Kwantyfikacja i charakterystyka całego genomu RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza

Epidemiologia oparta na ściekach jest obecnie wykorzystywana do uzupełniania strategii kontroli COVID-19 na całym świecie poprzez wykrywanie wirusowego RNA w próbkach ścieków i identyfikowanie potencjalnych ognisk choroby. Technika ta zapewnia obraz rozpowszechnienia COVID-19 w całej populacji, w tym przypadków bezobjawowych. Pobieranie próbek powietrza jest również ważnym dodatkiem do tego protokołu.

Diagnostyka kliniczna jest nadal najdokładniejszym sposobem radzenia sobie z ogniskami chorób i pandemiami. Jednak ta technika jest nadal przydatna jako jego uzupełnienie. Ta metoda składa się z wielu etapów i punktów krytycznych.

Demonstracja wizualna jest niezbędna, ponieważ pozwoli laboratoriom, które nie są tak zaznajomione z biologią molekularną, na powtórzenie procedury. Na początek zbierz jeden litr 24-godzinnej próbki ścieków kompozytowych. Wlej 20 mikrolitrów mengowirusa do 70 mililitrów próbki.

Po odwirowaniu próbki w temperaturze 700 G przez 10 minut, zagęścić otrzymany supernatant za pomocą odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji z odcięciem 10 kilodaltonów przez odwirowanie. Eluować koncentrat przez odwirowanie w temperaturze 700 G przez 40 minut i odwrócenie położenia urządzenia do ultrafiltracji. Powstały koncentrat należy wykorzystać do ekstrakcji RNA.

Aby pobrać próbki powietrza, przed rozpoczęciem pobierania należy umieścić sterylny stożek w próbniku powietrza. Po zakończeniu pobierania próbek wyekstrahuj RNA z przemytego PBS stożka za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji wirusowego RNA lub metody wewnętrznej. Przygotuj główną mieszankę reakcji dla każdego celu, mengowirusa, genów SARS-CoV-2, N1 i N2 w czystym kapturze w pomieszczeniu do ustawiania odczynników.

Wymieszaj mieszaninę starterów-sondy i enzym, odwracając pięć razy lub wirując impulsowo. Trzymając probówki do mikrowirówek w zimnym stojaku, dozować 15 mikrolitrów mieszanki do probówek do PCR w paski lub 96-dołkowej płytki PCR umieszczonej na stojaku chłodzącym. Przykryj płytkę i przenieś ją do obszaru obchodzenia się z kwasami nukleinowymi.

Delikatnie wirować podwielokrotność wyekstrahowanego RNA przez pięć sekund. Odpipetować pięć mikrolitrów RNA do mieszaniny reakcyjnej, aby uzyskać 25 mikrolitrów i rozpocząć RT-qPCR. Na płytce do PCR odpipetować 16 mikrolitrów każdej próbki do jej pozycji na płytce i dodać cztery mikrolitry pięciokrotnej odwrotnej transkrypcji lub głównej mieszanki RT.

Następnie rozpocznij reakcję PCR. Następnie przygotuj 10 mikromolowych rozcieńczeń każdego zestawu starterów i mieszankę wzorcową dla każdego zestawu starterów. Na nowej płytce do PCR odpipetować 20 mikrolitrów mieszanki wzorcowej, a następnie pięć mikrolitrów próbki RT do każdej mieszanki.

Po przykryciu płytki należy rozpocząć reakcję PCR. Po zakończeniu PCR wiruj płytkę o masie 1000 G przez 15 do 30 sekund. W celu oczyszczenia PCR dodaj 50 mikrolitrów odczynnika na bazie kulek do każdej studzienki i wymieszaj pipetując, aby kontynuować separację magnetyczną.

Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego. Zawiesić każdą osadkę w 15 mikrolitrach wody klasy PCR i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Umieść talerz z powrotem na stojaku magnetycznym i pozwól koralikom granulować się przez dwie minuty.

Następnie ostrożnie odpipetować 15 mikrolitrów supernatantu z każdej próbki na nową płytkę PCR. Następnie, w celu przygotowania biblioteki, dodaj 1,75 mikrolitra buforu reakcyjnego z zestawu do przygotowania biblioteki DNA i 0,75 mikrolitra mieszanki enzymów do każdej próbki. Krótko zakręć zakrytą płytką i wiruj w dół z prędkością 1000G przez 15 do 30 sekund.

Inkubować przez pięć minut w temperaturze 21 stopni Celsjusza i pięć minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Odpipetować trzy mikrolitry wody klasy PCR dla każdej próbki na nową płytkę PCR. Dodać 0,75 mikrolitra przygotowanych próbek i 1,25 mikrolitra kodów kreskowych w celu przygotowania biblioteki sekwencjonowania.

Następnie dodać pięć mikrolitrów głównej mieszanki ligazy DNA T4 i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Po odwirowaniu płytki w wirówce inkubować płytkę w temperaturze 21 stopni Celsjusza przez 20 minut, a w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po zebraniu wszystkich próbek dodaj 192 mikrolitry odczynnika na bazie kulek do puli w celu oczyszczenia PCR.

Dobrze wymieszać przez pipetowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym. Poczekaj, aż supernatant się oczyści i utworzy się granulka kulki.

Wyjmij supernatant i probówkę ze stojaka magnetycznego. Dodać 700 mikrolitrów buforu krótkich fragmentów lub SFB i wymieszać pipetując. Umieść rurkę z powrotem na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż utworzy się granulka, a płyn się usunie.

Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Dodać 35 mikrolitrów wody klasy PCR do probówki, wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i pozwól, aby koraliki się osadzały, a płyn oczyścił.

Odpipetować 35 mikrolitrów supernatantu do nowej probówki. Następnie należy przygotować mieszaninę reakcyjną podwiązania adaptera zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wymieszać 20 mikrolitrów odczynnika na bazie kulek z mieszanką reakcyjną ligacji w celu oczyszczenia PCR i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż utworzy się granulka kulki, a supernatant stanie się bezbarwny. Ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie. Wymieszaj 125 mikrolitrów SFB z rurką i umieść ją z powrotem na stojaku magnetycznym, aby oddzielić koraliki.

Gdy ciecz stanie się klarowna, wyrzucić supernatant i powtórzyć dodawanie SFB, jak pokazano wcześniej. Pozostaw rurkę na stojaku magnetycznym otwartą na 30 sekund. Dodać 15 mikrolitrów buforu elucyjnego i dobrze wymieszać przez pipetowanie.

Po krótkim odwirowaniu i inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut, umieść na stojaku magnetycznym na dwie minuty. Odpipetować 15 mikrolitrów supernatantu do nowej probówki o niskim poziomie wiązania w celu zmierzenia stężenia za pomocą zestawu do fluorometrycznego oznaczania ilościowego DNA. Następnie włóż komórkę przepływową do urządzenia do sekwencjonowania DNA i RNA w czasie rzeczywistym.

Włóż końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i ustawionej na 200 mikrolitrów do portu zasysającego. Obróć pokrętło regulacji głośności, aby zwiększyć głośność, aż zobaczysz płyn w końcówce, a następnie wyrzuć końcówkę. Dodaj 800 mikrolitrów mieszanki gruntującej do portu zalewania bez pęcherzyków i odczekaj pięć minut.

Odpipetować 200 mikrolitrów biblioteki wymieszać z portem zasysającym. Zamknij port pokrywy i port zalewania. Rozpocznij eksperyment sekwencjonowania w oprogramowaniu i wybierz Base Calling On.Ta metoda wykryła i określiła ilościowo RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza.

Próbki ścieków miały odchylenie standardowe od 1,91% do 13,98% wśród potrójnych próbek i wahały się od 3,05 razy 10 do 3 do 2,83 razy 10 do ośmiu kopii genów na litr. Próbki powietrza wahały się od 6,17 razy 10 do 3 do 5,48 razy 10 do dziewięciu, z odchyleniem standardowym w duplikatach od 0,54% do 10,95%Jak opisano w niniejszym protokole, próbki zostały zsekwencjonowane, a przykład wyników trzech zsekwencjonowanych próbek podsumowano tutaj. We wszystkich trzech próbkach linia BA.5.

x zostało przypisane jako najbardziej rozpowszechnione przez narzędzie Freyja. Koncentracja próbek ścieków jest kluczowym etapem, ponieważ wirusowe RNA jest obecne w ściekach w niskich stężeniach. Dlatego ten krok ma fundamentalne znaczenie dla dokładnego wykrywania i kwantyfikacji.

Procedura ta może być dostosowana poprzez zastosowanie różnych starterów w protokole RT-qPCR, które mają być używane do wykrywania i ilościowego oznaczania innych czynników zakaźnych. Technika ta pozwoliła dokładnie określić ilościowo obecność SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza. Różne patogeny mogą być wykrywane i określane ilościowo z różnych lokalizacji.