Name: Standaryzowana identyfikacja struktury związku w medycynie tybetańskiej za pomocą spektrometrii mas z pułapką jonową i wieloetapowej analizy fragmentacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji struktur związków w medycynie tybetańskiej z nasion Abelmoschus manihot przy użyciu spektrometrii mas z pułapką jonową. Technika zapewnia wyższą dokładność niż bazy danych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Xinglin Talent Program Uniwersytetu Chengdu TCM (nr 030058191), Nature Science Foundation of Sichuan (2022NSFSC1470) oraz National Natural Science Foundation of China (82204765).

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Dokładnie odważyć 1 g próbki AMS i umieścić ją w stożkowej kolbie z 30 ml 80% metanolu. Przenieść mieszaninę do sonikatora do kąpieli ultradźwiękowej na 30 minut ekstrakcji w temperaturze 25 °C. Odwirować próbkę przy 14 000 x g przez 5 min. 
	UWAGA: Częstotliwość sonografu do kąpieli ultradźwiękowej wynosi 40 KHz.</li>
	<li>Przygotować strzykawkę do wstrzykiwań i mikroporowaty filtr membranowy (0,22 μm, tylko organicznie). Przefiltrować supernatant do butelki na próbkę o pojemności 2 ml.</li>
</ol>
2. Ustawienia MS
<ol>
	<li>Włącz przełącznik pompy próżniowej. Otwórz główny zawór butli z argonem i zawór ciśnienia cząstkowego i wyreguluj ciśnienie na około 0,3 MPa. Otwórz zawór azotu. 
	UWAGA: Odczekaj co najmniej 8 godzin, aby zapewnić wystarczający stopień próżni dla warunków eksperymentalnych. Przed analizą sprawdź, czy ciśnienie gazu argonu i azotu jest wystarczająco wysokie.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie sterujące MS. Kliknij Podgrzewane źródło SEI w panelu oprogramowania i wprowadź parametry MS, w tym temperaturę grzałki (350 °C), natężenie przepływu gazu w osłonie (35 arb), natężenie przepływu gazu pomocniczego (15 arb), napięcie natrysku (3,8 KV dla trybu dodatniego, -2,5 KV dla trybu ujemnego) i temperaturę kapilary (275 °C). Kliknij przycisk Zastosuj, aby aktywować źródło jonów.</li>
</ol>
3. Wstępny przebieg LC, ustanowienie metody i akwizycja MS
<ol>
	<li>Przygotować ruchomą fazę A i ruchomą fazę B, używając odpowiednio 0,1% wodnego roztworu kwasu mrówkowego i czystego acetonitrylu. Odgazuj je w kąpieli ultradźwiękowej sonikatora przez co najmniej 15 minut. Podłącz roztwory odpowiednio do kanałów płynów A i B (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Przygotuj roztwór metanolu i wody (1:9 v/v), a następnie ręcznie wlej go do butelek z płynem czyszczącym pompy i wtryskiwacza. 
	UWAGA: Częstotliwość sonografu do kąpieli ultradźwiękowej wynosi 40 KHz.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie sterujące LC-MS.
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk Sterowanie bezpośrednie, aby otworzyć panel sterowania LC. Otwórz zawór upustowy w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara na module pompy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Kliknij przycisk Więcej opcji, aby otworzyć ustawienie pompy i ustaw parametry przedmuchiwania na 5 mLmin−1 na 3 minuty. Kliknij przycisk Przedmuchuj, aby rozpocząć usuwanie pęcherzyków. Następnie zamknij zawór upustowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij przyciski Prime Strzykawka, Pętla bufora do mycia i Igła do mycia zewnętrznie, aby przepłukać strzykawkę odpowiednio przez trzy cykle, pętlę przez jeden cykl i igłę przez jeden cykl. Umieść butelkę z próbką w próbniku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Kliknij przycisk Instrument Setup (Ustawienia instrumentu), aby otworzyć okno edycji metody. Kliknij przycisk Nowy, aby utworzyć nową metodę przyrządu LC-MS.</li>
	<li>Ustal całkowity czas wykonywania dla metody LC. Następnie wprowadź wartości, aby ustawić limit ciśnienia, całkowite natężenie przepływu, gradient przepływu, temperaturę próbki, temperaturę kolumny i deltę temperatury gotowości w oknie edycji metody. 
	UWAGA: Domyślne całkowite natężenie przepływu fazy ruchomej jest stałe i wynosi 0,3 ml/min przy 50% A i 50% B oraz bez temperatury kolumny w przypadku braku kolumny chromatograficznej. Domyślne wartości temperatury próbki i delta temperatury gotowości wynoszą odpowiednio 15 °C i 0,1 °C. Inne ustawienia zależą od rodzaju użytej kolumny do chromatografii cieczowej.</li>
	<li>Wybierz typ eksperymentu Ogólne MS lub MSn dla metody MS. Wprowadź wartości, aby skonfigurować czas akwizycji, polaryzację, zakres masy, liczbę wartości przekierowania i czas trwania wartości przekierowania. Kliknij przycisk Zapisz, aby skonfigurować ustawienia jako metodę instrumentu. 
	UWAGA: Ustawienia domyślne bez kolumny chromatograficznej są następujące: czas akwizycji, 2 min; polaryzacja, dodatnia lub ujemna; zakres masy, od 100 do 1,200; numer wartości przekierowania, 2; i czas trwania wartości przekierowania, 1,99 min.</li>
</ol>
4. Obsługa wielostopniowej spektrometrii mas
<ol>
	<li>Kliknij przycisk Ustawienia sekwencji, aby otworzyć tabelę sekwencji.
	<ol>
		<li>W tabeli wprowadź następujące informacje: typ próbki, nazwę pliku, ścieżkę, identyfikator próbki, metodę urządzenia, pozycję i objętość wtrysku.</li>
		<li>Kliknij przycisk Zapisz, aby nagrać tabelę sekwencji, a następnie kliknij przycisk Rozpocznij analizę, aby wprowadzić ustawienia i zainicjować akwizycję MS. 
		UWAGA: Domyślny typ próbki jest wybrany jako nieznany. Metoda instrumentalna to metoda zapisana w kroku 3.6. Butelkę z próbką umieszcza się w swoim unikalnym miejscu w pomieszczeniu na próbki. Na przykład RA1 jest pierwszym miejscem w pierwszym rzędzie czerwonego obszaru w pomieszczeniu do pobierania próbek. Domyślna objętość iniekcji wynosi zwykle 2 μl, co zależy od stężenia próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie surowy plik w eksploratorze, aby załadować dane MS do oprogramowania do przetwarzania danych. Na chromatogramie piku bazowego (BPI) wybierz obszar z maksymalnym obszarem pod krzywą (AUC), klikając i przeciągając myszą. Odpowiednie widma MS zostaną wyświetlone w tym samym oknie.</li>
	<li>Wybierz docelowy jon do następnej analizy MS/MS.
	<ol>
		<li>Otwórz ponownie okno edycji metody. W tabeli MS n Setting (Ustawienie MSn) ustaw m/z docelowego jonu na jedno miejsce po przecinku w kolumnie Parent Mass (Masa nadrzędna).</li>
		<li>Wybierz Tryb kolizji i wprowadź wartość energii zderzenia (CE). Ustaw zakres skanowania MS/MS. Kliknij przycisk Zapisz, aby nagrać metodę MS i wprowadź nową nazwę pliku w tabeli sekwencji. Kliknij przycisk Start, aby zainicjować pobieranie MS/MS. 
		UWAGA: Zakres skanowania MS/MS wynosił 40%-130% docelowego jonu rodzicielskiego. Domyślna wartość CE w trybie dysocjacji wywołanej kolizją (CID) wynosi 35%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie plik raw w eksploratorze, aby załadować plik raw MS/MS do oprogramowania do przetwarzania danych.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj najsilniejszy jon fragmentacyjny w widmie MS/MS i wprowadź jego wartość m/z do listy metod MSn. W tabeli MS n Setting (Ustawienia MSn) ustaw parametry MS3, w tym tryb kolizji, wartość CE i zakres skanowania.</li>
		<li>Kliknij przycisk Zapisz, aby nagrać metodę MS i wprowadź nową nazwę pliku w tabeli sekwencji. Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć pobieranie MS3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie plik raw w eksploratorze, aby załadować plik raw MS3 do oprogramowania do przetwarzania danych. Powtórz krok 4.4, aby uzyskać widmo MS4.</li>
	<li>Zakończyć eksperyment MSn, gdy w widmie nie obserwuje się stabilnych jonów fragmentacyjnych.</li>
</ol>
5. Ręczna analiza danych MSn
<ol>
	<li>Kliknij dwukrotnie surowe pliki, aby otworzyć wszystkie widma masowe od MS do MSn. Ręcznie oblicz wartości różnicy m/z między jonem a odpowiadającymi mu jonami fragmentacyjnymi. 
	UWAGA: Na przykład wartość różnicy m/z między jonem (m/z 617,25) a odpowiadającymi mu jonami fragmentacyjnymi (m/z 571,28) wynosiła 45,97 w MS/MS, wartość różnicy m/z między jonem (m/z 571,28) a odpowiadającymi mu jonami fragmentacyjnymi (m/z 525,38) wynosiła 45,90 w MS3, a wartości różnicy m/z między jonem (m/z 525,38) a odpowiadającymi im jonami fragmentacyjnymi (m/z 344,93 i 273,16) wynosiły 180,45 i 252,22 w MS4, odpowiednio.</li>
	<li>Ręcznie narysuj strukturę "rdzenia" zgodnie z wynikami MS4 (ostatni poziom MSn). Ręcznie wyprowadź oryginalną strukturę za pomocą grup funkcyjnych lub segmentów molekularnych na podstawie wartości różnicy m/z. Ręcznie narysuj ścieżki rozszczepienia molekularnego zgodnie z każdą strukturą molekularną w MSn. Przykłady ręcznego wyprowadzania molekularnego są szczegółowo opisane w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, X. -F., Wu, H. -T., Tan, G. -G., Zhu, Z. -Y., Chai, Y. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography+coupled+with+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry+for+qualitative+analysis+of+herbal+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).</li>
<li>Ou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematically+investigating+the+pharmacological+mechanism+of+Dazhu+Hongjingtian+in+the+prevention+and+treatment+of+acute+mountain+sickness+by+integrating+UPLC%2FQ-TOF-MS%2FMS+analysis+and+network+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028(2020).</li>
<li>Kind, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+molecules+using+accurate+mass+MS%2FMS+search%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search.</a> Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).</li>
<li>Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-faceted+mass+spectrometric+investigation+of+neuropeptides+in+Callinectes+sapidus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus.</a> Journal of Visualized Experiments. (183), e63322(2022).</li>
<li>Seetaloo, N., Phillips, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond+hydrogen%2Fdeuterium-exchange+mass+spectrometry+for+the+study+of+alpha-synuclein+structural+dynamics+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64050(2022).</li>
<li>Karas, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+uptake+of+platinum-and+ruthenium-based+compound+exposure+in+zebrafish+by+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry+with+broader+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e6358(2022).</li>
<li>Chang, H. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uracil-DNA+glycosylase+assay+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e63089(2022).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+and+identification+of+major+constituents+in+Jitai+tablets+by+high-performance+liquid+chromatography%2Fdiode-array+detection+coupled+with+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).</li>
<li>Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+applications+and+features+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+the+analysis+of+traditional+Chinese+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270(2016).</li>
<li>Ichou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+activation+time+effects+and+the+internal+energy+distributions+for+the+CID%2C+PQD+and+HCD+excitation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes.</a> Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+oligomer+formation+in+glucose+dehydration+by+CO2+and+tetrahydrofuran%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran.</a> Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+effects+on+degradative+condensation+side+reactions+of+fructose+in+its+initial+conversion+to+5-Hydroxymethylfurfural%5BTitle%5D)+AND+%22ChemSusChem%22%5BJournal%5D)">Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural.</a> ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).</li>
<li>Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+research+of+Tibetan+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Traditional+Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modern research of Tibetan medicine.</a> World Journal of Traditional Chinese Medicine. 5 (2), 131-138 (2019).</li>
<li>Shang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethno-veterinary+survey+of+medicinal+plants+in+Ruoergai+region%2C+Sichuan+province%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China.</a> Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), Sichuan province, China. 390-400 (2012).</li>
<li>Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcone+derivatives+from+Abelmoschus+manihot+seeds+restrain+NLRP3+inflammasome+assembly+by+inhibiting+ASC+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 932198(2022).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+out+the+reaction+network+of+humin+formation+at+the+initial+stage+of+fructose+dehydration+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Energy+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water.</a> Green Energy & Environment. , In Press (2022).</li>
<li>Hua, Y., Jenke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+sensitivity+of+an+LC-MS+method+for+screening+material+extracts+for+organic+extractables+via+mobile+phase+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatographic+Science%22%5BJournal%5D)">Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization.</a> Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).</li>
<li>Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+characterization+and+distribution+of+monoterpene+indole+alkaloids+in+Rauwolfia+species+by+Orbitrap+Velos+Pro+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).</li>
<li>Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+Ion+activation+in+tandem+mass+spectrometry+using+ultra-high+resolution+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation.</a> Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).</li>
<li>Wu, S. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+determination+of+disulfide+linkages+in+recombinant+therapeutic+proteins+using+online+LC%E2%88%92MS+with+electron-transfer+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC−MS with electron-transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).</li>
<li>Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+mobility+mass+spectrometry+as+a+potential+tool+to+assign+disulfide+bonds+arrangements+in+peptides+with+multiple+disulfide+bridges%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges.</a> Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

IT-MS i jego technologia MSn oferują nowe podejście do identyfikacji struktury śladowych związków TCM. W przeciwieństwie do Q-TOF-MS, który nie był w stanie dogłębnie zidentyfikować jonów fragmentacyjnych, IT-MS z technologią MSn wyróżnia się zdolnością do izolowania i akumulacji jonów. W artykule przedstawiono metodę identyfikacji związków śladowych w medycynie tybetańskiej przy użyciu techniki IT-MS i MSn . Metoda wykorzystuje wartość n w MSn do określenia ilości dostarczonyc...

Jakościowa analiza śladowych składników w tradycyjnej medycynie chińskiej (TCM) stała się kluczowym tematem badań. Ze względu na dużą liczbę związków w TCM trudno jest je wyizolować do analizy spektrometrem magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub dyfraktometrem rentgenowskim (XRD), co sprawia, że coraz popularniejsze stają się metody oparte na spektrometrii mas (MS), które wymagają jedynie niewielkich objętości próbek. Dodatkowo, chromatografia cieczowa (LC) w połączeniu z MS była szeroko stosowana w badaniach TCM w ostatnich latach w celu poprawy separacji złożonych próbek i jakościowej analizy związków chemicznych1. Jedną z powszechnych metod jest chromatografia cieczowa z jonizacją elektrorozpylania i spektrometria mas czasu przelotu (LC-ESI-TOF-MS), która jest szeroko stosowana w badaniach jakościowych nad medycyną tybetańską2. Dzięki tej metodzie złożone składniki są wzbogacane i rozdzielane w kolumnie LC, a stosunek masy do ładunku (m/z) jonów adduktowych obserwuje się za pomocą detektora MS. Przeszukiwanie tandemowych baz danych MS (MS/MS lub MS2) jest obecnie najszybszym podejściem do pewnych adnotacji związków w analizie małych cząsteczek przy użyciu kwadrupolowego czasu przelotu (Q-TOF) MS i Orbitrap MS3. Jednak słaba jakość baz danych i obecność różnych izomerów utrudniają identyfikację nieznanych związków. Ponadto informacje dostarczane przez bazę danych MS/MS są ograniczone4,5,6,7. Istotne jest zbadanie związków chemicznych w każdym TCM przy użyciu ogólnego protokołu, który może być szeroko stosowany do innych TCM.
IT-MS przechwytuje szeroki zakres jonów, przykładając różne napięcia o częstotliwości radiowej (RF) do elektrod pierścieniowych8. IT-MS może wykonywać wieloetapowe skany MS w szeregach czasowych w różnych porządkach chronologicznych, zapewniając wieloetapową fragmentację MS składników (MSn), gdzie n to liczba etapów jonów produktu9. Liniowy IT-MS jest uważany za najlepszy do identyfikacji struktury, ponieważ może być używany do sekwencyjnych eksperymentów MSn10. Docelowe jony mogą być izolowane i akumulowane w liniowym IT-MS1. MSn (n ≥ 3) w IT-MS dostarcza więcej informacji fragmentarycznych niż MS/MS w Q-TOF-MS. Ponieważ IT-MS nie może zablokować docelowego jonu i jego jonów fragmentacyjnych, jest to potężne narzędzie do wyjaśniania struktury nieznanych związków, w tym izomerów1. Technologia MSn jest szeroko stosowana do analizy strukturalnej nieznanych białek, peptydów i polisacharydów11,12. Poziom obfitości jonów fragmentacyjnych w MSn dostarcza więcej informacji o fragmentach molekularnych na docelowych związkach w złożonych próbkach niż MS/MS w Q-TOF-MS. W związku z tym zastosowanie technologii MSn do identyfikacji strukturalnej w TCM jest niezbędne.
Medycyna tybetańska jest znaczącym składnikiem TCM13, a leki te pochodzą głównie ze zwierząt, roślin i minerałów występujących na obszarze płaskowyżu14. Medycyna tybetańska Nasiona Abelmoschus manihot (AMS) jest nasieniem Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS to tradycyjny lek ziołowy stosowany w leczeniu stanów takich jak atopowe zapalenie skóry, reumatyzm i trąd. Zawiera chalkon, który ma działanie przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze, przeciwnowotworowe, przeciwutleniające i przeciwzapalne15. W niniejszym badaniu udoskonalono procedurydotyczące stwardnienia rozsianego i opracowano szczegółową metodę identyfikacji złożonych struktur w AMS medycyny tybetańskiej za pomocą IT-MS i MSn. Niektóre parametry MS, w tym tryb jonowy, zasięg skanowania i tryb zderzenia, zostały zoptymalizowane w celu przezwyciężenia problemów z identyfikacją związków śladowych. Badanie to ma na celu promowanie standaryzowanej identyfikacji struktury związków śladowych w TCM.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl</td><td>Thermo Scientific</td><td>CAS 75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td> klasy LC-MS <td>Knowles</td><td>CAS 64-18-6</td><td>Klasa HPLC</td></tr><tr><td>Liniowy spektrometr masowy z pułapką jonową</td><td>Chromatograf cieczowy Thermo Scientific</td><td>LTQ XL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>U3000</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Tune</td><td>Thermo Scientific</td><td>wersja 2.8.0</td><td>MS oprogramowanie</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>CAS 67-56-1</td><td>LC-MS klasa</td></tr><tr><td>Czysta woda</td><td>Thermo Scientific</td><td>CAS 7732-18-5</td><td>LC-MS klasa</td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>Thermo Scientific</td><td>wersja 2.0</td><td>Oprogramowanie operacyjne LC-IT-MS</td></tr></tbody></table>

standaryzowana identyfikacja struktury związku w medycynie tybetańskiej za pomocą spektrometrii mas z pułapką jonową i wieloetapowej analizy fragmentacji

Standardized Identification of Compound Structure in Tibetan Medicine Using Ion Trap Mass Spectrometry and Multiple-Stage Fragmentation Analysis

Leki tybetańskie są skomplikowane i zawierają wiele nieznanych związków, co sprawia, że dogłębne badania nad ich strukturami molekularnymi są niezbędne. Chromatografia cieczowa z jonizacją elektrorozpylania i spektrometria mas czasu przelotu (LC-ESI-TOF-MS) jest powszechnie stosowana do ekstrakcji medycyny tybetańskiej; Jednak po skorzystaniu z bazy danych Spectrum pozostaje wiele nieprzewidywalnych nieznanych związków. W artykule opracowano uniwersalną metodę identyfikacji składników medycyny tybetańskiej za pomocą spektrometrii mas z pułapką jonową (IT-MS). Metoda obejmuje znormalizowane i zaprogramowane protokoły przygotowania próbki, ustawienia MS, wstępnego uruchomienia LC, ustalenia metody, akwizycji MS, wieloetapowej operacji MS i ręcznej analizy danych. Dwa reprezentatywne związki w medycynie tybetańskiej nasiona Abelmoschus manihot zidentyfikowano za pomocą wieloetapowej fragmentacji, ze szczegółową analizą typowych struktur złożonych. Ponadto w artykule omówiono takie aspekty, jak wybór trybu jonowego, regulacja fazy ruchomej, optymalizacja zasięgu skanowania, kontrola energii kolizji, przełączanie trybu kolizji, współczynniki fragmentacji i ograniczenia metody. Opracowana ustandaryzowana metoda analizy jest uniwersalna i może być stosowana do nieznanych związków w medycynie tybetańskiej.

Celobiozę wykorzystano jako model do weryfikacji wykonalności MSn w trybie jonów dodatnich. Jak pokazano na Rysunku 2A, ESI-MS (tryb jonów dodatnich) celobiozy [C12H22O11]+ doprowadził do powstania protonowanej cząsteczki [M+H]+ o m/z 365. Skanowanie jonów produktowych (CID-MS/MS) dla [M+H]+ o m/z 365 zaowocowało powstaniem drugiego jonu fragmentacyjnego o m/z 305 (Rysunek 2B), który na...

Tutaj opisujemy ogólny protokół i projekt, który może być zastosowany do identyfikacji śladowych ilości i drobnych składników w złożonych preparatach produktów naturalnych (matrycach) w medycynie tybetańskiej.

Standaryzowana identyfikacja struktury związku w medycynie tybetańskiej za pomocą spektrometrii mas z pułapką jonową i wieloetapowej analizy fragmentacji

Tibetan medicines are complex and contain numerous unknown compounds, making in-depth research on their molecular structures crucial. Liquid ...

Metoda ta może pomóc naukowcom w analizie struktur związków medycyny tybetańskiej, zwłaszcza składników drzewa. Może dostarczyć informacji na temat jakościowych badań zawartości związków w medycynie naturalnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że dokładność uzyskanej w tym przypadku struktury związku jest wyższa niż w przypadku bazy danych.Technika ta może być stosowana w analizie struktury produktów przemiany materii pośredniej w pęcherzu moczowym lub moczu. Na początek przygotowanie próbki nasion tybetańskiej medycyny Abelmoschus manihot. Dokładnie odważ jeden gram AMS i umieść go w stożkowej kolbie zawierającej 30 mililitrów 80% metanolu.Używając ultradźwiękowego sonografu do kąpieli o częstotliwości 40 kiloherców, przeprowadzaj ekstrakcję mieszaniny przez 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie odwirować próbkę o masie 14 000 g przez pięć minut. Przygotować strzykawkę do wstrzykiwań i organiczny filtr z mikroporowatą membraną o grubości 0,22 mikrona, a następnie przefiltrować supernatant do dwumililitrowej butelki na próbkę.Po włączeniu przełącznika pompy próżniowej otwórz główny zawór butli z argonem wraz z zaworem ciśnienia cząstkowego i ustaw ciśnienie na około 0,3 megapaskala. Następnie otwórz zawór azotu. Uruchom oprogramowanie sterujące spektrometrią mas lub MS.Kliknij Podgrzewane źródło ESI w panelu oprogramowania i ustaw parametry MS, w tym temperaturę grzałki, natężenie przepływu gazu, napięcie natrysku dla trybów dodatnich i ujemnych oraz temperaturę kapilary. Kliknij przycisk Zastosuj, aby aktywować źródło jonów do chromatografii cieczowej lub LC. Przygotuj ruchome fazy A i B za pomocą 0,1% kwasu mrówkowego w roztworze wodnym w czystym acetonitrylu. Odgazować je w sonikatorze kąpieli ultradźwiękowej o częstotliwości 40 kiloherców przez co najmniej 15 minut przed podłączeniem roztworów odpowiednio do kanałów płynu A i B.Przygotuj wodny roztwór metanolu w proporcji 1:9 objętościowo, a następnie ręcznie wlej go do butelek z płynem czyszczącym pompy i wtryskiwacza. Po uruchomieniu oprogramowania sterującego LC-MS kliknij Sterowanie bezpośrednie, aby otworzyć panel sterowania LC. Otwórz zawór upustowy w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara na module pompy.Kliknij opcję Więcej, aby otworzyć ustawienie pompy i ustawić parametry przedmuchiwania na pięć mililitrów na minutę przez trzy minuty. Kliknij Usuń, aby rozpocząć usuwanie bąbelków. Po zakończeniu zamknij zawór upustowy.Następnie kliknij Prime Strzykawka, aby płukać strzykawkę przez trzy cykle, Wash Buffer Loop, aby przepłukać pętlę przez jeden cykl i Wash Needle Externally, aby umyć igłę przez jeden cykl. Umieścić butelkę z próbką w próbniku. Kliknij na Instrument Setup, aby otworzyć okno edycji metody i kliknij na New aby utworzyć nową metodę instrumentu LC-MS.Ustal całkowity czas pracy dla metody i ustaw limit ciśnienia. Całkowite natężenie przepływu, gradient przepływu, temperatura próbki, temperatura kolumny i różnica temperatury gotowości w oknie edycji metody. W przypadku metody MS wybierz typ eksperymentu General MS lub MSn.Wprowadź wartości czasu akwizycji, polaryzacji, zakresu masy, liczby wartości przekierowania i czasu trwania. Kliknij Zapisz, aby skonfigurować ustawienia jako metodę instrumentu. Kliknij Sequence Setup (Ustawienia sekwencji), aby otworzyć tabelę sekwencji, w której wprowadź informacje o typie próbki, pliku, nazwie, ścieżce, identyfikatorze próbki, metodzie instrumentu, pozycji i objętości wtrysku.Nagraj tabelę sekwencji, klikając przycisk Zapisz, a następnie zaimplementuj ustawienia i rozpocznij pobieranie MS. Aby załadować dane MS do oprogramowania do przetwarzania danych, kliknij dwukrotnie plik raw w Eksploratorze. W chromatogramie piku bazowego BPI wybierz maksymalny obszar pod krzywą lub AUC, klikając i przeciągając myszą.Odpowiednie widmo MS zostanie wyświetlone w tym samym oknie. Wybierz docelowy jon do następnej analizy MS/MS. Ponownie otwórz okno Edycja metody i w tabeli ustawień MSn ustaw m/z docelowego jonu na jedno miejsce po przecinku w kolumnie Masa nadrzędna.Następnie wybierz tryb kolizji i wprowadź energię kolizji lub wartość CE. Ustaw zakres skanowania MS/MS. Kliknij Zapisz, aby nagrać metodę MS i wprowadź nową nazwę pliku w tabeli sekwencji.Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć pobieranie MS/MS. Po zakończeniu akwizycji kliknij dwukrotnie plik raw w Eksploratorze, aby załadować plik raw MS/MS do oprogramowania do przetwarzania danych. Zidentyfikuj najsilniejszy jon fragmentacyjny w widmie i wprowadź jego wartość m/z do listy metod MSn.W tabeli ustawień MSn ustaw parametry MS3, w tym tryb kolizji, wartość CE i zakres skanowania. Ponownie kliknij przycisk Zapisz, aby nagrać metodę MS i wprowadzić nową nazwę pliku w tabeli sekwencji. Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć pobieranie MS3.Jak pokazano wcześniej, kliknij dwukrotnie plik raw w Eksploratorze, aby załadować plik raw MS3 do oprogramowania do przetwarzania danych i powtórz kroki, aby uzyskać widmo MS4. Aby przeanalizować dane, kliknij dwukrotnie surowe pliki, aby otworzyć wszystkie widma masowe od MS do MSn. Ręcznie oblicz wartości różnicy m/z między jonem a odpowiadającymi mu jonami fragmentacyjnymi.Następnie ręcznie narysuj strukturę rdzenia zgodnie z wynikami MS4 i wyprowadź oryginalną strukturę za pomocą grup funkcyjnych lub segmentów molekularnych na podstawie wartości różnicy m/z. Ręcznie narysuj ścieżki cięcia molekularnego zgodnie z każdą strukturą molekularną w MSn. ESI-MS modelowej celobiozy węglowodanowej wytworzył białkową cząsteczkę M H w temperaturze m/z 365 w trybie dodatnim.Skan jonów produktu, czyli CID MS/MS, spowodował powstanie drugiego jonu fragmentacyjnego o wartości m/z 305. Co więcej, analiza MS3 i MS4 sekwencyjnie doprowadziła do uzyskania trzeciego i czwartego jonu fragmentacyjnego odpowiednio na poziomie m/z 254 i m/z 185. Analiza MS/MS ujawniła sekwencję fragmentacji jonów, a mianowicie hydrolizę otwarcia pierścienia, rozszczepienie CC i odwodnienie.Tak więc ta metoda została uznana za odpowiednią dla węglowodanów. Wstępna analiza jakościowa AMS z wykorzystaniem LC Q-TOF MS wykazała obecność wielu nieznanych związków. Ujemna analiza MSn jonu M H przy m/z 617 wytworzyła drugi jon fragmentacyjny przy m/z 571.Analiza MS3 tego jonu fragmentacyjnego wytworzyła trzeci jon fragmentacyjny o stężeniu m/z 525 w wyniku utraty hydroksyetylu jako metanolu odpowiadającego 32 daltonom i hydroksylu jako wody, czyli 18 daltonów. Analiza MS4 wykazała czwarte jony fragmentacyjne w m/z 344 i 273. Ręczna identyfikacja struktury rdzenia ujawniła strukturę molekularną związku na m/z 617 i jego ścieżki rozszczepienia w MSn.Wykonano skan jonów produktowych jonu M H innego nieznanego związku, ujawniono również jego strukturę molekularną i mechanizm rozszczepienia. Po włączeniu pompy próżniowej odczekaj co najmniej pięć godzin, aby zapewnić wystarczający stopień podciśnienia dla warunków eksperymentalnych. Analiza statystyczna może być wykorzystana do zestawienia fragmentów o takim samym lub podobnym stosunku masy do ładunku.Wraz ze wzrostem liczby rozwiązań w zakresie spektrometrii mas, technika ta może pomóc naukowcom w uzyskaniu nowszych związków w medycynie naturalnej.

standardized-identification-compound-structure-tibetan-medicine-using

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

To badanie wykorzystuje dwuwymiarową, wysokowydajną technologię chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (2D-HPLC-MS) w połączeniu z sieciami molekularnymi, aby odkryć skomplikowany skład chemiczny tybetańskiej rośliny leczniczej Aconitum pendulum Busch (APB). W artykule przedstawiono szczegółowy protokół systematycznego badania i identyfikacji złożonych składników chemicznych leków ziołowych.

Technologia 2D-HPLC-MS połączona z siecią molekularną do identyfikacji składników w medycynie tybetańskiej Tojad wahadłowy

Opisujemy ogólny protokół, który integruje analizę spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości i dokowanie molekularne w badaniach tradycyjnej medycyny chińskiej.

Tandemowa spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości do badania składników chemicznych Gynura bicolor DC

Protokół ten opisuje zastosowanie ultrawydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu z hybrydową spektrometrią mas kwadrupolowo-Orbitrap o wysokiej rozdzielczości (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), połączoną z farmakologią sieciową i dokowaniem molekularnym, w celu przewidywania i walidacji podstaw materialnych wzoru Yiqi Qingjie (YQQJ) w leczeniu nefropatii IgA (IgAN).

Wyjaśnienie materialnych podstaw formuły Yiqi Qingjie wobec nefropatii IgA z wykorzystaniem UHPLC-Q-Orbitrap HRMS zintegrowanego z farmakologią sieciową

Tu przedstawiamy standardowy protokół, który łączy wieloetapowe drzewa spektrometrii masowej z procesem fragmentacji opartym na peroralnym płynie Huoxiang Zhengqi.

Podejście techniczne do analizy strukturalnej nieznaego związku w płynie doustnym Huoxiang Zhengqi na podstawie liniowej spektrometrii mas z pułapką jonów

Ten protokół opisuje specyficzne techniki używane do strukturalnej charakterystyki sekwencji glikozylu na końcu redukującym (RE) i obszarze wewnętrznym heteroksylanów poprzez znakowanie RE 2 aminobenzamidem przed hydrolizą enzymatyczną (endoksylanazą), a następnie analizę powstałych oligosacharydów za pomocą spektrometrii mas (MS) i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)

Przedstawiamy metodę oceny pirogenicznego węgla (PyC) w środowisku za pomocą kwasu polikarboksylowego benzenu (BPCA). Podejście specyficzne dla związku w unikalny sposób dostarcza jednoczesnych informacji o charakterystyce, ilości i składzie izotopowym (13C i 14C) PyC.

Charakterystyka, kwantyfikacja i analiza izotopowa specyficzna dla związku węgla pirogennego przy użyciu polikarboksylowych kwasów benzenowych (BPCA)

Przedstawiono metodę identyfikacji gatunków materiału botanicznego poprzez bezpośrednią analizę w czasie rzeczywistym - spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości i wielowymiarowa analiza statystyczna.

Szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości

Pokazano protokół charakteryzujący skład chemiczny wydychanego powietrza w czasie rzeczywistym za pomocą wtórnej jonizacji nanoelectrospray sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.

Analiza oddechu w czasie rzeczywistym przy użyciu wtórnej jonizacji nanoelektronizacyjnej sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości

Opisany jest protokół ręcznej syntezy oligo-peptoidów, po którym następuje analiza sekwencji za pomocą spektrometrii mas.

Synteza i analiza oligo-peptoidów za pomocą spektrometrii mas

Spektrometria mas jonów wtórnych czasu przelotu jest stosowana do zademonstrowania mapowania chemicznego i morfologii korozji na styku metalu i farby stopu aluminium po wystawieniu na działanie roztworu soli w porównaniu z próbką wystawioną na działanie powietrza.

Obrazowanie korozji na granicy faz metal-farba przy użyciu spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu

Poznaj metodę identyfikacji struktur związków w medycynie tybetańskiej z nasion Abelmoschus manihot przy użyciu spektrometrii mas z pułapką jonową. Technika zapewnia wyższą dokładność niż bazy danych.

Standaryzowana identyfikacja struktury związku w medycynie tybetańskiej za pomocą spektrometrii mas z pułapką jonową i wieloetapowej analizy fragmentacji (Wideo) | JoVE Journal

Standaryzowana identyfikacja struktury związku w medycynie tybetańskiej za pomocą spektrometrii mas z pułapką jonową i wieloetapowej analizy fragmentacji

Przeglądaj więcej filmów