Name: Model nawrotu glejaka po resekcji do badań terapeutycznych hydrożelu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Poznaj model nawrotu glejaka po resekcji do badań terapeutycznych hydrożelu. Ta metoda umożliwia ocenę skuteczności lokalnego leczenia nowotworu mózgu u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty projektowe z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82071767 i 82171781).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone i nadzorowane przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną oraz Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie (IACUC-1904004). Do niniejszego badania wykorzystano samice myszy C57BL/6J w wieku 6-8 tygodni. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Zważyć myszy i znieczulić je wstrzyknięciem dootrzewnowym 50 mg/kg pentobarbitalu sodu (patrz tabela materiałów). Podawać meloksykam (5 mg/kg mc.; i.p.) w celu znieczulenia okołooperacyjnego. Myszy należy trzymać w klatce w cyklu 12 godzin/12 godzin światło/ciemność, w temperaturze otoczenia 24 °C i wilgotności względnej 50%. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu początkowa waga myszy wynosiła około 22 g.</li>
	<li>Usuń włosy z głowy myszy za pomocą golarki laboratoryjnej dla zwierząt i przymocuj głowę i kończyny do aparatu stereotaktycznego (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Wysterylizuj cały sprzęt przed użyciem.</li>
	<li>Zdezynfekuj głowę myszy za pomocą co najmniej trzech naprzemiennych rund peelingu chlorheksydynowego lub powidonowo-jodowego, a następnie alkoholu i przykryj mysz sterylnym serwetem chirurgicznym. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Odetnij skórę głowy myszy około 1 cm wzdłuż linii środkowej na czubku prawego czoła nożyczkami okulistycznymi. 
	UWAGA: Potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia poprzez brak odruchu pedałowania przed wykonaniem nacięcia.</li>
	<li>Dostrój aparat stereotaktyczny, aby upewnić się, że szew w jodełkę i przedni punkt ciemiączka znajdują się na tym samym poziomie.</li>
</ol>
2. Budowa ortotopowego wewnątrzczaszkowego modelu GBM
<ol>
	<li>Zaznacz punkt 1 mm po przedniej stronie przedniego ciemiączka, 1,8 mm po prawej stronie przedniego ciemiączka i 3 mm w dół od przedniego ciemiączka za pomocą bawełnianego wacika nasączonego fioletem goryczkowym2 (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wywierć punkt za pomocą mini wiertła czaszkowego o średnicy 1 mm (patrz Tabela materiałów), aby uzyskać pory o średnicy około 1 mm i głębokości 1 mm.</li>
	<li>Usuń wysięk płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą sterylnego wacika.</li>
	<li>Odessać 5 μl zawiesiny komórek nowotworowych (GL261-Luci, 5 × 105 komórek zawieszonych w 5 μl PBS) za pomocą mikrostrzykawki. 
	UWAGA: GL261-Luci został uzyskany ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wyrównać końcówkę igły mikrostrzykawki pionowo z otworem do wiercenia czaszki, włożyć, aż końcówka igły wejdzie w płaszczyznę czaszki na 3 mm i cofnąć igłę o 0,5 mm7.</li>
	<li>Otworzyć mikrostrzykawkę i wstrzykiwać z prędkością 1 μl/min.</li>
	<li>Zachować igłę przez 10 minut po wstrzyknięciu.</li>
	<li>Powoli wyjąć mikrostrzykawkę i przycisnąć miejsce wstrzyknięcia sterylnym, suchym wacikiem.</li>
	<li>Zszyj skórę głowy niewchłanialnym szwem chirurgicznym (10-0, patrz Tabela materiałów) i ponownie zdezynfekuj nacięcie.</li>
	<li>Monitoruj stan zdrowia zwierzęcia i trzymaj je w ciepłych warunkach.</li>
	<li>Przesuń mysz z powrotem do klatki obudowy po wybudzeniu myszy.</li>
	<li>Wyobraź sobie mysz za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo (patrz tabela materiałów) w celu wykrycia przeszczepionego guza w 10 dniu po łożysku guza. 
	UWAGA: Lucyferazy załadowanej do komórek GBM, GL261, użyto do obrazowania bioluminescencyjnego.
	<ol>
		<li>Znieczulij mysz 1,5% izofluranem o natężeniu przepływu tlenu 0,6 l/min. Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia poprzez brak odruchu pedałowania, wstrzyknij mysz dootrzewnowo fluoresceinę potasu (10 mg / ml, patrz tabela materiałów), a 11 s później wykonaj obrazowanie bioluminescencyjne in vivo. Gdy wartość fluorescencji osiągnie ~5 × 105, procedura kończy się sukcesem. 
		UWAGA: Znieczulić zwierzę przed obrazowaniem. Utrzymuj znieczulenie za pomocą stożka nosowego zasilanego odparowanym izofluranem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz myszy z pomyślnym łożyskiem nowotworu, aby skonstruować model nawrotu GBM po resekcji.</li>
</ol>
3. Budowa modelu po resekcji nawrotu GBM
<ol>
	<li>Gdy rozmiar guza u ortotopowych wewnątrzczaszkowych myszy GBM osiągnie ~ 6,5 × 105, wybierz myszy do modelu nawrotu pooperacyjnego</li>.
	<li>Zważyć ortotopowe wewnątrzczaszkowe myszy modelowe GBM i znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym 50 mg/kg sodu pentobarbitalowego. Podawać meloksykam (5 mg/kg mc.; i.p.) w celu znieczulenia okołooperacyjnego. </li>
	<li>Powtórz proces kroków 1.2−1.5.</li>
	<li>Oddziel tkankę skóry głowy od czaszki i sprawdź otwór wywiercony do budowy ortotopowego wewnątrzczaszkowego modelu GBM. Jeśli się zagoiła, zidentyfikuj dziurę za pomocą aparatu stereotaktycznego i postępuj zgodnie z procedurą opisaną w krokach 2.1-2.3.</li>
	<li>Zwiększ średnicę otworu do 5 mm za pomocą wiertła do czaszki i usuń wysięk płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą sterylnego bawełnianego wacika.</li>
	<li>Ustaw ostroskop na główce myszy i dostosuj ustawienia, aby upewnić się, że wiercony otwór znajduje się w środku pola widzenia.</li>
	<li>Przeciąć opony mózgowe mikronożyczkami i usunąć część tkanki nowotworowej za pomocą mikrokirety i mikroskalpela pod mikroskopem. 
	UWAGA: Jeśli chodzi o opony mózgowe, gdy czaszka jest otwarta, cienka błona w pobliżu tkanki mózgowej to opony mózgowe.</li>
	<li>Zatamować krwawienie sterylną gazą i przemyć nacięcie sterylną solą fizjologiczną.</li>
	<li>Wstrzyknąć dostępny w handlu hydrożel (10 μl, patrz tabela materiałów) do jamy resekcyjnej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, zszyć skórę głowy niewchłanialnym szwem chirurgicznym (10-0) i ponownie zdezynfekować nacięcie (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Monitoruj stan zdrowia zwierzęcia i utrzymuj mysz w cieple.</li>
	<li>Przesuń mysz z powrotem do klatki obudowy po wybudzeniu myszy.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie bioluminescencyjne in vivo, aby wykryć przeszczepiony guz 1 dzień później, aby określić ilościowo rozmiar resztkowego guza (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2 i <silna klasa = "xfig" > Rycina 3).</li>
	<li>Waż myszy co 2 dni, aż do końcowego punktu końcowego. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu końcowym punktem końcowym był dzień 30, a myszy zostały poddane eutanazji przez przedawkowanie pentobarbitalu sodu we wstrzyknięciu dootrzewnowym.</li>
</ol>

<ol><li>Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+state+of+immunotherapy+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Current state of immunotherapy for glioblastoma.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (7), 422-442 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+targeting+nanoparticles-hydrogel+hybrid+system+for+combined+chemo-immunotherapy+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">In situ targeting nanoparticles-hydrogel hybrid system for combined chemo-immunotherapy of glioma.</a> Journal of Controlled Release. 345, 786-797 (2022).</li>
<li>Binder, Z. A., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma%3A+The+current+state+of+biology+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma: The current state of biology and therapeutic strategies.</a> Cancer Research. 82 (5), 769-772 (2022).</li>
<li>Kauer, T. M., Figueiredo, J. L., Hingtgen, S., Shah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+therapeutic+stem+cells+implanted+in+the+tumor+resection+cavity+induce+cell+death+in+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas.</a> Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+engineered+TRAIL-overexpressing+adipose-derived+stem+cells+target+and+eradicate+glioblastoma+via+intracranial+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle engineered TRAIL-overexpressing adipose-derived stem cells target and eradicate glioblastoma via intracranial delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13857-13862 (2016).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironmental+landscape+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The microenvironmental landscape of brain tumors.</a> Cancer Cell. 31 (3), 326-341 (2017).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostimulant+hydrogel+for+the+inhibition+of+malignant+glioma+relapse+post-resection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Immunostimulant hydrogel for the inhibition of malignant glioma relapse post-resection.</a> Nature Nanotechnology. 16 (5), 538-548 (2021).</li>
<li>Ruan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual-bioresponsive+drug-delivery+depot+for+combination+of+epigenetic+modulation+and+immune+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A dual-bioresponsive drug-delivery depot for combination of epigenetic modulation and immune checkpoint blockade.</a> Advanced Materials. 31 (17), 1806957(2019).</li>
<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li>
<li>Sun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostimulant+in+situ+hydrogel+improves+synergetic+radioimmunotherapy+of+malignant+glioblastoma+relapse+post-resection%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Immunostimulant in situ hydrogel improves synergetic radioimmunotherapy of malignant glioblastoma relapse post-resection.</a> Advanced Functional Materials. 32 (43), 2205038(2022).</li>
<li>Liu, D. K., Sulman, E. P., Wen, P. Y., Kurz, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapies+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurology+and+Neuroscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel therapies for glioblastoma.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 20 (7), 19(2020).</li>
<li>Mellinghoff, I. K., Cloughesy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+risk+and+efficiency+in+drug+development+for+rare+and+challenging+tumors%3A+A+new+paradigm+for+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Balancing risk and efficiency in drug development for rare and challenging tumors: A new paradigm for glioma.</a> Journal of Clinical Oncology. 40 (30), 3510-3519 (2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Operacja pozostaje pierwszym wyborem dla większości pacjentów z GBM11. Ze względu na charakterystykę inwazyjnego wzrostu GBM, niewielka liczba komórek nowotworowych nadal pozostaje po technikach mikroneurochirurgicznych, co prowadzi do ostatecznego nawrotu guza12. Jak zahamować nawroty GBM po operacji, stało się przedmiotem badań związanych z GBM. Jednak ze względu na złożoną budowę anatomiczną tkanki mózgowej, podstawowym problemem do rozwiązania w tej dziedzinie stała się budowa odpowiedniego pooperacyjnego modelu GBM.
W tym badaniu opracowano model nawrotu GBM po resekcji. W procesie konstruowania tego modelu kluczowe znaczenie ma budowa ortotopowego wewnątrzczaszkowego modelu GBM. Po pomyślnym opracowaniu tego modelu, resekcja musi zostać wykonana we właściwym czasie. Zalecany czas to ten, w którym wartość fluorescencji wielkości guza wynosi około 6,5 × 105. Aby zmniejszyć śmiertelność myszy, przeprowadzono resekcję w znieczuleniu z 40 mg/kg 1% pentobarbitalu sodu we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Jednak resekcja była trudna do wykonania, a myszy często poruszały się z powodu małej dawki środka znieczulającego. Na tej podstawie dawkę środka znieczulającego zwiększono do 50 mg/kg. Po zwiększeniu dawki środka znieczulającego odpowiedzi śródoperacyjne myszy zniknęły, a resekcja została przeprowadzona pomyślnie. W tym protokole można również stosować gaz izofluranowy.
W tym badaniu do opracowania modelu wykorzystano komórki GL261-Luci; w związku z tym do walidacji protokołu w przyszłości należy użyć więcej linii komórkowych GBM. Aby protokół był bardziej przekonujący, należy użyć różnych modeli myszy GBM, takich jak genetycznie modyfikowane modele myszy GBM. Ponadto rezonans magnetyczny może być najlepszym sposobem wykrywania nawrotu nowotworów po operacji.
Podsumowując, w niniejszej pracy opracowano model nawrotu GBM po resekcji. W tym modelu nawrót guza jest monitorowany poprzez ocenę resztkowego wzrostu guza po resekcji. Chociaż nie można uznać, że model ten całkowicie naśladuje nawrót guza, styl resekcji w tym modelu jest podobny do standardu maksymalnie bezpiecznej chirurgii w leczeniu klinicznym pacjentów z GBM. Praca ta stanowi wygodną i wykonalną metodę konstruowania modelu nawrotu GBM po resekcji i stanowi postęp w dziedzinie badań nad nawrotem GBM po resekcji.

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszym nowotworem złośliwym spośród wszystkich nowotworów ośrodkowego układu nerwowego1,2. Chirurgia jest leczeniem pierwszego rzutu u pacjentów z GBM, a chemioradioterapia jest głównym leczeniem uzupełniającym po operacji. Jednak nawrót nowotworu często rozwija się w ciągu 3-6 miesięcy u większości pacjentów z GBM przy różnych zabiegach3,4,5. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania skuteczniejszych strategii leczenia, aby zapobiec nawrotom GBM.
Ostatnie badania nad GBM skupiały się głównie na guzach pierwotnych, a nie na nowotworach nawracających6. Jednak najczęstszym problemem, który należy rozwiązać w klinice, jest to, jak zahamować nawroty GBM po operacji. Dlatego badania nad nawrotami GBM po operacji wymagają większej uwagi. Bioresponsywne hydrożele terapeutyczne są najczęstszym wektorem stosowanym w badaniach nad nawrotami nowotworów po zabiegach chirurgicznych7,8. Jednak ze względu na specyficzną budowę ośrodkowego układu nerwowego trudno jest opracować odpowiedni model nawrotu GBM po resekcji9, co ma kluczowe znaczenie dla badania nawrotu GBM.
To badanie wygenerowało ulepszony model nawrotu GBM po resekcji, oparty na ortotopowym wewnątrzczaszkowym modelu GBM używanym w badaniach nad pierwotnym GBM. W tym modelu większość guzów jest usuwana chirurgicznie za pomocą mikroskopii, a pozostałość guza jest wykrywana za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo i barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E). Model ten naśladuje stan resekcji u pacjentów z guzem mózgu i może być stosowany w różnych badaniach nad nawrotem GBM.

<table><tbody><tr><td>Fiolet gencjanowy</td><td>Sigma</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>GL261-Luci</td><td>Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.</td><td>ZQ0932</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania bioluminescencyjnego in vivo</td><td>Tanon</td><td>Tanon ABL X6</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoryjna golarka dla zwierząt</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>FS600</td><td></td></tr><tr><td>Myszy</td><td>Pekin Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro</td><td>łyżeczka Belevor Medical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro skalpel</td><td>Belevor Medical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Shanghai Xiangfan Instrument Co., Ltd</td><td>JSZ5A/B</td><td></td></tr><tr><td>Mikrostrzykawka</td><td>Hamilton</td><td>87943</td><td></td></tr><tr><td>Mini wiertarka czaszkowa</td><td>RWD</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>Niewchłanialny szew chirurgiczny</td><td>Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodowy</td><td>ChemSrc</td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td>PVA-TSPBA hydrożel&nbsp;</td><td>Aladdin</td><td>9002-89-5</td><td></td></tr><tr><td>Aparat stereotaktyczny</td><td>RWD</td><td>68043</td><td></td></tr></tbody></table>

model nawrotu glejaka po resekcji do badań terapeutycznych hydrożelu

Glioblastoma Relapse Post-Resection Model for Therapeutic Hydrogel Investigations

Nawrót nowotworu jest ważnym czynnikiem wskazującym na złe rokowanie w glejaku wielopostaciowym (GBM). Wiele badań ma na celu zidentyfikowanie skutecznych strategii terapeutycznych zapobiegających nawrotom GBM po operacji. Bioresponsywne hydrożele terapeutyczne zdolne do podtrzymywania leków uwalnianych miejscowo są często stosowane w miejscowym leczeniu GBM po operacji. Badania są jednak ograniczone ze względu na brak odpowiedniego modelu nawrotu GBM po resekcji. W tym przypadku opracowano model nawrotu GBM po resekcji, który został zastosowany w badaniach nad terapeutycznym hydrożelem. Model ten został skonstruowany w oparciu o ortotopowy wewnątrzczaszkowy model GBM, który jest szeroko stosowany w badaniach nad GBM. Resekcję subtotalną przeprowadzono na ortotopowym wewnątrzczaszkowym modelu myszy GBM w celu naśladowania leczenia klinicznego. Szczątkowy guz wykorzystano do wskazania wielkości wzrostu guza. Model ten jest łatwy do zbudowania, może lepiej naśladować sytuację chirurgicznej resekcji GBM i może być stosowany w różnych badaniach nad miejscowym leczeniem nawrotu GBM po resekcji. W rezultacie, model nawrotu GBM po resekcji zapewnia unikalny model nawrotu GBM do skutecznych badań nad leczeniem miejscowym nawrotu po resekcji.

Proces budowy modelu nawrotu GBM po resekcji jest pokazany w Rysunek 1. Pokazano jamę resekcję po częściowym usunięciu guza pod mikroskopem. Hydrożel wstrzyknięto do jamy resekcji za pomocą strzykawki, aby zademonstrować efekt terapeutyczny. Harmonogram projektu eksperymentalnego jest pokazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 2A. Po wszczepieniu komórek GBM do mózgu myszy, wzrost guza przetestowano za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo w 10 dniu. Resekcję wykonano w 11 dobie, a następnie hydrożel wstrzyknięto do jamy resekcji. Badanie obrazowania bioluminescencyjnego in vivo przeprowadzono w 15, 20, 25 i 30 dniu w celu monitorowania resztkowego wzrostu guza. Jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 2B,C, rozmiar guzów w modelu nawrotu GBM po resekcji był znacznie mniejszy niż w ortotopowym wewnątrzczaszkowym modelu GBM, jak wykazano w badaniach obrazowania bioluminescencyjnego in vivo. W 25 dniu guzy znacznie powróciły po resekcji (<silna klasa="xfig">Ryc. 2D). Barwienie H&amp;E potwierdziło, że model nawrotu GBM po resekcji został pomyślnie skonstruowany i że resztkowe guzy znacznie powróciły po resekcji (<silna klasa="xfig">Figura 3A,B).</silna></silna></silna></silna>
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65026/65026fig01.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 1: Śródoperacyjny widok resekcji guza i wstrzyknięcia hydrożelu. Część tkanki nowotworowej usunięto za pomocą mikrokirety i mikroskalpela pod mikroskopem, a następnie wstrzyknięto hydrożel do jamy resekcji. Podziałka skali: 50 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Sun et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65026/65026fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65026/65026fig02.jpg"> 
Rysunek 2: Harmonogram projektu eksperymentalnego i obrazowania bioluminescencyjnego in vivo myszy w wewnątrzczaszkowym i po resekcji modelu GBM. (A) Harmonogram projektu eksperymentalnego pokazujący, że resekcja została wykonana w dniu 11 i że obrazowanie bioluminescencyjne in vivo (IV) zostało wykonane w dniu 10, dniu 15, dniu 20, dniu 25 i dniu 30. (B) Wewnątrzczaszkowe myszy z modelem GBM wykazały duży rozmiar guza w dniu 10, (C) rozmiar guza został znacznie zmniejszony po resekcji w dniu 11 oraz (D) rozmiar guza zwiększył się po resekcji w dniu 25 w modelu GBM po resekcji. Grupę kontrolną stanowiły myszy z nawrotem GBM po resekcji, u których nie było leczono. W sumie w tym badaniu wykorzystano 42 myszy. Podziałka liniowa: 100 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Sun et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65026/65026fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65026/65026fig03.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 3: Obraz barwienia tkanki mózgowej metodą H&amp;E z modelu GBM po resekcji. (A) Obraz barwienia H&amp;E pokazujący jamę resekcji, pozostałość guza i normalną tkankę mózgową. Tkanka mózgowa została pobrana 1 dzień po resekcji. (B) Obraz barwienia H&amp;E pokazujący nawracający guz i normalną tkankę mózgową. Tkanka mózgowa została pobrana w 12 dniu po resekcji. Podziałka liniowa: 100 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Sun et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65026/65026fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>

Obecny protokół ustanawia model nawrotu glejaka (GBM) po resekcji za pomocą mikroskopii w celu zbadania efektu terapeutycznego wstrzykiwanego, bioresponsywnego hydrożelu in vivo.

Model nawrotu glejaka po resekcji do badań terapeutycznych hydrożelu

Tumor recurrence is an important factor indicative of a poor prognosis in glioblastoma (GBM). Many studies are attempting to identify effective ...

Nawrót guza jest główną przyczyną niepowodzenia schematu chirurgicznej resekcji GBM. Nasz protokół zapewnia unikalny model nawrotu GBM do skutecznych badań nad leczeniem miejscowym nawrotu, po badaniach. Technika ta zapewnia wygodną i wykonalną metodę konstruowania modelu nawrotu GBM po resekcji i może być stosowana w różnych badaniach nad nawrotem GBM.Zacznij od przygotowania zwierzęcia. Wytnij skórę głowy myszy około jednego centymetra wzdłuż linii środkowej na prawym czole nożyczkami okulistycznymi. Dostrój aparat stereotaktyczny tak, aby upewnić się, że szew w jodełkę i przedni punkt ciemiączka znajdują się na tym samym poziomie.Za pomocą bawełnianego wacika zanurzonego w fiolecie genianowym zaznacz punkt w odległości jednego milimetra do przodu, 1,8 milimetra w prawo i trzy milimetry w dół od przedniego ciemiączka. Wywierć punkt za pomocą mini-wiertła czaszkowego o średnicy jednego milimetra. Utwórz por o średnicy około jednego milimetra i głębokości jednego milimetra.Usuń wysięk płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą sterylnego bawełnianego wacika. Następnie odessać pięć mikrolitrów zawiesiny komórek nowotworowych za pomocą mikrostrzykawki. Wyrównać końcówkę igły mikrostrzykawki pionowo z otworem do wiercenia czaszki i wkładać, aż końcówka igły wejdzie w płaszczyznę czaszki na trzy milimetry.Następnie cofnij igłę o 0,5 milimetra. Otworzyć mikrostrzykawkę i wstrzykiwać roztwór z prędkością jednego mikrolitra na minutę. Zachować igłę przez 10 minut po wstrzyknięciu.Następnie powoli wyjmować mikrostrzykawkę i uciskać miejsce wstrzyknięcia sterylnym, suchym wacikiem. Zszyj skórę głowy niewchłanialnym szwem chirurgicznym 10-0 i zdezynfekuj nacięcie. Monitoruj stan zdrowia zwierzęcia i trzymaj je w ciepłych warunkach.Po obudzeniu myszy przenieś ją z powrotem do klatki mieszkaniowej. 10 dni po łożyskowaniu guza wykryj przeszczepiony guz. W tym celu wstrzyknij myszowi dootrzewnowo fluoresceinę potasu, a 11 sekund później zobrazuj mysz za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo.Oddziel tkankę skóry głowy od czaszki i sprawdź otwór wywiercony do budowy ortotopowego wewnątrzczaszkowego modelu GBM. Jeśli otwór się zagoił, zidentyfikuj otwór za pomocą aparatu stereotaktycznego i wywierć otwór, jak pokazano wcześniej. Zwiększ całą średnicę do pięciu milimetrów za pomocą wiertła do czaszki i usuń wysiękowy płyn mózgowo-rdzeniowy za pomocą sterylnego bawełnianego wacika.Ustaw ostrość mikroskop na główce myszy i dostosuj ustawienia, aby upewnić się, że wiercony otwór znajduje się w środku pola widzenia. Wytnij opony mózgowe mikronożyczkami. Następnie usuń część tkanki nowotworowej za pomocą mikrokirety i mikroskalpela pod mikroskopem.Należy zatamować krwawienie jałową gazą i przemyć wstrzyknięcie sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki wstrzyknąć 10 mikrolitrów dostępnego w handlu hydrożelu do jamy resekcyjnej. Korzystając z tego protokołu, komórki GBM wszczepiono do mózgu myszy, a wzrost guza przetestowano za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo w 10 dniu.Resekcję i wstrzyknięcie hydrożelu wykonano w 11 dobie. Wielkość guzów w modelu nawrotu GBM po resekcji była istotnie mniejsza niż w ortotopowym wewnątrzczaszkowym modelu GBM. Monitorowanie resztkowego wzrostu guza w 25 dniu wykazało nawrót guzów.Barwienie H&E potwierdziło, że model nawrotu GBM po resekcji został pomyślnie skonstruowany i że resztkowe guzy znacznie powróciły po resekcji. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać w tej procedurze, jest przecięcie opon mózgowych i usunięcie części tkanki nowotworowej pod mikroskopem.

glioblastoma-relapse-post-resection-model-for-therapeutic-hydrogel

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film pokazuje, jak glejaki, pochodzące z guzów mózgu, są rozdzielane na pojedyncze komórki i zamykane w hydrożelu na bazie kwasu hialuronowego. Proces ten sprzyja interakcjom komórka-komórka, tworząc ustrukturyzowany, trójwymiarowy model glejaka.

Hydrożel na bazie kwasu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli komórek glejaka

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Terapeutyczne mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są obiecujące jako metoda leczenia inwazyjnego glejaka. Optymalna transplantacja polega na dostarczeniu MSCs do jamy resekcji guza na rusztowaniach. W tym miejscu przedstawiono techniki przedkliniczne do badania leczenia glejaka wielopostaciowego MSC, w tym: resekcja guza pod kontrolą obrazu; wszczepianie rusztowań z nasionami MSC; i śledzenie terapii pooperacyjnej.

Resekcja glejaka wielopostaciowego pod kontrolą obrazu i wewnątrzczaszkowa implantacja terapeutycznych rusztowań wysiewanych komórkami macierzystymi

Tutaj prezentujemy protokół trójwymiarowej hodowli komórek glejaka pochodzących od pacjenta w ortogonalnie przestrajalnych biomateriałach zaprojektowanych tak, aby naśladować matrycę mózgu. Podejście to zapewnia platformę eksperymentalną in vitro, która zachowuje wiele cech komórek glejaka in vivo, zwykle traconych w hodowli.

Hydrożele na bazie kwasu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli komórek glejaka wielopostaciowego pochodzących od pacjentów

Ta praca opisuje rozwój elastycznych elektrod międzypalcowych do implementacji w modelach 3D guzów mózgu, a mianowicie w hodowli in vitro, modelu in ovo i modelu mysim in vivo. Proponowana metoda może być wykorzystana do oceny wpływu pulsacyjnych pól elektrycznych na nowotwory na różnych poziomach złożoności.

Elastyczne organiczne urządzenia elektroniczne do terapii pulsacyjnym polem elektrycznym glejaka

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Tutaj opisujemy przedkliniczny ortotopowy model myszy dla GBM, stworzony przez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych guzów myszy. Model ten wykazuje cechy charakterystyczne dla GBM u ludzi. W przypadku badań translacyjnych guz mózgu myszy jest śledzony za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo i histopatologii.

Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

Tutaj prezentujemy protokół, który umożliwia szybką, solidną i tanią produkcję sferoid nowotworowych, a następnie enkapsulację hydrożelową. Ma szerokie zastosowanie, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Byłoby to szczególnie przydatne do badania interakcji sferoida-matryca oraz budowania modeli fizjologii lub patologii tkanek in vitro.

Wytwarzanie i enkapsulacja sferoidów nowotworowych w hydrożelach glikolu polietylenowego do badania oddziaływań sferoida-matryca

Prezentujemy metodę replikacji mikrośrodowiska guza glejaka na froncie inwazyjnym, która obejmuje przepływ płynu śródmiąższowego. Ten model to hydrożel hialuronowo-kolagenowy I we wkładzie do hodowli tkankowej, w którym można zastosować głowicę ciśnieniową płynu. Inwazję można określić ilościowo, a komórki można wyizolować lub poddać lizie.

Fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem

Przedstawiamy trójwymiarowy model migracji glejaka glejaka wykorzystującego magnetyczne gliomasfery pochodzące od pacjentów, generowane z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów. Platforma ta umożliwia wizualizację specyficznych dla pacjenta dynamiki migracji oraz ocenę skuteczności terapeutycznej. Test może być multipleksowany po migracji, aby ocenić lokalizację i wzorce ekspresji białek.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Poznaj model nawrotu glejaka po resekcji do badań terapeutycznych hydrożelu. Ta metoda umożliwia ocenę skuteczności lokalnego leczenia nowotworu mózgu u myszy.

Model nawrotu glejaka po resekcji do badań terapeutycznych hydrożelu

Przeglądaj więcej filmów