Standaryzowana identyfikacja struktury związku w medycynie tybetańskiej za pomocą spektrometrii mas z pułapką jonową i wieloetapowej analizy fragmentacji

Metoda ta może pomóc naukowcom w analizie struktur związków medycyny tybetańskiej, zwłaszcza składników drzewa. Może dostarczyć informacji na temat jakościowych badań zawartości związków w medycynie naturalnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że dokładność uzyskanej w tym przypadku struktury związku jest wyższa niż w przypadku bazy danych.

Technika ta może być stosowana w analizie struktury produktów przemiany materii pośredniej w pęcherzu moczowym lub moczu. Na początek przygotowanie próbki nasion tybetańskiej medycyny Abelmoschus manihot. Dokładnie odważ jeden gram AMS i umieść go w stożkowej kolbie zawierającej 30 mililitrów 80% metanolu.

Używając ultradźwiękowego sonografu do kąpieli o częstotliwości 40 kiloherców, przeprowadzaj ekstrakcję mieszaniny przez 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie odwirować próbkę o masie 14 000 g przez pięć minut. Przygotować strzykawkę do wstrzykiwań i organiczny filtr z mikroporowatą membraną o grubości 0,22 mikrona, a następnie przefiltrować supernatant do dwumililitrowej butelki na próbkę.

Po włączeniu przełącznika pompy próżniowej otwórz główny zawór butli z argonem wraz z zaworem ciśnienia cząstkowego i ustaw ciśnienie na około 0,3 megapaskala. Następnie otwórz zawór azotu. Uruchom oprogramowanie sterujące spektrometrią mas lub MS.

Kliknij Podgrzewane źródło ESI w panelu oprogramowania i ustaw parametry MS, w tym temperaturę grzałki, natężenie przepływu gazu, napięcie natrysku dla trybów dodatnich i ujemnych oraz temperaturę kapilary. Kliknij przycisk Zastosuj, aby aktywować źródło jonów do chromatografii cieczowej lub LC. Przygotuj ruchome fazy A i B za pomocą 0,1% kwasu mrówkowego w roztworze wodnym w czystym acetonitrylu. Odgazować je w sonikatorze kąpieli ultradźwiękowej o częstotliwości 40 kiloherców przez co najmniej 15 minut przed podłączeniem roztworów odpowiednio do kanałów płynu A i B.

Przygotuj wodny roztwór metanolu w proporcji 1:9 objętościowo, a następnie ręcznie wlej go do butelek z płynem czyszczącym pompy i wtryskiwacza. Po uruchomieniu oprogramowania sterującego LC-MS kliknij Sterowanie bezpośrednie, aby otworzyć panel sterowania LC. Otwórz zawór upustowy w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara na module pompy.

Kliknij opcję Więcej, aby otworzyć ustawienie pompy i ustawić parametry przedmuchiwania na pięć mililitrów na minutę przez trzy minuty. Kliknij Usuń, aby rozpocząć usuwanie bąbelków. Po zakończeniu zamknij zawór upustowy.

Następnie kliknij Prime Strzykawka, aby płukać strzykawkę przez trzy cykle, Wash Buffer Loop, aby przepłukać pętlę przez jeden cykl i Wash Needle Externally, aby umyć igłę przez jeden cykl. Umieścić butelkę z próbką w próbniku. Kliknij na Instrument Setup, aby otworzyć okno edycji metody i kliknij na New aby utworzyć nową metodę instrumentu LC-MS.

Ustal całkowity czas pracy dla metody i ustaw limit ciśnienia. Całkowite natężenie przepływu, gradient przepływu, temperatura próbki, temperatura kolumny i różnica temperatury gotowości w oknie edycji metody. W przypadku metody MS wybierz typ eksperymentu General MS lub MSn.

Wprowadź wartości czasu akwizycji, polaryzacji, zakresu masy, liczby wartości przekierowania i czasu trwania. Kliknij Zapisz, aby skonfigurować ustawienia jako metodę instrumentu. Kliknij Sequence Setup (Ustawienia sekwencji), aby otworzyć tabelę sekwencji, w której wprowadź informacje o typie próbki, pliku, nazwie, ścieżce, identyfikatorze próbki, metodzie instrumentu, pozycji i objętości wtrysku.

Nagraj tabelę sekwencji, klikając przycisk Zapisz, a następnie zaimplementuj ustawienia i rozpocznij pobieranie MS. Aby załadować dane MS do oprogramowania do przetwarzania danych, kliknij dwukrotnie plik raw w Eksploratorze. W chromatogramie piku bazowego BPI wybierz maksymalny obszar pod krzywą lub AUC, klikając i przeciągając myszą.

Odpowiednie widmo MS zostanie wyświetlone w tym samym oknie. Wybierz docelowy jon do następnej analizy MS/MS. Ponownie otwórz okno Edycja metody i w tabeli ustawień MSn ustaw m/z docelowego jonu na jedno miejsce po przecinku w kolumnie Masa nadrzędna.

Następnie wybierz tryb kolizji i wprowadź energię kolizji lub wartość CE. Ustaw zakres skanowania MS/MS. Kliknij Zapisz, aby nagrać metodę MS i wprowadź nową nazwę pliku w tabeli sekwencji.

Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć pobieranie MS/MS. Po zakończeniu akwizycji kliknij dwukrotnie plik raw w Eksploratorze, aby załadować plik raw MS/MS do oprogramowania do przetwarzania danych. Zidentyfikuj najsilniejszy jon fragmentacyjny w widmie i wprowadź jego wartość m/z do listy metod MSn.

W tabeli ustawień MSn ustaw parametry MS3, w tym tryb kolizji, wartość CE i zakres skanowania. Ponownie kliknij przycisk Zapisz, aby nagrać metodę MS i wprowadzić nową nazwę pliku w tabeli sekwencji. Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć pobieranie MS3.

Jak pokazano wcześniej, kliknij dwukrotnie plik raw w Eksploratorze, aby załadować plik raw MS3 do oprogramowania do przetwarzania danych i powtórz kroki, aby uzyskać widmo MS4. Aby przeanalizować dane, kliknij dwukrotnie surowe pliki, aby otworzyć wszystkie widma masowe od MS do MSn. Ręcznie oblicz wartości różnicy m/z między jonem a odpowiadającymi mu jonami fragmentacyjnymi.

Następnie ręcznie narysuj strukturę rdzenia zgodnie z wynikami MS4 i wyprowadź oryginalną strukturę za pomocą grup funkcyjnych lub segmentów molekularnych na podstawie wartości różnicy m/z. Ręcznie narysuj ścieżki cięcia molekularnego zgodnie z każdą strukturą molekularną w MSn. ESI-MS modelowej celobiozy węglowodanowej wytworzył białkową cząsteczkę M H w temperaturze m/z 365 w trybie dodatnim.

Skan jonów produktu, czyli CID MS/MS, spowodował powstanie drugiego jonu fragmentacyjnego o wartości m/z 305. Co więcej, analiza MS3 i MS4 sekwencyjnie doprowadziła do uzyskania trzeciego i czwartego jonu fragmentacyjnego odpowiednio na poziomie m/z 254 i m/z 185. Analiza MS/MS ujawniła sekwencję fragmentacji jonów, a mianowicie hydrolizę otwarcia pierścienia, rozszczepienie CC i odwodnienie.

Tak więc ta metoda została uznana za odpowiednią dla węglowodanów. Wstępna analiza jakościowa AMS z wykorzystaniem LC Q-TOF MS wykazała obecność wielu nieznanych związków. Ujemna analiza MSn jonu M H przy m/z 617 wytworzyła drugi jon fragmentacyjny przy m/z 571.

Analiza MS3 tego jonu fragmentacyjnego wytworzyła trzeci jon fragmentacyjny o stężeniu m/z 525 w wyniku utraty hydroksyetylu jako metanolu odpowiadającego 32 daltonom i hydroksylu jako wody, czyli 18 daltonów. Analiza MS4 wykazała czwarte jony fragmentacyjne w m/z 344 i 273. Ręczna identyfikacja struktury rdzenia ujawniła strukturę molekularną związku na m/z 617 i jego ścieżki rozszczepienia w MSn.

Wykonano skan jonów produktowych jonu M H innego nieznanego związku, ujawniono również jego strukturę molekularną i mechanizm rozszczepienia. Po włączeniu pompy próżniowej odczekaj co najmniej pięć godzin, aby zapewnić wystarczający stopień podciśnienia dla warunków eksperymentalnych. Analiza statystyczna może być wykorzystana do zestawienia fragmentów o takim samym lub podobnym stosunku masy do ładunku.

Wraz ze wzrostem liczby rozwiązań w zakresie spektrometrii mas, technika ta może pomóc naukowcom w uzyskaniu nowszych związków w medycynie naturalnej.