Ustalanie, utrzymywanie, różnicowanie, manipulacja genetyczna i przeszczepianie organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi

Dzięki organoidom gruczołów łzowych można sprawdzić, w jaki sposób niektóre geny kontrolują homeostazę gruczołów łzowych. Dodatkowo organoidy mogą być wykorzystywane w medycynie regeneracyjnej. Główną zaletą technologii organoidów gruczołów łzowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych jest to, że umożliwia ona wzrost i badanie zdrowych i nieprzekształconych komórek nabłonka gruczołów łzowych.

Te organoidy mogą być ostatecznie stosowane w leczeniu pacjentów z zespołem suchego oka. Rozpocznij od przygotowania pożywki i materiału wymaganego do eksperymentu, a następnie połącz wszystkie składniki pożywki trawiącej przed eksperymentem. Wstępnie zwilż skalpele w tym podłożu, aby uniknąć przyklejania się do nich kawałków tkanki.

Wyjmij tkankę gruczołu łzowego myszy z pożywki, umieść ją na szalce Petriego i zmiel za pomocą wstępnie zwilżonych skalpeli. Gdy kawałki tkanki będą mniejsze niż 0,5 milimetra sześciennego, zeskrob je z szalki Petriego skalpelem i przenieś do 15-mililitrowej probówki zawierającej pożywkę wytrawiającą. W przypadku bardzo małej biopsji u człowieka należy umieścić ją bezpośrednio w pożywce trawiącej bez mielenia.

Inkubować 15-mililitrową probówkę z kawałkami tkanek przez maksymalnie 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. W międzyczasie zwęź końcówkę pipety Pasteura w płomieniu i wstępnie zwilż ją w podłożu bazowym. Aby ułatwić proces dysocjacji, pipetować zmieloną mieszaninę w górę iw dół co pięć minut za pomocą wstępnie zwilżonej, zwężonej pipety Pasteura.

Gdy pod mikroskopem widocznych jest wiele pojedynczych komórek i małych grudek, zatrzymaj dysocjację, dodając 10 mililitrów pożywki bazowej. Po odwirowaniu z prędkością 400 g przez pięć minut, usuń supernatant i ponownie zawieś osad w 10 mililitrach podłoża bazowego, aby powtórzyć płukanie i osadzanie w dół komórek. Usuń duże, niestrawione kawałki tkanki i pozostałe włókna kolagenowe, filtrując zmieloną mieszaninę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów.

Wirować eluat z prędkością 400 g przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu ponownie zawieś osad komórkowy w 100 mikrolitrach zimnej macierzy zewnątrzkomórkowej lub ECM dla pojedynczego gruczołu łzowego myszy i 50 mikrolitrów zimnego ECM dla biopsji człowieka, bez tworzenia pęcherzyków. Wysiewaj do 100 mikrolitrów komórek na studzienkę 12-dołkowej płytki zawiesinowej za pomocą P200, aby uzyskać około 20-mikrolitrowe kropelki w studzience.

Umieść płytkę do góry nogami w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 do 30 minut, aby umożliwić zestalenie ECM. Po zestaleniu się ECM dodaj około jednego mililitra pożywki rozprężnej myszy o temperaturze pokojowej na dołek 12-dołkowej płytki. Świeżo przygotuj jeden mililitr ludzkiej pożywki różnicującej zawierającej poszczególne składniki, które indukują wydzielanie przez organoidy gruczołów łzowych.

W zautomatyzowanym mikroskopie poklatkowym w jasnym polu ustaw pozycje, które mają być obrazowane na płycie, przedział czasu wynoszący pięć minut i czas trwania czterech godzin. Upewnij się, że cała kropla ECM jest widoczna w każdej pozycji. Przed rozpoczęciem obrazowania należy usunąć pożywkę hodowlaną z dołków, które mają być obrazowane, bez odsuwania płytki od mikroskopu i zastąpić ją świeżo przygotowanym, dobrze zawieszonym ludzkim podłożem różnicującym zawierającym związki, w tym forskolinę i noradrenalinę.

Jako kontrolę ujemną należy dołączyć studzienkę z odświeżonym podłożem różnicującym. Kliknij przycisk uruchamiania na mikroskopie i przeanalizuj wyniki po czterech godzinach. Po oddzieleniu organoidów, jak wspomniano w tekście, odrzucić supernatant.

Zawiesić ogniwa w 80 mikrolitrach buforu do elektroporacji. W 1,5-mililitrowej probówce przygotuj plazmidy wymagane do eksperymentu. Dodaj plazmidy do komórek i dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół.

Ustaw elektroporator z parametrami impulsu porowego i impulsu przenoszenia. Umieść komórki z plazmidami w kuwecie do elektroporacji. Natychmiast zmierz rezystancję, która powinna wynosić od 0,3 ampera do 0,55 ampera, i natychmiast poddaj się elektropowadze.

Po zakończeniu przenieś komórki do 1,5-mililitrowej probówki i dodaj 400 mikrolitrów buforu do elektroporacji uzupełnionego inhibitorem kinazy Rho. Pozwól komórkom zregenerować się w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie granuluj komórki po 500 g przez pięć minut.

Po odrzuceniu supernatantu umieścić komórki w 200 mikrolitrach ECM. Po zestaleniu dodaj podłoże ekspandujące myszy. W celu przygotowania organoidów należy rozdzielić organoidy ludzkiego gruczołu łzowego na około trzy dni przed dniem przeszczepienia.

Aby wyekstrahować organoidy z ECM, dodaj dyspazę do pożywki hodowlanej, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,125 jednostki na mililitr, i dokładnie ponownie zawieś kropelki ECM, aby je rozbić za pomocą P1000. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Ponownie zawiesić organoidy w 10 mililitrach pożywki zasadowej, aby wypłukać enzym.

Po zagnieżdżeniu komórek w ilości 400 g przez pięć minut, zawieś je ponownie w 50 mikrolitrach zimnej pożywki ekspansyjnej dla ludzi uzupełnionej 5% ECM. Umieścić zawiesinę organoidu na lodzie i natychmiast przystąpić do przeszczepu. W przypadku przeszczepu ortotopowego u myszy należy odessać zawiesinę organoidu za pomocą igły insulinowej.

Kiedy mysz śpi, szybko połóż ją na boku z dostępem do głównego gruczołu łzowego. Wstrzyknąć pięć mikrolitrów zawiesiny organoidowej bezpośrednio przez skórę do gruczołu łzowego. Pozwól myszy dojść do siebie i codziennie oceniaj obecność dyskomfortu związanego z przeszczepem, zwłaszcza w oku.

Po rozwarstwieniu gruczołu łzowego myszy, trawienie enzymatyczne i mechaniczne wytworzyło małe fragmenty tkanek, w tym acini i przewody. W udanym wyprowadzeniu organoidów gruczołów łzowych myszy organoidy torbielowate o średnicy około 500 mikrometrów znaleziono po siedmiu dniach. Ludzkie organoidy gruczołów łzowych rosły jako cysty w ciągu trzech do czterech dni i osiągały pełny rozmiar w ciągu 10 do 14 dni po izolacji tkanek.

Po odpowiednio pięciu dniach i siedmiu dniach w pożywce różnicującej organoidy gruczołów łzowych myszy i człowieka stały się gęstsze. Zastosowanie cyklicznego aktywatora AMP forskoliny lub neuroprzekaźnika noradrenaliny spowodowało obrzęk organoidów w czasie krótszym niż trzy godziny. W udanej elektroporacji wyrosły organoidy odporne na higromycynę.

Rosnące klony organoidów większe niż 300 mikrometrów zostały wybrane przed ich różnicowaniem. Amplifikacja PCR locus Pax6 ukierunkowanego przez przewodnik RNA dała pasmo 367 par zasad dla wszystkich wybranych klonów. Jeden homozygotyczny klon gruczołu łzowego myszy z sześcioma sekwencjonowanymi sekwencjami uzyskano przy użyciu przewodnika RNA ukierunkowanego na Pax6.

Niektóre klony dobrze wyrosły, ale niektóre klony organoidów zostały utracone po zerwaniu lub zaczęły się różnicować. Z 10 wybranych klonów organoidów, siedem wyrosło dobrze. Wszczepienie organoidów potwierdzono miesiąc po wstrzyknięciu organoidów do mysiego gruczołu łzowego poprzez barwienie pod kątem markera specyficznego dla człowieka, ludzkiego antygenu jąderkowego.

Jedną rzeczą, na którą należy zwrócić uwagę, jest to, aby nie trawić nadmiernie tkanki ani organoidów. W przeciwnym razie komórki mogą umrzeć, a to zmniejszy tempo tworzenia się organoidów. Organoidy gruczołów łzowych można analizować histologicznie.

W ten sposób można uzyskać wgląd w ich skład komórkowy.