Name: Ustalanie, utrzymywanie, różnicowanie, manipulacja genetyczna i przeszczepianie organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metodę tworzenia organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi w celu badań nad homeostazą i medycyną regeneracyjną. Technika ta umożliwia analizę genetyczną oraz potencjalne zastosowanie terapeutyczne w leczeniu zespołu suchego oka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Yorickowi Postowi za początkowy rozwój protokołu. Prace te zostały częściowo wsparte nagrodą przyznaną zespołowi SPECIFICANCER przez Cancer Research UK Grand Challenge (C6307/A29058) oraz Mark Foundation for Cancer Research.

<ol><li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+development%3A+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li>
<li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+infection+of+the+external+eye%3A+The+role+of+tears%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li>
<li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+treatment+of+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Deutsches+Arzteblatt+International%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li>
<li>Massie, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+lacrimal+gland+spheroids+for+lacrimal+gland+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li>
<li>Bannier-Hélaouët, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li>
<li>Jeong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+functional+epithelial+organoids+from+human+lacrimal+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands.</a> Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 247(2021).</li>
<li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li>
<li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520(2021).</li>
<li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li>
<li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues%3A+Studies+in+a+C57BL%2F6J+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232(2015).</li>
<li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438(2022).</li>
<li>Lõhmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
<li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvolution+of+complex+DNA+repair+%28DECODR%29%3A+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li>
<li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy%3A+Developmental+aspects+and+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li>
<li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+regeneration%3A+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li>
</ol>

Hans Clevers jest szefem działu badań farmaceutycznych i wczesnego rozwoju w firmie Roche w Bazylei i posiada kilka patentów związanych z technologią organoidów.

Protokół ten opisuje tworzenie i stosowanie organoidów gruczołów łzowych do testów funkcjonalnych, modelowania mutacji i przeszczepów. Podczas tworzenia organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi dysocjacja tkanek ma kluczowe znaczenie. Jeśli tkanka nie zostanie wystarczająco strawiona, wydajność organoidów będzie niska. Jeśli tkanka zostanie nadmiernie strawiona, komórki umrą i nie wyrosną jako organoidy. Każda tkanka powinna być trawiona przez określony enzym przez określony czas, aby zapewnić optymalny wzrost organoidów 14,17,18. Gruczoł łzowy jest raczej miękką tkanką, dla której trawienie kolagenazą trwające 5-10 minut w połączeniu z mechaniczną dysocjacją opartą na pipetowaniu jest wystarczające do wyizolowania małych fragmentów tkanki. Jeśli konieczne jest uzyskanie pojedynczych komórek do zastosowań takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, dysocjację można przeprowadzać przez dłuższy czas, aż do osiągnięcia stadium pojedynczej komórki, ale dysocjację należy przerwać, gdy tylko uzyska się pojedyncze komórki, aby ograniczyć jakikolwiek spadek żywotności. Ponieważ dysocjacja tkanek jest tak ważna, nadmierne trawienie jest najbardziej prawdopodobną przyczyną niewydolności organoidów gruczołów łzowych.
Właściwa konserwacja organoidów gruczołów łzowych jest ważna dla ich stosowania. Długotrwałe utrzymanie jest cechą charakterystyczną organoidów gruczołów łzowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych, w porównaniu z indukowanymi organoidami pochodzącymi z pluripotencjalnych komórek macierzystych 7,17. Aby osiągnąć długotrwałe utrzymanie, należy przeprowadzać regularne rozszczepianie organoidów i zmiany podłoża. Bez tego organoidy zaczynają się różnicować i rozwijać zmniejszony potencjał komórek macierzystych, co utrudnia ich długoterminowe utrzymanie7. Na tym etapie nadmierne trawienie może zabić komórki macierzyste i zaburzyć utrzymanie organoidów. Do regularnej konserwacji dysocjacja organoidów na pojedyncze komórki nie jest wymagana. Jednak, aby wygenerować klonalne linie organoidów z nokautem, ważne jest, aby zacząć od pojedynczych komórek. Jeśli tak się nie stanie, organoidy będą składać się z mozaiki komórek o różnym pochodzeniu genetycznym, co uniemożliwi analizę efektu pojedynczej, zdefiniowanej mutacji. Tutaj opisujemy użycie edytora bazowego C > T do generowania kodonów stop. Ten edytor genomu opiera się na obecności kodonów argininy, glutaminy lub tryptofanu w obrębie 12-18 zasad z NGG PAM. Gdy te warunki nie są spełnione przy projektowaniu gRNA, można zastosować konwencjonalne edytory zasad Cas9 lub C >T z alternatywnymi PAM 7,18. Jednak konwencjonalny Cas9 wprowadza dwuniciowe przerwy, które powodują powstawanie indeli po naprawie11. Ponieważ oba allele mogą zawierać różne indele, genotypowanie klonów wymaga dodatkowej ostrożności. Dekonwolucja wprowadzonych modyfikacji powinna być przeprowadzona w celu upewnienia się, że oba allele zawierają indele poza ramką, a tym samym, że klony organoidów są znokautowane dla genu docelowego19. Zaletą edytorów zasad C > T jest fakt, że można je wykorzystać do modelowania mutacji punktowych, które niekoniecznie skutkują kodonami stop. Na przykład można je wykorzystać do modelowania określonych mutacji Pax6 występujących u pacjentów z aniridią w celu zbadania ich wpływu na fizjologię gruczołów łzowych20.
Gruczoł łzowy wydziela wodną część filmu łzowego1. Wydzielanie łez można zrekapitulować w ludzkich organoidach po różnicowaniu, w którym pośredniczy wycofanie czynnika wzrostu i hamowanie NOTCH. W tych warunkach organoidy ulegają końcowemu różnicowaniu i nie mogą być dalej utrzymywane. Jednak zróżnicowane organoidy gruczołów łzowych mogą kierować opracowywaniem leków wywołujących łzawienie w kontekście zespołu suchego oka, potencjalnie w badaniach przesiewowych o wysokiej przepustowości. Test rozrywania przedstawiony w tym protokole jest tym, który obecnie daje największą zmianę wielkości organoidu w krótkim czasie, co ułatwia jego ilościowe określenie w kontekście badania przesiewowego leków 7,9,17.
Terapia komórkami macierzystymi jest bardzo obiecująca w regeneracji gruczołów łzowych w chorobie suchego oka21. Organoidy gruczołów łzowych pochodzące z dorosłych komórek macierzystych mogą być materiałem źródłowym do takich zastosowań. Przedstawiony tutaj protokół skutkuje wszczepieniem organoidów ludzkich gruczołów łzowych, głównie w postaci torbieli. Niskie wszczepienie organoidów może powstać w wyniku wstrzyknięcia organoidów w niewłaściwe miejsce. Szkolenie procedury iniekcji za pomocą barwnika pozwala na śledzenie miejsca wstrzyknięcia i ostatecznie poprawia dokładność iniekcji. Alternatywnie, naskórek myszy może zostać nacięty, aby mieć bezpośredni dostęp do gruczołu łzowego, tak jak to miało miejsce u szczurów przed22 rokiem życia. Ta metoda trwa dłużej, ale może być dokładniejsza. Z drugiej strony, przy obecnym protokole, organoidy nie integrowały się funkcjonalnie z gruczołem łzowym myszy. Podobne wyniki zaobserwowano w przypadku wszczepienia gruczołu łzowego pochodzącego z iPSC22. Metodę przeszczepu można jeszcze bardziej udoskonalić, raniąc wcześniej gruczoł łzowy przy użyciu mysiego modelu suchego oka i/lub wstrzykując organoidy w postaci pojedynczych komórek lub małych kępek. Niemniej jednak organoidy gruczołów łzowych pochodzące z dorosłych komórek macierzystych i związany z nimi zestaw narzędzi mogą stanowić podstawę przyszłych zastosowań w badaniach gruczołów łzowych i medycynie regeneracyjnej.

Gruczoł łzowy to nabłonek gruczołowy odpowiedzialny za wytwarzanie większości warstwy wodnej filmu łzowego1. Warstwa wodna filmu łzowego zawiera nie tylko wodę do smarowania powierzchni oka, ale także duży repertuar składników przeciwdrobnoustrojowych, które chronią powierzchnię oka przed infekcjami2. Gdy gruczoł łzowy jest uszkodzony lub znajduje się w stanie zapalnym, dochodzi do zespołu suchego oka, który powoduje dyskomfort u pacjentów i może ostatecznie doprowadzić do utraty wzroku3. Z biegiem lat systemy modelowe do badania gruczołu łzowego, w szczególności gruczołu ludzkiego, były ograniczone4,5,6. Przyczyniło się to do powstania luki w wiedzy na temat funkcji gruczołów łzowych w warunkach fizjologicznych i patologicznych.
Ostatnio opracowano modele in vitro do badania gruczołu łzowego w dish7,8,9. Te organoidy gruczołów łzowych pochodzą z dorosłych komórek macierzystych hodowanych jako trójwymiarowe struktury w macierzy zewnątrzkomórkowej uzupełnionej koktajlem czynników wzrostu, który podtrzymuje ich zdolności regeneracyjne in vitro7. Zaletą organoidów pochodzących z dorosłych komórek macierzystych (ASC) jest to, że mogą być utrzymywane przez bardzo długi czas, jednocześnie rekapitulując zdrowe cechy tkanki. Ten typ organoidu składa się wyłącznie z komórek nabłonkowych, w przeciwieństwie do organoidów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), które mogą również zawierać na przykład komórki zrębu. W przeciwieństwie do organoidów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), organoidy ASC są tworzone bezpośrednio z dorosłej tkanki i nie wymagają żadnych modyfikacji genetycznych w celu ich namnażania. Organoidy ASC wyrażają cechy dorosłego osobnika10.
Ten protokół zawiera zestaw narzędzi do pozyskiwania organoidów gruczołów łzowych z mysich i ludzkich tkanek pierwotnych. Protokół opisuje, w jaki sposób można jeszcze bardziej zwiększyć funkcjonalność organoidów poprzez proste wycofanie czynnika wzrostu oraz jak sprowokować organoidy do wydzielania płynu łzowego poprzez wykonanie testu obrzęku. Protokół ten dodatkowo obejmuje metodę transfekcji opartą na elektroporacji w celu genetycznej inżynierii organoidów myszy przy użyciu edytorów zasad pochodzących z CRISPR. W przeciwieństwie do konwencjonalnego Cas9, użycie edytorów zasad pozwala na modyfikację pojedynczych zasad w genomie bez generowania dwuniciowego break11,12. Na koniec opisano ortotopowe przeszczepienie organoidów ludzkich gruczołów łzowych myszom z niedoborem odporności i późniejszą ocenę histologiczną wszczepienia. Ten zestaw narzędzi organoidowych gruczołów łzowych może być wykorzystany w badaniach nad regeneracją i funkcją gruczołów łzowych oraz do modelowania chorób genetycznych i zapalnych.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówki wirówkowe z blokadą safe-lock</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-diaminobenzydyny tetrachlorowodorek hydrat (DAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td>CAS: 868272-85-9 , UWAGA, roztwór 6 g/l można przechowywać w porcji w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>5x zielony bufor GoTaq Flexi</td><td>Promega</td><td>M891A</td><td>Przechowywać przy -20 & deg; C</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Przechowywać przy -20 &deg; C, stan magazynowy 30 mM, 10000x</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>przechowywać pod kątem 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Płytki agarowe zawierające ampicylinę</td><td>Instytut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hubrechta Sól sodowa ampicyliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw VAPOUR-Line lite</td><td>Chemikalia</td><td></td><td></td>VWR</tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C, 50x</td></tr><tr><td>BD Micro-Fine igła insulinowa 1 ml</td><td>BD Bioscience</td><td>324825</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stołowy DMI1</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>MP biomedyczne</td><td>160069</td><td>Sklep w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>BTXpress</td><td>BTX</td><td>MDS450805</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 myszy</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kasety</td><td>Klinipath</td><td>410-02S</td><td></td></tr><tr><td>CellBanker 1</td><td>amsbio</td><td>11910</td><td>Pożywka do kriokonserwacji, postępuj zgodnie z instrukcją</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat kwasu cytrynowego</td><td>J.T. Baker</td><td>0088</td><td>CAS: 5949-29-1</td></tr><tr><td>Kolagenaza I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9407</td><td>Podwielokrotności w dawce 20 mg / ml, 20x, przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>Rurki stożkowe 50 ml</td><td>Corning</td><td>CLS430828-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24 mm x 50 mm</td><td>Menzel-Gl&auml; zer</td><td>BB024050S1</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z błony podstawnej Cultrex (BME), Obniżony czynnik wzrostu, Typ 2 - macierz zewnątrzkomórkowa</td><td>R& D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C, utrzymuj na 4 & stopni; C przez okres do 1 miesiąca</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5942</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C, zapas przy 10 mM, 1000x</td></tr><tr><td>Wodorofosforan disodowy bezwodny</td><td>Chemikalia VWR</td><td>28026.292</td><td>CAS: 7558-79-4</td></tr><tr><td>Dihydrat wodorofosforanu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td>CAS: 10028-24-7</td></tr><tr><td>Dypaza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17105-041</td><td>Podwielokrotności w stężeniu 50 U/ml, przechowywać w temperaturze -20 &deg; C do momentu użycia, 400x</td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel Sterylny N&deg; 10</td><td>Mikroskop Swann Morton</td><td>3033838</td><td></td></tr><tr><td>DM4000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPs 25 mM</td><td>Promega</td><td>U1420</td><td>Wymieszaj wszystkie 4 nukleotydy razem, Przechowuj w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>1x</td></tr><tr><td>Łatwe sitka 70 i mikro; m</td><td>Greiner</td><td>542170</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do elektroporacji</td><td>Nepagene</td><td>EC002S</td><td></td></tr><tr><td>Mysz EnVision+/HRP</td><td>Agilent</td><td>K400111-2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>BOOM</td><td>84045206; 5000</td><td>UWAGA, Służy do przygotowania innych rozcieńczeń etanolu</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>BOOM</td><td>84010059.5000</td><td>UWAGA</td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>BOOM</td><td>84050065.5000</td><td>UWAGA</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 2 System obrazowania komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Mikroskop do obrazowania na żywo w jasnym polu</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>Przechowywać przy -20 stopniach; C, zapas w 100 mg/ml w podłożu bazowym, 100x</td></tr><tr><td>Fidżi</td><td>NIH, Fidżi deweloperzy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu 4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496</td><td>CAS: 50-00-0, UWAGA</td></tr><tr><td>Forskolina</td><td>Tocris</td><td>1099</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C, zapas przy 10 mM, 10000x</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA Polimeraza</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td>Przechowywać w -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Chemikalia Hematoksylina</td><td>VWR</td><td>10047105</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni C, 100x</td></tr><tr><td>Histocore H i C, Maszyna do zatapiania tkanek</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Meidax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało antygenu jąderkowego</td><td>Abcam</td><td>ab-190710</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny 5 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10605882</td><td>CAS: 7647-01-0, UWAGA</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30%</td><td>Chem-lab</td><td>CL00.2308.1000</td><td>CAS: 7722-84-1, UWAGA</td></tr><tr><td>Hygromycyna B-gold</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg</td><td>Zapas w dawce 100 mg/&mikro; L, 1000x</td></tr><tr><td>kaseta odporności na higromycynę plazmid</td><td></td><td></td> zawierający <td>Andersson-Rolf i inni, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>IsoFlo 100%</td><td>Mecan</td><td>5960501</td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 25 mM</td><td>Promega</td><td>A351H</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Microtome RM2235</td><td>Zestaw</td> do izolacji DNA Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Midiprep Zestaw do izolacji DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210005</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>K210003</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A9165</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, zapas na 500 mM, 400x</td></tr><tr><td>NEPA21 elektroporator</td><td>Nepagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td>Przechowywać przy -20 &deg; C, zapas w 1M, 100x</td></tr><tr><td>myszy NOD Scid Gamma (NSG)</td><td>Hubrecht Institute colony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Noggin conditioned medium</td><td>U-Protein Express</td><td>Na zamówienie niestandardowe</td><td>Przechowywać w -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Noradrenaline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7257</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C, zapas przy 100 mM</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Memmert</td><td></td><td>Zestaw na 58 & deg; Pipety C</td></tr><tr><td>P20, P200 i P1000 Chemikalia</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>VWR 10048502</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura, z zaślepką szklaną</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1150-6973</td><td></td></tr><tr><td>Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&nbsp;</td><td>Pax6_C>T_R IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td><td>Addgene</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Przechowywać pod adresem -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Pertex</td><td>Klinipath</td><td>AM-08010</td><td></td></tr><tr><td>pFYF1320&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>47511</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1000X, przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Prostaglandyna E2 (PGE2)</td><td>Tocris</td><td>2296</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C, zapas 10 mM, 10000x</td></tr><tr><td>szalka Petriego, 10 cm</td><td>Greiner</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>bufor Q5</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td> QIAquick Zestaw do ekstrakcji <td></td></tr><tr><td>żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do ekstrakcji DNA QuickExtract</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td>Store podwielokrotności przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>R-spondyna 3 kondycjonowana pożywka</td><td>U-Protein Express</td><td>na zamówienie Przechowywać</td><td>w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>sgRNA Odwrotny starter: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTT CGGTGTTTCGTCCTCCAAG</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slajdy</td><td>StarFrost</td><td>MBB-0302-55A</td><td>Klej, mielony</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Merck</td><td>8.22335.1000</td><td>CAS: 26628-22-8, UWAGA</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu dwuwodny</td><td>J.T. Baker</td><td>0280</td><td>CAS: 6132-04-3</td></tr><tr><td>Standardowy starter do przodu: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skuteczność subklonowania kompetentne komórki DH5alpha</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórek zawiesinowych (24-dołkowe)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662102</td><td>24-dołkowe</td></tr><tr><td>płytki do hodowli komórek zawiesinowych (12-dołkowe)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665102</td><td>12-dołkowe</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TAE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B49</td><td>Stock przy 50x, rozcieńczyć do 1x plazmidem</td></tr><tr><td></td><td></td><td>zawierającym transpozazę</td> wody ultraczystej <td>Andersson-Rolf i in., Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td>przechowywać w 4 &deg; C</td></tr><tr><td>U6_Forward podkład: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose 1000</td><td>Invitrogen</td><td>16550</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Tulabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Klinipath</td><td>4055-9005</td><td>CAS: 1330-20-7, UWAGA</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>Y-27632 dichlorowodorek</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, zapas przy 10 mM, 1000x</td></tr></tbody></table>

ustalanie, utrzymywanie, różnicowanie, manipulacja genetyczna i przeszczepianie organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

Gruczoł łzowy jest niezbędnym organem dla homeostazy powierzchni oka. Wytwarzając wodną część filmu łzowego, chroni oko przed stresem związanym z wysuszeniem i zewnętrznymi zniewagami. Niewiele wiadomo na temat (pato)fizjologii gruczołów łzowych z powodu braku odpowiednich modeli in vitro. Technologia organoidów sprawdziła się jako użyteczna platforma eksperymentalna dla wielu narządów. Tutaj udostępniamy protokół tworzenia i utrzymywania organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi, zaczynając od biopsji gruczołów łzowych. Modyfikując warunki hodowli, zwiększamy funkcjonalność organoidów gruczołów łzowych. Funkcjonalność organoidów można badać za pomocą testu "płaczącego", który polega na wystawieniu organoidów gruczołów łzowych na działanie wybranych neuroprzekaźników w celu wywołania uwalniania łez w ich świetle. Wyjaśniamy, jak zobrazować i określić ilościowo to zjawisko. Aby zbadać rolę genów będących przedmiotem zainteresowania w homeostazie gruczołów łzowych, można je genetycznie zmodyfikować. Dokładnie opisujemy, jak genetycznie modyfikować organoidy gruczołów łzowych za pomocą edytorów bazowych - od przewodnika po projektowaniu RNA po genotypowanie klonów organoidów. Na koniec pokazujemy, jak badać potencjał regeneracyjny organoidów ludzkich gruczołów łzowych poprzez implantację ortotopową u myszy. Razem ten kompleksowy zestaw narzędzi zapewnia zasoby do wykorzystania organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi do badania (pato)fizjologii gruczołów łzowych.

Po wycięciu gruczołu łzowego myszy (Ryc. 2A), trawienie enzymatyczne i mechaniczne doprowadziło do powstania małych fragmentów tkanki, wśród których można było rozróżnić acini i przewody (Ryc. 2B). Pozostałe duże kawałki tkanki mogłyby zdestabilizować ECM, co zmniejszyłoby początkowy wzrost organoidów. Uzyskanie organoidów gruczołu łzowego myszy uznawano za udane, gdy po około 7 dniach zaobserwowano cystyczne organoidy o średnicy ~500 µm; był to etap, w którym organoidy były gotowe do pasażowania (Ryc. 2C). Nawet jeśli ogólny proces otrzymywania organoidów przebiega pomyślnie, niektóre z nich mogą zacząć rosnąć, a następnie ostatecznie przestać. Organoidy ludzkiego gruczołu łzowego wyrosły jako cysty w ciągu 3-4 dni i osiągnęły pełną wielkość w ciągu 10-14 dni po izolacji tkanki (Ryc. 2D). Zarówno w przypadku myszy, jak i ludzi, otrzymywanie organoidów czasami nie powiodło się, co objawiało się brakiem lub małą liczbą wyrośniętych organoidów; było to zazwyczaj spowodowane zbyt intensywnym trawieniem tkanki. Organoidy gruczołu łzowego myszy można było pasażować co najmniej 40 razy, a organoidy ludzkie co najmniej 20 razy. Pasażowanie wykonywano średnio co 7-10 dni, w zależności od tempa wzrostu organoidów.
<img alt="Schemat ekstrakcji gruczołu łzowego myszy, izolacji komórek i wzrostu organoidów do analizy badawczej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ustanowienie organoidów gruczołu łzowego myszy i człowieka. (A) Zdjęcia poszczególnych etapów sekcji gruczołu łzowego myszy. Strzałka wskazuje gruczoł łzowy pod błoną ochronną. (B) Obrazy w polu jasnym komórek gruczołu łzowego myszy bezpośrednio po trawieniu tkanki, z wstawkami pokazującymi pęcherzyk i przewód. (C) Obrazy w polu jasnym udanej i nieudanej hodowli organoidów gruczołu łzowego myszy. (D) Obrazy w polu jasnym wzrostu ludzkich organoidów w ciągu 14 dni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Organoidy gruczołu łzowego zawierają dużą proporcję komórek macierzystych podczas hodowli w medium ekspansyjnym. Aby zwiększyć ich poziom różnicowania, opracowaliśmy medium do różnicowania dla myszy i ludzi z obniżoną zawartością czynników wzrostu. Po odpowiednio 5 i 7 dniach w medium do różnicowania, mysie i ludzkie organoidy gruczołu łzowego stały się gęstsze (Rycina 3A-B). Ta zmiana morfologiczna korelowała ze zwiększeniem właściwości funkcjonalnych. Zastosowanie aktywatora cyklicznego AMP, forskoliny, lub neuroprzekaźnika noradrenaliny spowodowało obrzęk organoidów (tj. apikalną sekrecję wody) w czasie krótszym niż 3 h (Rycina 3C). W przypadku, gdy obrzęk trwał dłużej niż 3-4 h, sugerowało to, że organoidy nie były wystarczająco zróżnicowane i/lub nie wykazywały ekspresji markerów funkcjonalnych, takich jak receptory dla neuroprzekaźników.
<img alt="Różnicowanie i pęcznienie gruczołu łzowego, wzrost organoidów w czasie, wyniki mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Różnicowanie organoidów gruczołu łzowego myszy i człowieka oraz test funkcjonalnego pęcznienia w organoidach ludzkich. (A) Obrazy w polu jasnym organoidów gruczołu łzowego myszy hodowanych w medium ekspansyjnym przez 7 dni oraz w medium różnicującym przez 5 dni po 2 dniach w medium ekspansyjnym. (B) Obrazy w polu jasnym organoidów gruczołu łzowego człowieka hodowanych w medium ekspansyjnym przez 11 dni oraz w medium różnicującym przez 9 dni po 2 dniach w medium ekspansyjnym. (C) Obrazy w polu jasnym zróżnicowanych organoidów gruczołu łzowego człowieka eksponowanych na świeże medium różnicujące (kontrola), 1 µM forskoliny oraz 100 µM norepinefryny w ciągu 3 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby przeprowadzić nokaut Pax6 w organoidach gruczołu łzowego myszy, za pomocą PCR i ligacji wygenerowano plazmid zawierający wybrany gRNA celujący w Pax6 (Ryc. 4A). Plazmid zawierający gRNA wprowadzono metodą elektroporacji wraz z plazmidami Piggy-Bac (plazmidem zawierającym transpozon oporności na hygromycynę oraz plazmidem zawierającym transpozazę) oraz edytorem zasad Cas9 C &gt; T do organoidów gruczołu łzowego myszy rozdzielonych do pojedynczych komórek. Po 3 dniach, gdy organoidy się zregenerowały, poddano je działaniu hygromycyny w celu wyselekcjonowania klonów, które włączyły kasetę oporności na hygromycynę. W przypadku udanej elektroporacji wyrosły organoidy oporne na hygromycynę (Ryc. 4B). Wybrano rosnące klony organoidów o wielkości większej niż ~300 µm, najlepiej przed rozpoczęciem przez nie spontanicznej różnicowania (Ryc. 4C). Z części organoidu wyekstrahowano DNA, natomiast pozostałą część pozostawiono w kulturze. Amplifikacja PCR locus Pax6 celowanego przez gRNA dała prążek 367 bp dla każdego z wybranych klonów (Ryc. 4D). Po sekwencjonowaniu amplifikowanego locus zachowano klony z homozygotyczną edycją C &gt; T (n = 1). Z kolei klony nieedytowane (n = 4), heterozygotycznie edytowane lub błędnie edytowane (n = 1) odrzucono (Ryc. 4E). Ogólnie, stosując ten gRNA celujący w Pax6, uzyskano jeden homozygotyczny klon nokautowy gruczołu łzowego myszy z sześciu zsekwencjonowanych. Niektóre klony rosły dobrze, jednak niektóre klony organoidów utracono po wyselekcjonowaniu lub zaczęły one ulegać różnicowaniu (Ryc. 4F). Z 10 wybranych klonów organoidów 7 rozrosło się prawidłowo.
<img alt="Proces edycji genów CRISPR; sekwencjonowanie, selekcja higromycyną, elektroforeza w żelu, analiza klonów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Knock-out genu Pax6 w organoidach gruczołu łzowego myszy za pomocą edycji zasad.(A) Wynik sekwencjonowania metodą Sangera plazmidu pFYF1320 po prawidłowej integracji gRNA celującego w locus Pax6. (B) Obrazy w świetle przechodzącym organoidów gruczołu łzowego myszy 5 dni po ekspozycji na higromycynę po elektroporacji. Organoidy hodowano w mysiej pożywce ekspansyjnej. Po lewej znajduje się przykład nieudanej elektroporacji, w której nie wyrosły żadne klony oporne na higromycynę. Po prawej znajduje się przykład udanej elektroporacji, w której przeżyło kilka klonów organoidów opornych na higromycynę. (C) Obrazy w świetle przechodzącym klonów, które należy wybrać, oraz klonów, których nie należy wybierać. (D) Żel agarozowy pokazujący amplifikację locus Pax6 celowanego przez gRNA. Na zielono zaznaczono prążek o oczekiwanej wielkości 367 bp. (E) Wynik sekwencjonowania metodą Sangera trzech klonów organoidów opornych na higromycynę. Górny klon nie został poddany edycji. Środkowy klon to edycja homozygotyczna C &gt; T, a zatem homozygotyczny knock-out. Dolny klon wykazuje dwie heterozygotyczne mutacje punktowe i jest albo heterozygotycznym knock-outem, albo klonem mieszanym, który został błędnie zedytowany. (F) Obrazy w świetle przechodzącym wybranych klonów organoidów o różnym stopniu wzrostu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Na koniec, w celu przeprowadzenia ortotopowego przeszczepienia ludzkich organoidów gruczołu łzowego u myszy, wykorzystano organoidy rozdzielone z 3-dniowym wyprzedzeniem (o średnicy &lt; 100 µm). Przyjęcie organoidów potwierdzono 1 miesiąc po ich wstrzyknięciu do mysiego gruczołu łzowego poprzez barwienie na marker specyficzny dla człowieka, ludzki antygen jąderkowaty (Rycina 5). Brak punktowego barwienia we wszystkich przekrojach mysiego gruczołu łzowego oznaczał brak przyjęcia ludzkiego organoidu.
<img alt="Ludzki antygen jąderkowy, wynik mikroskopowy; porównanie przeszczepienia komórek ludzkich vs. brak przeszczepienia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Transplantacja ludzkich organoidów gruczołu łzowego do mysiego gruczołu łzowego. Barwienie przeszczepionych mysich gruczołów łzowych na ludzki marker jąderkowy w celu monitorowania przyjęcia przeszczepu 1 miesiąc po transplantacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Skład pożywek i buforów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.</a>

Ten protokół opisuje, jak ustanowić, utrzymywać, genetycznie modyfikować, różnicować, funkcjonalnie charakteryzować i przeszczepiać organoidy gruczołów łzowych pochodzące z pierwotnej tkanki mysiej i ludzkiej.

Ustalanie, utrzymywanie, różnicowanie, manipulacja genetyczna i przeszczepianie organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Dzięki organoidom gruczołów łzowych można sprawdzić, w jaki sposób niektóre geny kontrolują homeostazę gruczołów łzowych. Dodatkowo organoidy mogą być wykorzystywane w medycynie regeneracyjnej. Główną zaletą technologii organoidów gruczołów łzowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych jest to, że umożliwia ona wzrost i badanie zdrowych i nieprzekształconych komórek nabłonka gruczołów łzowych.Te organoidy mogą być ostatecznie stosowane w leczeniu pacjentów z zespołem suchego oka. Rozpocznij od przygotowania pożywki i materiału wymaganego do eksperymentu, a następnie połącz wszystkie składniki pożywki trawiącej przed eksperymentem. Wstępnie zwilż skalpele w tym podłożu, aby uniknąć przyklejania się do nich kawałków tkanki.Wyjmij tkankę gruczołu łzowego myszy z pożywki, umieść ją na szalce Petriego i zmiel za pomocą wstępnie zwilżonych skalpeli. Gdy kawałki tkanki będą mniejsze niż 0,5 milimetra sześciennego, zeskrob je z szalki Petriego skalpelem i przenieś do 15-mililitrowej probówki zawierającej pożywkę wytrawiającą. W przypadku bardzo małej biopsji u człowieka należy umieścić ją bezpośrednio w pożywce trawiącej bez mielenia.Inkubować 15-mililitrową probówkę z kawałkami tkanek przez maksymalnie 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. W międzyczasie zwęź końcówkę pipety Pasteura w płomieniu i wstępnie zwilż ją w podłożu bazowym. Aby ułatwić proces dysocjacji, pipetować zmieloną mieszaninę w górę iw dół co pięć minut za pomocą wstępnie zwilżonej, zwężonej pipety Pasteura.Gdy pod mikroskopem widocznych jest wiele pojedynczych komórek i małych grudek, zatrzymaj dysocjację, dodając 10 mililitrów pożywki bazowej. Po odwirowaniu z prędkością 400 g przez pięć minut, usuń supernatant i ponownie zawieś osad w 10 mililitrach podłoża bazowego, aby powtórzyć płukanie i osadzanie w dół komórek. Usuń duże, niestrawione kawałki tkanki i pozostałe włókna kolagenowe, filtrując zmieloną mieszaninę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów.Wirować eluat z prędkością 400 g przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu ponownie zawieś osad komórkowy w 100 mikrolitrach zimnej macierzy zewnątrzkomórkowej lub ECM dla pojedynczego gruczołu łzowego myszy i 50 mikrolitrów zimnego ECM dla biopsji człowieka, bez tworzenia pęcherzyków. Wysiewaj do 100 mikrolitrów komórek na studzienkę 12-dołkowej płytki zawiesinowej za pomocą P200, aby uzyskać około 20-mikrolitrowe kropelki w studzience.Umieść płytkę do góry nogami w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 do 30 minut, aby umożliwić zestalenie ECM. Po zestaleniu się ECM dodaj około jednego mililitra pożywki rozprężnej myszy o temperaturze pokojowej na dołek 12-dołkowej płytki. Świeżo przygotuj jeden mililitr ludzkiej pożywki różnicującej zawierającej poszczególne składniki, które indukują wydzielanie przez organoidy gruczołów łzowych.W zautomatyzowanym mikroskopie poklatkowym w jasnym polu ustaw pozycje, które mają być obrazowane na płycie, przedział czasu wynoszący pięć minut i czas trwania czterech godzin. Upewnij się, że cała kropla ECM jest widoczna w każdej pozycji. Przed rozpoczęciem obrazowania należy usunąć pożywkę hodowlaną z dołków, które mają być obrazowane, bez odsuwania płytki od mikroskopu i zastąpić ją świeżo przygotowanym, dobrze zawieszonym ludzkim podłożem różnicującym zawierającym związki, w tym forskolinę i noradrenalinę.Jako kontrolę ujemną należy dołączyć studzienkę z odświeżonym podłożem różnicującym. Kliknij przycisk uruchamiania na mikroskopie i przeanalizuj wyniki po czterech godzinach. Po oddzieleniu organoidów, jak wspomniano w tekście, odrzucić supernatant.Zawiesić ogniwa w 80 mikrolitrach buforu do elektroporacji. W 1,5-mililitrowej probówce przygotuj plazmidy wymagane do eksperymentu. Dodaj plazmidy do komórek i dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół.Ustaw elektroporator z parametrami impulsu porowego i impulsu przenoszenia. Umieść komórki z plazmidami w kuwecie do elektroporacji. Natychmiast zmierz rezystancję, która powinna wynosić od 0,3 ampera do 0,55 ampera, i natychmiast poddaj się elektropowadze.Po zakończeniu przenieś komórki do 1,5-mililitrowej probówki i dodaj 400 mikrolitrów buforu do elektroporacji uzupełnionego inhibitorem kinazy Rho. Pozwól komórkom zregenerować się w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie granuluj komórki po 500 g przez pięć minut.Po odrzuceniu supernatantu umieścić komórki w 200 mikrolitrach ECM. Po zestaleniu dodaj podłoże ekspandujące myszy. W celu przygotowania organoidów należy rozdzielić organoidy ludzkiego gruczołu łzowego na około trzy dni przed dniem przeszczepienia.Aby wyekstrahować organoidy z ECM, dodaj dyspazę do pożywki hodowlanej, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,125 jednostki na mililitr, i dokładnie ponownie zawieś kropelki ECM, aby je rozbić za pomocą P1000. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Ponownie zawiesić organoidy w 10 mililitrach pożywki zasadowej, aby wypłukać enzym.Po zagnieżdżeniu komórek w ilości 400 g przez pięć minut, zawieś je ponownie w 50 mikrolitrach zimnej pożywki ekspansyjnej dla ludzi uzupełnionej 5% ECM. Umieścić zawiesinę organoidu na lodzie i natychmiast przystąpić do przeszczepu. W przypadku przeszczepu ortotopowego u myszy należy odessać zawiesinę organoidu za pomocą igły insulinowej.Kiedy mysz śpi, szybko połóż ją na boku z dostępem do głównego gruczołu łzowego. Wstrzyknąć pięć mikrolitrów zawiesiny organoidowej bezpośrednio przez skórę do gruczołu łzowego. Pozwól myszy dojść do siebie i codziennie oceniaj obecność dyskomfortu związanego z przeszczepem, zwłaszcza w oku.Po rozwarstwieniu gruczołu łzowego myszy, trawienie enzymatyczne i mechaniczne wytworzyło małe fragmenty tkanek, w tym acini i przewody. W udanym wyprowadzeniu organoidów gruczołów łzowych myszy organoidy torbielowate o średnicy około 500 mikrometrów znaleziono po siedmiu dniach. Ludzkie organoidy gruczołów łzowych rosły jako cysty w ciągu trzech do czterech dni i osiągały pełny rozmiar w ciągu 10 do 14 dni po izolacji tkanek.Po odpowiednio pięciu dniach i siedmiu dniach w pożywce różnicującej organoidy gruczołów łzowych myszy i człowieka stały się gęstsze. Zastosowanie cyklicznego aktywatora AMP forskoliny lub neuroprzekaźnika noradrenaliny spowodowało obrzęk organoidów w czasie krótszym niż trzy godziny. W udanej elektroporacji wyrosły organoidy odporne na higromycynę.Rosnące klony organoidów większe niż 300 mikrometrów zostały wybrane przed ich różnicowaniem. Amplifikacja PCR locus Pax6 ukierunkowanego przez przewodnik RNA dała pasmo 367 par zasad dla wszystkich wybranych klonów. Jeden homozygotyczny klon gruczołu łzowego myszy z sześcioma sekwencjonowanymi sekwencjami uzyskano przy użyciu przewodnika RNA ukierunkowanego na Pax6.Niektóre klony dobrze wyrosły, ale niektóre klony organoidów zostały utracone po zerwaniu lub zaczęły się różnicować. Z 10 wybranych klonów organoidów, siedem wyrosło dobrze. Wszczepienie organoidów potwierdzono miesiąc po wstrzyknięciu organoidów do mysiego gruczołu łzowego poprzez barwienie pod kątem markera specyficznego dla człowieka, ludzkiego antygenu jąderkowego.Jedną rzeczą, na którą należy zwrócić uwagę, jest to, aby nie trawić nadmiernie tkanki ani organoidów. W przeciwnym razie komórki mogą umrzeć, a to zmniejszy tempo tworzenia się organoidów. Organoidy gruczołów łzowych można analizować histologicznie.W ten sposób można uzyskać wgląd w ich skład komórkowy.

establishment-maintenance-differentiation-genetic-manipulation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Gruczoł łzowy (LG) to rozgałęziony organ, który wytwarza wodne składniki łez, niezbędne do utrzymania wzroku i zdrowia oczu. Tutaj opisujemy mysie techniki preparacji LG i hodowli ex vivo w celu rozszyfrowania szlaków sygnałowych zaangażowanych w rozwój LG.

Manipulowanie mysim gruczołem łzowym

Gruczoł łzowy (LG) ma dwa typy komórek wyrażających aktynę α mięśni gładkich (αSMA): komórki mioepitelialne (MEC) i perycyty. MEC są pochodzenia ektodermalnego, znajdują się w wielu tkankach gruczołowych, podczas gdy perycyty to komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych pochodzenia endodermalnego. Protokół ten izoluje MEC i perycyty od mysich LG.

Izolacja komórek mioepitelialnych z dorosłych mysich gruczołów łzowych i podżuchwowych

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Długoterminowy system hodowli organoidów 3D ex vitro został stworzony z mysich hepatocytów. Organoidy te mogą być pasażowane i manipulowane genetycznie przez infekcję lentiwirusem o konstrukcji shRNA/ektopowej, transfekcję siRNA i inżynierię CRISPR-Cas9.

Tworzenie i manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów

Metoda trójwymiarowej, bezsurowicowej hodowli komórek macierzystych dorosłych gruczołów łzowych (LG) jest dobrze znana do indukcji tworzenia i różnicowania organoidów LG w komórki groniaste lub przewodowe.

Trójwymiarowy, bezsurowicowy system hodowli komórek macierzystych gruczołów łzowych

Tutaj prezentujemy metodę tworzenia mysiego modelu suchego oka z niedoborem wody wodnej poprzez wycięcie gruczołów łzowych zewnątrzoczodołowych i podoczodołowych oraz ocenę zmian na powierzchni oka w suchym oku z niedoborem wodnistości.

Opracowanie mysiego modelu suchego oka z niedoborem wody wodnistej

W tym filmie przedstawiamy generowanie oraz ekspansję ex vivo ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD40 (CD40-B) z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) poprzez stymulację ligandem CD40 oraz interleukiną-4.

Generowanie ludzkich limfocytów B aktywowanych CD40

Niniejszy protokół demonstruje sposób hodowli zdrowych, niezróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Hodowla i utrzymanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Opisano technikę genetycznego manipulowania komórkami nabłonkowymi w całych embrionalnych gruczołach podżuchwowych myszy (SMG) hodowanych ex vivo za pomocą transferu genów wirusowych. Metoda ta wykorzystuje wrodzoną zdolność nabłonka SMG i mezenchymy do spontanicznej rekombinacji po oddzieleniu i zakażeniu zaczątków nabłonka wektorami adenowirusowymi.

Modyfikacja genetyczna i rekombinacja kultur narządowych gruczołów ślinowych

Poznaj metodę tworzenia organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi w celu badań nad homeostazą i medycyną regeneracyjną. Technika ta umożliwia analizę genetyczną oraz potencjalne zastosowanie terapeutyczne w leczeniu zespołu suchego oka.

Ustalanie, utrzymywanie, różnicowanie, manipulacja genetyczna i przeszczepianie organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi

Przeglądaj więcej filmów