce, aby zablokować światło. Powtarzaj ten proces, aż cała wiązka zostanie odcięta w pobliżu spinacza do segregatora.

Po cięciu roztwór powinien wyglądać tak. Przenieś zlewkę z roztworem enzymu do słoika dzwonowego. Infiltrować próżniowo przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Inkubować na wytrząsarce stołowej z prędkością 40 obr./min w temperaturze pokojowej przez dwie i pół godziny. Po inkubacji zawiruj roztwór. Powinien wyglądać na mleczny, co wskazuje na udane trawienie.

Inkubować na wytrząsarce stołowej z prędkością 80 obr./min w temperaturze pokojowej jeszcze przez 10 minut. Umieścić zlewkę z roztworem enzymu na lodzie. Zatrzymaj trawienie, dodając jedną objętość lodowatego MMG.

Przefiltruj przez sitko o wielkości 40 mikronów do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Podziel roztwór na podwielokrotności nie większe niż 10 mililitrów każdy. Wlać do schłodzonych szklanych probówek z okrągłym dnem.

Odwirować probówki o stężeniu 100 G przez cztery minuty. Usuń supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu. Ponownie zawiesić, a następnie pobrać próbki do kolejnych myć.

Umyj protoplasty dwukrotnie pięcioma mililitrami MMG. Wiruj za każdym razem przy 100 G przez trzy minuty. Pellet powinien mieć piękny, jasnożółto-zielony kolor.

Będziesz mógł ponownie zawiesić pellet, delikatnie obracając rurkę. Ponownie zawiesić w jednym mililitrze MMG i rozcieńczyć małą porcję od 10 do 20 razy w celu policzenia. Ważne jest, aby ponownie zawiesić na długo przed aliqoutingiem, ponieważ protoplasty szybko się uspokoją.

Załaduj rozcieńczone protoplasty do hemocytometru. Policz protoplasty pod mikroskopem świetlnym. Dobry preparat nie będzie miał zbyt wiele nadmiaru zanieczyszczeń unoszących się po praniu.

Dobre protoplasty są okrągłe z widocznymi plastydami. Użyj liczby komórek, aby obliczyć łączną liczbę. W wyniku tego przygotowania powstało nieco ponad 10 milionów protoplastów.

Zalecamy sprawdzenie żywotności przy użyciu barwnika dioctanu fluoresceiny. Udane izolacje protoplastów dają żywotność od 70 do 90%Wymieszaj protoplasty z interesującym Cię plazmidem. W tym przykładzie użyto 1 miliona protoplastów i 15 mikrogramów DNA.

Inkubować na lodzie przez 30 minut. Zawieś ponownie, dotykając boku rurki. Dodaj roztwór PEG, aby osiągnąć końcowe stężenie 12% PEG.

Delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając. Protoplasty i roztwór PEG są delikatne, więc nie potrząsaj rurką. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Rozcieńczyć pięcioma objętościami roztworu inkubacyjnego i delikatnie wymieszać przez odwrócenie. Odwirować probówki o stężeniu 100 G przez cztery minuty. Przemyć raz jednym mililitrowym buforem do inkubacji.

Uważaj, aby nie naruszyć pelletu. Wiruj z prędkością 100 G przez trzy minuty. Zawiesić w buforze inkubacyjnym do stężenia od 500 do 1000 komórek na mikrolitr.

Inkubować w ciemności przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia wiruj z prędkością 100 G przez cztery minuty. Przemyć dwukrotnie schłodzonym roztworem do inkubacji.

Wirować za każdym razem przez trzy minuty w temperaturze 100 G w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić, a następnie załadować małą porcję do hemocytometru w celu ostatecznej kontroli. Najpierw policz całkowitą liczbę protoplastów w jasnym polu.

Teraz obserwuj frakcję protoplastów, które fluoryzują pod wpływem promieniowania UV, aby zweryfikować transfekcję. Protoplasty wyrażają naszego reportera GFP. Przejdźmy teraz do kilku wskaźników dotyczących wydajności transfekcji.

W tym przygotowaniu uzyskaliśmy łącznie 10 milionów protoplastów, z których transfekowaliśmy 1 milion. Następnego dnia odzyskaliśmy 335 000 osób. Spośród nich mieliśmy współczynnik transformacji wynoszący 30,3%, co daje nam łącznie około 100 000 protoplastów wykazujących ekspresję GFP.

Skuteczność transfekcji może się różnić. Jak widać na wykresie, rutynowo obserwujemy wydajność od 20 do 50% wśród powtarzających się preparatów. Protokół ten pozwala na zbieranie i przekształcanie milionów protoplastów mezofilu kukurydzy.

Jedną z najlepszych części protokołu jest jego zdolność do skalowania w górę. Skalując objętość, jak również liczbę protoplastów używanych w transformacji, możesz zwiększyć swoją transformację o więcej niż rząd wielkości w stosunku do tego, co pokazaliśmy dzisiaj. Do tej pory nasz największy eksperyment z pojedynczą probówką rozpoczął się od 20 milionów protoplastów i 200 mikrogramów DNA, a zakończył się na 3,1 miliona przekształconych protoplastów następnego dnia.

Ten protokół o wysokiej przepustowości jest szczególnie przydatny, gdy trzeba przetestować wiele różnych konstruktów plazmidowych, ale współpracownicy używali tego protokołu do celów, które nie wymagają możliwości skalowania w górę, takich jak projektowanie obwodów syntetycznych genów i kukurydzy. Dziękujemy za obejrzenie naszego filmu. Mamy nadzieję, że to pomogło.