January 27th, 2023
Ten artykuł przedstawia metodologię uzyskiwania i oceny zwapnienia naczyń krwionośnych poprzez izolację mysich aort, a następnie ekstrakcję zwapniałych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu obserwacji potencjału mineralizacji.
Protokół ten zapewnia metodę, która może być wykorzystana do oceny, a w przyszłości do opracowania metod leczenia zwapnienia naczyń krwionośnych, które jest najważniejszym czynnikiem prognostykicznym chorób sercowo-naczyniowych. Zdolność do izolowania EV pozwala nam na dalsze badanie mechanizmów, które prowadzą do zwapnienia naczyń krwionośnych i zmiany fenotypowej komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Technika ta zapewnia wgląd we wczesne mechanizmy molekularne zwapnienia komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, w których pośredniczą media.
Zrozumienie tego pozwala na badanie opcji terapeutycznych dla poznanego mechanizmu. Za pomocą tej metody można badać dowolne interesujące nas pojazdy elektryczne. Nie dotyczy to wyłącznie komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, osteoblastów lub zwapnienia naczyń.
Po eutanazji myszy unieś skórę za pomocą pęsety i wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej. Usuń nadmiar skóry lub tłuszczu. Następnie usuń narządy rozrodcze, pęcherz moczowy i tłuszcz poza linią środkową.
Następnie przesuń narządy żołądkowo-jelitowe na prawą stronę i podążaj za jelitami w linii środkowej. Po znalezieniu podnieś linię środkową i wytnij przewód pokarmowy aż do żołądka. Wytnij nerki, odsuwając je od linii środkowej.
Naciąć jak najbliżej nerki. Usuń wątrobę, podnosząc płaty i odcinając od linii środkowej. Następnie wykonaj perfuzję serca i aorty, wstrzykując zimny PBS do prawej komory za pomocą 10-mililitrowej strzykawki.
Poczekaj, aż płuca się napompują i zmienią kolor na biały. Usuń płuca i nadmiar przepony lub klatki piersiowej. Aby usunąć kość, otwórz szeroko nożyczki i umieść je w dolnej części myszy nad ogonem.
Odetnij w dół, unieś kręgosłup ze skóry i usuń tłuszcz z boków linii środkowej. Po oderwaniu skóry wytnij kręgosłup i nienaruszone narządy, przecinając je tuż nad sercem. Umieść kręgosłup i nienaruszone narządy w zlewce PBS w pojemniku na lód w przypadku transportu do stereoskopu.
Po przeniesieniu kręgosłupa i narządów do naczynia preparacyjnego, napełnij je lodowatym PBS i przygwoźdź kręgosłup i klatkę piersiową za pomocą igieł. Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie podnieś serce za pomocą pęsety i rozpocznij cięcie nad kręgosłupem i pod aortą. Kontynuuj to, aż dojdziesz do dolnej części kręgosłupa.
Usuń grzbiet z naczynia preparacyjnego i przygwoźdź serce oraz wszelkie obce tłuszcze lub mięśnie. Zaczynając od obszaru tuż pod sercem, zidentyfikuj przełyk, żyłę główną i aortę. Usuń przełyk i żyłę główną, aby mieć czyste pole widzenia aorty.
Za pomocą kleszczy i nożyczek do mikropreparacji zacznij podnosić tkankę tłuszczową i ciąć jak najbliżej aorty. Kontynuuj to wzdłuż linii przyśrodkowej, aż wszystkie aorty i tętnice udowe zostaną odsłonięte. W sercu usuń całą tkankę tłuszczową, odsłaniając trzy gałęzie przy łuku aorty.
Usuń korzeń aorty z lewej komory, wkładając nożyczki do mikropreparacji do lewej komory i przecinając mięsień otaczający aortę. Po wyizolowaniu i oczyszczeniu aorty zobrazuj ją za pomocą skanera bliskiej podczerwieni, aby uwidocznić zwapnienie naczyń krwionośnych. Korzystając z niestandardowego skryptu MATLAB, określ ilościowo całkowity sygnał znacznika wapnia znormalizowany do całkowitego zeskanowanego obszaru aorty.
Skieruj MATLAB do lokalizacji plików TIF ze skanowania w bliskiej podczerwieni aort, otwórz poszczególne pliki i wyodrębnij wartości intensywności pikseli z plików TIF. Wybierz aortę o największym zwapnieniu jako maksimum skali na obrazie odwzorowanym w kolorze. Gdy w oknie pojawi się polecenie Ile próbek znajduje się na obrazie, wprowadź liczbę aort na bieżącym obrazie i wybierz każdą aortę jeden po drugim.
Po wybraniu aorty MATLAB utworzy obrazy binarne z maską całkowitego obszaru i zwapniałego obszaru aorty. Wartości z tych zamaskowanych obrazów są następnie wykorzystywane do określenia całkowitego obszaru zwapniałego, całkowitego obszaru aorty, procentowego obszaru dodatniego dla zwapnienia oraz średniej intensywności zwapniałego obszaru. Natychmiast po zeskanowaniu aort połącz dwie do trzech aort, aby uzyskać wystarczające stężenie białka.
Inkubuj dwie do trzech połączonych aort w 1,5 mililitra roztworu trawiennego przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zebrać roztwór i odwirować przy 1 000 g przez 15 minut w celu usunięcia resztek komórek. Następnie, aby usunąć mikropęcherzyki, ponownie odwirować supernatant przez 30 minut w temperaturze 33 000 g.
Zebrać i ocenić supernatant pod kątem potencjału zwapnienia. Po usunięciu resztek komórkowych z kondycjonowanego zebranego podłoża przez odwirowanie, należy wirować zebrany supernatant w temperaturze 33 000 g przez 30 minut. Zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki.
Następnie dodać 1% z 300 milimolowych diwodorofosforanu sodu do próbek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i wymieszać roztwór przez pipetowanie. Przenieść 200 mikrolitrów roztworu mieszaniny na płytkę 96-dołkową i inkubować 96-dołkową płytkę w czytniku mikropłytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ustaw czytnik płytek tak, aby rejestrował absorbancję na długości fali 340 nanometrów co minutę.
Odpipetować 300 mikrolitrów roztworu kolagenu do każdego dołka szklanej z ośmiodołkową komorą i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny. Po inkubacji dodać 300 mikrolitrów DMEM jako kontrolę do studzienek. Dodać 300 mikrolitrów próbek pożywki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pobranych wcześniej do pozostałych studzienek i inkubować przez sześć dni, jak wykazano wcześniej.
Dziesiątego dnia odpipetować 2,5 mikrolitra mieszaniny OsteoSense i DMEM do każdego dołka i inkubować przez 24 godziny. Pod koniec inkubacji należy zobrazować hydrożele z filtrami do fluorescencji OsteoSense przez dno komory ze szkła nakrywkowego za pomocą mikroskopu odwróconego lub od góry za pomocą obiektywu o dużej odległości roboczej. Oceń liczbę zwapnień i rozmiar zwapnienia oraz zebrane obrazy, korzystając z opcji analizy cząstek dostępnych w ImageJ.
Następnie przejdź do Obrazu, wybierz Dostosuj i kliknij Próg, aby binarnie obrazy były wyświetlane na biało. Następnie użyj polecenia Analizuj i kliknij polecenie Analizuj cząstki, aby uzyskać informacje o każdym zwapnieniu na obrazie. Użyj tych samych parametrów progowych, aby zapewnić spójność dla każdego analizowanego obrazu.
Obrazowanie wypreparowanych aort za pomocą skanera optycznego w bliskiej podczerwieni wykazało wyższy sygnał OsteoSense w całej aorcie myszy z przewlekłą chorobą nerek niż dwie aorty myszy kontrolnej. Kondycjonowane podłoże uzyskane z komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych hodowanych w pożywce pro-wapniowej wykazało wyższą absorbancję przy 340 nanometrach niż podłoże kontrolne. Wzrost absorbancji nastąpił 1,5 raza szybciej w próbce pro-wapniowej w porównaniu z próbką kontrolną.
Kondycjonowana pożywka z komórek hodowanych w warunkach prowapiennych zawierała złoża mineralne. Podczas mikropreparowania aorty ważne jest, aby ostrożnie wyciąć tłuszcz otaczający aortę. Chcesz przeanalizować jak najwięcej aorty, ale może to być dość żmudne.
Po wyizolowaniu EV można wykonać dodatkowe testy, takie jak test aktywności fosfatazy alkalicznej lub badanie immunoorganizmu. Testy te pozwoliłyby na dalsze poznanie mechanizmów i białek obecnych w pojazdach elektrycznych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
To badanie prezentuje szczegółowy protokół oceny zwapnień naczyń poprzez izolację aorty mysich i wyodrębnianie zwapniałych pęcherzyków pozakomórkowych. Metodologia pozwala naukowcom zbadać mechanizmy prowadzące do zwapnień naczyniowych, które są głównym czynnikiem predykcyjnym chorób układu krążenia.
Vascular calcification is a critical risk factor in cardiovascular disease, yet remains without effective therapeutic intervention. This protocol enables mechanistic interrogation of extracellular vesicle (EV)-mediated calcification using both in vitro and in vivo models, supporting early-stage target validation and biological de-risking. The approach provides quantitative, reproducible outputs essential for translational research and portfolio triage in cardiovascular drug discovery.
This protocol integrates from early discovery through preclinical research, bridging mechanistic studies and translational validation in cardiovascular calcification.