Opracowanie znacznika PET znakowanego 68galem peptydu D do obrazowania ekspresji programowanego ligandu śmierci 1
3 lutego 2023
To badanie opracowało nieinwazyjną metodę oceny rozkładu programowanego ligandu śmierci 1 w całym ciele, na podstawie obrazowania tomograficznego emisji pozytonów antagonisty D-dodekapeptydu [68Ga]. Technika ta ma przewagę nad konwencjonalną immunohistochemią i poprawia skuteczność identyfikacji odpowiednich pacjentów, którzy odniosą korzyści z terapii blokującej immunologiczne punkty kontrolne.
W tej metodzie wykorzystuje się peptyd DPA, znakowany galem-68. Radioznacznik galu-68 do oznaczania DPA umożliwia wizualizację ekspresji PDL-1 w całym organizmie w czasie rzeczywistym w sposób nieinwazyjny. Zastosowanie peptydu D nadaje znacznikowi radiowemu nadmierną odporność na degradację proteolityczną i znacznie wydłuża ich okres półtrwania metabolizmu.
W szczególności technika ta może być stosowana do oceny różnych chorób, poddanych odkryciu określonych celów i opracowaniu znaczników radiowych o dobrej kinetyce rozmów telefonicznych. Technika ta może być również stosowana w leczeniu guzów PDL-1 dodatnich podczas znakowania DPA innymi radiowymi nukleotydami, takimi jak lutet-177 i aktyn-225. Procedurę zademonstruje Wu Jiang, badacz z mojego laboratorium.
W celu znakowania radioizotopowego antagonisty peptydu d-dodekapeptydu lub DPA, należy odpipetować pięć mikrolitrów przygotowanego buforu podstawowego zawierającego DPA do 1,5 mililitrowego pojemnika polipropylenowego z zakrętką i dodać 400 mikrolitrów trichlorku 68 galu do pojemnika. Mieszaj mieszaninę przez pięć sekund. Zmierzyć pH mieszaniny za pomocą pasków testowych pH i dostosować pH do 4 do 4,5 za pomocą 0,1 molowego wodorotlenku sodu.
Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez pięć do 10 minut. Następnie, postępując zgodnie z warunkami wymienionymi w tekście, należy poddać mieszaninę reakcyjną działaniu radiowej HPLC w celu analizy wydajności znakowania radioaktywnego. Aby przetestować stabilność znacznika w PBS, dodaj 10 mikrolitrów DPA znakowanego galem-68 w roztworze octanu sodu do 990 mikrolitrów PBS.
Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną, dwie i cztery godziny, z lekkim mieszaniem. Zbierz 200 mikrolitrów roztworu w każdym wspomnianym punkcie czasowym i przeanalizuj go za pomocą radiowej HPLC. Aby przetestować stabilność znacznika w surowicy myszy, dodaj 10 mikrolitrów DPA znakowanego galem-68 w roztworze octanu sodu do 90 mikrolitrów świeżo przygotowanej surowicy myszy i inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną, dwie i cztery godziny z lekkim mieszaniem.
Następnie zebrać 20 mikrolitrów roztworu w każdym wspomnianym punkcie czasowym i dodać 100 mikrolitrów mieszaniny wody acetonitrylowej do zebranej podwielokrotności. Odwirować mieszaninę w temperaturze 5 000 G przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Analizować supernatant za pomocą radiowej HPLC.
Hoduj komórki U-87 MG na płytkach 12-dołkowych, aż do osiągnięcia 80% konfluencji. Następnie usuń pożywkę i umyj komórki 0,5 mililitra PBS. Rozcieńczyć DPA znakowany galem-68 w świeżej pożywce do stężenia 74 kilobekereli na mililitr.
Następnie dodaj 0,5 mililitra rozcieńczonego buforu DPA znakowanego galem-68 do każdej studzienki. Inkubować komórki z DPA znakowanym galem-68 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10, 30, 40 i 120 minut. Po inkubacji odessać pożywkę za pomocą pipety i trzykrotnie przemyć komórki 0,5 mililitra PBS.
Następnie dodaj 300 mikrolitrów 0,5 molowego roztworu wodorotlenku sodu na studzienkę, aby zlizować komórki. Po 30 sekundach zbierz lepkie lizaty komórkowe w 1,5 mililitrowych probówkach. Umyj płytkę, dodając dwukrotnie 0,4 mililitra PBS na studzienkę i zbierz roztwór myjący do wspomnianych 1,5 mililitrowych probówek.
Uruchom wbudowany komputer automatycznego licznika gamma i włóż lampy do wbudowanej półki. Po załadowaniu wszystkich próbek na przenośnik naciśnij przycisk start. Wyniki są obliczane w wewnętrznym oprogramowaniu, podczas gdy odczyt rejestruje skorelowane liczby zaników na minutę lub CPM każdej probówki.
Zbierz komórki U-87 MG zgodnie z protokołem wymienionym w tekście i odessaj komórki do strzykawki o pojemności 0,5 mililitra. Następnie weź myszy BALB/c Nude i wstrzyknij komórki podskórnie, utrzymując liczbę dwóch guzów na mysz. Monitoruj wzrost guza po wstrzyknięciu, aż objętość guza osiągnie od 100 do 300 milimetrów sześciennych.
Aby wykonać obrazowanie PET, wstrzyknij znaczniki dożylnie przez wstępnie zainstalowany cewnik do żyły ogonowej. Utwórz przepływ pracy skanowania na komputerze hosta przy użyciu oprogramowania referencyjnego, a następnie utwórz folder badania i ustaw protokół akwizycji zgodnie z wytycznymi producenta. Wykonuj dynamiczne skanowanie za pomocą każdej myszy przez 60 minut w trybie listy 3D.
Następnie zdefiniuj protokół histogramu i protokół rekonstrukcji, postępując zgodnie z instrukcją producenta. Użyj filtra Hanninga z odcięciem Nyquista wynoszącym 0,5 cykli na piksel, aby zrekonstruować dynamiczne obrazy PET przez 25 do 30 minut i od 55 do 60 minut przez przefiltrowaną projekcję wsteczną. Generuj obrazy projekcji o maksymalnej intensywności lub MIP dla wszystkich myszy.
Podaj DPA znakowany galem-68 do MG U-87 z BALB/c Nagich myszy poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Po eutanazji należy wypreparować ścianę klatki piersiowej zwierzęcia i otworzyć serce. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki pobierz krew i wyciśnij krew ze strzykawki do probówki do radiotestu immunologicznego lub RIA o średnicy 13 milimetrów dla licznika gamma.
Wytnij główne narządy i guzy i umieść je w podobnych probówkach RIA dla licznika gamma. Zważ wszystkie główne organy wymienione w tekście. Zmierz radioaktywność w pobranych narządach za pomocą automatycznego licznika gamma i skoryguj wartości.
Obliczyć procent wstrzykniętej dawki na gram mokrej tkanki. DPA znakowany galem-68 wykazywał wysokie zanieczyszczenie radiochemiczne. Był bardzo stabilny zarówno w PBS, jak i w surowicy myszy, nie wykazując rozkładu galu-68 ani hydrolizy peptydów po czterogodzinnej inkubacji.
Stwierdzono, że około 60% komórek MG U-87 jest zaprogramowanych do śmierci liganda pierwszego lub PDL-1 dodatniego za pomocą cytometrii przepływowej, a barwienie immunofluorescencyjne potwierdziło silną ekspresję PDL-1 w komórkach MG U-87. Komórki MG U-87 wykazywały zależny od czasu wychwyt DPA znakowanego galem-68, który znacznie się zmniejszył po zastosowaniu inhibitora PDL-1, BMS-202, jako środka blokującego. Szacowane powinowactwo wiązania dla BMS-202 wynosiło 43,8 nanomoli na litr, gdy jako konkurent zastosowano DPA znakowany galem-68.
Obrazy PET całego ciała wykazały wysoką akumulację DPA znakowanego galem-68 w guzie po 30 i 60 minutach wstrzyknięcia. Równoległy eksperyment wykazał niewielką akumulację DPA znakowanego galem-68 w guzach Bon-1 kontroli negatywnej po 60 minutach od wstrzyknięcia. Co więcej, barwienie immunohistochemiczne ujawniło, że komórki U-87 MG wykazywały znaczną ekspresję PDL-1, ale nie guz Bon-1.
Barwienie hematoksyliną i eozyną wykazało podobną morfologię komórek między dwiema tkankami nowotworowymi. Badanie biodystrybucji ex vivo wykazało szybki klirens radioaktywności i krwi w większości analizowanych narządów, w tym w sercu, wątrobie, płucach i mięśniach. Nerka zgromadziła największą ilość radioaktywności, podczas gdy guz wykazywał drugi co do wielkości wychwyt znacznika we wszystkich punktach czasowych.
Najważniejszym krokiem jest to, że struktura peptydu D jest inna przy użyciu skutecznej metody znakowania DPA galem-68. Technika ta utorowała drogę do wykorzystania testu PET jako skutecznych radiofarmaceutyków do leczenia różnych nowotworów, zarówno jako znaczników PET, jak i środków diagnostyki radiowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu opracowano nieinwazyjną metodę oceny rozkładu liganda 1 programowanej śmierci (PDL-1) w całym organizmie w czasie rzeczywistym, wykorzystując obrazowanie pozytonową tomografią emisyjną (PET) z użyciem D-peptydu znakowanego galem-68. Technika ta usprawnia identyfikację pacjentów kwalifikujących się do terapii blokowania punktów kontrolnych układu odpornościowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Obrazowanie medyczne
Wstęp
- PDL-1 jest kluczowym celem w immunoterapii nowotworów.
- Konwencjonalne metody, takie jak immunohistochemia, mają swoje ograniczenia.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym może usprawnić dobór pacjentów do terapii.
- D-peptydy oferują zalety w zakresie stabilności i okresu półtrwania metabolicznego.
Cel badania
- Opracowanie nieinwazyjnej metody obrazowania rozkładu PDL-1.
- Usprawnienie identyfikacji pacjentów kwalifikujących się do immunoterapii.
- Wykorzystanie D-peptydów znakowanych Galem-68 do wizualizacji w czasie rzeczywistym.
Zastosowane metody
- Obrazowanie za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET).
- Zastosowanie D-peptydu DPA znakowanego galem-68.
- Ocena ekspresji PDL-1 w różnych jednostkach chorobowych.
- Zastosowanie różnych radionuklidów w leczeniu nowotworów.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja ekspresji PDL-1 w czasie rzeczywistym.
- Wykazane zalety w porównaniu do tradycyjnej immunohistochemii.
- Potencjał zastosowania w różnych typach nowotworów.
- Poprawiona stabilność metaboliczna znacznika w postaci D-peptydu.
Wnioski
- Opracowana metoda stanowi obiecujące narzędzie w terapii nowotworów.
- Umożliwia ona lepszą stratyfikację pacjentów pod kątem terapii inhibitorami punktów kontrolnych układu odpornościowego.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne radionuklidy w celu usprawnienia leczenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Heterogeniczna ekspresja PD-L1 w guzach ogranicza wartość prognostyczną immunohistochemii w stratyfikacji pacjentów w procesach immuno-onkologicznych. Opracowanie znacznika PET w postaci peptydu D znakowanego 68Galem umożliwia nieinwazyjną, ilościową ocenę statusu PD-L1 w całym organizmie, co wspiera podejmowanie bardziej świadomych decyzji go/no-go w przypadku terapii blokadą punktów kontrolnych układu odpornościowego. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną i optymalizację priorytetów w programach onkologii translacyjnej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie PD-L1 jako celu terapeutycznego in vivo z wykorzystaniem ilościowego obrazowania PET.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez potwierdzenie zaangażowania celu oraz jego rozkładu w odpowiednich modelach nowotworowych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu dla produktów w obszarze immunoonkologii.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system obrazowania do oceny dynamiki ekspresji PD-L1 w modelach przedklinicznych.
- Umożliwia powtarzalny, ilościowy pomiar wychwytu znacznika w celu standaryzacji testu.
- Wspiera przesiewanie cząsteczek kandydackich do modulacji PD-L1 z wykorzystaniem punktów końcowych obrazowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje odczyty obrazowania do strategii translacyjnych dotyczących biomarkerów w celu stratyfikacji pacjentów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając nieinwazyjne monitorowanie statusu PD-L1.
- Minimalizuje ryzyko decyzji o dalszym rozwoju projektu poprzez dostarczenie rzetelnych, ilościowych danych na temat ekspresji celu in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda znaczników PET integruje procesy od wczesnego odkrywania po walidację przedkliniczną, łącząc walidację celu, identyfikację związku wiodącego oraz rozwój biomarkerów translacyjnych w obszarze immunoonkologii.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe obrazowanie PET wspiera testowanie hipotez oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych w kierunku celowania w PD-L1.
- Przesiewanie: Ustandaryzowane testy obrazowania umożliwiają powtarzalną ocenę modulacji PD-L1 dla różnych związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty (np. CPM, %ID/g) dla rzetelnego porównania statystycznego warunków doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Nieinwazyjne obrazowanie jest zgodne ze strategiami doboru pacjentów opartymi na biomarkerach.
- Zastosowania korporacyjne: Platforma znacznika PET opartego na D-peptydach może zostać zaadaptowana do innych celów i radionuklidów, wspierając szersze zastosowania w portfolio.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu PD-L1.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne przepływy pracy w obrazowaniu w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz alokację kapitału poprzez dostarczanie praktycznych, ilościowych danych dotyczących biomarkerów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów w dziedzinie immunoonkologii w oparciu o ekspresję celu in vivo.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie radiochemii, obrazowania PET oraz ilościowej analizy danych.
- Wymaga dostępu do 68galu otrzymywanego z cyklotronu lub generatora oraz infrastruktury do obrazowania PET.
- Standaryzacja protokołów obrazowania i analizy danych jest kluczowa dla odtwarzalności wyników między zespołami.
- Adaptacja do innych modeli nowotworowych lub celów może wymagać inżynierii peptydów i walidacji.
- Farmakokinetyka znacznika i rozkład w narządach muszą zostać uwzględnione w celu zapewnienia spójności translacyjnej.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:09
68Ga Radiolabeling
1:58
Tracer Stability Test
3:01
Cellular Uptake Experiment
4:33
Positron Emission Tomography (PET) Imaging
5:50
Ex Vivo Biodistribution
6:42
Results: Analyzing In Vivo Binding Affinity, Stability, and Imaging Capacity of [68Ga]DPA
8:38
Conclusion
![Synteza jednoputowa z wykorzystaniem mikrofal N-succinimidylo-4-[18F]fluorobenzoesanu ([18F]SFB)](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F2755.jpg%3Fv%3D2026-08-21T11%253A49%253A06.000Z&w=384&q=75)
![Zautomatyzowana radiosynteza [68Ga]Ga-FAPI-46 do rutynowego stosowania klinicznego](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F66708.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A24.167Z&w=384&q=75)
