Name: Analiza zwapnienia naczyń krwionośnych za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu modeli in vitro i in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj metodę analizy zwapnienia naczyń krwionośnych poprzez izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysich aort. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów molekularnych prowadzących do zwapnienia komórek mięśniowych gładkich naczyń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 i 5 T32GM132054-04) oraz Florida Heart Research Foundation. Chcielibyśmy podziękować Kassandrze Gomez za pomoc w syntezie i obrazowaniu hydrożeli.

Praca in vivo została zatwierdzona i nadzorowana przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Międzynarodowym Uniwersytecie Florydy i była zgodna z aktualnymi wytycznymi National Institutes of Health (NIH). W przypadku tego protokołu procedura nie różni się w zależności od szczepu, wagi, wieku i płci myszy. Rodzaj badanego zwapnienia, diety i leczenie mogą zmieniać czas trwania badania i wagę wykorzystanej myszy i mogą zależeć od określonego szczepu i płci myszy wykorzystanej w badaniu. Do tego protokołu wykorzystano zarówno samce, jak i samice myszy C57BL/6J, które karmiono dietą zwapnienia. Myszy zostały uśmiercone między 20 tygodniem a 24 tygodniem życia.
1. Izolacja i wycięcie aorty
<ol>
	<li>Markery fluorescencyjne
	<ol>
		<li>Czterdzieści osiem godzin przed eutanazją wstrzyknij myszom 20 μM OsteoSense 680, środek do obrazowania fluorescencyjnego, w zalecanej dawce 100 μl na 25 g we wstrzyknięciu dożylnym.</li>
		<li>Pod wyciągiem umieść płytę styropianową z czterema kołkami teowymi, wiadro wyłożone ręcznikiem papierowym, probówkę o pojemności 50 ml wypełnioną ręcznikiem papierowym, probówkę do mikrowirówki o pojemności 1.5 ml, narzędzia do preparowania (patrz tabela materiałów) i etanol w butelce z rozpylaczem. Umieść zlewki z PBS na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie krwi
	<ol>
		<li>Dodaj 2 ml izofluranu do stożkowej probówki o pojemności 50 ml wypchanej ręcznikiem papierowym. Umieść rurkę w wiadrze i zamknij ją pokrywką. 
		UWAGA: Z izofluranem należy obchodzić się w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, bez recyrkulacji powietrza wywiewanego ze względu na toksyczność krótkotrwałego narażenia.</li>
		<li>Przenoś jedną mysz do wiadra na raz. Po uspokojeniu umieść mysz na ręczniku papierowym w pozycji grzbietowej. Trzymając mysz dłonią ręki niedominującej, odłóż uszy do tyłu za pomocą kciuka i palca wskazującego.</li>
		<li>Za pomocą pęsety wytnij jedno z oczu. Przytrzymaj mysz nad probówką o pojemności 1,5 ml, aby rozpocząć pobieranie krwi, podczas którego należy pobrać 1 ml krwi. Gdy krew przestanie odpływać, umieść mysz z powrotem w wiadrze w celu dalszego uspokojenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>eutanazja
	<ol>
		<li>Połóż ręcznik papierowy na macie preparacyjnej. Gdy mysz zostanie uspokojona, połóż ją na macie w pozycji leżącej. Zabezpiecz mysz w pozycji leżącej na plecach za pomocą sworznia w kształcie litery t, aby przytrzymać każdą kończynę.</li>
		<li>Spryskaj brzuch myszy alkoholem. Za pomocą pęsety unieś skórę w okolicy klatki piersiowej. Nożyczkami przetnij linię przyśrodkową do jamy klatki piersiowej. Po przecięciu mostka pośrodku przetnij przeponę po obu stronach klatki piersiowej.</li>
		<li>W razie potrzeby odetnij przednią część klatki piersiowej, aby odsłonić serce i płuca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie narządów
	<ol>
		<li>Za pomocą pęsety unieś skórę i wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej. Usuń nadmiar skóry lub tłuszczu. Usuń narządy rozrodcze i pęcherz moczowy, a także tłuszcz poza linią środkową.</li>
		<li>Przesuń narządy żołądkowo-jelitowe (GI) na prawą stronę i podążaj za jelitami w linii środkowej. Po znalezieniu podnieś linię środkową i wytnij przewód pokarmowy aż do żołądka.</li>
		<li>Wytnij nerki, odsuwając je od linii środkowej. Naciąć jak najbliżej nerki.</li>
		<li>Następnie rozpocznij usuwanie wątroby, podnosząc płaty i odcinając od linii środkowej.</li>
		<li>Perfuzja serca i aorty. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wstrzyknąć zimny PBS do prawej komory. Poczekaj, aż płuca napompują się i zmienią kolor na biały. Usuń płuca, a także nadmiar przepony lub klatki piersiowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie kości
	<ol>
		<li>Otwórz szeroko nożyczki i umieść je w dolnej części myszy nad ogonem. Cięcie w dół i zacznij podnosić kręgosłup ze skóry. Usuń tłuszcz z boków linii środkowej. Po oderwaniu skóry wytnij kręgosłup i nienaruszone narządy, przecinając je tuż nad sercem. W przypadku transportu do stereoskopu umieść kręgosłup i nienaruszone narządy w zlewce PBS w wiadrze z lodem.</li>
		<li>Przenieś kręgosłup i narządy do naczynia preparacyjnego. Napełnij lodowatym PBS. Przypnij kręgosłup i klatkę piersiową za pomocą igieł.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym użyj pęsety, aby ostrożnie podnieść serce i zacznij ciąć powyżej kręgosłupa i pod aortą. Kontynuuj to, aż dojdziesz do dolnej części kręgosłupa. Usuń grzbiet z naczynia preparacyjnego i przygwoźdź serce oraz wszelkie obce tłuszcze lub mięśnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikrodysekcja
	<ol>
		<li>Zaczynając od obszaru tuż pod sercem, zidentyfikuj trzy struktury rurkowe: przełyk, żyłę główną i aortę. Usuń przełyk i żyłę główną, aby mieć czyste pole widzenia aorty.</li>
		<li>Za pomocą kleszczyków i nożyczek do mikrodysekcji zacznij podnosić tkankę tłuszczową i ciąć jak najbliżej aorty. Pamiętaj, aby nie przecinać aorty. Kontynuuj to wzdłuż linii przyśrodkowej, aż cała aorta oraz tętnice udowe zostaną odsłonięte.</li>
		<li>W sercu usuń całą tkankę tłuszczową, odsłaniając trzy gałęzie na łuku aorty. Usuń korzeń aorty z lewej komory, wkładając nożyczki do mikrodysekcji do lewej komory i przecinając mięsień otaczający aortę.</li>
		<li>Po wyizolowaniu i oczyszczeniu aorty zobrazuj ją za pomocą skanera bliskiej podczerwieni, aby uwidocznić zwapnienie naczyń krwionośnych.</li>
		<li>Użyj niestandardowego skryptu MATLAB (plik uzupełniający 1), aby określić ilościowo całkowity sygnał znacznika wapnia, który jest znormalizowany do całkowitego zeskanowanego obszaru aorty. Skrypt MATLAB działa przy użyciu dodatku Bioinformatics toolbox. MATLAB jest najpierw kierowany do lokalizacji plików TIFF ze skanowania aort w bliskiej podczerwieni, następnie otwierane są poszczególne pliki, a wartości intensywności pikseli są wyodrębniane z plików TIFF.
		<ol>
			<li>Po zaprezentowaniu użytkownikowi obrazu z kolorową mapą, jako maksimum skali wybierz aortę o największym zwapnieniu.</li>
			<li>Gdy MATLAB zapyta "Ile próbek znajduje się na obrazie?" w oknie poleceń wprowadź liczbę aort na bieżącym obrazie i wybierz każdą aortę jeden po drugim. Po wybraniu aorty MATLAB utworzy obraz binarny z maską całkowitego obszaru aorty i inny obraz binarny z maską zwapniałego obszaru aorty. Wartości z tych zamaskowanych obrazów są następnie wykorzystywane do określenia całkowitego obszaru zwapniałego, całkowitego obszaru aorty, procentowego obszaru dodatniego dla zwapnienia oraz średniej intensywności zwapniałego obszaru.</li>
			<li>Aby wybrać aortę, utwórz ramkę wokół interesującej ją aorty na najnowszej figurze na ekranie, zaznaczając cztery rogi jednym lewym przyciskiem myszy i tworząc ramkę wokół obrazu. Aby zamknąć pole, kliknij dwukrotnie pierwszy róg. 
			UWAGA: Próg może się różnić w zależności od zastosowanego modelu zwapnienia. To od użytkownika zależy, jaka wartość określa dodatni sygnał do zwapnienia naczyń krwionośnych. Po ustawieniu progu dla eksperymentu musi on pozostać taki sam przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po wyodrębnieniu danych ilościowych wykonaj jednokierunkową ANOVA za pomocą testu post-hoc Tukeya, aby pokazać istotność między grupami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolowanie i ekstrakcja EV z aort
UWAGA: Po wyizolowaniu i usunięciu aort, EV mogą być ekstrahowane z tkanki. Korzystając z roztworu trawiennego i wielu cykli wirowania, EV mogą być zbierane i wykorzystywane do wielu różnych technik, w tym testów zwapnienia, elektroforezy żelowej i immunoblottingu13. Protokół izolacji i ekstrakcji EV jest następujący:
<ol>
	<li>Natychmiast po zeskanowaniu aort połącz dwie do trzech aort, aby uzyskać wystarczające stężenie białka.</li>
	<li>Przygotuj roztwór trawienny zawierający 0,25 M sacharozy, 0,12 M chlorku sodu (NaCl), 0,01 M chlorku potasu (KCl), 0,02 M chlorowodorku trisu i 600 U/ml kolagenazy13.</li>
	<li>Inkubować dwie lub trzy zebrane aorty w 1,5 ml roztworu trawiennego przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Zebrać roztwór. Odwirować roztwór o stężeniu 1 000 × g przez 15 minut w celu usunięcia resztek komórek.</li>
	<li>Odwirować supernatant przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 33 000 × g w celu usunięcia mikropęcherzyków. Zebrać i ocenić supernatant pod kątem potencjału zwapnienia (patrz sekcja 3). 
	UWAGA: Postępuj zgodnie z kolejnymi krokami, jeśli ma być wykonana elektroforeza żelowa i immunoblotting białek EV.</li>
	<li>Ultraodwirować supernatant w stężeniu 100 000 × g przez 1 godzinę, aby wyizolować interesujące nas EV.</li>
	<li>Podczas gdy supernatant jest poddawany ultrawirowaniu, należy przygotować bufor do lizy i ekstrakcji RIPA (patrz tabela materiałów), dodając inhibitor proteazy i wirując aż do rozpuszczenia.</li>
	<li>Po zakończeniu ultrawirowania odessać supernatant, pozostawiając osad, który zawiera EV. Zawiesić osad w przygotowanej mieszaninie inhibitorów lizy i proteazy RIPA. Próbki są gotowe do elektroforezy żelowej i western bloting.</li>
</ol>
3. Ocena potencjału zwapnienia pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z absorbancją rozpraszania światła
UWAGA: Aby zmierzyć tworzenie się minerałów w czasie rzeczywistym przez EV, użyliśmy pierwotnie opracowanego testu do badania tworzenia się minerałów z chrząstek EV płytki wzrostu z hodowli komórkowych14. Ponieważ osadzanie się fosforanu wapnia jest cechą charakterystyczną zwapnienia, wzrost absorbancji rozpraszania światła w wyniku tworzenia się związków fosforanu wapnia wskazuje na potencjał zwapnienia14. Metody in vitro Modele VSMC są wygodne do pomiaru potencjału zwapnienia pojazdów elektrycznych. W tej technice czytnik płytek z filtrem o krótkiej długości fali może określić ilościowo zwapnienie EV in vitro. Odczyt chłonności jest rejestrowany przy 340 nm, a wyższa absorbancja wskazuje na większe tworzenie się minerałów fosforanu wapnia. Protokół oznaczania absorbancji rozpraszania światła jest następujący:
<ol>
	<li>Odwirować kondycjonowane zebrane podłoże VSMC o stężeniu 1,000 × g przez 5 minut, aby usunąć resztki komórek14.</li>
	<li>Odwirować supernatant w stężeniu 33 000 × g przez 30 minut, zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki. 
	UWAGA: Obecność EV w pobranym supernatancie można potwierdzić za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) lub analizy śledzenia nanocząstek (NTA)</li>
	<li>Przygotować sterylny roztwór jednozasadowy (NaH, 2PO, 4) fosforanu sodu o stężeniu 300 mM. W razie potrzeby przefiltrować roztwór, aby zapewnić sterylne warunki.</li>
	<li>Dodać 1% (v/v) z 300 mM NaH2PO4 do próbek EV i delikatnie pipetować roztwór, aby dobrze wymieszać. Przenieść 200 μl roztworu mieszaniny na płytkę 96-dołkową. Inkubować 96-dołkową płytkę w czytniku mikropłytek w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ustaw czytnik płytek tak, aby rejestrował absorbancję przy długości fali 340 nm co 1 minutę.</li>
</ol>
4. Ocena mineralnego formowania zwapnień pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą hydrożeli kolagenowych
UWAGA: Agregacja EV i powstawanie mikrozwapnień są obserwowane za pomocą hydrożeli kolagenowych. Te hydrożele działają jak rusztowanie, które naśladuje gęstość kolagenu obserwowaną in vivo15. Pokazuje to wpływ kolagenu na wzrost zwapnienia. Protokół oceny tworzenia się minerałów EV w hydrożelach jest następujący:
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór kolagenu o stężeniu 2,5 mg/ml w DMEM. Powoli dodawaj 5 M wodorotlenku sodu do mieszaniny kolagen/DMEM, aż kolor zmieni się na czerwony. Sprawdzić, czy pH roztworu wynosi około 7, 
		UWAGA: Jeśli roztwór zmieni kolor na fioletowy i stanie się zbyt podstawowy, uruchom ponownie proces.</li>
		<li>Odpipetować 300 μl roztworu kolagenu o pH 2,5 mg/ml o pH 7 do każdej studzienki szklanej komory 8-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C i kontrolowanej wilgotności 5% CO2 przez 72 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 4
	<ol>
		<li>Dodaj 300 μl DMEM jako kontrolę do studzienek.</li>
		<li>Dodać 300 μl próbek pożywki EV pobranych wcześniej do pozostałych studzienek.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C i kontrolowanej wilgotności 5% CO2 przez 6 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 10
	<ol>
		<li>Przygotować 2,5 μl Osteosense 680EX z 22,5 μl DMEM.</li>
		<li>Odpipetować 2,5 μl mieszaniny Osteosense i DMEM do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C i wilgotności kontrolowanej 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 11
	<ol>
		<li>Zobrazuj hydrożele z filtrami odpowiednimi dla fluorescencji Osteosense. Zobrazuj je przez dno komory ze szkła nakrywkowego za pomocą odwróconego mikroskopu lub od góry za pomocą obiektywu o dużej odległości roboczej.</li>
		<li>Oceń liczbę zwapnień i rozmiar zwapnienia na zebranych obrazach, korzystając z opcji analizy cząstek dostępnych w ImageJ.
		<ol>
			<li>Korzystanie z punktu menu Obraz | Dostosuj | Polecenie threshold w celu binaryzacji obrazów w taki sposób, aby tylko sygnał Osteosense był biały. Korzystanie z punktu menu Analiza | Polecenie Analizuj cząstki, aby uzyskać informacje o każdym zwapnieniu na obrazie. Pamiętaj, aby użyć tych samych parametrów progowych dla każdego analizowanego obrazu w celu zapewnienia spójności.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+mediators+of+cardiovascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78(2017).</li>
<li>Ho, C. Y., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medial+arterial+calcification%3A+an+overlooked+player+in+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).</li>
<li>Marinelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+arterial+media+calcification+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiorenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease.</a> Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).</li>
<li>Moe, S. M., Chen, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).</li>
<li>Mir, B., Goettsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+delivery+vehicles+of+specific+cellular+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo.</a> Cells. 9 (7), 1601(2020).</li>
<li>Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+calcification%3A+Current+controversies+and+novel+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).</li>
<li>New, S. E., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+extracellular+vesicles+in+de+novo+mineralization%3A+An+additional+novel+mechanism+of+cardiovascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).</li>
<li>Aikawa, E., Hutcheson, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAikawa%2C+E+%22Cardiovascular+Calcification+and+Bone+Mineralization%22">Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization</a>. , Humana Press. Cham, Switzerland. (2020).</li>
<li>Johnson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P-407-induced+murine+model+of+dose-controlled+hyperlipidemia+and+atherosclerosis%3A+A+review+of+findings+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).</li>
<li>Shobeiri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+calcification+in+animal+models+of+CKD%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Vascular calcification in animal models of CKD: A review.</a> American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).</li>
<li>El-Abbadi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate+feeding+induces+arterial+medial+calcification+in+uremic+mice%3A+role+of+serum+phosphorus%2C+fibroblast+growth+factor-23%2C+and+osteopontin%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin.</a> Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).</li>
<li>Veseli, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li>
<li>Chen, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transglutaminase+2+accelerates+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease.</a> American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).</li>
<li>Wu, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+characterization+of+the+nucleational+core+of+matrix+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).</li>
<li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podczas wykonywania protokołu ważne jest, aby zwrócić uwagę na kluczowe kroki w celu uzyskania pomyślnych wyników. Podczas izolacji aorty mysiej ważne jest, aby perfuzja została wykonana prawidłowo. Podczas wstrzykiwania PBS należy uważać, aby nie przebić prawej komory. Spowodowałoby to, że płyn wyciekałby bezpośrednio z komory i nie krążyłby w płucach, pozostawiając krew w aorcie. Po prawidłowym przeprowadzeniu perfuzji i rozpoczęciu mikrodysekcji, cała tkanka tłuszczowa i tłuszczowa musi zostać usunięta z aorty przed z...

Zwapnienie jest najważniejszym czynnikiem wpływającym na śmiertelność i zachorowalność z powodu chorób sercowo-naczyniowych1. Zwapnienie zmienia mechanikę ściany tętnicy z powodu nagromadzenia minerałów wapniowych i fosforanowych2. W miażdżycy zwapnienie może nasilać miejscowy stres i powodować pękanie blaszki miażdżycowej, która jest główną przyczyną zawałów serca. Zwapnienie przyśrodkowe - często wynikające z przewlekłej choroby nerek - jest bardziej rozpowszechnione i prowadzi do znacznego usztywnienia tętnic, dysfunkcji i przeciążenia serca2,3. Obecnie nie ma możliwości terapeutycznych w leczeniu lub zapobieganiu zwapnieniu naczyń krwionośnych.
Komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) przyjmują fenotyp podobny do osteoblastu i uwalniają zwapniające pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), które zarodkują powstające minerały, powodując w ten sposób zwapnienie4,5,6. Proces ten przypomina fizjologiczną mineralizację osteoblastów w bone7. Chociaż punkt końcowy mineralizacji jest podobny w ścianie naczynia krwionośnego i macierzy kostnej, mechanizmy, dzięki którym powstają zwapnienia EV, różnią się w obu tkankach8. Istnieje wiele rodzajów modeli, które są używane do badania zwapnienia naczyń krwionośnych. In vitro modele hodowli komórkowych naśladują osteogenne przejście VSMC i późniejsze tworzenie minerałów za pomocą specjalistycznych pożywek.
Podczas badania zwapnienia in vivo, używany model zależy od rodzaju badanego zwapnienia. Mysie modele hiperlipidemiczne są często używane do badania zwapnienia miażdżycowego, które wydaje się bardziej ogniskowe w blaszkach bogatych w lipidy9. W przeciwieństwie do tego, zwapnienie przyśrodkowe jest bardziej rozpowszechnione w całym układzie naczyniowym i często jest badane przy użyciu modeli przewlekłej choroby nerek, które wykorzystują dietę bogatą w adeninę w celu wywołania niewydolności nerek lub techniki chirurgiczne w celu usunięcia znacznych części nerek10,11. Agresywne modele zwapnienia naczyń krwionośnych wykorzystywały kombinację modeli hiperlipidemicznej i przewlekłej choroby nerek12. Protokół ten zapewnia metodę oceny zwapnienia naczyń krwionośnych w aorcie mysim zarówno pod kątem zwapnienia przyśrodkowego, jak i miażdżycowego, ekstrakcji EV ze ściany aorty oraz obserwacji potencjału mineralizacji w EV uzyskanych z modeli hodowli komórkowych in vitro. Przyszłe badania mogą wykorzystywać te procedury w mechanistycznych analizach zwapnienia naczyń krwionośnych oraz do oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>8-dołkowa komora nakrywkowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409PK</td><td></td></tr><tr><td>10 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>20 G 1-calowa igła</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>kolagen, wysoka koncentracja, ogon szczura</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>kolagenaza</td><td>Worthington Biochemiczne</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>zakrzywione kleszcze</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>RS-8254</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie preparacyjne</td><td>Żywe systemy Oprzyrządowanie</td><td>DD-90-S</td><td></td></tr><tr><td>Patelnia preparcyjna i wosk</td><td>United Scientific Supplies</td><td>DSPA01-W</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cytiva</td><td>SH30022. </td><td></td>FS</tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey</td><td>LI-COR</td><td>DLx</td><td></td></tr> Mikro zakrzywione <tr><td>nożyczki preparacyjne (ostrze 24 mm)&nbsp;</td><td>Instrument chirurgiczny Roboz</td><td>RS-5913</td><td></td></tr> Mikro sprężynowe <tr><td>nożyczki preparacyjne (ostrze 13 mm)</td><td>Instrument chirurgiczny Roboz</td><td>RS-5677</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe do mikropreparacji (ostrze 5 mm)</td><td>Instrument chirurgiczny</td><td>Roboz RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Mikro pęseta preparcyjna (końcówka 0,10 x 0,06 mm)</td><td>Instrument chirurgiczny Roboz</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td> <td>Optima MAX-TLBeckman Coulter</td><td>B11229</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680EX</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Pierce'a</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32963</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fischer Chemical</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy i ekstrakcji RIPA</td><td>G Biosciences</td><td>786-489</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fischer Chemical</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Thermo Scientific</td><td>A4782602</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX Czytnik wielomodowy</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowych, 96-dołkowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins</td><td>United Scientific Supplies</td><td>TPIN02-PK/100</td><td></td></tr><tr><td>Tris Chlorowodorek</td><td>Fischera Chemiczny</td><td>BP153</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza zwapnienia naczyń krwionośnych za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu modeli in vitro i in vivo

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Choroby sercowo-naczyniowe są główną przyczyną zgonów na świecie, a zwapnienie naczyń krwionośnych jest najważniejszym predyktorem zdarzeń sercowo-naczyniowych; jednak obecnie nie ma możliwości leczenia zwapnienia naczyń krwionośnych. Zwapnienie rozpoczyna się w wyspecjalizowanych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV), które służą jako ogniska zarodkowania poprzez agregację jonów wapnia i fosforanów. Protokół ten opisuje metody uzyskiwania i oceny zwapnienia w aortach mysich oraz analizy powiązanych wyekstrahowanych EV. Najpierw przeprowadza się grubą sekcję myszy w celu pobrania odpowiednich narządów, takich jak nerki, wątroba i płuca. Następnie mysia aorta jest izolowana i wycinana od korzenia aorty do tętnicy udowej. Dwie do trzech aort są następnie łączone i inkubowane w roztworze trawiennym przed poddaniem ultrawirowaniu w celu wyizolowania interesujących EV. Następnie określa się potencjał mineralizacji EV poprzez inkubację w roztworze o wysokiej zawartości fosforanów i pomiar absorbancji światła o długości fali 340 nm. Wreszcie, hydrożele kolagenowe są używane do obserwacji zwapniałych minerałów tworzących się i dojrzewających wytwarzanych przez EV in vitro.

Po wyekstrahowaniu aorty, obrazowanie z użyciem skanera optycznego w bliskiej podczerwieni pozwala na wizualizację aorty oraz zwapnień naczyniowych (Rysunek 1). Wartości intensywności pikseli w zeskanowanym obrazie fluorescencyjnym reprezentują rozkład zwapnień i są tutaj przedstawione za pomocą kolorowej mapy ciepła. Metody ilościowe obejmują wyznaczenie progu pozytywnego i określenie procentowej powierzchni aorty o wartościach przekraczających ten próg oraz/lub wyznaczenie średniej intensy...

Ten artykuł przedstawia metodologię uzyskiwania i oceny zwapnienia naczyń krwionośnych poprzez izolację mysich aort, a następnie ekstrakcję zwapniałych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu obserwacji potencjału mineralizacji.

Analiza zwapnienia naczyń krwionośnych za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu modeli in vitro i in vivo

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Protokół ten zapewnia metodę, która może być wykorzystana do oceny, a w przyszłości do opracowania metod leczenia zwapnienia naczyń krwionośnych, które jest najważniejszym czynnikiem prognostykicznym chorób sercowo-naczyniowych. Zdolność do izolowania EV pozwala nam na dalsze badanie mechanizmów, które prowadzą do zwapnienia naczyń krwionośnych i zmiany fenotypowej komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Technika ta zapewnia wgląd we wczesne mechanizmy molekularne zwapnienia komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, w których pośredniczą media.Zrozumienie tego pozwala na badanie opcji terapeutycznych dla poznanego mechanizmu. Za pomocą tej metody można badać dowolne interesujące nas pojazdy elektryczne. Nie dotyczy to wyłącznie komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, osteoblastów lub zwapnienia naczyń.Po eutanazji myszy unieś skórę za pomocą pęsety i wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej. Usuń nadmiar skóry lub tłuszczu. Następnie usuń narządy rozrodcze, pęcherz moczowy i tłuszcz poza linią środkową.Następnie przesuń narządy żołądkowo-jelitowe na prawą stronę i podążaj za jelitami w linii środkowej. Po znalezieniu podnieś linię środkową i wytnij przewód pokarmowy aż do żołądka. Wytnij nerki, odsuwając je od linii środkowej.Naciąć jak najbliżej nerki. Usuń wątrobę, podnosząc płaty i odcinając od linii środkowej. Następnie wykonaj perfuzję serca i aorty, wstrzykując zimny PBS do prawej komory za pomocą 10-mililitrowej strzykawki.Poczekaj, aż płuca się napompują i zmienią kolor na biały. Usuń płuca i nadmiar przepony lub klatki piersiowej. Aby usunąć kość, otwórz szeroko nożyczki i umieść je w dolnej części myszy nad ogonem.Odetnij w dół, unieś kręgosłup ze skóry i usuń tłuszcz z boków linii środkowej. Po oderwaniu skóry wytnij kręgosłup i nienaruszone narządy, przecinając je tuż nad sercem. Umieść kręgosłup i nienaruszone narządy w zlewce PBS w pojemniku na lód w przypadku transportu do stereoskopu.Po przeniesieniu kręgosłupa i narządów do naczynia preparacyjnego, napełnij je lodowatym PBS i przygwoźdź kręgosłup i klatkę piersiową za pomocą igieł. Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie podnieś serce za pomocą pęsety i rozpocznij cięcie nad kręgosłupem i pod aortą. Kontynuuj to, aż dojdziesz do dolnej części kręgosłupa.Usuń grzbiet z naczynia preparacyjnego i przygwoźdź serce oraz wszelkie obce tłuszcze lub mięśnie. Zaczynając od obszaru tuż pod sercem, zidentyfikuj przełyk, żyłę główną i aortę. Usuń przełyk i żyłę główną, aby mieć czyste pole widzenia aorty.Za pomocą kleszczy i nożyczek do mikropreparacji zacznij podnosić tkankę tłuszczową i ciąć jak najbliżej aorty. Kontynuuj to wzdłuż linii przyśrodkowej, aż wszystkie aorty i tętnice udowe zostaną odsłonięte. W sercu usuń całą tkankę tłuszczową, odsłaniając trzy gałęzie przy łuku aorty.Usuń korzeń aorty z lewej komory, wkładając nożyczki do mikropreparacji do lewej komory i przecinając mięsień otaczający aortę. Po wyizolowaniu i oczyszczeniu aorty zobrazuj ją za pomocą skanera bliskiej podczerwieni, aby uwidocznić zwapnienie naczyń krwionośnych. Korzystając z niestandardowego skryptu MATLAB, określ ilościowo całkowity sygnał znacznika wapnia znormalizowany do całkowitego zeskanowanego obszaru aorty.Skieruj MATLAB do lokalizacji plików TIF ze skanowania w bliskiej podczerwieni aort, otwórz poszczególne pliki i wyodrębnij wartości intensywności pikseli z plików TIF. Wybierz aortę o największym zwapnieniu jako maksimum skali na obrazie odwzorowanym w kolorze. Gdy w oknie pojawi się polecenie Ile próbek znajduje się na obrazie, wprowadź liczbę aort na bieżącym obrazie i wybierz każdą aortę jeden po drugim.Po wybraniu aorty MATLAB utworzy obrazy binarne z maską całkowitego obszaru i zwapniałego obszaru aorty. Wartości z tych zamaskowanych obrazów są następnie wykorzystywane do określenia całkowitego obszaru zwapniałego, całkowitego obszaru aorty, procentowego obszaru dodatniego dla zwapnienia oraz średniej intensywności zwapniałego obszaru. Natychmiast po zeskanowaniu aort połącz dwie do trzech aort, aby uzyskać wystarczające stężenie białka.Inkubuj dwie do trzech połączonych aort w 1,5 mililitra roztworu trawiennego przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zebrać roztwór i odwirować przy 1 000 g przez 15 minut w celu usunięcia resztek komórek. Następnie, aby usunąć mikropęcherzyki, ponownie odwirować supernatant przez 30 minut w temperaturze 33 000 g.Zebrać i ocenić supernatant pod kątem potencjału zwapnienia. Po usunięciu resztek komórkowych z kondycjonowanego zebranego podłoża przez odwirowanie, należy wirować zebrany supernatant w temperaturze 33 000 g przez 30 minut. Zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki.Następnie dodać 1% z 300 milimolowych diwodorofosforanu sodu do próbek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i wymieszać roztwór przez pipetowanie. Przenieść 200 mikrolitrów roztworu mieszaniny na płytkę 96-dołkową i inkubować 96-dołkową płytkę w czytniku mikropłytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ustaw czytnik płytek tak, aby rejestrował absorbancję na długości fali 340 nanometrów co minutę.Odpipetować 300 mikrolitrów roztworu kolagenu do każdego dołka szklanej z ośmiodołkową komorą i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny. Po inkubacji dodać 300 mikrolitrów DMEM jako kontrolę do studzienek. Dodać 300 mikrolitrów próbek pożywki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pobranych wcześniej do pozostałych studzienek i inkubować przez sześć dni, jak wykazano wcześniej.Dziesiątego dnia odpipetować 2,5 mikrolitra mieszaniny OsteoSense i DMEM do każdego dołka i inkubować przez 24 godziny. Pod koniec inkubacji należy zobrazować hydrożele z filtrami do fluorescencji OsteoSense przez dno komory ze szkła nakrywkowego za pomocą mikroskopu odwróconego lub od góry za pomocą obiektywu o dużej odległości roboczej. Oceń liczbę zwapnień i rozmiar zwapnienia oraz zebrane obrazy, korzystając z opcji analizy cząstek dostępnych w ImageJ.Następnie przejdź do Obrazu, wybierz Dostosuj i kliknij Próg, aby binarnie obrazy były wyświetlane na biało. Następnie użyj polecenia Analizuj i kliknij polecenie Analizuj cząstki, aby uzyskać informacje o każdym zwapnieniu na obrazie. Użyj tych samych parametrów progowych, aby zapewnić spójność dla każdego analizowanego obrazu.Obrazowanie wypreparowanych aort za pomocą skanera optycznego w bliskiej podczerwieni wykazało wyższy sygnał OsteoSense w całej aorcie myszy z przewlekłą chorobą nerek niż dwie aorty myszy kontrolnej. Kondycjonowane podłoże uzyskane z komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych hodowanych w pożywce pro-wapniowej wykazało wyższą absorbancję przy 340 nanometrach niż podłoże kontrolne. Wzrost absorbancji nastąpił 1,5 raza szybciej w próbce pro-wapniowej w porównaniu z próbką kontrolną.Kondycjonowana pożywka z komórek hodowanych w warunkach prowapiennych zawierała złoża mineralne. Podczas mikropreparowania aorty ważne jest, aby ostrożnie wyciąć tłuszcz otaczający aortę. Chcesz przeanalizować jak najwięcej aorty, ale może to być dość żmudne.Po wyizolowaniu EV można wykonać dodatkowe testy, takie jak test aktywności fosfatazy alkalicznej lub badanie immunoorganizmu. Testy te pozwoliłyby na dalsze poznanie mechanizmów i białek obecnych w pojazdach elektrycznych.

analysis-extracellular-vesicle-mediated-vascular-calcification-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje technikę barwienia do oceny zwapnienia tętnic przyśrodkowych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro. Metoda von Kossy wykorzystuje reakcję fotochemiczną w celu osadzenia metalicznego srebra w miejscach zwapnienia i nadania czarnego zabarwienia.

Barwienie von Kossy komórek mięśni gładkich naczyń aorty: technika in vitro do oceny zwapnienia przyśrodkowej warstwy tętniczej

Źródło: Hakim, M. A.  i inni., Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia analizę funkcjonalną śródbłonka tętniczki wyizolowanej z mózgu myszy. Przedstawiono w nim etapy pomiaru wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia i potencjału błonowego, zarówno na początku badania, jak i w odpowiedzi na stymulację farmakologiczną.

Analiza dynamiki wapnia i zmian potencjału błonowego w śródbłonku tętniczym myszy

Ładowanie barwnikiem indukowane przez esterazy celowane (TED) wspiera analizę dynamiki wewnątrzkomórkowego magazynowania wapnia za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda opiera się na ukierunkowaniu rekombinowanej karboksylesterazy na retikulum endoplazmatyczne (ER), gdzie poprawia miejscowe demaskowanie syntetycznych barwników wskaźnikowych Ca2+ o niskim powinowactwie w świetle ER.

Bezpośrednie obrazowanie wapnia ER z ładunkiem barwnika indukowanym przez celowaną esterazy (TED)

Zwapnienie naczyń krwionośnych jest ważnym czynnikiem predykcyjnym i przyczyniającym się do chorób sercowo-naczyniowych u ludzi. Protokół ten opisuje metody indukowania zwapnienia hodowanych pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz ilościowego określania zwapnienia i obciążenia makrofagami w aorcie zwierzęcej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni.

zwapnienie komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz obrazowanie zwapnień i stanów zapalnych aorty

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Ten protokół opisuje izolację, hodowlę i zwapnienie komórek śródmiąższowych zastawki pochodzących od szczurów, wysoce fizjologiczny model in vitro zwapnienia zastawki aortalnej (CAVD). Wykorzystanie tego szczurzego modelu ułatwia badania nad CAVD w badaniu mechanizmów komórkowych i molekularnych, które leżą u podstaw tego złożonego procesu patologicznego.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych komórek śródmiąższowych zastawki szczura: nowy model do badania zwapnienia zastawki aortalnej

W tej pracy opisujemy protokoły do badania roli pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum. W szczególności skupiamy się na interakcjach EV z komórkami śródbłonka.

Ocena funkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych podczas zakażenia malarią

Ten artykuł opisuje izolację komórek mysiej zastawki aortalnej za pomocą dwuetapowej procedury kolagenazy. Izolowane komórki zastawki myszy są ważne dla wykonywania różnych testów, takich jak test zwapnienia in vitro, oraz dla badania szlaków molekularnych prowadzących do mineralizacji zastawki aortalnej.

Izolacja komórek zastawki śródmiąższowej myszy w celu zbadania zwapnienia zastawki aortalnej in vitro

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z lizatu płytkowego w celu monitorowania ich migracji i pobierania w eksplantatach chrząstek, używanych jako model choroby zwyrodnieniowej stawów.

Znakowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu monitorowania migracji i wychwytu w eksplantatach chrząstki

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na całym świecie. Zwapnienie naczyń krwionośnych w znacznym stopniu przyczynia się do obciążenia chorobowością i śmiertelnością z przyczyn sercowo-naczyniowych. Protokół ten opisuje prostą metodę ilościowego oznaczania wytrącania wapnia za pośrednictwem komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.

Półautomatyczna i powtarzalna metoda biologiczna do ilościowego oznaczania depozycji wapnia in vitro

Protokół wykorzystuje specyficzną dla adipocytów linię myszy raportującej CD63-GFP do wizualizacji i ilościowej wydzieliny pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów (EV) oraz wykazania ich przyjmowania przez komórki progenitorowe, ujawniając szlak parakrynowy w tkance tłuszczowej.

Charakterystyka wydzielania pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z adipocytów za pomocą modelu myszy reportera CD63-GFP in vivo i in vitro

Poznaj metodę analizy zwapnienia naczyń krwionośnych poprzez izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysich aort. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów molekularnych prowadzących do zwapnienia komórek mięśniowych gładkich naczyń.

Analiza zwapnienia naczyń krwionośnych za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu modeli in vitro i in vivo

Przeglądaj więcej filmów