Name: Kwantyfikacja i charakterystyka całego genomu RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji RNA SARS-CoV-2 w ściekach i powietrzu oraz sekwencjonowania całego genomu. Technika ta wspiera epidemiologię opartą na ściekach i ocenę ryzyka ekspozycji na aerozole.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wykonana dzięki wsparciu finansowemu Rządu Regionalnego Kastylii i León oraz programu FEDER (projekty CLU 2017-09, UIC315 i VA266P20).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały opublikowane w innym miejscu i zawierają niewielkie modyfikacje względem metod oryginalnych.
1. Pobieranie ścieków i wstępne przetwarzanie próbek
UWAGA: Ze względu na niskie stężenia RNA SARS-CoV-2 w próbkach środowiskowych, przeprowadzenie etapu zagęszczania jest kluczowe dla skutecznej detekcji33,34,35. Opisana tutaj metoda jest pierwszą raportowaną metodą detekcji SARS-CoV-2 w ściekach36.
<ol>
	<li>Pobieranie i zagęszczanie próbek ścieków
	<ol>
		<li>Pobrać 1 L złożonej próby ścieków z 24 h. Próbkę przechowywać w temperaturze 4 °C i przystąpić do protokołu w ciągu 24 h.</li>
		<li>Uhomogenizować próbkę, delikatnie wstrząsając butelką. Odlać 70 mL do probówki wirówki o pojemności 100 mL lub podzielić próbkę do dwóch probówek wirówki po 50 mL.</li>
		<li>Dodać 20 µL mengowirusa (3,2 x 103 kopii/µL) do 70 mL każdej próbki jako kontrolę wewnętrzną procesu zagęszczania. Alternatywnie, dodać 10 µL mengowirusa (3,2 x 103 kopii/µL) do każdej probówki wirówki 50 mL.</li>
		<li>Uhomogenizować próbkę i wirować przy 700 x g przez 10 min, aby usunąć duże cząstki i organizmy (osad).</li>
		<li>Uzyskany supernatant poddać zagęszczaniu za pomocą urządzeń do ultrafiltracji odwirygowej z odcięciem 10 KDa, wirując przy 4 000 x g przez 40 min w temperaturze 4 °C. Eluować koncentrat, wirując przy 700 x g przez 40 min po odwróceniu urządzenia do ultrafiltracji.</li>
		<li>Zmierzyć objętość otrzymanego koncentratu. Objętość będzie się różnić w zależności od ilości ciał stałych w próbce, które zapychają filtry wirówki. W niniejszym badaniu uzyskane objętości koncentratu wynosiły od 200 do 1 200 µL.</li>
		<li>Uzyskany koncentrat wykorzystać do ekstrakcji RNA przy użyciu zestawu komercyjnego lub metody wewnętrznej. W przypadku próbek użytych w tym badaniu zastosowano specjalistyczny komercyjny zestaw do ekstrakcji viralnego RNA z objętością elucji 50 µL.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie wyekstrahowanego RNA za pomocą fluorometrycznego zestawu do ilościowego oznaczania RNA. Podzielić wyekstrahowane RNA na alikwoty i zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy. 
		UWAGA: Dla każdego zestawu procedur izolacji RNA należy dołączyć negatywną kontrolę izolacji (NCI), zawierającą wyłącznie bufory, w celu wykrycia ewentualnego zanieczyszczenia podczas ekstrakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek powietrza za pomocą kompaktowego próbnika powietrza Coriolis
	<ol>
		<li>Wybrać strategię pobierania próbek zgodnie z celem badawczym, definiując częstotliwość oraz miejsca poboru próbek.</li>
		<li>Ustawić szybkość przepływu w próbniku powietrza (w tym przypadku 50 L/min przez 30 min). Należy pamiętać, że szybkość przepływu przekraczająca 200 L/min może degradować viralne RNA, dlatego zaleca się stosowanie przepływu poniżej 200 L/min.</li>
		<li>Przed rozpoczęciem pobierania umieścić sterylny stożek w próbniku powietrza, uruchamiając go impulsem startowym. Po zakończeniu pobierania dodać 5-15 mL sterylnego roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) do stożka. Delikatnie wymieszać na wortexie lub wstrząsnąć próbką ręcznie przez 15 s. Próbki przechowywać do 24 h w temperaturze 4 °C lub w temperaturze -80 °C w probówkach kriogenicznych.</li>
		<li>Można przeprowadzić opcjonalny etap zagęszczania. Stożki należy czyścić i odkażać po każdym eksperymencie za pomocą wybielacza.</li>
		<li>Wyekstrahować RNA przy użyciu zestawu komercyjnego lub metody wewnętrznej. W przypadku próbek w tym badaniu zastosowano specjalistyczny komercyjny zestaw do ekstrakcji viralnego RNA z objętością elucji 50 µL.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie wyekstrahowanego RNA za pomocą fluorometrycznego zestawu do ilościowego oznaczania RNA. Podzielić wyekstrahowane RNA na alikwoty i zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy. 
		​UWAGA: Dla każdego zestawu procedur izolacji RNA należy dołączyć negatywną kontrolę izolacji (NCI), zawierającą wyłącznie bufory, w celu wykrycia ewentualnego zanieczyszczenia podczas ekstrakcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ilościowe oznaczanie RNA SARS-CoV-2 za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)
UWAGA: Poniższy protokół jest zgodny z panelem diagnostycznym RT-PCR dla nowego koronawirusa z 2019 roku (2019-nCoV) opracowanym przez CDC37. Należy podzielić mieszaninę starterów i sond na kilka alikwotów, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania.
<ol>
	<li>Przygotować mastermix reakcyjny dla każdego celu (mengowirus; SARS-CoV-2 [geny N1 i N2]) zgodnie z Tabelą 1, w czystym dygestorium w pomieszczeniu do przygotowania odczynników. Pomieszać mieszaninę starterów/sond i enzym poprzez pięciokrotne odwracanie probówek. Alternatywnie, lekko wymieszać mieszaninę starterów/sond i enzym w wstrząsarce typu vortex pięć razy. 
	UWAGA: Wszystkie odczynniki należy utrzymywać w niskiej temperaturze podczas przygotowania i użytkowania. Aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania, zdecydowanie zaleca się mrożenie w alikwotach.</li>
	<li>Odwirować (1 000 x g przez 15-30 s) probówki, aby zebrać zawartość na dnie, a następnie umieścić je w zimnym statywie lub w lodzie.</li>
	<li>Oznaczyć probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL dla każdego celu. Do każdej probówki dodać wymaganą ilość każdego odczynnika (objętość na jedną reakcję pomnożona przez liczbę reakcji, w tym niezbędne kontrole). Pomieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie odwirować przez 5 s, aby zebrać zawartość na dnie.</li>
	<li>Przechowywać probówki w zimnym statywie i rozdać po 15 µL do paskowych probówek PCR lub na płytkę 96-dołkową w statywie chłodzącym. Przykryć płytkę i przenieść ją do strefy manipulacji kwasami nukleinowymi (przechowując ją w statywie chłodzącym).</li>
	<li>Rozmrozić alikwot wyekstrahowanego RNA i delikatnie wymieszać w wstrząsarce typu vortex przez 5 s. Do każdego dołka reakcyjnego lub probówki zawierającej wcześniej przygotowany mastermix pipetować 5 µL RNA (dodatkowo 5 µL kontroli bez matrycy [NTC], negatywnej kontroli izolacji [NCI] oraz kontroli pozytywnej [PC]). Często zmieniać rękawiczki w razie potrzeby, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej.</li>
	<li>Przykryć całą płytkę reakcyjną lub probówki i delikatnie wymieszać w wstrząsarce typu vortex. Odwirować (1 000 x g przez 15-30 s) płytkę lub probówki PCR.</li>
	<li>Rozpocząć reakcję RT-qPCR o objętości 25 µL z następującymi warunkami cyklicznymi: odwrotna transkrypcja w 45 °C przez 10 min; aktywacja polimerazy w 95 °C przez 10 min; 45 cykli denaturacji w 95 °C przez 15 s oraz przyłączania/elongacji w 60 °C przez 45 s.</li>
	<li>Obliczyć wydajność odzysku kontroli mengowirusa zgodnie z opisem Conte i wsp.38: 
	<img alt="wzór na wydajność odzysku mengowirusa; równanie obliczania kopii genomowych; zastosowanie badawcze" src="/files/ftp_upload/65053/65053eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> × 100</li>
</ol>
3. Sekwencjonowanie wariantów w ściekach i analiza danych
UWAGA: Opisany protokół jest zmodyfikowaną procedurą opracowaną przez Quick i współpracowników39,40. Wykorzystuje on dwa zestawy starterów do amplifikacji genomu SARS-CoV-2 metodą PCR tiling – startery ARTIC oraz startery VarSkip. Zastosowanie kombinacji starterów ma na celu zapewnienie optymalnego pokrycia genomu oraz zminimalizowanie ryzyka, że nowe mutacje spowodują niepowodzenie amplifikacji z użyciem starterów jednego typu. Ogólnie protokół dzieli się na trzy etapy: odwrotną transkrypcję (RT) i generowanie amplikonów, przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania oraz sekwencjonowanie i analizę danych.
<ol>
	<li>Odwrotna transkrypcja i generowanie amplikonów
	<ol>
		<li>Należy upewnić się, że próbki wejściowe mają znaną wartość progu cyklu (Ct) qPCR, aby poprawnie rozcieńczyć je w wodzie klasy PCR. Wartość Ct uzyskuje się podczas kwantyfikacji metodą qPCR. Rozcieńczenia są następujące: jeśli wartość Ct wynosi 12-15, rozcieńczyć próbki 1:100; jeśli wartość Ct wynosi 15-18, rozcieńczyć próbki 1:10; jeśli wartość Ct wynosi 18-35, nie rozcieńczać próbki. Próbki o wartości Ct powyżej 35 mają duże prawdopodobieństwo niepowodzenia reakcji.</li>
		<li>Na płytkę PCR nanieść pipetą 16 µL każdej próbki na odpowiadające jej miejsce na płytce. Dodać 4 µL mastermixu do odwrotnej transkrypcji (RT) (5x). Przykryć płytkę i rozpocząć reakcję PCR w następujących warunkach: 25 °C przez 2 min, 55 °C przez 20 min oraz 95 °C przez 1 min.</li>
		<li>Przygotować rozcieńczenia 10 µM każdego zestawu starterów (ARTIC pool A i pool B oraz VarSkip pool A i pool B). Przygotować mastermix dla każdego zestawu starterów (ARTIC zestaw A i B oraz VarSkip zestaw A i B) zgodnie z Tabelą 2. W wyniku tego powstaną cztery mastermixy.</li>
		<li>Na nową płytkę PCR nanieść pipetą 20 µL mastermixu do każdego odpowiedniego dołka. Dodać 5 µL próbki RT do każdej mieszaniny. 
		UWAGA: Każda próbka będzie miała cztery mieszaniny reakcyjne: ARTIC pool A i B oraz VarSkip pool A i B.</li>
		<li>Przykryć płytkę i rozpocząć reakcję PCR w następujący sposób: aktywacja polimerazy przy 98 °C przez 30 s; 35 cykli denaturacji przy 98 °C przez 15 s oraz annealingu/elongacji przy 65 °C przez 4 min. Odwirować płytkę (1 000 x g przez 15-30 s). Połączyć pule reakcyjne ARTIC oraz oddzielnie połączyć pule reakcyjne VarSkip. Każda próbka będzie miała dwie reakcje amplikonowe o objętości 50 µL.</li>
		<li>Dodać 50 µL odczynnika do oczyszczania PCR opartego na kuletkach do każdego dołka i dobrze wymieszać poprzez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. 
		UWAGA: Przed każdym użyciem należy energicznie wymieszać odczynnik do oczyszczania PCR, aby resuspenderć kuletki.</li>
		<li>Umieścić płytkę na statywie do separacji magnetycznej i poczekać, aż kuletki utworzą pellet, a ciecz stanie się przejrzysta (~5 min). Odessać i odrzucić nadsącz.</li>
		<li>Utrzymując płytkę PCR na statywie magnetycznym, dodać 200 µL 80% etanolu do każdej próbki, nie dotykając pelletu kuletek. Usunąć etanol.</li>
		<li>Powtórzyć poprzedni krok. Pozostawić płytkę na statywie magnetycznym bez przykrycia przez 30 s, aby etanol odparował.</li>
		<li>Zdjąć płytkę ze statywu magnetycznego i dodać 15 µL wody klasy PCR do każdej próbki. Resuspenderć pellet poprzez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min.</li>
		<li>Umieścić płytkę ponownie na statywie magnetycznym i pozwolić kuletkom opaść na dno (2 min). Ostrożnie nanieść pipetą 15 µL nadsączu z każdej próbki na nową płytkę PCR.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie każdej próbki za pomocą fluorometrycznego zestawu do kwantyfikacji RNA. Do następnego kroku przenieść około 50 ng każdej próbki w 12,5 µL. W razie potrzeby rozcieńczyć próbkę w wodzie klasy PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie biblioteki
	<ol>
		<li>Dodać 1,75 µL buforu reakcyjnego z zestawu do przygotowania bibliotek DNA Illumina oraz 0,75 µL mieszaniny enzymów do każdej próbki. Przykryć płytkę, krótko wymieszać w wortexie i odwirować (1 000 x g przez 15-30 s). Inkubować w temperaturze 21 °C przez 5 min oraz 65 °C przez 5 min.</li>
		<li>Na nowej płytce PCR nanieść pipetą 3 µL wody klasy PCR dla każdej próbki. Dodać 0,75 µL przygotowanych próbek, 1,25 µL kodów kreskowych (barcodes) do przygotowania biblioteki sekwencyjnej oraz 5 µL mastermixu ligazy DNA T4. Dobrze wymieszać poprzez pipetowanie, krótko odwirować (1 000 x g przez 15-30 s) w wirówce i inkubować w temperaturze 21 °C przez 20 min oraz 65 °C przez 10 min. 
		UWAGA: W przypadku użycia mniej niż 25 próbek należy podwoić wszystkie objętości w tym kroku.</li>
		<li>Połączyć wszystkie próbki, dodając 10 µL każdej próbki do tej samej probówki o niskim wiązaniu (low-binding). Przenieść 480 µL do następnego kroku.</li>
		<li>Dodać 192 µL odczynnika do oczyszczania PCR opartego na kuletkach do puli i dobrze wymieszać poprzez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
		<li>Umieścić probówkę na statywie magnetycznym i poczekać, aż nadsącz stanie się przejrzysty, a kuletki utworzą pellet. Usunąć nadsącz. Zdjąć probówkę ze statywu magnetycznego.</li>
		<li>Dodać 700 µL buforu do krótkich fragmentów (SFB) i wymieszać poprzez pipetowanie. Umieścić ponownie na statywie magnetycznym i poczekać, aż utworzy się pellet, a ciecz stanie się przejrzysta (~5 min). Odessać i odrzucić nadsącz.</li>
		<li>Powtórzyć poprzedni krok. Pozostawić probówkę na statywie magnetycznym. Dodać 100 µL 80% etanolu, nie dotykając kuletek. Odessać etanol i pozwolić kuletkom wyschnąć przez 30 s. 
		UWAGA: Nie dopuścić do nadmiernego wysuszenia kuletek.</li>
		<li>Zdjąć probówkę ze statywu magnetycznego i dodać 35 µL wody klasy PCR. Wymieszać poprzez pipetowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min. Umieścić probówkę na statywie magnetycznym i pozwolić kuletkom opaść na dno, a cieczy stać się przejrzystą. Przenieść 35 µL nadsączu do nowej probówki.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie RNA połączonej biblioteki. Nanieść objętość potrzebną do uzyskania ilości 30-50 ng RNA i dopełnić wodą klasy PCR do końcowej objętości 30 µL.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcji ligacji adapterów: 30 µL połączonej biblioteki, 5 µL Adapter Mix II, 10 µL buforu do reakcji ligacji (5x) oraz 5 µL ligazy DNA T4. Wymieszać poprzez pipetowanie i odwirować (1 000 x g przez 15-30 s). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
		<li>Dodać 20 µL odczynnika do oczyszczania PCR opartego na kuletkach i wymieszać poprzez pipetowanie. Inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umieścić probówkę na statywie magnetycznym i poczekać, aż utworzy się pellet kuletek, a nadsącz stanie się bezbarwny. Ostrożnie odessać i odrzucić nadsącz.</li>
		<li>Zdjąć ze statywu magnetycznego i dodać 125 µL SFB. Wymieszać poprzez pipetowanie i ponownie umieścić na statywie magnetycznym w celu oddzielenia kuletek. Gdy ciecz stanie się przejrzysta, odessać i odrzucić nadsącz.</li>
		<li>Powtórzyć poprzedni krok. Pozostawić probówkę otwartą na statywie magnetycznym przez 30 s, aby odparowała część pozostałej cieczy.</li>
		<li>Zdjąć probówkę ze statywu magnetycznego i dodać 15 µL buforu do elucji. Dobrze wymieszać poprzez pipetowanie i krótko odwirować (1 000 x g przez 15-30 s). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Umieścić na statywie magnetycznym na 2 min.</li>
		<li>Przenieść 15 µL nadsączu do nowej probówki o niskim wiązaniu. Jest to końcowa biblioteka. Zmierzyć stężenie za pomocą fluorometrycznego zestawu do kwantyfikacji DNA. 
		UWAGA: W następnym kroku wymagane jest 12 µL. Jeśli stężenie jest bardzo wysokie i potrzeba mniej niż 12 µL biblioteki, dopełnić do 12 µL odczynnikiem buforu do elucji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie komórki przepływowej i sekwencjonowanie
	<ol>
		<li>Włożyć komórkę przepływową (R9.4.1) do urządzenia do sekwencjonowania DNA i RNA w czasie rzeczywistym.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę startową (priming mix), dodając 30 µL odczynnika flush tether (FLT) do probówki z odczynnikiem buforu płuczącego (FB). Wymieszać w wortexie i odwirować (1 000 x g przez 15-30 s).</li>
		<li>Otworzyć pokrywę portu startowego. Używając pipety 1 000 µL ustawionej na 200 µL, włożyć końcówkę do portu startowego. Obracać pokrętło ustawiania objętości i zwiększać ją, aż w końcówce pojawi się ciecz. Wyrzucić końcówkę. 
		UWAGA: Obracać pokrętło tylko do momentu, aż w końcówce pojawi się kilka µL cieczy. Pobranie większych ilości mogłoby uszkodzić komórkę przepływową.</li>
		<li>Powoli dodać 800 µL mieszaniny startowej do portu startowego, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Odczekać 5 min.</li>
		<li>W tym czasie przygotować biblioteki do ładowania. Wymieszać 37,5 µL buforu do sekwencjonowania, 25,5 µL buforu do ładowania i 12 µL biblioteki. 
		​UWAGA: Wymieszać bufor do ładowania przed pipetowaniem. Kuletki w tym odczynniku osiadają bardzo szybko.</li>
		<li>Otworzyć pokrywę portu. Pipetować 200 µL mieszaniny startowej do portu startowego. 
		UWAGA: Podczas pipetowania do portu startowego przy otwartej pokrywie można zauważyć małe krople wypływające z portu próbkowego. Pipetować wystarczająco wolno, aby port próbkowy mógł wessać krople bez ich przelania.</li>
		<li>Przed załadowaniem przygotowanej biblioteki dobrze wymieszać ją poprzez pipetowanie. Używając pipety 100 µL ustawionej na 75 µL, pobrać bibliotekę i nanosić kropla po kropli do portu próbkowego. Nie dotykać portu i poczekać, aż każda kropla zostanie wchłonięta do portu przed nałożeniem kolejnej, aby uniknąć przelania cieczy.</li>
		<li>Zamknąć pokrywę portu oraz port startowy. Uruchomić oprogramowanie i rozpocząć eksperyment sekwencjonowania. Wybrać opcję basecalling On. W przypadku biblioteki z 96 zmuksowanymi próbkami 10-12 h sekwencjonowania jest zazwyczaj wystarczające do wygenerowania odpowiedniej ilości danych. 
		UWAGA: Za pomocą oprogramowania można wprowadzić arkusz próbek w formacie .csv. Arkusz próbek wymaga następujących danych: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code oraz kit. Wymagane jest ID komórki przepływowej (podane z boku komórki przepływowej) wraz z użytym zestawem. Dla sugerowanego protokołu należy wybrać zestaw LSK109.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych sekwencyjnych
	<ol>
		<li>Wprowadzić skompresowane odczyty fastq do przepływu pracy wf-artic41. Uruchomić przepływ pracy oddzielnie dla dwóch różnych schematów starterów (ARTIC/V4.1 oraz NEB-VarSkip/v1a). Dla każdej próbki zostaną utworzone dwa pliki „. primertrimmed.rg.sorted.bam”.</li>
		<li>Połączyć pliki BAM w jeden plik za pomocą komendy „samtools merge”42. Wprowadzić połączony plik BAM do narzędzia Freyja, pozostawiając ustawienia domyślne, aby odzyskać względne obfitości linii43.</li>
		<li>Aby utworzyć plik FASTA, wprowadzić połączony plik BAM do narzędzi „samtools mpileup” i „ivar” z domyślnymi ustawieniami44,45. Do wyznaczania mutacji załadować plik FASTA do narzędzia Nextclade46,47.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów ekonomicznych ani innych konfliktów interesów.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe drobnoustrojów i wirusów za pomocą metod (RT-)qPCR zyskało powszechną akceptację ze względu na ich niezwykłą czułość. Techniki te napotykają jednak wiele wyzwań podczas analizy próbek środowiskowych. Próbki ścieków zawierają mnóstwo substancji hamujących, które mogą zniekształcać pomiary i generować mylące wyniki. Aby poradzić sobie z tymi ograniczeniami i zwiększyć precyzję, opracowano, zaprojektowano i wdrożono złożony protokół. Protokół ten został opracowany poprzez połączenie protoko...

W grudniu 2019 roku pojawiła się nowa choroba o nazwie COVID-19, wywołana przez nieznany wcześniej koronawirus, SARS-CoV-21. Wynikająca z tego globalna pandemia stanowi poważne wyzwanie dla laboratoriów klinicznych i zdrowia publicznego na całym świecie, ponieważ duża liczba osób wymaga testów w celu dokładnej oceny transmisji i rozpowszechnienia wirusa w społeczności. Jednak w wielu regionach osiągnięcie niezbędnego poziomu testowania w odpowiednim czasie i w sposób przestrzennie niewykonalny jest ekonomicznie niewykonalne2,3. Obecne systemy nadzoru oparte na indywidualnej diagnostyce klinicznej opierają się w dużej mierze na nasileniu objawów i indywidualnym zgłaszaniu, a także na stopniu, w jakim objawy te pokrywają się z istniejącymi chorobami krążącymi w populacji4,5,6,7,8,9,10. W związku z tym duża liczba przypadków bezobjawowych przyczynia się do znacznego niedoszacowania obciążenia chorobą7,11.
Ze względu na te wyzwania, epidemiologia oparta na ściekach (WBE) do nadzoru nad COVID-19 została zaproponowana jako uzupełniająca strategia nadzoru. WBE został po raz pierwszy opisany w 200112, i początkowo był używany do śledzenia kokainy i innych nielegalnych narkotyków13. Podejście to opiera się na założeniu, że możliwe jest obliczenie początkowego stężenia dowolnej substancji, która jest stabilna w ściekach i wydalana przez ludzi8,12. WBE został z powodzeniem wdrożony w wielu krajach jako uzupełniający i skuteczny system nadzoru nad SARS-CoV-23,8,14,15,16. Większość metod wykrywania wirusów ludzkich w środowisku wodnym przebiega zgodnie z następującymi krokami: koncentracja, ekstrakcja kwasu nukleinowego, amplifikacja wybranego segmentu (lub segmentów) genomu oraz wykrywanie/kwantyfikacja amplifikowanego segmentu genomowego3.
Innym ważnym środowiskiem do wykrywania i oznaczania ilościowego SARS-CoV-2 są próbki powietrza. Początkowo uważano, że SARS-CoV-2 jest przenoszony głównie poprzez bliski kontakt osobisty z kropelkami oddechowymi z aerozoli wytwarzanymi przez zakażoną osobę podczas mówienia, kichania, kaszlu, śpiewania lub oddychania17. Jednak kilka badań zaczęło donosić o obecności RNA SARS-CoV-2 w powietrzu, zwłaszcza w placówkach służby zdrowia i innych zamkniętych przestrzeniach18,19,20,21. Dowody na żywotność SARS-CoV-2 w próbkach powietrza pobranych w pomieszczeniach szpitalnych i innych zamkniętych pomieszczeniach stwierdzono, gdy stężenie wirusa było wystarczająco wysokie22,23,24. Badania plenerowe na ogół nie wykazały obecności SARS-CoV-2, z wyjątkiem zatłoczonych przestrzeni zewnętrznych21,25,26,27,28,29. Na razie transmisja SARS-CoV-2 drogą powietrzną została uznana za sposób transmisji30,31. Niedawne badanie przeglądowe pokazuje różnice między przebywaniem na zewnątrz, gdzie ryzyko transmisji drogą powietrzną jest minimalne poza zatłoczonymi obszarami, a pomieszczeniami, gdzie większe ryzyko może występować w słabo wentylowanych środowiskach, w których mogą występować silne źródła (tj. liczba zakażonych osób). Niedawne kompleksowe badanie przeglądowe podkreśliło znaczne różnice między ryzykiem przenoszenia drogą powietrzną w środowisku zewnętrznym i wewnętrznym, szczególnie w zatłoczonych obszarach o słabej wentylacji. Badanie wskazuje, że ryzyko przenoszenia drogą powietrzną jest minimalne w środowiskach zewnętrznych, gdzie dostępna jest większa objętość powietrza do rozcieńczania i dyspersji cząsteczek wirusa32. Odkrycia te mają ważne implikacje dla polityki i wytycznych w zakresie zdrowia publicznego związanych z COVID-19. Dostrzegając znaczące różnice w ryzyku transmisji między środowiskiem wewnętrznym i zewnętrznym, decydenci mogą opracować skuteczniejsze strategie łagodzenia rozprzestrzeniania się wirusa i ochrony zdrowia publicznego.
Istnieje wiele metod i protokołów do wykrywania, kwantyfikacji i sekwencjonowania SARS-CoV-2 z różnych próbek środowiskowych. Niniejszy artykuł dotyczący metody ma na celu przedstawienie kombinacji dobrze ugruntowanych protokołów, które umożliwiają laboratoriom o różnych poziomach wydajności wykrywanie, kwantyfikację i sekwencjonowanie wirusów w środowisku z próbek ścieków i powietrza.

<table><tbody><tr><td>Adapter + A25 + A2: D19 + A2: D20 + A2 + A2: D19</td><td>Sekwencjonowanie</td><td>Oxford Nanopore</td><td>EXP-AMII001</td></tr><tr><td>Zestaw AllPrep PowerViral DNA/RNA Zestaw</td> do <td>ekstrakcji RNA</td><td>Qiagen</td><td>28000-50</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Oczyszczanie PCR, NGS Oczyszczanie, Czyszczenie PCR</td></tr><tr><td>Panel amplikonów ARTIC SARS-CoV-2</td><td>IDT</td><td>10011442</td><td>Amplifikacja genomu SARS-CoV-2</td></tr><tr><td>Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0367S</td><td>Przygotowanie biblioteki</td></tr><tr><td>CENTRICON PLUS&nieśmiały; 70 10 kda.</td><td>Fisher Scientific</td><td>10296062</td><td>Filtry stężenia</td></tr><tr><td>CORIOLIS KOMPAKTOWY PRÓBNIK POWIETRZA</td><td>Bertin Technologies</td><td>083-DU001</td><td>Próbnik powietrza</td></tr><tr><td>Duran&nbsp; butelki laboratoryjne</td><td>Butelki do pobierania próbek</td><td>Merck</td><td>Z305200-10EA</td></tr><tr><td>Komórka przepływowa (R9.4.1)</td><td>Sekwencjonowanie</td> <td>Oxford Nanopore</td><td>FLO-MIN106D</td></tr><tr><td>Ogólne materiały eksploatacyjne laboratoryjne (probówki, płytki qPCR itp.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do sekwencjonowania ligacji</td><td>Oxford Nanopore</td><td>SQK-LSK109</td><td>Sekwencjonowanie</td></tr><tr><td>LunaScript&nbsp; Zestaw RT SuperMix NEB</td><td></td><td>E3010</td><td>&nbsp; Synteza cDNA</td></tr><tr><td>Zestaw do kontroli ekstrakcji mengowirusa</td><td>Biom &eacute; rieux</td><td>KMG</td><td>Kontrola koncentracji</td></tr><tr><td>Nalgene Ogólne długoterminowe przechowywanie Probówki kriogeniczne</td><td>Thermofisher</td><td>5011-0012</td><td>Przechowywanie próbek</td></tr><tr><td>Natywne rozszerzenie kodów kreskowych 1-12 (bez PCR</td><td>Oxford Nanopore</td><td>EXP-NBD104</td><td>Kod kreskowy</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB</td><td></td><td>E7595</td><td>Naprawa DNA</td></tr><tr><td>NEBNext VarSkip Krótkie mieszanki podkładowe SARS-CoV-2</td><td>NEB</td><td>E7658</td><td>Amplifikacja genomu SARS-CoV-2</td></tr><tr><td>NEBNext&nbsp; Bufor reakcyjny do szybkiej ligacji</td><td>Sekwencjonowanie NEB</td><td>B6058S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Merck</td><td>P4474</td><td>Bufor zbiorczy</td></tr><tr><td>Sola fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, 1X), sterylnie filtrowana</td><td>Thermofisher</td><td>J61196. AP</td><td>Elucja próbek powietrza</td></tr><tr><td>Q5&nbsp; Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0494S</td><td>gorący start Polimeraza DNA</td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit RNA HS Thermofisher</td><td></td><td>Q32852</td><td>Kwantyfikacja RNA</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer i Zestaw sond</td><td>IDT</td><td>10006713</td><td>Mieszanka startera-sondy i kontrola pozytywna qPCR</td></tr><tr><td>TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix</td><td>Thermofisher</td><td>A15299</td><td>Zestaw RT-qPCR</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja i charakterystyka całego genomu rna sars-cov-2 w próbkach ścieków i powietrza

Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples

Epidemiologia oparta na ściekach okazała się obiecującym i skutecznym systemem nadzoru nad SARS-CoV-2 i innymi chorobami zakaźnymi w wielu krajach. Proces ten zazwyczaj obejmuje zagęszczanie ścieków, ekstrakcję kwasów nukleinowych, amplifikację wybranych segmentów genomu oraz wykrywanie i kwantyfikację amplifikowanego segmentu genomu. Metodologia ta może być również wykorzystana do wykrywania i ilościowego oznaczania czynników zakaźnych, takich jak SARS-CoV-2, w próbkach powietrza. Początkowo zakładano, że SARS-CoV-2 rozprzestrzenia się głównie poprzez bliski kontakt osobisty z kropelkami wytwarzanymi przez zakażoną osobę podczas mówienia, kichania, kaszlu, śpiewania lub oddychania. Jednak coraz więcej badań donosi o obecności RNA SARS-CoV-2 w powietrzu placówek opieki zdrowotnej, co oznacza, że transmisja drogą powietrzną jest realną drogą rozprzestrzeniania się wirusa. W badaniu tym przedstawiono kombinację ustalonych protokołów ułatwiających wykrywanie, kwantyfikację i sekwencjonowanie wirusów zarówno w próbkach ścieków, jak i powietrza.

Wyniki podsumowane w Tabeli 3 przedstawiają przykłady wykrywania i oznaczania ilościowego RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza przy użyciu metody opisanej w niniejszym artykule. Próbki ścieków pobrano z oczyszczalni ścieków w Hiszpanii i Słowenii; uznano je za pozytywne, jeśli wartość Ct była mniejsza niż 40 w co najmniej dwóch z trzech powtórzeń, a oznaczanie ilościowe uznano za prawidłowe, jeśli zmienność Ct wynosiła mniej niż 5%. W Hiszpanii i Portugalii pobrano próbki powietrza wewnątrz i na...

Ten protokół ma na celu ilościowe określenie RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza, które mają być wykorzystane do badań epidemiologicznych opartych na ściekach oraz ocenę ryzyka narażenia na SARS-CoV-2 w aerozolach wewnątrz i na zewnątrz. Protokół ten opisuje również podejście do sekwencjonowania długiego szablonu amplikonu w celu charakterystyki całego genomu SARS-CoV-2.

Kwantyfikacja i charakterystyka całego genomu RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza

Wastewater-based epidemiology has emerged as a promising and efficacious surveillance system for SARS-CoV-2 and other infectious diseases in many nations. ...

Epidemiologia oparta na ściekach jest obecnie wykorzystywana do uzupełniania strategii kontroli COVID-19 na całym świecie poprzez wykrywanie wirusowego RNA w próbkach ścieków i identyfikowanie potencjalnych ognisk choroby. Technika ta zapewnia obraz rozpowszechnienia COVID-19 w całej populacji, w tym przypadków bezobjawowych. Pobieranie próbek powietrza jest również ważnym dodatkiem do tego protokołu.Diagnostyka kliniczna jest nadal najdokładniejszym sposobem radzenia sobie z ogniskami chorób i pandemiami. Jednak ta technika jest nadal przydatna jako jego uzupełnienie. Ta metoda składa się z wielu etapów i punktów krytycznych.Demonstracja wizualna jest niezbędna, ponieważ pozwoli laboratoriom, które nie są tak zaznajomione z biologią molekularną, na powtórzenie procedury. Na początek zbierz jeden litr 24-godzinnej próbki ścieków kompozytowych. Wlej 20 mikrolitrów mengowirusa do 70 mililitrów próbki.Po odwirowaniu próbki w temperaturze 700 G przez 10 minut, zagęścić otrzymany supernatant za pomocą odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji z odcięciem 10 kilodaltonów przez odwirowanie. Eluować koncentrat przez odwirowanie w temperaturze 700 G przez 40 minut i odwrócenie położenia urządzenia do ultrafiltracji. Powstały koncentrat należy wykorzystać do ekstrakcji RNA.Aby pobrać próbki powietrza, przed rozpoczęciem pobierania należy umieścić sterylny stożek w próbniku powietrza. Po zakończeniu pobierania próbek wyekstrahuj RNA z przemytego PBS stożka za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji wirusowego RNA lub metody wewnętrznej. Przygotuj główną mieszankę reakcji dla każdego celu, mengowirusa, genów SARS-CoV-2, N1 i N2 w czystym kapturze w pomieszczeniu do ustawiania odczynników.Wymieszaj mieszaninę starterów-sondy i enzym, odwracając pięć razy lub wirując impulsowo. Trzymając probówki do mikrowirówek w zimnym stojaku, dozować 15 mikrolitrów mieszanki do probówek do PCR w paski lub 96-dołkowej płytki PCR umieszczonej na stojaku chłodzącym. Przykryj płytkę i przenieś ją do obszaru obchodzenia się z kwasami nukleinowymi.Delikatnie wirować podwielokrotność wyekstrahowanego RNA przez pięć sekund. Odpipetować pięć mikrolitrów RNA do mieszaniny reakcyjnej, aby uzyskać 25 mikrolitrów i rozpocząć RT-qPCR. Na płytce do PCR odpipetować 16 mikrolitrów każdej próbki do jej pozycji na płytce i dodać cztery mikrolitry pięciokrotnej odwrotnej transkrypcji lub głównej mieszanki RT.Następnie rozpocznij reakcję PCR. Następnie przygotuj 10 mikromolowych rozcieńczeń każdego zestawu starterów i mieszankę wzorcową dla każdego zestawu starterów. Na nowej płytce do PCR odpipetować 20 mikrolitrów mieszanki wzorcowej, a następnie pięć mikrolitrów próbki RT do każdej mieszanki.Po przykryciu płytki należy rozpocząć reakcję PCR. Po zakończeniu PCR wiruj płytkę o masie 1000 G przez 15 do 30 sekund. W celu oczyszczenia PCR dodaj 50 mikrolitrów odczynnika na bazie kulek do każdej studzienki i wymieszaj pipetując, aby kontynuować separację magnetyczną.Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego. Zawiesić każdą osadkę w 15 mikrolitrach wody klasy PCR i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Umieść talerz z powrotem na stojaku magnetycznym i pozwól koralikom granulować się przez dwie minuty.Następnie ostrożnie odpipetować 15 mikrolitrów supernatantu z każdej próbki na nową płytkę PCR. Następnie, w celu przygotowania biblioteki, dodaj 1,75 mikrolitra buforu reakcyjnego z zestawu do przygotowania biblioteki DNA i 0,75 mikrolitra mieszanki enzymów do każdej próbki. Krótko zakręć zakrytą płytką i wiruj w dół z prędkością 1000G przez 15 do 30 sekund.Inkubować przez pięć minut w temperaturze 21 stopni Celsjusza i pięć minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Odpipetować trzy mikrolitry wody klasy PCR dla każdej próbki na nową płytkę PCR. Dodać 0,75 mikrolitra przygotowanych próbek i 1,25 mikrolitra kodów kreskowych w celu przygotowania biblioteki sekwencjonowania.Następnie dodać pięć mikrolitrów głównej mieszanki ligazy DNA T4 i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Po odwirowaniu płytki w wirówce inkubować płytkę w temperaturze 21 stopni Celsjusza przez 20 minut, a w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po zebraniu wszystkich próbek dodaj 192 mikrolitry odczynnika na bazie kulek do puli w celu oczyszczenia PCR.Dobrze wymieszać przez pipetowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym. Poczekaj, aż supernatant się oczyści i utworzy się granulka kulki.Wyjmij supernatant i probówkę ze stojaka magnetycznego. Dodać 700 mikrolitrów buforu krótkich fragmentów lub SFB i wymieszać pipetując. Umieść rurkę z powrotem na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż utworzy się granulka, a płyn się usunie.Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Dodać 35 mikrolitrów wody klasy PCR do probówki, wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i pozwól, aby koraliki się osadzały, a płyn oczyścił.Odpipetować 35 mikrolitrów supernatantu do nowej probówki. Następnie należy przygotować mieszaninę reakcyjną podwiązania adaptera zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wymieszać 20 mikrolitrów odczynnika na bazie kulek z mieszanką reakcyjną ligacji w celu oczyszczenia PCR i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż utworzy się granulka kulki, a supernatant stanie się bezbarwny. Ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie. Wymieszaj 125 mikrolitrów SFB z rurką i umieść ją z powrotem na stojaku magnetycznym, aby oddzielić koraliki.Gdy ciecz stanie się klarowna, wyrzucić supernatant i powtórzyć dodawanie SFB, jak pokazano wcześniej. Pozostaw rurkę na stojaku magnetycznym otwartą na 30 sekund. Dodać 15 mikrolitrów buforu elucyjnego i dobrze wymieszać przez pipetowanie.Po krótkim odwirowaniu i inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut, umieść na stojaku magnetycznym na dwie minuty. Odpipetować 15 mikrolitrów supernatantu do nowej probówki o niskim poziomie wiązania w celu zmierzenia stężenia za pomocą zestawu do fluorometrycznego oznaczania ilościowego DNA. Następnie włóż komórkę przepływową do urządzenia do sekwencjonowania DNA i RNA w czasie rzeczywistym.Włóż końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i ustawionej na 200 mikrolitrów do portu zasysającego. Obróć pokrętło regulacji głośności, aby zwiększyć głośność, aż zobaczysz płyn w końcówce, a następnie wyrzuć końcówkę. Dodaj 800 mikrolitrów mieszanki gruntującej do portu zalewania bez pęcherzyków i odczekaj pięć minut.Odpipetować 200 mikrolitrów biblioteki wymieszać z portem zasysającym. Zamknij port pokrywy i port zalewania. Rozpocznij eksperyment sekwencjonowania w oprogramowaniu i wybierz Base Calling On.Ta metoda wykryła i określiła ilościowo RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza.Próbki ścieków miały odchylenie standardowe od 1,91% do 13,98% wśród potrójnych próbek i wahały się od 3,05 razy 10 do 3 do 2,83 razy 10 do ośmiu kopii genów na litr. Próbki powietrza wahały się od 6,17 razy 10 do 3 do 5,48 razy 10 do dziewięciu, z odchyleniem standardowym w duplikatach od 0,54% do 10,95%Jak opisano w niniejszym protokole, próbki zostały zsekwencjonowane, a przykład wyników trzech zsekwencjonowanych próbek podsumowano tutaj. We wszystkich trzech próbkach linia BA.5.x zostało przypisane jako najbardziej rozpowszechnione przez narzędzie Freyja. Koncentracja próbek ścieków jest kluczowym etapem, ponieważ wirusowe RNA jest obecne w ściekach w niskich stężeniach. Dlatego ten krok ma fundamentalne znaczenie dla dokładnego wykrywania i kwantyfikacji.Procedura ta może być dostosowana poprzez zastosowanie różnych starterów w protokole RT-qPCR, które mają być używane do wykrywania i ilościowego oznaczania innych czynników zakaźnych. Technika ta pozwoliła dokładnie określić ilościowo obecność SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza. Różne patogeny mogą być wykrywane i określane ilościowo z różnych lokalizacji.

quantification-whole-genome-characterization-sars-cov-2-rna

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Tutaj opisujemy prostą metodę, która łączy fluorescencję RNA hybrydyzację in situ (RNA-FISH) z immunofluorescencją w celu wizualizacji RNA koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Protokół ten może zwiększyć zrozumienie charakterystyki molekularnej interakcji RNA-gospodarz SARS-CoV-2 na poziomie pojedynczej komórki.

Wizualizacja SARS-CoV-2 za pomocą hybrydyzacji immuno RNA-fluorescencji in situ

Ta praca podsumowuje kroki nad opracowaniem różnych testów do wykrywania SARS-CoV-2 przy użyciu dwukolorowego systemu ddPCR. Kroki są skomplikowane i dołączono uwagi dotyczące tego, jak poprawić wyniki testów i eksperymentów. Testy te mogą być stosowane w wielu zastosowaniach SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Dwuetapowe cyfrowe protokoły PCR z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2

Obywatelski projekt naukowy miał na celu rekrutację mieszkańców San Diego do pobierania próbek środowiskowych na obecność SARS-CoV-2. Stworzono wielojęzyczną platformę internetową do przesyłania danych za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu urządzenia mobilnego. System zarządzania informacjami laboratoryjnymi ułatwił gromadzenie tysięcy próbek zróżnicowanych geograficznie dzięki śledzeniu wyników w czasie rzeczywistym.

Wymazy ze środowiska miejskiego - rurociąg do pobierania próbek i wykrywania SARS-CoV-2 ze zbiorników środowiskowych

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

Protokół opisuje metodę diagnostyczną SARS-CoV-2, która wykorzystuje automatyzację open-source do przeprowadzania testów molekularnych RT-qPCR próbek śliny. To skalowalne podejście może być stosowane w klinicznym nadzorze nad zdrowiem publicznym, a także w celu zwiększenia wydajności mniejszych laboratoriów uniwersyteckich.

Skuteczna ilościowa strategia diagnostyki śliny metodą PCR z odwrotną transkryptazą SARS-CoV-2 z wykorzystaniem robotów do pipetowania typu open source

Stężenie wirusa z próbek wody i ścieków środowiskowych jest trudnym zadaniem, przeprowadzanym głównie w celu identyfikacji i kwantyfikacji wirusów. Chociaż opracowano i przetestowano kilka metod koncentracji wirusów, tutaj wykazujemy skuteczność ultrafiltracji i flokulacji mleka odtłuszczonego dla wirusów RNA z różnymi typami próbek.

Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji

Tutaj prezentujemy szybki i ekonomiczny proces charakteryzowania genomów wirusa wścieklizny (RABV) za pomocą technologii nanoporowej. Przepływ pracy ma na celu wsparcie nadzoru opartego na genomice na poziomie lokalnym, dostarczając informacji na temat krążących linii RABV i ich umiejscowienia w regionalnych filogenezach w celu ukierunkowania środków kontroli wścieklizny.

Sekwencjonowanie całego genomu w celu szybkiej charakterystyki wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej

Tutaj udostępniamy kompletny protokół do standaryzacji i implementacji metody wykrywania wirusa SARS-CoV-2 w próbkach ludzkich za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Ta metoda, wykonana w ciągu 60 minut, może być dostosowana do każdego laboratorium lub punktu opieki nad pacjentem przy niskich kosztach i przy użyciu niedrogiego sprzętu.

Wykrywanie wirusa SARS-CoV-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji

Prezentujemy dwa wewnętrzne, jednoetapowe zestawy RT-qPCR do powszechnych wirusów układu oddechowego. Pierwszy test dotyczy SARS-CoV-2 (N), grypy A (H1N1 i H3N2) oraz grypy B. Drugi dotyczy SARS-Cov-2 (N) i MERS (UpE i ORF1a). Testy te mogą być z powodzeniem wdrożone w każdym specjalistycznym laboratorium.

Opracowanie multipleksowych testów RT-qPCR w czasie rzeczywistym do wykrywania SARS-CoV-2, grypy A/B i MERS-CoV

Dwie uzupełniające analizy atmosferycznych cząstek biologicznych z filtrów próbek powietrza są opisane tutaj: ekstrakcja i wykrywanie endotoksyny oraz DNA.

Analiza filtra z próbką powietrza pod kątem endotoksyn i zawartości DNA

Poznaj metodę kwantyfikacji RNA SARS-CoV-2 w ściekach i powietrzu oraz sekwencjonowania całego genomu. Technika ta wspiera epidemiologię opartą na ściekach i ocenę ryzyka ekspozycji na aerozole.

Kwantyfikacja i charakterystyka całego genomu RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza

Przeglądaj więcej filmów