Specyficzny dla adipocytów ATAC-Seq z tkankami tłuszczowymi przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

ATAC-seq to potężna technika pozwalająca zrozumieć mechanizmy regulacji ekspresji genów. Jednak tkanka tłuszczowa jest trudna przy użyciu tej techniki ze względu na dużą zawartość lipidów, wysokie zanieczyszczenie mitochondriów i niejednorodność komórkową. W tym protokole sekwencjonowanie ATAC specyficzne dla adipocytów przeprowadzono przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją, które generuje wysokiej jakości dane przy minimalnym zanieczyszczeniu mitochondrialnego DNA.

Metoda ta może być również stosowana w innych tkankach, w których dostępne są specyficzne dla typu komórki linie myszy Cre z transgenicznymi liniami reporterowymi znakującymi jądra. Izolację jądra należy rozpocząć od schłodzenia szkła Homogenizatory do odbić na lodzie z jednym szklanym odbiciem na próbkę. Następnie dodaj 7 mililitrów mieszanki NPB do każdej szklanki Dounce.

Następnie umieść od 50 do 100 miligramów zamrożonej tkanki tłuszczowej w szklance Dounce i pokrój ją na kilka mniejszych kawałków za pomocą długich nożyczek. Uderz 10 razy luźnym tłuczkiem dla wszystkich próbek, a następnie 10 razy ciasnym tłuczkiem. Przefiltrować zawartość przez sitko o średnicy 100 mikrometrów do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów przed przeniesieniem przefiltrowanych homogenatów do probówki o pojemności 15 mililitrów w celu odwirowania.

Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach PBS-N poprzez delikatne, ale dokładne stukanie palcami. Następnie przefiltruj zawiesinę przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do rurki o pojemności 50 mililitrów i przepłucz sitko 250 mikrolitrami PBS-N. Przenieść przefiltrowaną zawiesinę jądrową do aktywowanego fluorescencją sortowania komórek lub probówki FACS za pomocą mikropipety.

Przygotuj probówkę zbiorczą, dodając 500 mikrolitrów PBS-N do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i odwróć ją kilka razy, aby zwilżyć wszystkie wewnętrzne powierzchnie buforem. Krótko zakręć rurkami, aby spuścić cały płyn przed umieszczeniem ich na lodzie do momentu sortowania. W przypadku FACS użyj bramki FSC-A/FSC-H do podkoszulki i FSC-A/SSC-A do usuwania małych lub dużych zanieczyszczeń.

Bramka dla populacji jądra adipocytów mCherry/GFP-dodatnich i zebrać 10 000 jąder w każdej przygotowanej wcześniej probówce zbiorczej. W celu przygotowania jądra po sortowaniu, dodać 500 mikrolitrów PBS-N do każdej probówki zbiorczej i wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę przed odwirowaniem probówek zbiorczych o stężeniu 200 G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Całkowicie usunąć supernatant.

Aby przygotować 25 mikrolitrów głównej mieszaniny Tn5, wymieszaj 12,5 mikrolitrów 2x buforu DNA do znakowania lub buforu TD, 1,25 mikrolitra transpozazy Tn5 lub enzymu TDE I i 11,25 mikrolitra wody wolnej od nukleaz. Następnie dodać 25 mikrolitrów głównej mieszaniny Tn5 do każdego jądra osadu i ponownie zawiesić go przez delikatne pipetowanie. Inkubować z prędkością 600 obr./min przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą mieszalnika termicznego.

Dodaj 25 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do 25 mikrolitrów mieszaniny zawiesiny jądra Tn5, uzyskując końcową objętość 50 mikrolitrów. Następnie dodać 250 mikrolitrów buforu PB i 5 mikrolitrów 3 M octanu sodu o pH 5,2. Po przeniesieniu mieszaniny do kolumny dostarczonej z zestawem referencyjnym, odwirować ją przy 17 900 G przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.

Po wyrzuceniu przepływu umieść kolumnę wirującą z powrotem w tej samej probówce zbiorczej. Do probówki dodać 750 mikrolitrów buforu PE zawierającego absolutny etanol. Odwirować kolumnę, odrzucić przepływ i umieścić kolumnę wirową z powrotem w tej samej probówce zbiorczej.

Odwirować probówkę i wyrzucić probówkę zbiorczą z przepływem. Aby amplifikować transponowane fragmenty DNA, należy przygotować główną mieszaninę PCR bez dodawania unikalnego Ad2. n Elementarz kodów kreskowych.

Uruchom PCR. Uruchom ilościowy PCR lub qPCR. Sprawdź krzywe amplifikacji i określ liczbę dodatkowych cykli PCR, które są potrzebne, szacując liczbę cykli, które osiągnęły około 35% maksimum.

Skorzystaj z obliczeń, aby uruchomić PCR dla pozostałych 45 mikrolitrów reakcji PCR. Korzystając z wcześniejszych procedur, eluuj amplifikowane fragmenty DNA za pomocą 20 mikrolitrów buforu EB. Przenieś eluowane DNA do nowej probówki PCR i dostosuj objętość do 100 mikrolitrów, dodając 80 mikrolitrów buforu EB. Następnie dodaj 55 mikrolitrów kulek SPRI i wymieszaj pipetując. Po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej oddziel go na mini stojaku magnetycznym na 5 minut.

Po zakończeniu przenieś 150 mikrolitrów supernatantu do nowej probówki do PCR, dodaj 95 mikrolitrów kulek SPRI i wymieszaj przez pipetowanie. Inkubuj reakcję przez 5 minut przed oddzieleniem kulek na mini stojaku magnetycznym. Ostrożnie wyrzucić supernatant i myć kulki przez 1 minutę przy użyciu 200 mikrolitrów 70% etanolu.

Powtórz jeszcze dwa prania. Po ostatnim umyciu odwirować probówki o stężeniu 1000 G przez 1 minutę. Odpipetować pozostały etanol i suszyć granulki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2 minuty na maszynie do PCR z otwartą pokrywą.

Po wysuszeniu ponownie zawiesić osad w 20 mikrolitrach buforu EB przez pipetowanie i inkubować probówkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Oddziel kulki na 5 minut na mini podstawce magnetycznej przed przeniesieniem 18 mikrolitrów supernatantu zawierającego ostateczną bibliotekę do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Jądra adipocytów znakowane mCherry i GFP można było odróżnić od jąder innych typów komórek wyizolowanych z tkanki tłuszczowej myszy Adipoq-NuTRAP.

W zależności od rodzaju depotingu tkanki tłuszczowej zaobserwowano różnicę około 50% we frakcjach adipocytów, w eWAT 30%, a we frakcjach adipocytów 65% w BAT. Próbki wymagające więcej niż 15 cykli PCR wskazywały na próbki niskiej jakości. Analiza rozkładu wielkości bibliotek ATAC-seq wykazała wiele pików odpowiadających regionowi wolnemu od nukleosomów lub NFR oraz mono, di i multinukleosomom o średnich rozmiarach około 500 do 800 par zasad.

Próbki o niskiej jakości zazwyczaj wykazywały głównie NFR bez pików nukleosomalnych lub z niewielką ich liczbą. Testy kontroli jakości za pomocą analizy qRT-PCR wykazały 10 do 20-krotne wzbogacenie w dodatnie elementy genomu w pobliżu genów markerów adipocytów, takich jak Adipoq, Fabp4, Plin1 i Pnpla2, podczas gdy nie wykazano wzbogacenia w kontrolę ujemną. Wzbogacenie w termogeniczny gen Ucp1 zaobserwowano specyficznie w BAT.

Odczyty mitochondrialne wynosiły mniej niż 2%, a frakcja pod pikami wynosiła około 18% do 44%Wiele silnych pików o wysokim stosunku sygnału do szumu ujawniono w pobliżu genów markerów adipocytów, takich jak Adipoq, Fabp4 i Plin1 ze wszystkich magazynów tłuszczowych. W próbce BAT zaobserwowano silne piki sekwencji ATAC w locus brązowego markera adipocytów Ucp1. Najważniejszym czynnikiem dla tego protokołu jest jakość jądra.

Ważne jest, aby używać wysokiej jakości próbek tkanek i delikatnie obchodzić się z jądrami przez cały czas trwania eksperymentu, zwłaszcza podczas ponownego zawieszania po odwirowaniu i sortowaniu. Ważne jest, aby pamiętać, że ten protokół opiera się na transgenicznych myszach reporterowych z znakowaniem jądrowym. Użyto tutaj myszy NuTRAP, ale można zastosować każdy podobny system.

Dzięki naszym danym FACS można przeprowadzić obliczeniową analizę wielokrotną w celu znalezienia kluczowych czynników transkryptomicznych, które regulują ekspresję genów w warunkach biologicznych.