Name: Implantacja matrycy podtwardówkowej miękkiej elektrokortykografii (ECoG) i długotrwała rejestracja kory mózgowej u świnek miniaturowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę implantacji miękkich elektrod podtwardówkowych u świnek miniaturowych do długotrwałej rejestracji kory mózgowej. Technika umożliwia ocenę bezpieczeństwa i skuteczności urządzeń kortykalnych oraz wspiera rozwój neuroprotez sensorycznych i motorycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od Fundacji Bertarelli oraz grantu SNSF Sinergia CRSII5_183519. Autorzy pragną również podziękować Katii Galan z EPFL za jej pomoc w opracowaniu protokołu barwienia dla histologii, personelowi Platformy Mikrosystemów Neuronowych Centrum Bio i Neuroinżynierii Wyss w Genewie za pomoc w procesach produkcyjnych, personelowi platformy dla zwierząt w Uniwersyteckim Centrum Medycznym (CMU) na Uniwersytecie Genewskim (UNIGE) za opiekę nad zwierzętami, asysta chirurgiczna i postępowanie pooperacyjne świnki miniaturowej (John Diaper, Xavier Belin, Fabienne Fontao i Walid Habre), członkowie zespołu Centrum Obrazowania Biomedycznego (CIBM) na Uniwersytecie Genewskim (Julien Songeon, François Lazeyras i Rares Salomir), członkowie personelu Oddziału Patologii Szpitala Uniwersyteckiego w Genewie (HUG) (Sami Schranz, Francesca Versili, Ruben Soto i Koralina Egger) oraz Blaise Yvert z Université Grenobles-Alpes za wkład i wymianę informacji na temat przewlekłych eksperymentów z miniświniami. Autorzy pragną podziękować pracownikom Neurosoft Bioelectronics SA za pomoc w procesie wytwarzania oraz za pomoc w eksperymentach z miniświniami (Benoit Huguet i Margaux Roulet).

<ol><li>Ritaccio, A. L., Brunner, P., Schalk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+mapping+of+the+brain%3A+Basic+principles+and+emerging+alternatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation mapping of the brain: Basic principles and emerging alternatives.</a> Journal of Clinical Neurophysiology. 35 (2), 86-97 (2018).</li>
<li>Mullin, J. P., Sexton, D., Al-Omar, S., Bingaman, W., Gonzalez-Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcomes+of+subdural+grid+electrode+monitoring+in+the+stereoelectroencephalography+era%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Outcomes of subdural grid electrode monitoring in the stereoelectroencephalography era.</a> World Neurosurgery. 89, 255-258 (2016).</li>
<li>Vansteensel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+implanted+brain-computer+interface+in+a+locked-in+patient+with+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fully implanted brain-computer interface in a locked-in patient with ALS.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (21), 2060-2066 (2016).</li>
<li>Lacour, S. P., Courtine, G., Guck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+and+technologies+for+soft+implantable+neuroprostheses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Materilas%22%5BJournal%5D)">Materials and technologies for soft implantable neuroprostheses.</a> Nature Reviews. Materilas. 1, 16063(2016).</li>
<li>Fallegger, F., Schiavone, G., Lacour, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformable+hybrid+systems+for+implantable+bioelectronic+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Conformable hybrid systems for implantable bioelectronic interfaces.</a> Advanced Materials. 32 (15), 1903904(2019).</li>
<li>Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+implant+biomaterial+research+in+bone%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Animal models for implant biomaterial research in bone: A review.</a> European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).</li>
<li>Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swine+as+models+in+biomedical+research+and+toxicology+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Swine as models in biomedical research and toxicology testing.</a> Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).</li>
<li>Khoshnevis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+induced+glioblastoma+by+implantation+of+a+human+xenograft+in+Yucatan+minipig+as+a+large+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of induced glioblastoma by implantation of a human xenograft in Yucatan minipig as a large animal model.</a> Journal of Neuroscience Methods. 282, 61-68 (2017).</li>
<li>Borton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+implantable+neuroprosthetics%3A+A+new+model+in+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+%26+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Developing implantable neuroprosthetics: A new model in pig.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society. 2011, 3024-3030 (2011).</li>
<li>Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pig+model+in+brain+imaging+and+neurosurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">The pig model in brain imaging and neurosurgery.</a> Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).</li>
<li>Gierthmuehlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+mECoG+electrode+arrays+in+the+minipig%3A+Experimental+procedure+and+neurosurgical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of mECoG electrode arrays in the minipig: Experimental procedure and neurosurgical approach.</a> Journal of Neuroscience Methods. 202 (1), 77-86 (2011).</li>
<li>Palma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+recording+of+cortical+activity+underlying+vocalization+in+awake+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic recording of cortical activity underlying vocalization in awake minipigs.</a> Journal of Neuroscience Methods. 366, 109427(2022).</li>
<li>Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C. H., Palomero-Gallagher, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telencephalon+of+the+G%C3%B6ttingen+minipig%2C+cytoarchitecture+and+cortical+surface+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+%26+Function%22%5BJournal%5D)">The telencephalon of the Göttingen minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy.</a> Brain Structure & Function. 222 (5), 2093-2114 (2017).</li>
<li>Lind, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pigs+in+neuroscience%3A+Modeling+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).</li>
<li>Shepherd, R. K., Villalobos, J., Burns, O., Nayagam, D. A. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stimulators%3A+A+review+of+preclinical+safety+and+efficacy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">The development of neural stimulators: A review of preclinical safety and efficacy studies.</a> Journal of Neural Engineering. 15 (4), 041004(2018).</li>
<li>Schiavone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft%2C+implantable+bioelectronic+interfaces+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Matererials%22%5BJournal%5D)">Soft, implantable bioelectronic interfaces for translational research.</a> Advanced Matererials. 32 (17), 1906512(2020).</li>
<li>Fallegger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI-compatible+and+conformal+electrocorticography+grids+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">MRI-compatible and conformal electrocorticography grids for translational research.</a> Advanced Science. 8 (9), 2003761(2021).</li>
<li>Minev, I. R., Wenger, N., Courtine, G., Lacour, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+update%3A+Platinum-elastomer+mesocomposite+as+neural+electrode+coating%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Materials%22%5BJournal%5D)">Research update: Platinum-elastomer mesocomposite as neural electrode coating.</a> APL Materials. 3 (1), 014701(2015).</li>
<li>Schiavone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+to+study+and+develop+soft+electrode+systems+for+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Guidelines to study and develop soft electrode systems for neural stimulation.</a> Neuron. 108 (2), 238-258 (2020).</li>
<li>Musigazi, G. U., De Vleeschauwer, S., Sciot, R., Verbeken, E., Depreitere, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+perfusion+fixation+in+male+pigs+using+a+safer+closed+system%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Brain perfusion fixation in male pigs using a safer closed system.</a> Laboratory Animals. 52 (4), 413-417 (2018).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
</ol>

F.F. i S.P.L. są współzałożycielami i udziałowcami firmy Neurosoft Bioelectronics SA zajmującej się opracowywaniem układów miękkich elektrod.

Przedstawiamy tutaj metodę długotrwałej implantacji i oceny miękkich macierzy ECoG. W tym badaniu zaprojektowaliśmy spójne, minimalnie inwazyjne podejście chirurgiczne do obustronnej implantacji funkcjonalnych siatek elektrod nad płatami skroniowymi (w tym przypadku ukierunkowanymi na korę słuchową). Najpierw oceniliśmy funkcjonalność siatki, z powodzeniem rejestrując potencjały wywołane w czasie trwania badania (6 miesięcy) i śledząc właściwości elektrochemiczne elektrod (patrz rysunek 6). Po drugie, oceniliśmy bezpieczeństwo biologiczne siatek, in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego i stworzenia systemu w pełni kompatybilnego z rezonansem magnetycznym, a także sekcji zwłok, opracowując protokół pobierania tkanek i barwienia immunologicznego.
Aby zminimalizować inwazyjność, zoptymalizowaliśmy wielkość okna kraniotomii. Aby dotrzeć do kory słuchowej znajdującej się na płacie skroniowym i uniknąć resekcji mięśnia skroniowego, opracowaliśmy technikę wsuwania implantu pod oponę twardą. Technika ta pozwala drastycznie zmniejszyć powierzchnię odsłoniętego mózgu i nadal docierać do odległych celów. Chociaż ten rodzaj implantacji może wydawać się ślepy, zastosowanie markerów nieprzepuszczających promieni rentgenowskich na urządzeniach, które są wizualizowane w promieniowaniu rentgenowskim w płaszczyźnie śródoperacyjnej, pozwala na weryfikację położenia i zapewnia, że matryca nie jest złożona pod oponą twardą. Ślizg podtwardówkowy okazał się bezpieczny w większości wykonanych przez nas powtórzeń. Dodatkowo, durotomia w szczelinie minimalizuje wybrzuszenia mózgu w czasie, gdy kraniotomia jest otwarta i ułatwia zamykanie wokół implantu bez konieczności stosowania dodatkowego materiału, takiego jak sztuczna opona twarda, która mogłaby zaburzyć reakcję zapalną. Wreszcie, mocną stroną tego podejścia chirurgicznego jest jego zdolność do transpozycji do różnych obszarów kory mózgowej. Zabawa współrzędnymi, pozycją kraniotomii i rozmiarem urządzenia, które można dostosować, umożliwia tej metodzie celowanie w większość obszaru kory mózgowej.
Przedstawiona tu metoda chirurgiczna, wraz z oceną funkcjonalną i badaniem biointegracji w czasie, nie ogranicza się do technologii miękkich elektrod zastosowanych w niniejszym raporcie. Inne elektrody podtwardówkowe, które są opracowywane do translacji u ludzi, mogą być oceniane za pomocą tego samego protokołu. Siła tej metody polega na tym, że większość elementów, takich jak kabel i cokół, jest modułowa, personalizowana i może być dostosowana do konkretnego testowanego urządzenia. Dodatkowo, sondy wewnątrzkorowe lub głęboko penetrujące mogą być również używane zamiast lub w połączeniu z elektrodami podtwardówkowymi, ponieważ wymaga to jedynie dostosowania geometrii kraniotomii i durotomii. Długoterminowe wyniki można następnie porównać z ich klinicznymi odpowiednikami, tak jak zrobiliśmy to tutaj.
Jednym z głównych ograniczeń prezentowanej metody jest obecność zatok czaszkowych u świnek miniaturowych, które rozwijają się w ciągu pierwszego rokużycia 12. W związku z tym ważnymi aspektami, które należy wziąć pod uwagę, są wiek implantacji, a także wielkość zwierzęcia. Wykonywanie kraniotomii w czaszce osoby dorosłej narusza integralność zatok i prowadzi do wysokiego ryzyka poważnej infekcji w warunkach przewlekłych. Takie zatoki są widoczne na płaskim zdjęciu rentgenowskim i tomografii komputerowej przed operacją. Z drugiej strony, zbyt wczesne wykonanie przewlekłej implantacji u zwierzęcia, które jest zbyt małe, również nie jest optymalne, gdy czaszka przechodzi ogromny wzrost i przebudowę. Postawiliśmy hipotezę, że te "ruchy czaszki" po operacji mogą powodować przesuwanie się i fałdowanie implantu, co ostatecznie jest szkodliwe dla eksperymentu. Stwierdziliśmy tutaj, że miniświnki z Getyngi, które w momencie implantacji mają około 5-6 miesięcy (i 8 kg) powinny dawać najlepsze wyniki.
W celu oceny działania wszczepionego ECoG do zapisów elektrofizjologicznych opracowaliśmy szybki protokół rejestracji słuchowego potencjału wywołanego (AEP), który może być stosowany u zwierząt poruszających się swobodnie i w sedacji. Polega na zaprezentowaniu serii akustycznych impulsów tonów o określonych częstotliwościach w ciągu kilku minut. Zaletą takiego protokołu jest fakt, że można go dostroić do dostępnej długości nagrania poprzez zmniejszenie liczby sondowanych częstotliwości. Jednym z wyzwań podczas rejestrowania sygnałów korowych w znieczuleniu jest to, że poziom świadomości zwierzęcia powinien być brany pod uwagę podczas analizowania i porównywania danych.
Protokół perfuzji był dostosowywany w czasie poprzez obserwację jakości wyekstrahowanego mózgu. Rzeczywiście, okazało się, że łatwiej jest cewnikować tylko tętnicę szyjną, a nie żyłę szyjną. Początkowo w literaturze przedstawiono metody, w których żyła szyjna jest cewnikowana w celu drenażu odpadów20. W praktyce ogranicza to przepływ krwi z mózgu i prowadzi do gorszego pobierania krwi i ogólnej jakości perfuzji. Przecinając żyłę szyjną i pozostawiając płyn do ucieczki w dużym pojemniku, w którym leży zwierzę, zwiększa się wydajność perfuzji.
Opracowaliśmy solidną metodę przygotowania tkanek, która działa z przeciwciałami rutynowo stosowanymi do śledzenia stanu zapalnego. Rozdzieliliśmy te dwie półkule ze względów praktycznych, ponieważ połowa mózgu świni mieści się na standardowych szkiełkach mikroskopowych, a zatem jest kompatybilna z większością urządzeń do obrazowania dostępnych w laboratoriach histologicznych. Dzięki pocięciu mózgu na bloki, możliwy jest bezpośredni dostęp do strefy zainteresowania bez konieczności dalszego cięcia całego mózgu lub przycinania rozległych części tkanki. Wycinki mózgu o wielkości 40 μm można łączyć w standardowych płytkach dołkowych i barwić w sposób swobodnie unoszący się bez większych zmian w protokole spowodowanych barwieniem immunologicznym innych gatunków. Pełne barwienie immunologiczne mózgu można również przewidzieć, stosując na przykład metody CLARITY21.
Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół, który obejmuje spersonalizowane projektowanie implantów aż do implantacji, monitorowanie funkcjonalności i ocenę bezpieczeństwa biologicznego, jest solidny i spójny. Wykazaliśmy tutaj jego wykonalność do badania układu słuchowego, ale można go przetransponować w celu zbadania innych funkcji fizjologicznych. Co więcej, siła naszej metody polega na tym, że nie ogranicza się ona do świnek miniaturowych, ale jest w pełni transpozycyjna na inne gatunki, takie jak owce, kozy czy naczelne. Do pewnego stopnia można go również łatwo dostosować do szczurów.

Zaburzenia i choroby neurologiczne mogą być diagnozowane lub leczone za pomocą matryc elektrokortykografii (ECoG). Te siatki elektrod są wszczepione na powierzchni mózgu i pozwalają na rejestrację lub stymulację ludzkiej kory mózgowej1. Na przykład w przypadku padaczki lekoopornej pomagają one wyznaczyć obszar padaczkowy do resekcji2. W długoterminowych zastosowaniach, takich jak interfejsy mózg-komputer, te epikortyczne elektrody są używane do rejestrowania intencji ruchu mózgu, do sterowania kończynami robotycznymi sparaliżowanych pacjentów3. Jednak obecne siatki elektrod są wykonane ze sztywnych metalowych bloków osadzonych w sztywnych podłożach polimerowych i nie odpowiadają na potrzebę zapisów mózgu w wysokiej rozdzielczości i długotrwałej biointegracji podtwardówkowej (>30 dni). Zamiast tego wywołują miejscowe reakcje tkankowe, które prowadzą do zwłóknieniowej enkapsulacji wszczepionego urządzenia, co z czasem prowadzi do gorszej wydajności. Ostatnio zaproponowano elastyczne lub rozciągliwe układy elektrod wykorzystujące cienkie podłoża polimerowe wytwarzane technikami mikrofabrykacji, aby osiągnąć wysoką wydajność w długotrwałych implantacjach poprzez ograniczenie reakcji tkankowej4,5. Potrzebne są jednak badania przedkliniczne nad tymi nowymi technologiami implantologicznymi, aby potwierdzić ich długoterminową funkcjonalność i profil bezpieczeństwa, tak aby można było przewidzieć ich translację na pacjentów. W tym kontekście, modele świnek miniaturowych i świń są rutynowo wykorzystywane do opracowywania urządzeń w innych kontekstach medycznych (np. układu sercowo-naczyniowego, kostnego lub żołądkowego) ze względu na ich duże rozmiary narządów i łatwą obsługę zwierząt6,7,8. Jednak w literaturze opisano tylko kilka zastosowań neurofizjologii ukierunkowanych na mózg, głównie ze względu na ograniczenia podejścia chirurgicznego i integrację systemu implantów na żywym zwierzęciu9,10,11,12. Często nie są one zgodne z przewlekłym implantowaniem u żywych zwierząt, ponieważ wymagałoby to na przykład opracowania złożonego sprzętu, takiego jak wszczepialna wbudowana elektronika. Ponadto nie badają wpływu systemu implantów na tkankę docelową, co ma kluczowe znaczenie dla aspektu bezpieczeństwa biologicznego w badaniach translacyjnych. Model świni jest zbliżony do anatomii człowieka pod względem budowy kory mózgowej, kości czaszki i grubości skóry13. Co więcej, ich zdolność do uczenia się zadań behawioralnych sprawia, że są potężnym modelem do badania strategii rehabilitacji funkcjonalnej lub percepcji sensorycznej14.
Tłumaczenie nowych technologii i terapii na ludzi wymaga oceny bezpieczeństwa i skuteczności, zgodnie z wymogami kompetentnych władz medycznych. Są one zazwyczaj opisane w dokumentach technicznych i normach15, jednak wymagają one jedynie przejścia tych testów i nie badają rzeczywistego efektu implantacji urządzenia lub zbierania innych użytecznych danych równolegle z badaniem bezpieczeństwa. W celu przeprowadzenia pełnego badania bezpieczeństwa biologicznego i wydajności mózgu, przedstawiamy tutaj podłużny i systematyczny zbiór danych obrazowych mózgu, pomiarów elektrofizjologicznych, oceny właściwości elektrochemicznych wszczepionych elektrod oraz histologii pośmiertnej w modelu świniowym. Aby to osiągnąć, należy wziąć pod uwagę kilka aspektów, aby stworzyć kompletny model eksperymentalny: (i) minimalnie inwazyjny dostęp chirurgiczny do implantacji urządzenia wraz ze stabilnym mechanicznie portem transdermalnym do połączenia z elektrodami, (ii) solidny paradygmat zapisu elektrofizjologicznego, który służy jako dane wyjściowe dla wszczepionych elektrod zarówno w znieczuleniu, jak i w warunkach swobodnego ruchu, (iii) obrazowanie in vivo (tomografia komputerowa [CT] i/lub rezonans magnetyczny [MRI]) w różnych punktach czasowych w celu śledzenia ewolucji mózgu i implantu, a także kompatybilności wszczepionego systemu ze sprzętem do obrazowania, oraz (iv) proces przygotowania tkanek w celu ekstrakcji mózgu do analizy histologicznej.
Tutaj opisujemy metodę długotrwałej implantacji (6 miesięcy) i ocenę miękkich matryc ECoG w modelu minipig (pokazanym schematycznie w <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Układy miękkich elektrod zostały przedstawione w naszych poprzednich raportach i są wykonane z cienkich membran silikonowych zatapiających elastyczne cienkie złote folie używane jako ścieżki elektryczne16,17. Kontakt z tkanką odbywa się poprzez mieszaninę nanocząstek platyny osadzonych w matrycy silikonowej, co zapewnia miękki i wydajny interfejs elektrochemiczny z tkanką mózgową18. Implanty są połączone elastycznym tunelowanym podstodniowo przez czaszkę i skórę z portem transdermalnym, w którym znajdują się łączniki na głowie zwierzęcia. Rozmiar i kształt implantu można dostosować do celu i potrzeb badania. Obecne paski elektrod w tym badaniu odzwierciedlają rzeczywisty rozmiar pasków klinicznych. Klinicznie dostępne paski i siatki podtwardówkowe zastosowano jako komparatory przy użyciu tego samego podejścia. Polimerowy port transdermalny kompatybilny z MRI jest umieszczany na czaszce za pomocą systemu podstawy, który mocno zakotwicza go w czaszce. Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę chirurgiczną, od podtwardówkowej implantacji obu półkul do powrotu do zdrowia zwierzęcia. Skupiamy się na korze słuchowej jako przykładowym obszarze docelowym, w którym potencjały wywołane są indukowane przez stymulację akustyczną zarówno w warunkach znieczulonych, jak i swobodnie poruszających się. W różnych punktach czasowych mózg zwierzęcia jest obrazowany w rezonansie magnetycznym (lub CT dla elektrod klinicznych) w znieczuleniu i mierzone są właściwości elektrochemiczne elektrod. Metody charakteryzacji elektrod są wykorzystywane do śledzenia ewolucji implantu i granicy elektroda-tkanka (więcej szczegółów można znaleźć w Schiavone et al.19). Obejmują one chronoamperometrię w celu zbadania zdolności stymulacyjnych kontaktu elektrody, elektrochemiczną spektroskopię impedancji (EIS), która może wskazać ewolucję rezystancyjnych i pojemnościowych składników elektrody, oraz międzykanałowe pomiary rezystancji w celu zbadania awarii hermetycznej enkapsulacji. Na koniec opracowaliśmy rurociąg ekstrakcji tkanek w celu perfuzji mózgu po eutanazji, eksplantacji z założonymi elektrodami, przekroju i przeprowadzenia analizy histologicznej przy użyciu różnych markerów stanu zapalnego. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta umożliwi prowadzenie badań przedklinicznych z solidnym gromadzeniem danych multimodalnych w celu przyszłego klinicznego przełożenia nowych technologii i terapii na mózg.

<table><tbody><tr><td>Wiertło do kości</td><td>BBraun</td><td>Elan 4 z&nbsp; Rękojeść</td><td></td>GA861</tr><tr><td>Wiertło do kości</td><td>BBraun</td><td>Neurocutter GP204R</td><td></td></tr><tr><td>Wosk kostny</td><td>Ethicon</td><td>W31G</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik</td><td>Venisystems</td> Mikroskop konfokalny <td>Abbocath 14G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td>, <td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Pfizer</td><td>Gelfoam</td><td></td></tr><tr><td>Włóż głośniki</td><td>Etymotic</td><td>Etymotic ER2 włóż słuchawki</td><td></td></tr><tr><td>Multimetr</td><td>Fluke Fluke</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>Tektronix</td><td>MDO3014 Oscyloskop</td><td></td>w domenie mieszanej</tr><tr><td>Pompa perfuzyjna</td><td>Shenzen</td><td>LabS3/UD15</td><td></td></tr><tr><td>Potencjostat</td><td>Gamry Instruments</td><td>Reference 600</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne Anty-GFAP</td><td>Thermofischer</td><td>Anti-GFAP, Szczur, # 13-0300</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne anty-Iba1</td><td>Fujifilm</td><td>Anti Iba1, Królik, 019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne Anti-NeuN</td><td>SigmaAldrich</td><td>Anti-NeuN, świnka morska, ABN90</td><td></td></tr><tr><td>Generator impulsów</td><td>AM Systems</td><td>Model 2100 Izolowany stymulator</td><td></td>impulsów</tr><tr><td>Nagrywanie sceny głównej</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>W2100-HS32</td><td></td></tr><tr><td>System nagrywania</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>W2100</td><td></td></tr><tr><td>Śrubokręt</td><td>Medtronic</td><td>Uchwyt: 001201, Wał: 8001205</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe 488</td><td>Thermofischer</td><td>Koza anty-szczurza IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 488, # A-11006</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe 555</td><td>Thermofischer</td><td>Kozia świnia morska IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 555, # A-21435</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe 647</td><td>Thermofischer</td><td>Goat anty-królicze IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 647, # A-21245</td><td></td></tr><tr><td>Skaner slajdów</td><td>Olympus</td><td>VS120</td><td></td></tr><tr><td>Snapfrost</td><td>Excilone</td><td>Excilone Snapfrost</td><td></td></tr><tr><td>Nóż do dźgania</td><td>Grzywna Science Tools</td><td>10316-14</td><td></td></tr><tr><td>Drut do szycia skórny</td><td>Ethicon</td><td>Vicryl 2-0</td><td></td></tr><tr><td>Drut do szycia opony twardej</td><td>Ethicon</td><td>Mersilk 5-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Drut do szycia cewnika</td><td>Ethicon</td><td>Vycril 3-0 bez igły Drut</td><td></td></tr><tr><td>do szycia do podnoszenia opony twardej</td><td>Ethicon</td><td>Prolene 6-0 z igłą BV-1 Drut</td><td></td></tr><tr><td>do szycia podskórny</td><td>Ethicon</td><td>Vicryl 4-0</td><td></td></tr><tr><td>Most tytanowy</td><td>Medtronic</td><td>TiMesh 015-2001-4</td><td>Wytnij wymagany rozmiar</td></tr><tr><td>tytanowe</td><td>Medtronic</td><td>9001635, 9001640</td><td></td></tr><tr><td>System rentgenowski</td><td>GE</td><td>GE OEC 9800 Plus C-Arm</td><td></td></tr></tbody></table>

implantacja matrycy podtwardówkowej miękkiej elektrokortykografii (ecog) i długotrwała rejestracja kory mózgowej u świnek miniaturowych

Subdural Soft Electrocorticography (ECoG) Array Implantation and Long-Term Cortical Recording in Minipigs

Zaburzenia i choroby neurologiczne mogą być diagnozowane lub leczone za pomocą matryc elektrokortykografii (ECoG). W padaczce lekoopornej pomagają one wyznaczyć obszar padaczkowy do wycięcia. W długoterminowych zastosowaniach, takich jak interfejsy mózg-komputer, te epickie elektrody są używane do rejestrowania intencji ruchowych mózgu, do kontrolowania robotycznych kończyn sparaliżowanych pacjentów. Jednak obecne sztywne siatki elektrod nie odpowiadają na potrzebę zapisów mózgu w wysokiej rozdzielczości i długoterminowej biointegracji. Ostatnio zaproponowano elastyczne układy elektrod, aby osiągnąć długoterminową stabilność implantu przy wysokiej wydajności. Potrzebne są jednak badania przedkliniczne nad tymi nowymi technologiami implantologicznymi, aby potwierdzić ich długoterminową funkcjonalność i profil bezpieczeństwa w odniesieniu do ich przełożenia na pacjentów. W tym kontekście modele świń są rutynowo wykorzystywane do opracowywania wyrobów medycznych ze względu na ich duże rozmiary narządów i łatwą obsługę zwierząt. Jednak w literaturze opisano tylko kilka zastosowań mózgu, głównie ze względu na ograniczenia chirurgiczne i integrację systemu implantów z żywym zwierzęciem.
Tutaj przedstawiamy metodę długoterminowej implantacji (6 miesięcy) i ocenę miękkich macierzy ECoG w modelu minipig. W badaniu najpierw przedstawiono system implantów, składający się z miękkiego mikrofabrykowanego układu elektrod zintegrowanego z polimerowym portem transdermalnym kompatybilnym z rezonansem magnetycznym (MRI), w którym znajdują się złącza oprzyrządowania do zapisów elektrofizjologicznych. Następnie w badaniu opisano procedurę chirurgiczną, od implantacji podtwardówkowej po rekonwalescencję zwierząt. Skupiamy się na korze słuchowej jako przykładowym obszarze docelowym, w którym potencjały wywołane są indukowane przez stymulację akustyczną. Na koniec opisujemy sekwencję pozyskiwania danych, która obejmuje rezonans magnetyczny całego mózgu, charakterystykę elektrochemiczną implantu, śródoperacyjną i swobodnie poruszającą się elektrofizjologię oraz barwienie immunohistochemiczne pobranych mózgów.
Ten model może być wykorzystany do zbadania bezpieczeństwa i funkcji nowatorskiego projektu protez korowych; obowiązkowe badanie przedkliniczne w celu wyobrażenia sobie translacji na pacjentów ludzkich.

W celu potwierdzenia rozmieszczenia (Rysunek 3A) i funkcjonalności urządzeń, po umieszczeniu postumentu przeprowadza się śródoperacyjne zapisy elektrofizjologiczne. Najpierw, przez 2 min, rejestruje się sygnał bazowy bez stymulacji jako kontrolę aktywności podstawowej. Następnie zwierzę poddaje się stymulacji akustycznej za pomocą impulsów dźwiękowych o różnych częstotliwościach (500-20 000 Hz), a surowe dane są uśredniane w okresie stymulacji w celu zmapowania potencjałów wywołanych słuchowo w obrębie macierzy (np. przy 800 Hz w porównaniu do poziomu bazowego; Rysunek 3B). Przedstawione tutaj dane są nieprzetworzone, jednak w przypadku wystąpienia zbyt dużego poziomu szumów można zastosować filtry zaporowe (notch) i pasmowoprzepustowe. Typowe źródła szumów w bloku operacyjnym obejmują m.in. maty grzewcze, podłączone wiertarki oraz ssawy lub kauteryzatory, które należy usunąć przed rozpoczęciem akwizycji. Podczas zapisów u zwierząt w stanie czuwania należy unikać dużych ruchów mięśniowych w okolicy głowy, takich jak żucie, aby uzyskać czystsze zestawy danych.
Protokół ten stosowano w każdym punkcie czasowym pomiaru, co pozwalało na porównywanie sygnałów z pojedynczego kanału w czasie. Jeden z przykładów zilustrowano na Rysunku 3C, wykazując stabilność i ewolucję odpowiedzi. Zdolność rejestracyjną każdego kontaktu w czasie trwania eksperymentu można ocenić, obliczając odchylenie standardowe sygnału bazowego w każdym punkcie czasowym (Rysunek 3D). W niniejszym badaniu stosunek sygnału do szumu malał i ustabilizował się między dniem 0 a 6. miesiącem, pomimo pewnej zmienności wynikającej z ograniczonego czasu trwania pomiaru (tj. 2 min). Można to dodatkowo skorelować z impedancjami elektrod.
Obrazowanie in vivo jest wykonywane po operacji w celu oceny stanu mózgu i ułożenia implantu. W pierwszej iteracji protokołu nie wykonano śródoperacyjnego zdjęcia rentgenowskiego, co doprowadziło do zgięcia urządzenia, co widoczne jest na Rysunku 4A w sekwencji MRI ważonej obrazem T1 (zob. dodatkowo Rysunek 4B). U zwierzęcia nie zaobserwowano zmian w zachowaniu, jednak z czasem doprowadziło to do powstania włóknistej otoczki wokół urządzenia z powodu makroskopowej kompresji mózgu wokół miejsca implantu (Rysunek 4C). Po tym doświadczeniu wprowadzono śródoperacyjne zdjęcie rentgenowskie, jak pokazano na Rysunku 4D, gdzie widać, że markery radioprzepuszczalne (czarne paski widoczne na implancie na wstawce do Rysunku 4D) są prawidłowo rozmieszczone. Powierzchnia mózgu pozostaje wówczas nienaruszona, co można zaobserwować w pooperacyjnym badaniu MRI na Rysunku 4E. Ogólnie rzecz biorąc, przy zastosowaniu tego systemu implantu i postumentu możliwe jest obrazowanie całego mózgu. Różne sekwencje w płaszczyznach czołowych umożliwiają wizualizację struktur anatomicznych (Rysunek 4F,G; sekwencje MRI T1 i T2) lub obecności płynu i krwi wokół implantu (Rysunek 4H; sekwencja MRI ważona TSE). System postumentu niemal nie generuje artefaktów, z wyjątkiem kilku małych obszarów o niskim kontraście wokół śrub tytanowych (zob. Rysunek 4G). Dodatkowo w badaniu tym jako porównywacze wykorzystano elektrody kliniczne, których nie można obrazować za pomocą MRI ze względu na ryzyko nagrzewania i kwestie bezpieczeństwa. Dlatego w przypadku tych zwierząt wykonano tomografię komputerową (CT), jak pokazano na Rysunku 4I. Elektrody są wyraźnie widoczne, a system postumentu nie wpływa na jakość obrazu.
Po okresie implantacji zwierzę zostaje poddane perfuzji, a mózg zostaje wyekstrahowany. W niniejszym badaniu analiza odpowiedzi zapalnej jest przeprowadzana niezależnie dla każdej półkuli. Podzielenie mózgu na pół ułatwia przygotowanie tkanki przed sekcjonowaniem i daje tę zaletę, że skrawki mogą być umieszczone na standardowych szkiełkach mikroskopowych. Przykład próbki mózgu przedstawiono przed (Rysunek 5A) i po (Rysunek 5B) cięciu w blokach. Zarys implantu jest wyraźnie widoczny i spowodował niewielkie wgłębienie w mózgu. Dzięki cięciu w płaszczyznach równoległych tkanka jest już wyrównana względem kriostatu, a skrawki można łatwo wycinać bez utraty tkanki podczas przycinania (Rysunek 5C). Po barwieniu obrazowany jest cały skrawki tkanki (Rysunek 5D), gdzie na przykład warstwa neuronów jest wyraźnie widoczna w szczegółach (patrz marker NeuN). Pełne sekcje są kruche i mogą czasami prowadzić do utraty części tkanki (patrz dół Rysunka 5D), jednak obszar zainteresowania pozostaje nienaruszony. Przy większym powiększeniu, uzyskanym dzięki obrazowaniu konfokalnemu przy 40x, komórki są wyraźnie zdefiniowane, co umożliwia dokładne badanie markerów zapalnych, na przykład (Rysunek 5E). Można przeprowadzić dalszą analizę ilościową, aby porównać stan zapalny między półkulą kontrolną a implantowaną. Rysunek 6 przedstawia charakterystykę elektrochemiczną implantowanych elektrod. Spektroskopię impedancji elektrochemicznej In vitro miękkiego układu elektrod z modułem impedancji i fazą przedstawiono na Rysunku 6A, a moduł impedancji przy 1 kHz w ciągu 6 miesięcy implantacji pokazano na Rysunku 6B.
<img alt="Schemat implantacji macierzy ECoG podtwardówkowej, kompatybilnej z MRI, do długoterminowych rejestracji korowych u miniprzysu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat eksperymentu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Sekwencja procedury chirurgicznej: kraniotomia, wykonanie nacięcia, ustawienie płytki mocującej i podstawków do badań." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Małoinwazyjna implantacja miękkiej elektrokortykografii (ECoG) na mózg. (A) Dostęp chirurgiczny do czaszki z zaznaczeniem punktu bregma. (B) Obustronna kraniotomia z widoczną oponą twardą. (C) Nacięcie opony twardej w pierwszej półkuli. (D) Podtwardówkowa implantacja miękkiej ECoG i zamknięcie opony twardej. (E) Nacięcie opony twardej w drugiej półkuli. Fixacja płata kostnego w pierwszej półkuli za pomocą mostków tytanowych. (F) Implantacja miękkiej ECoG w drugiej półkuli i zamknięcie opony twardej. (G) Fixacja płata kostnego w drugiej półkuli. (H) Pozycjonowanie płytki mocującej na czaszce. (I) Fixacja podstawka na płytce mocującej. (J) Zamknięcie skóry wokół podstawy podstawka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat stymulacji mózgu; wykresy amplitudy AEP i wykresy analizy odpowiedzi; badanie z zakresu neuronauki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Rejestracja potencjałów wywołanych słuchowo. (A) Schemat rozmieszczenia elektrod na powierzchni płata skroniowego. (B) Reprezentatywne mapowanie aktywności podstawowej (szare ślady) oraz potencjałów wywołanych słuchowo w odpowiedzi na stymulację krótkimi impulsami dźwiękowymi o częstotliwości 800 Hz (fioletowy ślad). Każna średnia odpowiada jednemu kanałowi w macierzy miękkiego ECoG. Uśrednianie jest wyzwalane przez analogowy sygnał wejściowy ze stymulacji dźwiękowej. Okresy stymulacji akustycznej „ON” i „OFF” są zaznaczone na jednym kanale w lewym dolnym rogu. (C) Ewolucja w czasie (dzień 0, miesiąc 2 i miesiąc 5) odpowiedzi pojedynczego kanału po bodźcu akustycznym, w porównaniu do sygnału podstawowego w sytuacji braku bodźca (szary). Uśrednianie jest wyzwalane przez analogowy sygnał wejściowy ze stymulacji dźwiękowej. Okresy stymulacji „ON” i „OFF” są zaznaczone na dole. Potencjał wywołany stymulacją „ON” jest oznaczony strzałkami. (D) Odchylenie standardowe na kanał (kolorowe kropki) w poszczególnych punktach czasowych rejestracji podstawowej. Wartości mediany przedstawiono na ciemnoniebiesko. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Sekwencja MRI i CT mózgu; skany T1, T2-zależne, w skali szarości oraz metoda implantacji do diagnostyki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obrazowanie in vivo mózgu i wszczepionych elektrod. (A) Pooperacyjne MRI T1-zależne w płaszczyźnie czołowej. Strzałka wskazuje zagięty implant. (B) Powiększony fragment A, gdzie zagięcie implantu powoduje wgniecenie w mózgu. (C) MRI T1-zależne po 1 miesiącu implantacji, wykazujące ucisk mózgu z powodu włóknistej enkapsulacji tkanki mózgowej w tym samym miejscu, co w C. (D) Śródoperacyjne zdjęcie rentgenowskie w płaszczyźnie, weryfikujące umiejscowienie implantu i brak zagięć, co potwierdza położenie markerów radioprzepuszczalnych. Wstawka: Zdjęcie implantu z widocznym markerem radioprzepuszczalnym. (E) Pooperacyjne MRI T1-zależne w płaszczyźnie czołowej z optymalnym umiejscowieniem implantu. (F) MRI T1-zależne po 1 miesiącu implantacji. (G) MRI T2-zależne po 1 miesiącu implantacji. Strzałka wskazuje artefakt obrazowy pochodzący od tytanowych śrub utrzymujących płytkę stopową na czaszce. (H) MRI TSE-zależne po 1 miesiącu implantacji. (I) Tomografia komputerowa (CT) zwierzęcia z wszczepionymi elektrodami klinicznymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Przecinanie, zatapianie i immunostaining mózgu myszy; mikroskopia fluorescencyjna; markery GFAP, NeuN, Iba1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Analiza histologiczna mózgu po długoterminowej implantacji. (A) Zdjęcie wyjętej z organizmu i perfundowanej lewej półkuli mózgu. (B) Perfundowany mózg pocięty na bloki przed etapem zamrażania. (C) Zdjęcie konfiguracji do cięcia całych bloków w kriosztacie; możliwe jest cięcie wszystkich „bloków wstępnie pociętych”. (D) Obrazowanie immunostaining całej półkuli (skaner slajdów, obiektyw 20x) oraz(E) powiększenie pierwszych warstw kory (obrazowanie konfokalne, obiektyw 40x) przedstawiające komórki glejowe, astrocyty i neurony. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki spektroskopii impedancyjnej; częstotliwość względem modułu, fazy i impedancji in vivo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Charakterystyka elektrochemiczna implantowanych elektrod. (A) Spektroskopia impedancyjna in vitro macierzy miękkich elektrod (małe szare linie dla każdego kanału, średnia na czerwono) z modułem impedancji (góra) i fazą (dół). (B) Zmiany modułu impedancji przy 1 kHz w ciągu 6 miesięcy implantacji (średnia na niebiesko; szare linie to poszczególne kanały; pomiar in vitro podano jako referencję na czerwono). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig06large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Postument kompatybilny z MRI. (A) Przewlekły system połączeń przezskórnych kompatybilny z MRI (postument) umożliwiający dostęp do macierzy elektrod miękkich. (B) Postument z elektrodami zamontowanymi na stopce służącej do kotwiczenia w czaszce. Wstawka: Szczegóły stopki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/FigS1_Pedestal.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 2: Dostęp chirurgiczny dla optymalnej perfuzji mózgu. (A) Nacięcie skóry i dostęp do miejsca położenia tętnicy szyjnej oraz żyły szyjnej. (B) Disekcja tkanki wokół naczyń krwionośnych. (C,D) Identyfikacja i disekcja tkanki wokół tętnicy szyjnej i żyły szyjnej. (E) Izolacja tętnicy szyjnej od tkanki pod nią. (F) Izolacja żyły szyjnej od tkanki pod nią. (G) Umieszczenie nici chirurgicznych wokół tętnicy szyjnej (szew 1 i szew 2) oraz żyły szyjnej (szew 3). (H) Zaciśnięcie szwu 3 u podstawy tętnicy szyjnej (od strony serca), aby uniknąć krwawienia podczas otwierania naczynia. (I) Zaciśnięcie tętnicy szyjnej po przeciwnej stronie niż w punkcie H. (J) Przecięcie tętnicy szyjnej. (K) Wprowadzenie cewnika do otworu powstałego w punkcie J. Wstawka: Przygotowany cewnik z solą fizjologiczną przepłukaną strzykawką do końcówki cewnika. (L) Zaciśnięcie szwu 2 w celu utrzymania cewnika w miejscu i wzdłuż tętnicy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/FigS2_Catheter.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Parametry dla sekwencji MRI odpowiednio dla T1- (strony 1-2), T2- (strony 3-4) oraz TSE- (strony 5-6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/Supplementary%20File%201_MRIparameters.pdf" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Metadane skanera slajdów do obrazowania całych preparatów barwionych przekrojów mózgu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/Supplementary%20File%202_Metadata%20Slide%20Scanner%20(1).pdf" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Metadane dla obrazowania konfokalnego powiększonego fragmentu barwionych przekrojów mózgu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/Supplementary%20File%203_Original%20Metadata%20-%20confocalsettings.pdf" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy metodę długoterminowej oceny wydajności i bezpieczeństwa miękkich matryc elektrod podtwardówkowych w modelu minipig, opisując metodę i narzędzia chirurgiczne, pooperacyjny rezonans magnetyczny, elektrofizjologię kory słuchowej, właściwości elektrochemiczne implantu oraz immunochemię pośmiertną.

Implantacja matrycy podtwardówkowej miękkiej elektrokortykografii (ECoG) i długotrwała rejestracja kory mózgowej u świnek miniaturowych

Neurological impairments and diseases can be diagnosed or treated using electrocorticography (ECoG) arrays. In drug-resistant epilepsy, these help ...

Model ten może stać się standardem walidacji bezpieczeństwa i skuteczności przewlekle chorych na korę mózgową pod względem biokompatybilności, rozdzielczości i jakości sygnału. Nasza procedura opisuje powtarzalną i skalowalną metodę przeprowadzania długoterminowej obserwacji bezpieczeństwa i skuteczności urządzenia. Obejmuje to monitorowanie neuronalne w czasie, a także obrazowanie in vivo i ex vivo.Nasza metoda pomoże w opracowaniu neuroprotezy czuciowej i ruchowej kory mózgowej. Jest to narzędzie do zrozumienia aktywności sieci korowych na dużą skalę. Metoda ta może być stosowana w neurobiologii podstawowej do badania funkcjonalnej łączności w różnych obszarach kory mózgowej.Może być również stosowany do innych dużych modeli zwierzęcych. Podejście chirurgiczne wymaga pewnej wprawy, którą można najpierw nabyć na zwłokach lub ostrych eksperymentach. Pomiary powinny być wtedy dość proste.Na początek naciąć skórę znieczulonego zwierzęcia nożem skalpela wzdłuż linii środkowej. Oddziel mięsień i okostną od kości za pomocą tarnika i umieść rozsiewacze, aby uzyskać optymalny dostęp. Aby wykonać kraniotomię, należy wywiercić kontur za pomocą wiertła do kości z okrągłym wiertłem tnącym, biorąc pod uwagę grubość czaszki zmierzoną na zdjęciu rentgenowskim.Miejsce wiercenia należy przepłukać roztworem soli, aby uniknąć przegrzania kości. Ostrożnie wywierć kontur jednorodnie, aż dotrze do opony twardej. Przy pierwszym przebiciu zakończ wiercenie konturu, aż stanie się wystarczająco cienki, aby prawie się przebić.Następnie użyj płaskiej szpatułki, aby odłamać płat kostny w jednym kawałku, używając krawędzi kraniotomii jako dźwigni. Aby wykonać durotomię, za pomocą igły z zestawu do szwów sześciostopniowych, ostrożnie przekłuj i unieś oponę twardą na przednim lub tylnym końcu kraniotomii, w połowie odległości między stroną przyśrodkową a boczną, i utwórz początek nacięcia nożem kłującym. Następnie za pomocą małej płaskiej szpatułki włożonej w przestrzeń podtwardówkową, działającej jako podstawa tnąca w celu ochrony kory.Utwórz szczelinę przednio-tylną w oponie twardej, posuwając się jednocześnie obydwoma narzędziami. Upewnij się, że szczelina jest nieco większa niż szerokość implantu. Umieść implant nad szczeliną opony twardej i za pomocą małych kleszczyków wsuń poddwojowo urządzenie, przesuwając je kolejno po każdej krawędzi.Ostrożnie przytrzymaj cokół urządzenia i przesuwaj się wraz z implantem, aby nie wytworzyć napięcia utrudniającego wprowadzenie. Zatrzymaj wkładanie, gdy krawędź łącznika znajduje się na górze szczeliny. Aby zamocować implant na miejscu, umieść tytanowy most na za krawędzią kraniotomii lub w skrzydłach kotwiących i zabezpiecz go jedną lub dwiema tytanowymi za pomocą odpowiedniego śrubokręta.Następnie ostrożnie zszyj oponę twardą wokół implantu. Używając trzech ochów wchłanialnego szwu i małego uchwytu na igłę, zbliż dwie krawędzie opony twardej tak bardzo, jak to możliwe, bez rozrywania cienkiej membrany drutem do szycia. Aby wykonać umieszczenie płata kostnego, przymocuj tytanowy most do przedniej i tylnej części każdego płata kostnego za pomocą tytanowej.Przykręć koniec tytanowych mostków do czaszki. Następnie zaplanuj orientację podnóżka, aby upewnić się, że wszystkie nogi można przykręcić do czaszki. Następnie zabezpiecz podnóżek, wkręcając tytanowe podnóżka, aż zostanie mocno osadzony.Następnie przykręć cokół do podnóżka. Wykonaj szwy podskórne za pomocą czterech niewchłanialnych drutów do szwów z szwami oddalonymi od siebie o trzy milimetry. Zacznij od cokołu, przesuwając się w jego kierunku po obu stronach nacięcia.Następnie zamknij warstwę skórną, zszywając skórę za pomocą niewchłanialnego drutu do szwów o grubości sześciu oh. Ze szwami oddalonymi od siebie o pięć milimetrów. Zacznij od cokołu, przesuwając się w jego kierunku po obu stronach nacięcia.Należy zwrócić uwagę, aby uzyskać dobre przyleganie tkanek między dwoma płatami skóry i w pobliżu krawędzi cokołu, aby uniknąć pustej przestrzeni. Po podłączeniu bezprzewodowego stopnia głowy do zwierzęcia osiągniętego poprzez trzymanie zwierzęcia lub odwracanie jego uwagi poprzez karmienie smakołykami, nagraj sygnały przebudzonego mózgu. Upewnij się, że podczas nagrywania sygnałów umieścisz amplifier antena i głośniki zewnętrzne blisko klatki świni.Podstawowa aktywność bez bodźców dźwiękowych i słuchowych potencjałów wywołanych w odpowiedzi na stymulację impulsem tonów o częstotliwości 800 Hz może być odwzorowana na matrycy elektrod. Słuchowy potencjał wywołany w pojedynczym kanale elektrody jest pokazany w czasie za pomocą strzałek oznaczających odpowiedź włączenia, a aktywność wyjściowa jest pokazana jako porównanie. Obrazowanie in vivo wykonano śródoperacyjnie i pooperacyjnie w celu oceny stanu mózgu i umiejscowienia implantu.Śródoperacyjne prześwietlenie rentgenowskie potwierdziło umieszczenie implantu i brak fałdowania, co obserwuje się po umieszczeniu markera nieprzepuszczającego promieni rentgenowskich. Powierzchnia mózgu jest nienaruszona, co można zaobserwować w pooperacyjnym rezonansie magnetycznym. Ogólnie rzecz biorąc, dzięki temu systemowi implantów i cokołów możliwe jest obrazowanie całego mózgu w trakcie okresu implantacji, aby zobaczyć struktury anatomiczne lub obecność płynu i krwi wokół implantu.Ponadto elektrody kliniczne są używane jako komparatory w tym badaniu, ale nie można ich zobrazować w rezonansie magnetycznym ze względu na ogrzewanie i obawy dotyczące bezpieczeństwa oraz wymagają skanów CT. Prezentowany rurociąg umożliwia ekstrakcję i sekcję całego mózgu w celu zobrazowania całych półkul. Obrazowanie całego wycinka tkanki wykazało wyraźną warstwę neuronów.Komórki są wyraźnie zdefiniowane w obrazowaniu konfokalnym przy 20-krotnym powiększeniu i umożliwiają dokładne badanie markerów stanu zapalnego. Charakterystykę elektrochemiczną urządzeń wykorzystano do wyodrębnienia modułu impedancji i fazy in vitro, które śledzono w czasie z prędkością jednego kiloherca w ciągu sześciu miesięcy implantacji. Bardzo ważne jest, aby starannie dobrać wiek i wielkość zwierzęcia, aby uniknąć otwarcia zatok podczas operacji.To naraziłoby na szwank chroniczny eksperyment. Ważne jest, aby unikać krwawienia podczas uzyskiwania dostępu do opony twardej lub wprowadzania implantów. Pozwoli to uniknąć dalszych powikłań i reakcji zapalnej.Po wprowadzeniu tego modelu można go wykorzystać do wykonywania elektrofizjologii swobodnego zachowania u mini świń i rejestrowania aktywności z obszarów kory mózgowej. Metoda ta może być stosowana do gromadzenia danych dotyczących bezpieczeństwa biologicznego w celu złożenia wniosku o badanie kliniczne podczas opracowywania nowych neuroprotez, które zostaną przetłumaczone na ludzi.

subdural-soft-electrocorticography-ecog-array-implantation-long-term

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy przydatne informacje dla chirurgów uczących się procesu implantacji chronicznych elektrod do rejestracji sygnałów neuronalnych. Opisano techniki stosowane dla systemów elektrod penetrujących oraz powierzchniowych w modelu gryzoni.

Chirurgiczna implantacja chronicznych elektrod neuronowych do rejestracji aktywności pojedynczych jednostek i sygnałów elektrokortykograficznych

Ten film demonstruje protokół wszczepiania elektrod elektrokortykograficznych do kory mózgowej myszy w celu rejestrowania sygnałów elektrycznych w odpowiedzi na wirusy związane z adenowirusami, które atakują i manipulują ekspresją kofiliny.

Implantacja elektrod do kory myszy w celu zapisów elektrokortykograficznych

Ten film demonstruje wszczepienie miękkiego zestawu elektrokortykograficznego i długoterminowe zapisy korowe u miniświnki. Przedstawiono w nim etapy związane z chirurgicznym wszczepieniem macierzy w korze słuchowej świnki miniaturowej i rejestrowaniem potencjałów czynnościowych neuronów wywołanych zarówno bodźcem podstawowym, jak i dźwiękowym.

Implantacja podtwardówkowa miękkiej matrycy elektrokortykograficznej do rejestracji elektrofizjologii kory mózgowej u świnek miniaturowych

Ten artykuł demonstruje skuteczność akupunktury, modeli epilepsji i analizy snu u gryzoni. Opisano procedurę akupunktury i identyfikację punktów akupunkturowych. Pilokarpina lub pentylenotetrazol (PTZ) jest stosowany w celu wywołania padaczki. Do analizy snu wykorzystuje się elektrokortykogram (ECoG), elektromiogram (EMG), temperaturę mózgu i zapisy aktywności lokomotorycznej.

Manipulacja elektrokortykogramem padaczkowym (ECoG) i snem u szczurów i myszy za pomocą akupunktury

Ten szczegółowy protokół opisuje umieszczanie elektrod stymulacji przezczaszkowej na kości skroniowej w celu zbadania krótko- i długoterminowych efektów przezczaszkowej stymulacji elektrycznej u swobodnie poruszających się szczurów.

Przewlekła przezczaszkowa stymulacja elektryczna i zapis wewnątrzkorowy u szczurów

To badanie bada nowatorskie zastosowanie technologii matryc mikroelektrod opartych na enzymach (MEA) do monitorowania in vivo aktywności neuroprzekaźników  u prosiąt.Postawiono hipotezę, że rozregulowanie glutaminianu przyczynia się do mechanizmu neurotoksyczności znieczulającej. W tym miejscu przedstawiamy protokół adaptacji technologii MEA do badania mechanizmu neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem.

Adaptacja technologii matryc mikroelektrod do badania neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem w nienaruszonym mózgu prosiąt

Tutaj prezentujemy protokół do rejestrowania telemetrycznych elektroencefalogramów (EEG) od swobodnie poruszających się prosiąt bezpośrednio w kojcu bez użycia środka uspokajającego, umożliwiając rejestrowanie typowych wzorców EEG podczas snu non-REM, takich jak pęknięcia wrzeciona.

Nieinwazyjne zapisy EEG od swobodnie poruszających się prosiąt

Opracowaliśmy całokorową matrycę elektrokortykograficzną dla marmozety pospolitej, która nieprzerwanie pokrywa prawie całą boczną powierzchnię kory, od bieguna potylicznego do bieguna skroniowego i czołowego. Protokół ten opisuje przewlekłą procedurę implantacji matrycy w przestrzeni zewnątrzoponowej mózgu marmozety.

Przewlekła implantacja całej korowej matrycy elektrokortykograficznej u marmozety zwyczajnej

W badaniu przedstawiono skalowalną, wiarygodną i odtwarzalną metodę powtarzających się przewlekłych zapisów korowych w modelu świni. Metoda ma zastosowanie w różnych dziedzinach neuronauki, w tym w badaniach nad bólem i diagnostyce chorób neurologicznych.

Technika przewlekłego okna czaszkowego do powtarzających się zapisów korowych podczas znieczulenia u świń

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Poznaj metodę implantacji miękkich elektrod podtwardówkowych u świnek miniaturowych do długotrwałej rejestracji kory mózgowej. Technika umożliwia ocenę bezpieczeństwa i skuteczności urządzeń kortykalnych oraz wspiera rozwój neuroprotez sensorycznych i motorycznych.

Implantacja matrycy podtwardówkowej miękkiej elektrokortykografii (ECoG) i długotrwała rejestracja kory mózgowej u świnek miniaturowych (Wideo) | JoVE Journal

Implantacja matrycy podtwardówkowej miękkiej elektrokortykografii (ECoG) i długotrwała rejestracja kory mózgowej u świnek miniaturowych

Przeglądaj więcej filmów