Name: Specyficzny dla adipocytów ATAC-Seq z tkankami tłuszczowymi przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Poznaj protokół ATAC-seq specyficzny dla adipocytów z tkanki tłuszczowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanego fluorescencją. Ta metoda generuje wysokiej jakości dane z minimalnym zanieczyszczeniem DNA mitochondrialnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez IUSM Showalter Research Trust Fund (dla H.C.R.), grant pilotażowy i wykonalności IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases (dla H.C.R.), National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 dla H.C.R.) oraz American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 dla H.C.R.).

Opieka nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Indiana University School of Medicine.
1. Przygotowania przed rozpoczęciem eksperymentu
<ol>
	<li>Przygotowanie tkanek
	<ol>
		<li>W celu znakowania jądra adipocytów skrzyżuj myszy NuTRAP z liniami adiponektyny-Cre specyficznymi dla adipocytów (Adipoq-Cre), aby wygenerować myszy Adipoq-NuTRAP, które są hemizygotyczne zarówno dla Adipoq-Cre, jak i NuTRAP.</li>
		<li>Przeprowadź sekcję tkanki tłuszczowej interesującej nas myszy Adipoq-NuTRAP, jak opisano wcześniej14.</li>
		<li>Błyskawicznie zamrozić tkanki w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: Każda poduszeczka tłuszczowa może być przechowywana jako całość, a zamrożone tkanki można później pokroić na suchym lodzie na mniejsze kawałki (~50 mg) do eksperymentów. Alternatywnie, tkanki tłuszczowe można pokroić, podzielić i zamrozić w probówkach do przechowywania (~ 50 mg na probówkę). Zamrożone próbki nigdy nie mogą się rozmrozić po zamrożeniu do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie buforu 
	UWAGA: Utrzymuj na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor do przygotowania jądra (NPB): 250 mM sacharozy, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 i 0,1% NP40. Przygotować 7 ml NPB na próbkę. Dodaj świeży 100-krotny koktajl inhibitorów proteazy (końcowy 1x), DTT (końcowy 1 mM) i Hoechst (końcowy 1 μg/ml) do NPB przed użyciem. 
		UWAGA: Zaleca się przygotowanie świeżego NPB, ale można go przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.</li>
		<li>Przygotować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami z 0,1% NP-40 (PBS-N).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja jądra
<ol>
	<li>Homogenizatory Dounce ze szkła chłodzącego, z jedną szklanką Dounce na próbkę, na lodzie. Następnie dodaj 7 ml mieszanki NPB do każdej szklanki Dounce. 
	UWAGA: Zaleca się użycie do ośmiu próbek w każdym eksperymencie. Praca z więcej niż ośmioma próbkami znacznie opóźniłaby wszystkie etapy, a zwłaszcza mogłaby obniżyć jakość jądra podczas sortowania.</li>
	<li>Zamrożoną tkankę tłuszczową (50-100 mg) umieść w szklance Dounce i natychmiast pokrój ją na kilka mniejszych kawałków za pomocą długich nożyczek. Uderz 10x luźnym tłuczkiem dla wszystkich próbek, a następnie 10x ciasnym tłuczkiem. 
	UWAGA: Tkanki tłuszczowe są miękkie, więc pokrojenie ich na kilka małych kawałków powinno wystarczyć. W przypadku rzadkich próbek można użyć mniejszych fragmentów (10-20 mg), chociaż liczba pobranych jąder adipocytów może się różnić.</li>
	<li>Przefiltruj przez sitko 100 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml. Przefiltrowane homogenaty przenieść do nowej probówki o pojemności 15 ml, wlewając. Wirować z prędkością 200 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z uchylnym kubełkiem. Usunąć supernatant tak bardzo, jak to możliwe. 
	UWAGA: Najpierw zassać za pomocą podciśnienia, a następnie usunąć pozostałą objętość za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Zawiesić osad w 500 μl PBS-N, delikatnie, ale dokładnie stukając palcem. 
	UWAGA: Należy unikać pipetowania, ponieważ może to spowodować uszkodzenie jąder.</li>
	<li>Przefiltrować przez sitko o średnicy 40 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą delikatnego pipetowania. Przepłukać sitko 250 μl PBS-N. Przefiltrowaną zawiesinę jądrową przenieść do probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) za pomocą mikropipety. 
	UWAGA: Jeśli to możliwe, probówki i sitka do komórek mogą być używane do mniejszych objętości, aby zminimalizować straty próbki.</li>
</ol>
3. Sortowanie jąder
<ol>
	<li>Przygotowanie probówki zbiorczej
	<ol>
		<li>Dodaj 500 μl PBS-N do nowych probówek o pojemności 1,5 ml i odwróć kilka razy, aby zwilżyć wszystkie wewnętrzne powierzchnie buforem.</li>
		<li>Krótko zakręć rurkami, aby spuścić cały płyn, a następnie schłódź je na lodzie do momentu sortowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FACS (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
	<ol>
		<li>Użyj bramki FSC-A/FSC-H do podkoszulki i FSC-A/SSC-A do usuwania małych lub dużych zanieczyszczeń.</li>
		<li>Bramka dla populacji jądra adipocytów mCherry/GFP-dodatnich.</li>
		<li>Zbierz 10 000 jąder w każdej z probówek pobraniowych przygotowanych w kroku 3.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie jądra po sortowaniu
	<ol>
		<li>Dodaj 500 μl PBS-N do każdej probówki zbiorczej i odwróć kilka razy do wymieszania.</li>
		<li>Obracać probówki zbiorcze z prędkością 200 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z odchylanym wiadrem. Całkowicie usunąć supernatant. 
		UWAGA: Najpierw użyj odkurzacza, aby usunąć pęcherzyki, odlej supernatant i użyj chusteczek papierowych, aby całkowicie usunąć pozostały płyn. Śrut jest w tym momencie niewidoczny. Przygotować mieszaninę wzorcową Tn5 podczas etapu wirowania, jak opisano poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Tagmentacja Tn5 (Tabela 1)
<ol>
	<li>Aby przygotować 25 μl głównej mieszaniny Tn5, wymieszaj 12,5 μl 2x buforu DNA do znakowania (bufor TD), 1,25 μl transpozazy Tn5 (enzym TDE I) i 11,25 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Dodać 25 μl mieszaniny głównej Tn5 do każdego osadu jądra i ponownie zawiesić przez delikatne pipetowanie. Inkubować przy 600 obr./min przez 30 min w temperaturze 37 °C przy użyciu termomiksera.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie DNA
UWAGA: Poniższa procedura wykorzystuje zestaw do oczyszczania PCR wymieniony w Tabeli Materiałów. Można zastosować wszelkie inne podobne metody oczyszczania DNA.
<ol>
	<li>Dodać 25 μl wody wolnej od nukleaz do 25 μl mieszaniny zawiesiny jądra Tn5 otrzymanej po kroku 4.2. Ostateczna objętość wynosi 50 μl na próbkę.</li>
	<li>Dodać 250 μl buforu PB.</li>
	<li>Dodać 5 μl 3 M octanu sodu (NaOAc) (pH 5,2).</li>
	<li>Przenieść mieszaninę do kolumny (dostarczonej z zestawem referencyjnym) i odwirować przy 17 900 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Wyrzuć przepływ i umieść kolumnę wirującą z powrotem w tej samej probówce zbiorczej. Dodać 750 μl buforu PE zawierającego absolutny etanol (EtOH) i odwirować przy 17 900 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzuć przepływ i umieść kolumnę wirującą z powrotem w tej samej probówce zbiorczej. Odwirować przy 17 900 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i wyrzucić probówkę zbiorczą z przepływem.</li>
	<li>Aby wymyć fragmenty DNA, wyposażyć kolumnę w nową probówkę o pojemności 1,5 ml, dodać 10 μl buforu EB i pozostawić w temperaturze pokojowej na 3 minuty. Wirować przy 17 900 × g przez 1 minutę w temperaturze RT. 
	UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub w temperaturze -20 °C przez tygodnie.</li>
</ol>
6. Amplifikacja PCR (Tabela 2)
UWAGA: Startery użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli 3.
<ol>
	<li>Aby amplifikować transponowane fragmenty DNA, przygotuj główną mieszaninę PCR bez dodawania unikalnego startera do kodów kreskowych Ad2.n (starter #2). Na próbkę należy użyć 38 μl mieszaniny wzorcowej PCR: 11 μl wody wolnej od nukleaz, 2 μl 25 μM Ad1_noMX startera (starter #1) i 25 μl 2x PCR Master Mix.</li>
	<li>Dodać 38 μl mieszaniny wzorcowej PCR do probówki PCR o pojemności 0,2 ml.</li>
	<li>Dodać 10 μl eluowanych fragmentów DNA z kroku 5.7.</li>
	<li>Dodaj 2 μl 25 μM startera #2, który musi być specyficzny dla każdej próbki.</li>
	<li>Przeprowadzić PCR zgodnie z warunkami cyklicznymi wskazanymi w tabeli 2.</li>
</ol>
7. Ilościowy test PCR (qPCR) w czasie rzeczywistym (Tabela 4)
UWAGA: Ten krok ma na celu określenie dodatkowych cykli potrzebnych do amplifikacji DNA. Jest to opcjonalne, ale wysoce zalecane, szczególnie w przypadku nowych eksperymentów.
<ol>
	<li>Przygotować główną mieszaninę qPCR bez dodawania startera #2. Na próbkę należy użyć 9,975 μl mieszaniny głównej qPCR: 4,41 μl wody wolnej od nukleaz, 0,25 μl startera 25 μM #1, 5 μl 2x PCR Master Mix i 0,09 μL 100x SYBR Green I. 
	UWAGA: Aby przygotować 100x SYBR Green I, rozcieńczyć 10 000x zapas wodą bez nukleaz. Ponieważ objętość 100x SYBR Green I użytego do mieszaniny głównej qPCR jest znikoma, łatwiej jest wykonać dodatkową mieszaninę wzorcową rozcieńczonej 100x SYBR Green I (np. dla 8-10 próbek).</li>
	<li>Dodać 9,975 μl mieszaniny wzorcowej qPCR do każdego dołka płytki qPCR.</li>
	<li>Dodaj 0,25 μl 25 μM startera #2 do każdej studzienki. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby dodać ten sam podkład #2, aby dopasować go do tego, który został dodany do każdej konkretnej próbki w kroku 6.4.</li>
	<li>Dodać 5 μl reakcji PCR otrzymanej po amplifikacji PCR w kroku 6.5 i wymieszać pipetując. 
	UWAGA: Pozostałe 45 μL reakcji PCR zostanie wykorzystane do drugiej amplifikacji PCR.</li>
	<li>Przeprowadzić qPCR zgodnie z warunkami cyklicznymi wskazanymi w tabeli 5.</li>
	<li>Sprawdź krzywe amplifikacji i zidentyfikuj liczbę dodatkowych cykli PCR, które są potrzebne, szacując liczbę cykli, które osiągnęły ~35% maksimum (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). 
	UWAGA: Zazwyczaj 10 000 jąder wymaga od pięciu do ośmiu dodatkowych cykli PCR.</li>
</ol>
8. Dodatkowa amplifikacja PCR
<ol>
	<li>Przeprowadzić PCR, używając wszystkich pozostałych 45 μl reakcji PCR zgodnie z obliczeniami z kroku 7.6 (Tabela 6). 
	UWAGA: Każda próbka może wymagać innej liczby cykli amplifikacji.</li>
</ol>
9. Drugie oczyszczanie DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR
<ol>
	<li>Zastosować te same procedury, co w punkcie 5, ale wymyć amplifikowane fragmenty DNA za pomocą 20 μl buforu EB.</li>
</ol>
10. Wybór rozmiaru fragmentu DNA
UWAGA: Użyj odwracalnych koralików unieruchamiających w fazie stałej, jak opisano poniżej. Wszelkie inne podobne kulki oczyszczające DNA mogą być używane zgodnie z instrukcjami producenta. Zawiesina perełkowa SPRI powinna być całkowicie ponownie zawieszona i zrównoważona w temperaturze pokojowej z obrotem przed użyciem.
<ol>
	<li>Przenieś eluowane DNA do nowej probówki PCR i dodaj 80 μl buforu EB, aby uzyskać końcową objętość 100 μl.</li>
	<li>Dodać 55 μl kulek SPRI (0,55x objętość próbki) i wymieszać pipetując. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie oddzielić na mini stojaku magnetycznym do 8-probówek do PCR przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść 150 μl supernatantu do nowej probówki do PCR. Dodać 95 μl kulek SPRI i wymieszać pipetując. 
	UWAGA: Supernatant zawiera DNA o masie około 500 pz lub mniejszej.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie oddzielać na mini stojaku magnetycznym przez 5 minut. Ostrożnie wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Umyj kulki przez 1 minutę 200 μl 70% EtOH. Powtórz dwa razy, w sumie trzy prania. 
	UWAGA: Nie przesuwaj probówek PCR ze stojaka magnetycznego podczas prania.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu odwirować probówki o masie 1 000 × g przez 1 minutę i odpipetować pozostały EtOH. Suszyć granulki z otwartą pokrywką w temperaturze 37 °C przez 2 minuty na maszynie do PCR. 
	UWAGA: Po wyschnięciu granulki koralików powinny wykazywać tylko drobne pęknięcia. Unikaj przesuszenia.</li>
	<li>Zawiesić osad z 20 μl buforu EB przez pipetowanie i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Oddzielić na mini podstawce magnetycznej na 5 minut, a następnie przenieść 18 μl supernatantu zawierającego ostateczną bibliotekę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA Biblioteka może być przechowywana w temperaturze -20 °C podczas przeprowadzania kontroli jakości.</li>
</ol>
11. Kwantyfikacja DNA za pomocą fluorometru
<ol>
	<li>Aby przygotować mieszaninę główną, rozcieńczyć 200x odczynnik dsDNA o wysokiej czułości (HS) z buforem dsDNA HS do końcowego stężenia 1x.</li>
	<li>W przypadku wzorców dodać 190 μl 1x mieszaniny wzorcowej i 10 μl wzorca 1 lub wzorca 2 do probówki fluorometru. 
	UWAGA: Przed rozpoczęciem kwantyfikacji należy zrównoważyć wzorce w RT w ciemności.</li>
	<li>W przypadku próbek z biblioteki dodać 198 μl 1x mieszaniny wzorcowej i 2 μl każdej próbki do oddzielnej probówki fluorometru. 
	UWAGA: Jeśli ilości próbki są ograniczone, objętość próbki można zmniejszyć do 1 μl, a objętość 1x mieszaniny głównej można zwiększyć do 199 μl.</li>
	<li>Odwiruj lub potrząśnij rurkami fluorometru i pozwól im siedzieć przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Zmierzyć stężenie DNA za pomocą testu dsDNA HS fluorometru.</li>
</ol>
12. Kontrola jakości biblioteki za pomocą systemów elektroforezy o wysokiej czułości
<ol>
	<li>Weź bibliotekę ATAC-seq i rozcieńcz wodą wolną od nukleaz do końcowego stężenia 1-5 ng / μL.</li>
	<li>Analizuj rozkład rozmiarów bibliotek ATAC-seq przy użyciu zautomatyzowanych systemów elektroforezy o wysokiej czułości zgodnie z protokołami producenta.</li>
</ol>
13. Kontrola jakości biblioteki ATAC-seq za pomocą ukierunkowanego qPCR
<ol>
	<li>Weź 5-10 ng z biblioteki ATAC-seq i rozcieńcz 50 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Przeprowadzić qPCR przy użyciu starterów ukierunkowanych na promotory i wzmacniacze, o których wiadomo, że są aktywne w adipocytach, zgodnie z warunkami cyklicznymi wskazanymi w Tabeli 7.</li>
	<li>Należy stosować startery kontroli ujemnej ukierunkowane na zamknięte/ciche regiony genomu (Tabela 7).</li>
	<li>Obliczyć wzbogacenie promotora/wzmacniaczy w stosunku do kontroli ujemnych (tabela 8). 
	UWAGA: Oczekuje się, że zobaczymy ≥10-20-krotne wzbogacenie z udanymi próbkami.</li>
</ol>
14. Sekwencjonowanie
<ol>
	<li>Prześlij biblioteki ATAC-seq do sekwencjonowania. Użyj sekwencjonowania sparowanych końców (2 x 34 pz, 2 x 50 pz lub dłużej) ze średnią liczbą odczytów 10-30 milionów odczytów na próbkę.</li>
</ol>

<ol><li>Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+Adipocyte+biology.+Adipose+tissue+function+and+plasticity+orchestrate+nutritional+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation.</a> Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).</li>
<li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+adipocyte+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).</li>
<li>Bielczyk-Maczynska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+adipocyte+plasticity+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">White adipocyte plasticity in physiology and disease.</a> Cells. 8 (12), 1507(2019).</li>
<li>Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+transcriptome+profiling+using+high+throughput+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genomics%22%5BJournal%5D)">Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies.</a> Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).</li>
<li>Esteve Rafols, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue%3A+Cell+heterogeneity+and+functional+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinologia+y+Nutricion%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity.</a> Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).</li>
<li>Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+white+adipose+tissue%3A+Molecular+basis+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications.</a> Experimental and Molecular Medicine. 48, e215(2016).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+fail+to+maintain+cellular+identity+during+obesity+due+to+reduced+PPAR%CE%B3+activity+and+elevated+TGF%CE%B2-SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling.</a> Molecular Metabolism. 42, 101086(2020).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warming+induces+significant+reprogramming+of+beige%2C+but+not+brown%2C+adipocyte+cellular+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity.</a> Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+analysis+in+human+early+development+reveals+epigenetic+transition+during+ZGA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA.</a> Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).</li>
<li>Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+dissection+of+diverse+mouse+adipose+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identification and dissection of diverse mouse adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59499(2019).</li>
<li>So, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cAMP+activation+induces+adipocyte+browning+through+discordant+biphasic+remodeling+of+transcriptome+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility.</a> Molecular Metabolism. 66, 101619(2022).</li>
<li>Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+GFP-tagged+nuclei+from+frozen+livers+of+INTACT+mice+for+RNA-+and+ATAC-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100805(2021).</li>
<li>Heyward, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+analysis+of+AgRP+neurons+reveals+that+IRF3+regulates+leptin%27s+hunger-suppressing+effects%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych istotnych ani istotnych interesów finansowych związanych z badaniami opisanymi w niniejszym artykule.

W tym artykule przedstawiliśmy zoptymalizowany protokół sekwencyjny ATAC do oceny dostępności chromatyny specyficznej dla adipocytów in vivo. Ten protokół ATAC-seq wykorzystujący mysz Adipoq-NuTRAP z powodzeniem wygenerował profile dostępności chromatyny specyficzne dla adipocytów. Najważniejszym czynnikiem decydującym o udanych i powtarzalnych eksperymentach ATAC-seq jest jakość jądra. Bardzo ważne jest, aby natychmiast zamrozić rozcięte tkanki tłuszczowe w ciekłym azocie i przechowywać je bezpiecznie w tempera...

Tkanka tłuszczowa, która specjalizuje się w magazynowaniu nadmiaru energii w postaci cząsteczek lipidów, jest kluczowym organem do regulacji metabolizmu. Ścisła kontrola tworzenia i utrzymywania adipocytów jest niezbędna dla funkcjonowania tkanki tłuszczowej i homeostazy energetycznej całego ciała1. Wiele regulatorów transkrypcji odgrywa kluczową rolę w kontroli różnicowania, plastyczności i funkcji adipocytów; Niektóre z tych regulatorów są związane z zaburzeniami metabolicznymi u ludzi2,3. Ostatnie postępy w wysokoprzepustowych technikach sekwencjonowania ekspresji genów i analizie epigenomicznej jeszcze bardziej ułatwiły odkrycie molekularnych regulatorów biologii adipocytów4. Badania profilowania molekularnego z wykorzystaniem tkanki tłuszczowej są trudne do przeprowadzenia ze względu na niejednorodność tych tkanek. Tkanka tłuszczowa składa się głównie z adipocytów, które są odpowiedzialne za magazynowanie tłuszczu, ale zawiera również różne inne typy komórek, takie jak fibroblasty, komórki śródbłonka i komórki odpornościowe5. Ponadto skład komórkowy tkanki tłuszczowej ulega radykalnej zmianie w odpowiedzi na zmiany patofizjologiczne, takie jak temperatura i stan odżywienia6. Aby przezwyciężyć te problemy, wcześniej opracowaliśmy transgeniczną mysz reporterową o nazwie Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), która wytwarza rybosomy znakowane GFP i biotynylowane jądra znakowane mCherry w sposób zależny od rekombinazy Cre7. System podwójnego znakowania umożliwia przeprowadzanie specyficznych dla typu komórki analiz transkryptomicznych i epigenomicznych tkanek. Korzystając z myszy NuTRAP skrzyżowanych z specyficznymi dla adipocytów liniami adiponektyny-Cre (Adipoq-NuTRAP), wcześniej scharakteryzowaliśmy profile ekspresji genów i stany chromatyny z czystych populacji adipocytów in vivo i określiliśmy, w jaki sposób są one zmieniane podczas otyłości7,8. Wcześniej myszy NuTRAP skrzyżowane z brązowymi i beżowymi liniami Ucp1-Cre specyficznymi dla adipocytów (Ucp1-NuTRAP) pozwoliły nam scharakteryzować epigenomiczną przebudowę rzadkiej populacji adipocytów termogenicznych, adipocytów beżowych, w odpowiedzi na zmiany temperatury9.
ATAC-seq to szeroko stosowana metoda analityczna do oceny dostępności chromatyny w całym genomie. Hiperreaktywna transpozaza Tn5 zastosowana w ATAC-seq pozwala na identyfikację otwartych regionów chromatyny poprzez znakowanie adapterów sekwencjonowania w dostępnym dla chromatyny regionie jąder10. ATAC-seq jest prostą metodą, ale zapewnia solidne wyniki i jest bardzo wydajny nawet w przypadku próbek o niskim wkładzie wejściowym. Stała się ona zatem jedną z najpopularniejszych metod profilowania epigenomicznego i przyczyniła się do zrozumienia mechanizmów regulacyjnych ekspresji genów w różnych kontekstach biologicznych. Od czasu powstania oryginalnego protokołu ATAC-seq różne techniki wywodzące się z ATAC-seq zostały dalej rozwinięte w celu modyfikacji i optymalizacji protokołu dla różnych typów próbek. Na przykład Fast-ATAC jest przeznaczony do analizy próbek krwinek11, Omni-ATAC to zoptymalizowany protokół dla próbek tkanek mrożonych12, a MiniATAC-seq jest skuteczny do analizy zarodków we wczesnym stadium13. Jednak zastosowanie metody ATAC-seq do adipocytów, zwłaszcza z próbek tkanek, jest nadal trudne. Oprócz niejednorodności tkanki tłuszczowej, jej wysoka zawartość lipidów może zakłócać sprawne reakcje rekombinacji przez transpozazę Tn5 nawet po izolacji jądra. Ponadto wysoka zawartość mitochondriów w adipocytach, szczególnie w adipocytach brązowych i beżowych, powoduje wysokie zanieczyszczenie mitochondrialnego DNA i marnotrawstwo odczytów sekwencjonowania. W tym artykule opisano protokół specyficznego dla adipocytów sekwencji ATAC przy użyciu myszy Adipoq-NuTRAP (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Wykorzystując sortowanie jąder znakowanych fluorescencyjnie, protokół ten umożliwia zbieranie czystych populacji jąder adipocytów z dala od innych mylących typów komórek i skuteczne usuwanie lipidów, mitochondriów i resztek tkankowych. W związku z tym protokół ten może generować wysokiej jakości dane specyficzne dla typu komórki i minimalizować odpady z odczytów mitochondrialnych przy użyciu zmniejszonej ilości danych wejściowych i odczynników w porównaniu ze standardowym protokołem.

<table><tbody><tr><td>Mysz Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adiponectin-Cre</td> Mysz <td>Jackson Laboratory</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>NuTRAP Laboratorium</td><td>Jacksona</td><td>29899</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki i odczynniki Materiały</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL probówki DNA-LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>86-923</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m sitko komórkowe</td><td>Falcon</td><td>352-360</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>VWR</td><td>525-1071</td><td></td></tr><tr><td>2x bufor TD</td><td>Illumina</td><td>15027866</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka PCR</td><td>Zastosowany biosystem</td><td>4483285</td><td></td></tr><tr><td>40 i mikro; m sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352-340</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td> Odczynnik <td>VWR</td><td>525-1077</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP (kulki SPRI)</td><td>Zestaw bioanalizatora Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr> o <tr><td>wysokiej czułości DNA</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta folia samoprzylepna</td><td>Zastosowana biosystem</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana bez DNaz/RNaz</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Młynek do tkanek Dounce</td><td>DWK Nauki przyrodnicze</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 magnes boczny listwowy</td><td>Thermo Fishers</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>Rurki FACS</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>28719128</tr><tr><td>HEPES</td><td>Boston BioProducts</td><td>BBH-75</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>2134015</td><td></td></tr><tr><td>KCl (2 M)</td><td>Boston BioProducts</td><td>MT-252</td><td></td></tr><tr><td>Stojak do separacji magnetycznej do PCR 8-probówkowe</td><td>paski EpiCypher</td><td>10-0008</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (1 M)</td><td>Boston BioProducts</td><td>MT-200</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania MinElute PCR</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix</td><td>BioLabs</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Thermo Fishers</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8-tubowy pasek</td> USA <td>scientific</td><td>1402-4708</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy (100x)</td><td>Thermo Fishers</td><td>78439</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0389-1KG</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I (10 000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>TDE I</td><td>enzym Illumina</td><td>15027865</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria Fusion</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Thermo Fishers</td><td>QuantStudio?5</td><td></td></tr></tbody></table>

specyficzny dla adipocytów atac-seq z tkankami tłuszczowymi przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting

Test chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ATAC-seq) to solidna technika, która umożliwia profilowanie dostępności chromatyny w całym genomie. Technika ta okazała się przydatna do zrozumienia mechanizmów regulacyjnych ekspresji genów w szeregu procesów biologicznych. Chociaż sekwencja ATAC została zmodyfikowana dla różnych typów próbek, nie przeprowadzono skutecznych modyfikacji metod sekwencjonowania ATAC dla tkanek tłuszczowych. Wyzwania związane z tkanką tłuszczową obejmują złożoną heterogeniczność komórkową, dużą zawartość lipidów i wysokie zanieczyszczenie mitochondriów. Aby przezwyciężyć te problemy, opracowaliśmy protokół, który umożliwia sekwencję ATAC specyficzną dla adipocytów poprzez zastosowanie sortowania jądra aktywowanego fluorescencją za pomocą tkanek tłuszczowych z transgenicznego reportera Nuclear tagging i Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Protokół ten generuje wysokiej jakości dane przy minimalnym marnotrawstwie odczytów sekwencjonowania, jednocześnie zmniejszając ilość danych wejściowych jądra i odczynników. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowe instrukcje krok po kroku dotyczące metody ATAC-seq zwalidowanej do stosowania jąder adipocytów wyizolowanych z mysich tkanek tłuszczowych. Protokół ten pomoże w badaniu dynamiki chromatyny w adipocytach po różnych stymulacjach biologicznych, co pozwoli na nowy wgląd biologiczny.

Aby przeanalizować tkankę tłuszczową przy użyciu tego protokołu ATAC-seq, wygenerowano myszy Adipoq-NuTRAP karmione standardową karmą; następnie za pomocą cytometrii przepływowej wyizolowano jądra adipocytów z białej tkanki tłuszczowej nadjajoniczkowej (eWAT), białej tkanki tłuszczowej pachwinowej (iWAT) oraz brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT). Wyizolowane jądra wykorzystano do tagmentacji, po której nastąpiło oczyszczanie DNA, amplifikacja PCR, etapy kontroli jakości, sekwencjonowanie oraz analiza danych, zgodnie z powy...

Przedstawiamy protokół do oznaczania chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ATAC-seq) szczególnie na adipocytach za pomocą sortowania jąder z tkankami tłuszczowymi wyizolowanymi od transgenicznych myszy reporterowych z znakowaniem fluorescencji jądrowej.

Specyficzny dla adipocytów ATAC-Seq z tkankami tłuszczowymi przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a robust technique that enables genome-wide chromatin ...

ATAC-seq to potężna technika pozwalająca zrozumieć mechanizmy regulacji ekspresji genów. Jednak tkanka tłuszczowa jest trudna przy użyciu tej techniki ze względu na dużą zawartość lipidów, wysokie zanieczyszczenie mitochondriów i niejednorodność komórkową. W tym protokole sekwencjonowanie ATAC specyficzne dla adipocytów przeprowadzono przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją, które generuje wysokiej jakości dane przy minimalnym zanieczyszczeniu mitochondrialnego DNA.Metoda ta może być również stosowana w innych tkankach, w których dostępne są specyficzne dla typu komórki linie myszy Cre z transgenicznymi liniami reporterowymi znakującymi jądra. Izolację jądra należy rozpocząć od schłodzenia szkła Homogenizatory do odbić na lodzie z jednym szklanym odbiciem na próbkę. Następnie dodaj 7 mililitrów mieszanki NPB do każdej szklanki Dounce.Następnie umieść od 50 do 100 miligramów zamrożonej tkanki tłuszczowej w szklance Dounce i pokrój ją na kilka mniejszych kawałków za pomocą długich nożyczek. Uderz 10 razy luźnym tłuczkiem dla wszystkich próbek, a następnie 10 razy ciasnym tłuczkiem. Przefiltrować zawartość przez sitko o średnicy 100 mikrometrów do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów przed przeniesieniem przefiltrowanych homogenatów do probówki o pojemności 15 mililitrów w celu odwirowania.Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach PBS-N poprzez delikatne, ale dokładne stukanie palcami. Następnie przefiltruj zawiesinę przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do rurki o pojemności 50 mililitrów i przepłucz sitko 250 mikrolitrami PBS-N. Przenieść przefiltrowaną zawiesinę jądrową do aktywowanego fluorescencją sortowania komórek lub probówki FACS za pomocą mikropipety.Przygotuj probówkę zbiorczą, dodając 500 mikrolitrów PBS-N do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i odwróć ją kilka razy, aby zwilżyć wszystkie wewnętrzne powierzchnie buforem. Krótko zakręć rurkami, aby spuścić cały płyn przed umieszczeniem ich na lodzie do momentu sortowania. W przypadku FACS użyj bramki FSC-A/FSC-H do podkoszulki i FSC-A/SSC-A do usuwania małych lub dużych zanieczyszczeń.Bramka dla populacji jądra adipocytów mCherry/GFP-dodatnich i zebrać 10 000 jąder w każdej przygotowanej wcześniej probówce zbiorczej. W celu przygotowania jądra po sortowaniu, dodać 500 mikrolitrów PBS-N do każdej probówki zbiorczej i wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę przed odwirowaniem probówek zbiorczych o stężeniu 200 G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Całkowicie usunąć supernatant.Aby przygotować 25 mikrolitrów głównej mieszaniny Tn5, wymieszaj 12,5 mikrolitrów 2x buforu DNA do znakowania lub buforu TD, 1,25 mikrolitra transpozazy Tn5 lub enzymu TDE I i 11,25 mikrolitra wody wolnej od nukleaz. Następnie dodać 25 mikrolitrów głównej mieszaniny Tn5 do każdego jądra osadu i ponownie zawiesić go przez delikatne pipetowanie. Inkubować z prędkością 600 obr./min przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą mieszalnika termicznego.Dodaj 25 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do 25 mikrolitrów mieszaniny zawiesiny jądra Tn5, uzyskując końcową objętość 50 mikrolitrów. Następnie dodać 250 mikrolitrów buforu PB i 5 mikrolitrów 3 M octanu sodu o pH 5,2. Po przeniesieniu mieszaniny do kolumny dostarczonej z zestawem referencyjnym, odwirować ją przy 17 900 G przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.Po wyrzuceniu przepływu umieść kolumnę wirującą z powrotem w tej samej probówce zbiorczej. Do probówki dodać 750 mikrolitrów buforu PE zawierającego absolutny etanol. Odwirować kolumnę, odrzucić przepływ i umieścić kolumnę wirową z powrotem w tej samej probówce zbiorczej.Odwirować probówkę i wyrzucić probówkę zbiorczą z przepływem. Aby amplifikować transponowane fragmenty DNA, należy przygotować główną mieszaninę PCR bez dodawania unikalnego Ad2. n Elementarz kodów kreskowych.Uruchom PCR. Uruchom ilościowy PCR lub qPCR. Sprawdź krzywe amplifikacji i określ liczbę dodatkowych cykli PCR, które są potrzebne, szacując liczbę cykli, które osiągnęły około 35% maksimum.Skorzystaj z obliczeń, aby uruchomić PCR dla pozostałych 45 mikrolitrów reakcji PCR. Korzystając z wcześniejszych procedur, eluuj amplifikowane fragmenty DNA za pomocą 20 mikrolitrów buforu EB. Przenieś eluowane DNA do nowej probówki PCR i dostosuj objętość do 100 mikrolitrów, dodając 80 mikrolitrów buforu EB. Następnie dodaj 55 mikrolitrów kulek SPRI i wymieszaj pipetując. Po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej oddziel go na mini stojaku magnetycznym na 5 minut.Po zakończeniu przenieś 150 mikrolitrów supernatantu do nowej probówki do PCR, dodaj 95 mikrolitrów kulek SPRI i wymieszaj przez pipetowanie. Inkubuj reakcję przez 5 minut przed oddzieleniem kulek na mini stojaku magnetycznym. Ostrożnie wyrzucić supernatant i myć kulki przez 1 minutę przy użyciu 200 mikrolitrów 70% etanolu.Powtórz jeszcze dwa prania. Po ostatnim umyciu odwirować probówki o stężeniu 1000 G przez 1 minutę. Odpipetować pozostały etanol i suszyć granulki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2 minuty na maszynie do PCR z otwartą pokrywą.Po wysuszeniu ponownie zawiesić osad w 20 mikrolitrach buforu EB przez pipetowanie i inkubować probówkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Oddziel kulki na 5 minut na mini podstawce magnetycznej przed przeniesieniem 18 mikrolitrów supernatantu zawierającego ostateczną bibliotekę do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Jądra adipocytów znakowane mCherry i GFP można było odróżnić od jąder innych typów komórek wyizolowanych z tkanki tłuszczowej myszy Adipoq-NuTRAP.W zależności od rodzaju depotingu tkanki tłuszczowej zaobserwowano różnicę około 50% we frakcjach adipocytów, w eWAT 30%, a we frakcjach adipocytów 65% w BAT. Próbki wymagające więcej niż 15 cykli PCR wskazywały na próbki niskiej jakości. Analiza rozkładu wielkości bibliotek ATAC-seq wykazała wiele pików odpowiadających regionowi wolnemu od nukleosomów lub NFR oraz mono, di i multinukleosomom o średnich rozmiarach około 500 do 800 par zasad.Próbki o niskiej jakości zazwyczaj wykazywały głównie NFR bez pików nukleosomalnych lub z niewielką ich liczbą. Testy kontroli jakości za pomocą analizy qRT-PCR wykazały 10 do 20-krotne wzbogacenie w dodatnie elementy genomu w pobliżu genów markerów adipocytów, takich jak Adipoq, Fabp4, Plin1 i Pnpla2, podczas gdy nie wykazano wzbogacenia w kontrolę ujemną. Wzbogacenie w termogeniczny gen Ucp1 zaobserwowano specyficznie w BAT.Odczyty mitochondrialne wynosiły mniej niż 2%, a frakcja pod pikami wynosiła około 18% do 44%Wiele silnych pików o wysokim stosunku sygnału do szumu ujawniono w pobliżu genów markerów adipocytów, takich jak Adipoq, Fabp4 i Plin1 ze wszystkich magazynów tłuszczowych. W próbce BAT zaobserwowano silne piki sekwencji ATAC w locus brązowego markera adipocytów Ucp1. Najważniejszym czynnikiem dla tego protokołu jest jakość jądra.Ważne jest, aby używać wysokiej jakości próbek tkanek i delikatnie obchodzić się z jądrami przez cały czas trwania eksperymentu, zwłaszcza podczas ponownego zawieszania po odwirowaniu i sortowaniu. Ważne jest, aby pamiętać, że ten protokół opiera się na transgenicznych myszach reporterowych z znakowaniem jądrowym. Użyto tutaj myszy NuTRAP, ale można zastosować każdy podobny system.Dzięki naszym danym FACS można przeprowadzić obliczeniową analizę wielokrotną w celu znalezienia kluczowych czynników transkryptomicznych, które regulują ekspresję genów w warunkach biologicznych.

adipocyte-specific-atac-seq-with-adipose-tissues-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych pochodzących z grzebienia nerwowego (ADSC) z mysiej tkanki tłuszczowej łuku okołoaortalnego. Po wyizolowaniu NCADSC są wykrywane, sortowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, a następnie hodowane na płytce, co sprzyja proliferacji komórek.

Izolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy okołoortowej

Tkanka tłuszczowa (AT) to miejsce intensywnej aktywacji i interakcji komórek odpornościowych.  Prawie wszystkie komórki układu odpornościowego są obecne w AT, a ich proporcje są zmieniane przez otyłość.  Właściwa izolacja, kwantyfikacja i charakterystyka populacji komórek odpornościowych AT mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w chorobie immunometabolicznej.

Izolacja komórek odpornościowych tkanki tłuszczowej

Prezentujemy techniki wymagane do wyizolowania zrębowej frakcji naczyniowej (SVF) z mysich pachwinowych (podskórnych) i okołogonadalnych (trzewnych) magazynów tkanki tłuszczowej w celu oceny ich ekspresji genów i aktywności kolagenolitycznej. Metoda ta obejmuje wzbogacanie komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 za pomocą immunomagnetycznej separacji komórek.

Immunomagnetyczna separacja komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 specyficznych dla Fat Depot

Tutaj przedstawiamy metodę izolacji populacji komórek progenitorowych adipocytów (APC) z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT) za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MCS). Metoda ta pozwala na zwiększoną izolację APC na gram tkanki tłuszczowej w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).

Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych

Ze względu na wysoką zawartość lipidów, tkanka tłuszczowa była trudna do wizualizacji przy użyciu tradycyjnych metod histologicznych. Adipo-Clear to technika oczyszczania tkanek, która umożliwia solidne znakowanie i wolumetryczne obrazowanie fluorescencyjne tkanki tłuszczowej w wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbki, obróbki wstępnej, barwienia, czyszczenia i montażu do obrazowania.

Adipo-Clear: metoda oczyszczania tkanek do trójwymiarowego obrazowania tkanki tłuszczowej

Ta publikacja opisuje protokół izolacji jąder z dojrzałych adipocytów, oczyszczania przez sortowanie aktywowane fluorescencją oraz transkryptomiki na poziomie pojedynczej komórki.

Izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Tutaj opisujemy prostą, tanią i szybką metodę oczyszczania struktury 3D zarówno mysjej, jak i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą kombinacji markerów do wizualizacji układu naczyniowego, jąder, komórek odpornościowych, neuronów i białek płaszcza lipidowo-kropelkowego za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.

Badanie struktury tkanki tłuszczowej poprzez oczyszczanie salicylanu metylu i obrazowanie 3D

Prezentujemy prostą metodę izolowania wysoce żywotnych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z najądrzy myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Biologia międzymięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) jest w dużej mierze niezbadana ze względu na ograniczoną dostępność tkanek ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji jąder i przygotowania biblioteki zamrożonego ludzkiego IMAT do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder w celu identyfikacji składu komórkowego tego unikalnego magazynu tłuszczu.

Izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder w dół

Poznaj protokół ATAC-seq specyficzny dla adipocytów z tkanki tłuszczowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanego fluorescencją. Ta metoda generuje wysokiej jakości dane z minimalnym zanieczyszczeniem DNA mitochondrialnego.

Specyficzny dla adipocytów ATAC-Seq z tkankami tłuszczowymi przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Przeglądaj więcej filmów