Name: Opracowanie znacznika PET znakowanego 68galem peptydu D do obrazowania ekspresji programowanego ligandu śmierci 1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę obrazowania PET znakowanego peptydem D do wizualizacji ekspresji PDL-1 w całym organizmie. Technika ta umożliwia nieinwazyjną selekcję pacjentów do terapii blokowania punktów kontrolnych układu immunologicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Non-profit Fundusz Centralnego Instytutu Badawczego Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (nr 2022-RC350-04) oraz Fundusz Innowacji CAMS dla Nauk Medycznych (nr 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 i 2022-I2M-2-002).

Procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie lub Narodowe Instytuty Nauki i Technologii Kwantowej. Eksperymenty na myszach były ściśle przeprowadzane zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych.
1. Synteza peptydów
<ol>
	<li>Pęcznieć 100 mg żywicy 4-metylobenzhydrylaminy (MBHA) (zdolność ładowania 0,37 mmol/g) w 1 ml N-metylo-2-pirolidonu (NMP) przez 30 minut pod łagodnym bulgotaniemN2.</li>
	<li>Przygotuj świeży bufor podstawowy składający się z aminokwasów chronionych Fmoc (5,0 equiv), HCTU (4,9 equiv) i DIPEA (10,0 equiv) w 1 ml NMP i dodaj do żywicy (100 mg). Pozwól, aby reakcja sprzęgania postępowała przez 1,5-2 godziny.</li>
	<li>Przygotować bufor deprotekcyjny składający się z 50% (vol/vol) morfoliny w NMP. Przemyć żywicę (100 mg) 2 x 30 minut 1 ml buforu odbezpieczającego w każdym płukaniu, aby usunąć grupę Fmoc z grupy aminowej. Płukać żywicę dichlorometanem (DCM; 1 ml) przez 1 minutę, usunąć DCM i ponownie przemyć żywicę NMP (1 ml) przez kolejną 1 minutę. Następnie usuń NMP i ponownie umyj żywicę DCM przez 1 min. 
	UWAGA: Wszystkie procedury prania przeprowadza się przy łagodnym bulgotaniu azotu2. Powyższe procedury powtarza się aż do ostatniego aminokwasu.</li>
	<li>W celu dodania kwasu 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctowego (DOTA) do peptydu, należy wstępnie aktywować DOTA chlorowodorkiem N-(3-dimetyloaminopropylo)-N-etylokarbodimidu (EDC·HCl) i N-hydroksysukcynimidem (NHS). Inkubować bufor podstawowy DOTA/EDC·HCl/NHS w stosunku molowym 1:1:1 w dimetylosulfotlenku (DMSO) przez 3 godziny, przy końcowym stężeniu DOTA 1 M. Następnie dodać bufor podstawowy (1 ml) do żywicy (100 mg) i pozostawić reakcję do przebiegu przez 2 godziny z delikatnym bulgotaniemN2. 
	UWAGA: Kwas 1,4,7-triazacyklononano-1,4,7-trioctowy (NOTA) może być również stosowany jako chelator do kompleksowania 68Ga. Te same procedury można zastosować w przypadku sprzężenia NOTA.</li>
	<li>Dokładnie spłucz żywicę od góry za pomocą DCM i jednocześnie zastosuj próżnię, aby usunąć resztki roztworu reakcyjnego. Wypłucz żywicę 3x za pomocą DCM (1,5 ml), a następnie spłucz MeOH (1,5 ml), aby skurczyć żywicę. Umieść żywicę pod azotem na noc lub pod wysoką próżnią przez co najmniej 4 godziny, aż żywica wyschnie.</li>
	<li>Wysuszoną żywicę zawierającą peptydy DPA umieścić w polipropylenowym pojemniku o pojemności 2 ml z zakrętką. Dodać odpowiedni koktajl rozszczepialny (95/2,5/2,5 TFA/TIS/H2O objętości; 1 ml/100 mg żywicy) i szczelnie zamknąć pojemnik za pomocą zakrętki. Delikatnie mieszać reakcję na wytrząsarce orbitalnej w dygestorium w temperaturze 20-25 °C przez 2 h. 
	UWAGA: Kwas trifluorooctowy (TFA) należy przygotować w dygestoriach w odzieży ochronnej, ze względu na jego silnie charakter.</li>
	<li>Usunąć większość TFA przez odparowanie pod azotem w dygestorium. Wytrącić peptydy, dodając eter dietylowy (~1,5 ml/100 mg żywicy).</li>
	<li>Zmieszać mieszaninę w celu rozprowadzenia peptydów i odwirować w temperaturze pokojowej (10 000 × g, 5 min). Ostrożnie wylej rozpuszczalnik z pojemnika. Powtórz kroki 1.7-1.8.</li>
	<li>Pozostałość suszyć na powietrzu w otwartym pojemniku przez 10 minut. Dodać 50% (obj./obj.) wodnego acetonitrylu i wirować przez 1-2 s do rozpuszczenia produktów (1 ml/100 mg żywicy).</li>
	<li>Usuń żywicę, filtrując mieszaninę, a następnie umyj żywicę 2x za pomocą 0,2 ml 50% (obj./obj.) wodnego roztworu acetonitrylu. Wymieszać filtraty do oczyszczania metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Należy użyć następujących warunków HPLC. Kolumna: YMC-Triat-C18 (średnica wewnętrzna 4,6 mm [i.d.], 150 mm, 5 mm); gradient rozpuszczalnika: rozpuszczalnik A-woda dejonizowana; rozpuszczalnik B-acetonitryl (0,1% TFA); czas przepływu: 20 min, z acetonitrylem od 10% do 90%; przepływ: 1 mL/min.</li>
	<li>Zebrane eluenty HPLC zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C i poddać liofilizacji (-50 °C i <1 pa). W celu znakowania promieniotwórczego należy rozpuścić stały peptyd w buforze octanu sodu (100 mM, pH 5,0) w końcowym stężeniu 1 mg/ml jako bufor podstawowy.</li>
</ol>
2. Radioznakowanie 68Ga
UWAGA 68Ga zostało wygenerowane wewnętrznie w Pierwszym Szpitalu w Nankinie (Nanjing, Chiny) przy użyciu generatora 68Ge/68Ga.
<ol>
	<li>Odpipetować 5 μl buforu wyjściowego do 1,5 ml polipropylenowego pojemnika z zakrętką. Dodać 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μL) do pojemnika.</li>
	<li>Wiruj mieszaninę przez 5 s. Zmierz pH za pomocą pasków testowych pH. Doprowadzić pH do 4-4,5 za pomocą NaOH (0,1 M). 
	UWAGA: Odpowiednie pH ma kluczowe znaczenie dla kompleksowania między 68Ga i DOTA.</li>
	<li>Roztwór inkubować w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut. Mieszaninę reakcyjną poddać działaniu radio-HPLC w celu analizy wydajności znakowania radioizotopowego w następujących warunkach: kolumna: YMC-triat-C18 (średnica wewnętrzna 4,6 mm, 150 mm, 5 mm); gradient rozpuszczalnika: rozpuszczalnik A-woda dejonizowana; rozpuszczalnik B-acetonitryl (0,1% TFA); czas przepływu: 20 min, z acetonitrylem od 10% do 90%; natężenie przepływu: 1 ml/min. 
UWAGA: Radioaktywna chromatografia cienkowarstwowa (TLC) może być stosowana jako alternatywne podejście do badania wydajności znakowania radioaktywnego. Sugerowany bufor elucyjny TLC to 0,1 M Na3C6H5O7, pH 4.</li>
</ol>
3. Test stabilności znacznika
<ol>
	<li>Test stabilności znacznika w PBS
	<ol>
		<li>Dodać [68Ga]DPA (10 μL, 3,7 MBq, w NaOAc) do PBS (990 μL). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1, 2 i 4 godziny z lekkim mieszaniem.</li>
		<li>Zebrać 200 μl roztworu w każdym punkcie czasowym. Wstrzyknąć go do radio-HPLC w celu analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stabilność znacznika w surowicy myszy
	<ol>
		<li>Dodaj [68Ga]DPA (10 μL, ~3,7 MBq, w NaOAc) do surowicy myszy (90 μL, świeżo przygotowanej). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1, 2 i 4 godziny z lekkim mieszaniem.</li>
		<li>Zebrać 20 μl roztworu w każdym punkcie czasowym. Dodać MeCN i wodę (100 μL, 1:1, v/v).</li>
		<li>Odwirować mieszaninę przez 10 minut (5 000 × g, 25 °C). Analizować supernatant za pomocą radio-HPLC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza ekspresji PD-L1 za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę, uzupełniając pożywkę RPMI-1640 10% (obj./obj.) płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny (obj./obj.). Ponownie zawiesić komórki U87MG w pożywce hodowlanej i wysiać na 12-dołkowych płytkach o gęstości10-5 komórek/dołek. Umieścić komórki w inkubatorze (5% CO2, 37 °C) i hodować je przez co najmniej 24 godziny, nie zakłócając spokoju.</li>
	<li>Umyj komórki 0,5 ml PBS i dodaj 250 μl trypsyny-EDTA (0,25%). Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze (5% CO2, 37 °C) na 2 minuty.</li>
	<li>Dodaj 1 ml pożywki hodowlanej, aby zatrzymać dysocjację komórek. Dodaj pożywkę do komórek, aby odłączyć je od szalek, pipetując w górę iw dół, a następnie zebrać je do probówek o pojemności 1,5 ml. Odwirowywać komórki przez 5 minut (100 × g).</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS. Odwirowywać komórki przez 5 minut (100 × g). Powtórz ten krok jeszcze raz.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało PD-L1 sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) z 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) do 20 nmol/l. Dodać do komórek i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 5 minut (100 × g), a następnie dwukrotnie przemyć zimnym PBS. Analizuj komórki PD-L1-dodatnie za pomocą cytometru przepływowego i oprogramowania do analizy.</li>
</ol>
5. Immunocytochemia
<ol>
	<li>Umieść komórki U87MG w szklanych szalkach do hodowli komórek (35 mm) o gęstości 2,5 × 105 komórek na dołek. Po osiągnięciu 60% zbiegu należy odessać pożywkę hodowlaną i dodać 1 ml PBS. Delikatnie wstrząśnij kilka razy i aspiruj. Wykonaj krok prania 3x.</li>
	<li>Do potraw dodać 500 μl 4% paraformaldehydu. Umieść komórki w temperaturze pokojowej i utrwal na 30 minut.</li>
	<li>Umyj komórki 3x PBS. Dodać 1 ml 3% BSA (wag./obj., w PBS) i zablokować utrwalone komórki na 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć 3% BSA i bezpośrednio inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-PD-L1 (mAb,1:100, rozcieńczonym w 3% BSA) przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Po zablokowaniu komórek za pomocą BSA nie myć PBS.</li>
	<li>Umyj komórki 3x 3% buforem BSA. Inkubować komórki z przeciwciałem anty-ludzkim IgG Fc sprzężonym z FITC (1:500, rozcieńczonym w PBS) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj komórki 3x PBS. Dodać 0,5 ml DAPI (1 μg/ml) do komórek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przemyj wybarwione komórki 3x PBS i obserwuj za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
6. Eksperyment z wychwytem i hamowaniem komórkowym
<ol>
	<li>Eksperyment z wychwytem komórkowym
	<ol>
		<li>Hoduj komórki U87MG na płytkach 12-dołkowych, aż do osiągnięcia 80% konfluencji. Usuń pożywkę i przemyj komórki 0,5 ml PBS.</li>
		<li>Rozcieńczyć [68Ga]DPA w świeżej pożywce do stężenia 74 KBq/ml. Dodać 0,5 ml rozcieńczonego buforu [68Ga]DPA do każdego dołka.</li>
		<li>Inkubować komórki z [68Ga]DPA w temperaturze 37 °C przez różne okresy czasu (10, 30, 40 i 120 min). Odessać pożywkę za pomocą pipety. Umyj komórki PBS (0,5 ml) trzy razy.</li>
		<li>Dodać roztwór NaOH (0,5 M, 300 μl na studzienkę) w celu lizy komórek. Po 30 s zbierz lepkie lizaty komórkowe w probówkach o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Umyj płytkę dwukrotnie 0,4 ml PBS. Zebrać roztwór myjący do powyższej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Uruchom wbudowany komputer automatycznego licznika gamma; włóż lampy do wbudowanej półki. Po załadowaniu wszystkich próbek na przenośnik należy nacisnąć przycisk START. Wyniki są obliczane w wewnętrznym oprogramowaniu. Odczyt rejestruje skorelowaną z rozpadem liczbę na minutę (CPM) każdej probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konkurencyjny test wiązania
	<ol>
		<li>Hoduj komórki U87MG na płytkach 12-dołkowych, aż do osiągnięcia 80% konfluencji. Usuń pożywkę i przemyj komórki 0,5 ml PBS.</li>
		<li>Rozcieńczyć [68Ga]DPA w świeżej pożywce do stężenia 74 KBq/ml. Rozpuść odpowiednią ilość związków BMS202 w 10% DMSO, aby uzyskać stężenie 10 mM (400 μL).</li>
		<li>Rozcieńczyć 4 μl 10 mM BMS202 w 396 μl PBS, aby uzyskać stężenie 100 μM. Powtórzyć ten krok, aby uzyskać różne stężenia BMS202 (1 μM, 10 nM, 100 pM i 1 pM).</li>
		<li>Dodać 0,5 ml rozcieńczonego buforu [68Ga]DPA do każdego dołka (0,37 MBq na studzienkę). Dodać 5 μl roztworów BMS202 do każdego dołka (trzy dołki dla każdego stężenia). Inkubować komórki w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C przez 120 minut.</li>
		<li>Odessać pożywkę za pomocą pipety. Umyj komórki 3 x 0,5 ml PBS.</li>
		<li>Dodać roztwór NaOH (0,5 M, 300 μl na studzienkę) w celu lizy komórek. Po 30 s zebrać lepkie lizaty komórkowe do probówek o pojemności 1,5 ml. Umyj płytkę 2 x 0,4 ml PBS.</li>
		<li>Zebrać roztwór myjący do powyższej probówki o pojemności 1,5 ml. Włóż probówki do wbudowanej półki automatycznego licznika gamma.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z tymi samymi procedurami, co w kroku 6.1.6.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Obrazowanie PET
UWAGA: Wykonaj obrazowanie PET małych zwierząt, używając mikro skanera PET, który dostarcza 159 poprzecznych przekrojów osiowych oddalonych od siebie o 0,796 mm (od środka do środka), z poziomym polem widzenia 10 cm i osiowym polem widzenia 12,7 cm. Wszystkie dane zebrane w trybie listy są zorganizowane w trójwymiarowe sinogramy. Fourier jest następnie ponownie składany w dwuwymiarowe sinogramy (klatka × min: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).
<ol>
	<li>W tym badaniu wykorzystano samce, 5-8-tygodniowe nagie myszy BALB/C. Zebrać komórki U87MG wykonując kroki 4.1-4.4 i odessać komórki do strzykawki o pojemności 0,5 ml. Podskórnie wstrzyknąć komórki myszom (1 × 106 komórek na guz, dwa guzy na mysz). Monitoruj wzrost guza po wstrzyknięciu, aż objętość guza osiągnie 100-300 mm3.</li>
	<li>Znieczulenie myszy za pomocą 1%-2% (v/v) izofluranu (1 ml/min). Włącz urządzenie grzewcze i utrzymuj legowisko dla zwierząt z PET w temperaturze 37 °C. </li>
	<li>Umieść znieczulone myszy we właściwej pozycji na łóżku zwierzęcym maszyny PET. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu. 
	UWAGA: Trzymaj myszy w pozycji leżącej, aby uniknąć śmierci podczas skanowania. Podczas całego procesu obrazowania należy podać przepływ izofluranu (1,0 ml/min) przez nos za pomocą wstępnie zainstalowanej rurki.</li>
	<li>Dostosuj pozycję legowiska dla zwierząt za pomocą panelu sterowania. Znaczniki należy wstrzyknąć dożylnie przez fabrycznie zainstalowany cewnik do żyły ogonowej.</li>
	<li>Utwórz przepływ pracy skanowania na komputerze hosta przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (patrz Spis materiałów) Utwórz folder badania i ustaw protokół akwizycji zgodnie z protokołem producenta. Wykonuj skanowanie dynamiczne (60 minut dla każdej myszy) na wszystkich myszach w trybie listy 3D.</li>
	<li>Zdefiniuj protokół histogramu i protokół rekonstrukcji zgodnie z protokołem producenta. Użyj filtra Hanninga z odcięciem Nyquista wynoszącym 0,5 cyklu/piksel, aby zrekonstruować dynamiczne obrazy PET (25-30 min i 55-60 min) za pomocą filtrowanej projekcji wstecznej. Generuj obrazy projekcji o maksymalnej intensywności (MIP) dla wszystkich myszy.</li>
	<li>Łączenie protokołów w przepływ pracy i uruchamianie przepływu pracy. Analizuj wynikowe obrazy trójwymiarowe za pomocą oprogramowania, postępując zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Użyj oprogramowania symulacyjnego, aby wybrać interesujące Cię woluminy. Radioaktywność jest korygowana pod kątem rozpadu do czasu wstrzyknięcia i przedstawiana jako procent całkowitej dawki iniekcyjnej na gram tkanki (% ID/g).</li>
</ol>
8. Biodystrybucja ex vivo
<ol>
	<li>Podaj [68Ga]DPA (1,85 MBq/100 μL) nagim myszom z BALB/C noszącym U87MG poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Znieczulić myszy za pomocą 1%-2% (v/v) izofluranu (1 ml / min), a następnie uśmiercić trzy myszy przez zwichnięcie szyjki macicy po wstrzyknięciu przez 5, 30, 60 i 120 min. 
	UWAGA: Osoby demonstrujące tę procedurę powinny być przeszkolone w zakresie technicznych umiejętności zwichnięcia szyjki macicy, aby zapewnić szybką utratę przytomności. Zapewni to, że wszystkie procedury eutanazji w tym eksperymencie zostaną przeprowadzone w sposób humanitarny.</li>
	<li>Po potwierdzeniu śmierci otwórz ścianę klatki piersiowej myszy. Następnie otwórz serce. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml, aby pobrać krew; Wycisnąć krew ze strzykawki do probówki do testu radioimmunologicznego (RIA) (o średnicy 13 mm) do licznika gamma.</li>
	<li>Wytnij główne narządy i guzy i umieść je w probówkach RIA (o średnicy 13 mm) do licznika gamma. Główne narządy obejmują krew ogółem, serce, grasicę, wątrobę, śledzionę, kości, żołądek, nerki, mięśnie, węzły chłonne jelitowe, jelito cienkie, trzustkę, jądra, mózg i płuca. Zważ wszystkie narządy.</li>
	<li>Zmierz radioaktywność w pobranych narządach za pomocą licznika autogamma i skoryguj wartości w fazie rozpadu. Obliczyć procent wstrzykniętej dawki na gram mokrej tkanki (% ID/g).</li>
</ol>
9. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Zbierz tkanki glejaka i umyj je 3x PBS. Umieść świeże chusteczki w 4% paraformaldehydzie i utrwal na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Utrwalone tkanki zanurzyć w parafinie i pokroić je na kawałki o grubości 10 μm. Umieścić skrawki w inkubatorze (60 °C) i inkubować przez 2 godziny. Odwoskować i uwodnić skrawki przez inkubację przez 10 minut każda w następujący sposób: ksylen (dwukrotnie), alkohol bezwodny, 95% alkoholu, 90% alkoholu, 80% alkoholu, 75% alkoholu.</li>
	<li>Umieścić skrawki w 0,01 M roztworze cytrynianu sodu i podgrzać je do temperatury 92-95 °C. Utrzymać temperaturę przez 40 minut, aby uzyskać pobranie antygenu.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworuH2O2(3%) do skrawków i dezaktywować endoperoksydazy przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zablokuj niespecyficzne miejsca poprzez traktowanie 3% BSA przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować skrawki w pierwszorzędowym przeciwciałie anty-PD-L1 (mAb, 1:100, rozcieńczony w 3% BSA) przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Po zablokowaniu za pomocą BSA nie myć PBS.</li>
	<li>Umyj sekcje 3x PBS. Inkubować skrawki z kozim przeciwciałem wtórnym przeciwko królikom znakowanym HRP (1:500, rozcieńczonym w PBS) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj komórki 3x PBS. Dodać 200 μl roztworu roboczego 3,3-diaminobenzydyny (DAB) (roztwór A: roztwór B: roztwór C = 1:1:18) do sekcji i inkubować przez 5 minut w ciemności.</li>
	<li>Umyj sekcje 3x PBS. Dodać 500 μl roztworu hematoksyliny (100%) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyj sekcje wodą przez 30 s. Skrawki umieścić w roztworze różnicującym (75% alkoholu:HCL = 99:1) przez 30 s. Umyj sekcje wodą przez 1 min.</li>
	<li>Odwodnić próbki, sekwencyjnie inkubując je z 75% alkoholem, 80% alkoholem, 90% alkoholem, 95% alkoholem, alkoholem absolutnym i ksylenem (dwukrotnie) (10 min każda). Zamontuj wszystkie sekcje za pomocą żywicy neutralnej i obserwuj je pod mikroskopem optycznym.</li>
</ol>

Nie deklaruje się żadnych sprzecznych interesów.

Krytyczne kroki opisane w tej metodzie obejmują skuteczne znakowanie 68Ga do DPA i wybór odpowiedniego okna czasowego do obrazowania PET, które musi idealnie pasować do wzorca farmakodynamicznego DPA w guzie.
W przeciwieństwie do IHC, obrazowanie PET umożliwia wykrywanie ekspresji PD-L1 w całym ciele w sposób nieinwazyjny, umożliwiając wizualizację każdego dodatniego obszaru w heterogenicznym guzie 6,7. Peptydy wybrano jako ...

Odkrycie białek immunologicznych punktów kontrolnych było przełomem w terapii nowotworów i doprowadziło do znacznych postępów w rozwoju terapii blokady immunologicznego punktu kontrolnego1. Białko programowanej śmierci komórki 1 (PD-1) i ligand programowanej śmierci 1 (PD-L1) są potencjalnymi celami leków z kilkoma przeciwciałami zatwierdzonymi przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA). PD-1 ulega ekspresji przez komórki odpornościowe naciekające nowotwór, takie jak limfocyty T CD4 +, CD8 + i limfocyty T regulatorowe. PD-L1 jest jednym z ligandów PD-1, który ulega nadekspresji w różnych komórkach nowotworowych2,3. Interakcja między PD-1 i PD-L1 inaktywuje PD-1, hamując w ten sposób przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną4. Odkrycia te sugerują, że hamowanie PD-L1 może poprawić efekt zabijania komórek odpornościowych i wyeliminować komórki nowotworowe5. Obecnie immunohistochemia chromogenna (IHC) jest najczęściej stosowanym podejściem do identyfikacji pacjentów, którzy najprawdopodobniej zareagują na terapię immunologicznych punktów kontrolnych6,7. Jednak ze względu na niejednorodną ekspresję PD-L1 w komórkach nowotworowych, wyniki IHC z biopsji nie mogą dostarczyć dokładnych informacji na temat ekspresji PD-L1 u pacjentów8. Poprzednie badania wykazały, że tylko 20%-40% pacjentów uzyskuje długoterminowe korzyści z terapii blokadą immunologicznego punktu kontrolnego1,9,10. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowej metody w celu obejścia wyników fałszywie ujemnych spowodowanych niejednorodną ekspresją tych białek immunologicznych punktów kontrolnych.
Technologia obrazowania molekularnego, taka jak pozytonowa tomografia emisyjna (PET), umożliwia wizualizację całego ciała w czasie rzeczywistym w nieinwazyjny sposób, a tym samym może przewyższyć konwencjonalną metodę IHC11,12,13. Znakowane radioizotopowo przeciwciała, peptydy i małe cząsteczki są obiecującymi znacznikami do monitorowania ekspresji PD-L1 u pacjentów z rakiem14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25. FDA zatwierdziła trzy terapeutyczne przeciwciała monoklonalne PD-L1: awelumab, atezolizumab i durwalumab26. Znaczniki immuno-PET oparte na tych przeciwciałach zostały dobrze udokumentowane27,28,29,30,31,32. Badania kliniczne we wczesnej fazie wykazały ograniczoną wartość dla zastosowań klinicznych ze względu na niekorzystną farmakokinetykę30. W porównaniu z przeciwciałami, peptydy wykazują szybszy klirens krwi i narządów ze zdrowych narządów i mogą być łatwo modyfikowane chemicznie33. Odnotowano wiele peptydów o wysokim powinowactwie do PD-1/PD-L12; WL12 jest zgłoszonym peptydem, który wykazuje specyficzne wiązanie z PD-L134. Doniesiono, że znakowane radioizotopem, [64Cu]WL12, [68Ga]WL12 i [18F]FPyWL12, wykazują wysoką zdolność do celowania w nowotwór specyficzny in vivo, co pozwala na zbieranie wysokiej jakości obrazów ekspresji PD-L1 w nowotworach26,35,36,37. Co więcej, pierwsza ocena znakowanego radioaktywnie WL12 na ludziach wykazała, że [68Ga]WL12 (schelatowany przez NOTA) ma bezpieczny i skuteczny potencjał do klinicznego obrazowania nowotworów38. Ze względu na wysoką hydrofobowość i wysoki wychwyt w zdrowej wątrobie, WL12 ma ograniczone zastosowanie kliniczne. Inne peptydy znakowane radioizotopem, takie jak TPP1 i SETSKSF, które specyficznie wiążą się z PD-L1, również wykazały potencjalną stabilność i swoistość w wizualizacji ekspresji PD-L1 w całym ciele39,40. Jednak niezmodyfikowane peptydy są łatwo degradowane przez proteazy i są szybko metabolizowane przez nerki. Peptydy prawoskrętne(D)-są szeroko stosowane jako skuteczne mediatory, ze względu na słabą stabilność lewoskrętnych (L)-peptydów41,42,43. Peptydy D są hiperodporne na degradację proteolityczną i znacznie wydłużają okres półtrwania metabolizmu. W porównaniu ze swoimi L-odpowiednikami, peptydy D w większości wykazują specyficzne zdolności wiązania44,45,46.
To badanie zaprojektowało nową metodę wykrywania ekspresji PD-L1, opartą na obrazowaniu PET znakowanego 68Ga PD-L1 D-peptydu, antagonisty D-dodekapeptydu (DPA), w modelu myszy z nowotworem47. Stabilność [68Ga]DPA po raz pierwszy badano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i surowicy myszy, po czym zbadano powinowactwo wiązania [68Ga]DPA w guzach z nadekspresją PD-L1. Następnie przeprowadzono obrazowanie PET w modelach ksenoprzeszczepów glejaka, aby potwierdzić, czy [68Ga]DPA jest idealnym znacznikiem PET do monitorowania ekspresji PD-L1 w nowotworach. Połączenie obrazowania PET i DPA nie tylko zapewnia nowe podejście do przezwyciężania wyzwań związanych z niejednorodną ekspresją PD-L1, ale także stanowi podstawę do opracowania radioznaczników na bazie peptydu D.

<table><tbody><tr><td>Kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctowy (DOTA)</td><td>Merck</td><td>60239-18-1</td><td>68Ga&nbsp; chelatacja</td></tr><tr><td>3,3-diaminobenzydyny (DAB) Zestaw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7304-1SET</td><td>Immunohistochemia</td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-PD-L1</td><td>Wuhan Proteintech</td><td>17952-1-ap</td><td>Immunohistochemia: przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>BMS202</td><td>Selleck</td><td>1675203-84-5</td><td>Kompetycyjny test wiązania: inhibitor</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>V900933</td><td>Immunofluorescencyjny : blokowanie&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542</td><td>Immunofluorescencyjny: barwienie jądra</td></tr><tr><td>Dichlorometan (DCM)</td><td>Merck</td><td>34856</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>DIPEA</td><td>Merck</td><td>3439</td><td>Sprzężenie peptydowe</td></tr><tr><td>EDC&middot; HCl</td><td>Merck</td><td>E6383</td><td>Aktywacja DOTA</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099</td><td>Hodowla komórkowa: suplement</td></tr><tr><td>FITC-sprzężone przeciwciało anty-ludzkie IgG Fc</td><td>Biolegend</td><td>409310</td><td>Immunofluorescencyjne: przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty PD-L1 sprzężone z FITC</td><td>Biolegend</td><td>393606</td><td>Cytometria przepływowa: przeciwciało bezpośrednie</td></tr><tr><td>HCTU</td><td>Energy Chemical</td><td>E070004-25g</td><td>Sprzężenie peptydowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw królikowi znakowane HRP</td><td>Servicebio</td><td>GB23303</td><td>Immunohistochemia: przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Hydroksysukcynimid (NHS)</td><td>Merck</td><td>130672</td><td>Aktywacja DOTA</td></tr><tr><td>MeCN</td><td>Merck</td><td>PHR1551</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>Merck</td><td>8.06127</td><td>Fmoc- deprotekcja</td></tr><tr><td>NMP</td><td>Merck</td><td>8.06072</td><td>Solevent</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck</td><td>30525-89-4</td><td>Utrwalanie tkanek</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Hodowla komórkowa: bufor</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>Hodowla komórkowa: suplement</td></tr><tr><td>RIA probówka</td><td>PolyLab</td><td>P10301A</td><td>Jako pojemnik na próbkę tkanki</td></tr><tr><td>RPMI-1640 podłoże</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Hodowla komórkowa: podłoże podstawowe</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Merck</td><td>1.06264</td><td>Sól do buforu</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Hodowla komórkowa: środek dysocjacyjny</td></tr><tr><td>U87MG linia komórkowa</td><td>Procell Nauki przyrodnicze & Technology Co</td><td>CL-0238</td><td>Model komórki</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>68Ge/68Ga</td><td>Isotope Technologies Monachium, ITM</td><td>Nie dotyczy</td><td>Generacja [68Ga]</td></tr><tr><td>Autogamma licznik</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>Wizard2</td><td>Wykrywanie promieniotwórczości</td></tr><tr><td>Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna</td><td>Keyence Obserwacja</td><td></td><td>wyników immunofluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>Becton Dickinson, BD</td><td>LSRII</td><td>Monitorowanie komórek PD-L1 dodatnich</td></tr><tr><td>Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)</td><td>SHIMAZU</td><td>LC-20AT&nbsp;</td><td>Oczyszczanie peptydu DPA</td></tr><tr><td>Skaner PET</td><td>Siemens Medical Solutions</td><td>Inveon MultiModality System Obrazowanie</td><td>PET</td></tr><tr><td>Mikroskopia optyczna</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipse E100</td><td>Obserwacja wyników immunohistochemii</td></tr><tr><td>Syntezator peptydów w fazie stałej</td><td>Promega Vac-Man Laboratoryjny kolektor próżniowy</td><td>LOT#11101</td><td>Synteza peptydu DPA-DOTA</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ASIPro</td><td>Siemens Medical Solutions</td><td>Nie dotyczy</td><td>Analiza wyników PET-CT</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Becton Dickinson, BD</td><td>FlowJo 7.6.1</td><td>Analiza wyników cytometru przepływowego</td></tr><tr><td>Inveon Acquisition Workplace (IAW)</td><td>Siemens Medical Solutions</td><td>Nie dotyczy</td><td>Zarządzanie mechine PET</td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad Prism</td><td>8.0</td><td>Analiza danych&nbsp;</td></tr></tbody></table>

opracowanie znacznika pet znakowanego 68galem peptydu d do obrazowania ekspresji programowanego ligandu śmierci 1

Development of a 68Gallium-Labeled D-Peptide PET Tracer for Imaging Programmed Death-Ligand 1 Expression

Rozwój terapii blokującej immunologiczne punkty kontrolne opartej na białku programowanej śmierci komórki 1 (PD-1)/ligandzie programowanej śmierci 1 (PD-L1) zrewolucjonizował terapie przeciwnowotworowe w ostatnich latach. Jednak tylko część pacjentów reaguje na inhibitory PD-1 / PD-L1 ze względu na niejednorodną ekspresję PD-L1 w komórkach nowotworowych. Ta heterogeniczność stanowi wyzwanie w precyzyjnym wykrywaniu komórek nowotworowych za pomocą powszechnie stosowanego podejścia immunohistochemicznego (IHC). Sytuacja ta wymaga lepszych metod stratyfikacji pacjentów, którzy odniosą korzyści z terapii blokującej immunologiczne punkty kontrolne, w celu poprawy skuteczności leczenia. Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) umożliwia wizualizację ekspresji PD-L1 w całym ciele w sposób nieinwazyjny. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania znakowanych radioaktywnie znaczników w celu wykrywania dystrybucji PD-L1 w nowotworach za pomocą obrazowania PET.
W porównaniu do swoich L-odpowiedników, prawoskrętne (D)-peptydy mają takie właściwości, jak odporność proteolityczna i niezwykle wydłużony okres półtrwania metabolizmu. W badaniu tym opracowano nową metodę wykrywania ekspresji PD-L1 w oparciu o obrazowanie PET 68znakowanego Ga peptydu D ukierunkowanego na PD-L1, antagonistę D-dodekapeptydu (DPA), u myszy z nowotworem. Wyniki wykazały, że [68Ga]DPA może specyficznie wiązać się z guzami z nadekspresją PD-L1 in vivo i wykazał korzystną stabilność, a także doskonałą zdolność obrazowania, co sugeruje, że [68Ga]DPA-PET jest obiecującym podejściem do oceny statusu PD-L1 w nowotworach.

[68Ga]Radioznakowanie DPA i stabilność 
Modelowy peptyd DPA jest skutecznym antagonistą PD-L1. DOTA-DPA uzyskano o czystości &gt;95% i wydajności 68%. Masa DOTA-DPA jest eksperymentalnie obserwowana na poziomie 1 073,3 ([M+2H]2+). 68 RozdziałGal jest uważany za odpowiedni radionuklid do znakowania peptydów do obrazowania PET i dlatego został wybrany do tego badania. Do znakowania radioaktywnego DPA za pomocą 68Ga (okres półt...

To badanie opracowało nieinwazyjną metodę oceny rozkładu programowanego ligandu śmierci 1 w całym ciele, na podstawie obrazowania tomograficznego emisji pozytonów antagonisty D-dodekapeptydu [68Ga]. Technika ta ma przewagę nad konwencjonalną immunohistochemią i poprawia skuteczność identyfikacji odpowiednich pacjentów, którzy odniosą korzyści z terapii blokującej immunologiczne punkty kontrolne.

Opracowanie znacznika PET znakowanego 68galem peptydu D do obrazowania ekspresji programowanego ligandu śmierci 1

The development of immune checkpoint blockade therapy based on programmed cell death-protein 1 (PD-1)/programmed death-ligand 1 (PD-L1) has revolutionized ...

W tej metodzie wykorzystuje się peptyd DPA, znakowany galem-68. Radioznacznik galu-68 do oznaczania DPA umożliwia wizualizację ekspresji PDL-1 w całym organizmie w czasie rzeczywistym w sposób nieinwazyjny. Zastosowanie peptydu D nadaje znacznikowi radiowemu nadmierną odporność na degradację proteolityczną i znacznie wydłuża ich okres półtrwania metabolizmu.W szczególności technika ta może być stosowana do oceny różnych chorób, poddanych odkryciu określonych celów i opracowaniu znaczników radiowych o dobrej kinetyce rozmów telefonicznych. Technika ta może być również stosowana w leczeniu guzów PDL-1 dodatnich podczas znakowania DPA innymi radiowymi nukleotydami, takimi jak lutet-177 i aktyn-225. Procedurę zademonstruje Wu Jiang, badacz z mojego laboratorium.W celu znakowania radioizotopowego antagonisty peptydu d-dodekapeptydu lub DPA, należy odpipetować pięć mikrolitrów przygotowanego buforu podstawowego zawierającego DPA do 1,5 mililitrowego pojemnika polipropylenowego z zakrętką i dodać 400 mikrolitrów trichlorku 68 galu do pojemnika. Mieszaj mieszaninę przez pięć sekund. Zmierzyć pH mieszaniny za pomocą pasków testowych pH i dostosować pH do 4 do 4,5 za pomocą 0,1 molowego wodorotlenku sodu.Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez pięć do 10 minut. Następnie, postępując zgodnie z warunkami wymienionymi w tekście, należy poddać mieszaninę reakcyjną działaniu radiowej HPLC w celu analizy wydajności znakowania radioaktywnego. Aby przetestować stabilność znacznika w PBS, dodaj 10 mikrolitrów DPA znakowanego galem-68 w roztworze octanu sodu do 990 mikrolitrów PBS.Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną, dwie i cztery godziny, z lekkim mieszaniem. Zbierz 200 mikrolitrów roztworu w każdym wspomnianym punkcie czasowym i przeanalizuj go za pomocą radiowej HPLC. Aby przetestować stabilność znacznika w surowicy myszy, dodaj 10 mikrolitrów DPA znakowanego galem-68 w roztworze octanu sodu do 90 mikrolitrów świeżo przygotowanej surowicy myszy i inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną, dwie i cztery godziny z lekkim mieszaniem.Następnie zebrać 20 mikrolitrów roztworu w każdym wspomnianym punkcie czasowym i dodać 100 mikrolitrów mieszaniny wody acetonitrylowej do zebranej podwielokrotności. Odwirować mieszaninę w temperaturze 5 000 G przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Analizować supernatant za pomocą radiowej HPLC.Hoduj komórki U-87 MG na płytkach 12-dołkowych, aż do osiągnięcia 80% konfluencji. Następnie usuń pożywkę i umyj komórki 0,5 mililitra PBS. Rozcieńczyć DPA znakowany galem-68 w świeżej pożywce do stężenia 74 kilobekereli na mililitr.Następnie dodaj 0,5 mililitra rozcieńczonego buforu DPA znakowanego galem-68 do każdej studzienki. Inkubować komórki z DPA znakowanym galem-68 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10, 30, 40 i 120 minut. Po inkubacji odessać pożywkę za pomocą pipety i trzykrotnie przemyć komórki 0,5 mililitra PBS.Następnie dodaj 300 mikrolitrów 0,5 molowego roztworu wodorotlenku sodu na studzienkę, aby zlizować komórki. Po 30 sekundach zbierz lepkie lizaty komórkowe w 1,5 mililitrowych probówkach. Umyj płytkę, dodając dwukrotnie 0,4 mililitra PBS na studzienkę i zbierz roztwór myjący do wspomnianych 1,5 mililitrowych probówek.Uruchom wbudowany komputer automatycznego licznika gamma i włóż lampy do wbudowanej półki. Po załadowaniu wszystkich próbek na przenośnik naciśnij przycisk start. Wyniki są obliczane w wewnętrznym oprogramowaniu, podczas gdy odczyt rejestruje skorelowane liczby zaników na minutę lub CPM każdej probówki.Zbierz komórki U-87 MG zgodnie z protokołem wymienionym w tekście i odessaj komórki do strzykawki o pojemności 0,5 mililitra. Następnie weź myszy BALB/c Nude i wstrzyknij komórki podskórnie, utrzymując liczbę dwóch guzów na mysz. Monitoruj wzrost guza po wstrzyknięciu, aż objętość guza osiągnie od 100 do 300 milimetrów sześciennych.Aby wykonać obrazowanie PET, wstrzyknij znaczniki dożylnie przez wstępnie zainstalowany cewnik do żyły ogonowej. Utwórz przepływ pracy skanowania na komputerze hosta przy użyciu oprogramowania referencyjnego, a następnie utwórz folder badania i ustaw protokół akwizycji zgodnie z wytycznymi producenta. Wykonuj dynamiczne skanowanie za pomocą każdej myszy przez 60 minut w trybie listy 3D.Następnie zdefiniuj protokół histogramu i protokół rekonstrukcji, postępując zgodnie z instrukcją producenta. Użyj filtra Hanninga z odcięciem Nyquista wynoszącym 0,5 cykli na piksel, aby zrekonstruować dynamiczne obrazy PET przez 25 do 30 minut i od 55 do 60 minut przez przefiltrowaną projekcję wsteczną. Generuj obrazy projekcji o maksymalnej intensywności lub MIP dla wszystkich myszy.Podaj DPA znakowany galem-68 do MG U-87 z BALB/c Nagich myszy poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Po eutanazji należy wypreparować ścianę klatki piersiowej zwierzęcia i otworzyć serce. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki pobierz krew i wyciśnij krew ze strzykawki do probówki do radiotestu immunologicznego lub RIA o średnicy 13 milimetrów dla licznika gamma.Wytnij główne narządy i guzy i umieść je w podobnych probówkach RIA dla licznika gamma. Zważ wszystkie główne organy wymienione w tekście. Zmierz radioaktywność w pobranych narządach za pomocą automatycznego licznika gamma i skoryguj wartości.Obliczyć procent wstrzykniętej dawki na gram mokrej tkanki. DPA znakowany galem-68 wykazywał wysokie zanieczyszczenie radiochemiczne. Był bardzo stabilny zarówno w PBS, jak i w surowicy myszy, nie wykazując rozkładu galu-68 ani hydrolizy peptydów po czterogodzinnej inkubacji.Stwierdzono, że około 60% komórek MG U-87 jest zaprogramowanych do śmierci liganda pierwszego lub PDL-1 dodatniego za pomocą cytometrii przepływowej, a barwienie immunofluorescencyjne potwierdziło silną ekspresję PDL-1 w komórkach MG U-87. Komórki MG U-87 wykazywały zależny od czasu wychwyt DPA znakowanego galem-68, który znacznie się zmniejszył po zastosowaniu inhibitora PDL-1, BMS-202, jako środka blokującego. Szacowane powinowactwo wiązania dla BMS-202 wynosiło 43,8 nanomoli na litr, gdy jako konkurent zastosowano DPA znakowany galem-68.Obrazy PET całego ciała wykazały wysoką akumulację DPA znakowanego galem-68 w guzie po 30 i 60 minutach wstrzyknięcia. Równoległy eksperyment wykazał niewielką akumulację DPA znakowanego galem-68 w guzach Bon-1 kontroli negatywnej po 60 minutach od wstrzyknięcia. Co więcej, barwienie immunohistochemiczne ujawniło, że komórki U-87 MG wykazywały znaczną ekspresję PDL-1, ale nie guz Bon-1.Barwienie hematoksyliną i eozyną wykazało podobną morfologię komórek między dwiema tkankami nowotworowymi. Badanie biodystrybucji ex vivo wykazało szybki klirens radioaktywności i krwi w większości analizowanych narządów, w tym w sercu, wątrobie, płucach i mięśniach. Nerka zgromadziła największą ilość radioaktywności, podczas gdy guz wykazywał drugi co do wielkości wychwyt znacznika we wszystkich punktach czasowych.Najważniejszym krokiem jest to, że struktura peptydu D jest inna przy użyciu skutecznej metody znakowania DPA galem-68. Technika ta utorowała drogę do wykorzystania testu PET jako skutecznych radiofarmaceutyków do leczenia różnych nowotworów, zarówno jako znaczników PET, jak i środków diagnostyki radiowej.

development-68gallium-labeled-d-peptide-pet-tracer-for-imaging

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opracowano prostą, jednoetapową syntezę N-sukcynimidylo-4-[18F]fluorobenzoesanu ([18F]SFB) w oparciu o beznawodny, trzyetapowy proces radiochemiczny. Dzięki zastosowaniu ogrzewania mikrofalowego całą procedurę można przeprowadzić w czasie krótszym niż 30 min, lub w 60 min w przypadku dodatkowego oczyszczania za pomocą preparatywnej HPLC. Skorygowane o czas rozpadu wydajności radiochemiczne (RCYs) wynosiły 35-5% (n &gt; 30).

Synteza jednoputowa z wykorzystaniem mikrofal N-succinimidylo-4-[18F]fluorobenzoesanu ([18F]SFB)

Ten film demonstruje technikę wykorzystującą radioimmunokoniugat do obrazowania in vivo guza na modelu mysim. Po wstrzyknięciu radioimmunokoniugatu przeciwciała koniugatu wiążą się ze specyficznym antygenem błonowym na komórkach nowotworowych. Radioznacznik koniugatu emituje pozytony, które oddziałują z sąsiednimi elektronami w celu wytworzenia energii, która jest wykrywana przez skaner pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) w celu stworzenia obrazu guza.

Technika obrazowania PET in vivo do wykrywania guzów w modelu mysim przy użyciu przeciwciał znakowanych radioaktywnie

Bioortogonalna cykloaddycja Dielsa-Aldera została wykorzystana do stworzenia skutecznej i modułowej, pretargetowanej strategii obrazowania PET dla raka. W niniejszym protokole etapy tej metodologii są opisane w kontekście systemu modelowego wykorzystującego przeciwciało ukierunkowane na raka jelita grubego huA33 i radioligand znakowany 64Cu.

Wykorzystanie bioortogonalnej cykloaddycji Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania PET

Przedstawiono tu procedurę izolacji EOB-DTPA i późniejszej kompleksacji z naturalnym Ga(III) i 68Ga, a także dokładną analizę wszystkich związków i badania nad skutecznością znakowania, stabilnością in vitro i współczynnikiem dystrybucji n-oktanol/woda w radioznakowanym kompleksie.

Badania kompleksu Ga(III) EOB-DTPA i jego analogu znakowanego radioizotopowo o masie 68Ga

Po przygotowaniu zmodyfikowanego 64Cu przeciwciała monoklonalnego wiążącego się z transgenicznym receptorem mysich limfocytów T, limfocyty T są znakowane radioaktywnie in vivo, analizowane pod kątem żywotności, funkcjonalności, stabilności znakowania i apoptozy, a następnie adoptycyjnie przenoszone do myszy z reakcją nadwrażliwości typu opóźnionego w drogach oddechowych do nieinwazyjnego obrazowania za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej (PET/CT).

Znakowanie mysich limfocytów za pomocą receptora przeciwciał Cu 64w celu transportu komórek in vivo za pomocą PET / CT

Integrynaα vβ3 jest rodzajem białka adhezyjnego, które ulega silnej ekspresji na aktywowanych komórkach śródbłonka przechodzących angiogenezę. W związku z tym ocena integralności integryny jest bardzo interesująca w onkologii. W tym miejscu przedstawiamy metodę otrzymywania 68radiopeptydów znakowanych Ga oraz metodę oceny jej skuteczności biologicznej.

Przygotowanie peptydu argininowo-glicynowego asparaginianu (RGD) znakowanego 68Ga do angiogenezy

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskania 68Ga domieszkowanych rdzeniem nanocząstek tlenku żelaza poprzez szybką syntezę mikrofalową. Metodologia ta pozwala uzyskać nanocząstki PET/(T1)MRI o skuteczności znakowania radioaktywnego wyższej niż 90% i czystości radiochemicznej 99% w 20-minutowej syntezie.

Synteza nanocząstek tlenku żelaza domieszkowanego rdzeniem 68Ga do podwójnej pozytonowej tomografii emisyjnej /(T1)Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego

Dobrze zróżnicowane guzy neuroendokrynne nadmiernie eksprymują receptory somatostatyny, które mogą być wykorzystane do diagnostyki obrazowej za pomocą radioznakowanego analogu somatostatyny 68Ga-DOTATATE. Protokół ten szczegółowo opisuje znakowanie radioizotopowe 68Ga-DOTATATE, kontrolę jakości, przygotowanie pacjenta i późniejsze obrazowanie PET/CT. Pod uwagę brane jest bezpieczeństwo radiologiczne i ograniczenia czasowe wynikające z krótkiego okresu połowicznego rozpadu wynoszącego 68Ga.

Praktyczny przewodnik po wytwarzaniu i obrazowaniu PET/CT 68GA-DOTATATE w guzach neuroendokrynnych w codziennej praktyce klinicznej

Ta praca opisuje zautomatyzowaną produkcję do 1,7 GBq [68Ga]Ga-FAPI-46 na syntezatorze iPHASE MultiSyn do obrazowania PET białka aktywującego fibroblasty.

Zautomatyzowana radiosynteza [68Ga]Ga-FAPI-46 do rutynowego stosowania klinicznego

Ten artykuł opisuje radiosyntezę, formułowanie, kontrolę jakości nowej sondy znakowanej radioaktywnie (tj. nanoniki NM-02 znakowanej 68Ga) oraz jej zastosowanie do obrazowania PET/CT małych zwierząt w modelu ksenoprzeszczepu.

Radiosynteza, kontrola jakości i obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej małych zwierząt 68nanocząsteczek znakowanych Ga

To badanie opisuje zautomatyzowany proces produkcji [68Ga]Ga-3BP-3940 za pomocą syntezatora GAIA V2, do obrazowania PET białka aktywującego fibroblasty. Przedstawiono również wyniki badań kontroli jakości przeprowadzonych na trzech seriach testowych.

Automatyczne przygotowanie [68Ga]GA-3BP-3940 na module syntezy do obrazowania PET mikrośrodowiska guza

Poznaj metodę obrazowania PET znakowanego peptydem D do wizualizacji ekspresji PDL-1 w całym organizmie. Technika ta umożliwia nieinwazyjną selekcję pacjentów do terapii blokowania punktów kontrolnych układu immunologicznego.

Opracowanie znacznika PET znakowanego ⁶⁸galem peptydu D do obrazowania ekspresji programowanego ligandu śmierci 1

Przeglądaj więcej filmów