Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji

Epidemiologia oparta na wodzie i ściekach pojawiła się jako alternatywna metoda monitorowania i przewidywania przebiegu epidemii w społecznościach. Metoda flokulacji mleka odtłuszczonego stanowi alternatywne podejście do zagęszczania drobnoustrojów. Metoda flokulacji mleka odtłuszczonego stanowi wszechstronną, tanią i łatwą w obsłudze metodę koncentracji frakcji mikrobiologicznych bez znaczących różnic w porównaniu z metodami ultrafiltracji lub filtracji z przepływem stycznym.

Podejście to jest stosowane w metagenomice lub celowanych badaniach PCR. Po zagęszczeniu frakcji mikrobiologicznych ekstrakcję kwasów nukleinowych można przeprowadzić przy użyciu komercyjnych zestawów ekstrakcyjnych lub wewnętrznego protokołu. Metoda flokulacji mleka odtłuszczonego jest stosunkowo łatwiejsza w przypadku dużych lub małych objętości próbek wody lub ścieków.

W ramach tej metody należy uwzględnić kontrolę tła z wodą Milli-Q. Procedurę zademonstrują Kadir Yanac, Jhannelle Francis i Jocelyn Zambrano-Alvarado, absolwenci z laboratorium Miguela Uyaguariego. Na początek należy pobrać dwa litry 24-godzinnych próbek ścieków surowych o proporcjonalnym przepływie.

Próbki należy przetransportować do laboratorium w nieprzepuszczających światła butelkach w zamrażalni i przetworzyć je w ciągu 24 godzin. Uzyskaj dane o charakterystyce ścieków od personelu technicznego oczyszczalni ścieków. Dla każdej metody ultrafiltracji należy zwiększyć pięć razy 10 do czwartej kopii opancerzonego RNA do 140 mililitrów każdej z sześciu próbek świeżych ścieków pobranych w jednym dniu i sześciu świeżych próbek ścieków w innym dniu.

Homogenizować opancerzony RNA w próbce, mieszając przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza na mieszadle magnetycznym. W przypadku flokulacji mleka odtłuszczonego lub SMF przygotuj 1% roztwór mleka odtłuszczonego, rozpuszczając 0,5 grama odtłuszczonego mleka w proszku w 50 mililitrach syntetycznej wody morskiej. Dostosuj pH SMF do 3,5 za pomocą jednego zwykłego kwasu solnego.

Dodaj pięć mililitrów roztworu odtłuszczonego mleka do 500 mililitrów próbki surowych ścieków. Mieszać próbkę przez osiem godzin i pozostawić uformowane stada na kolejne osiem godzin w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej, nie naruszając osiadłych stad.

Przenieść końcową objętość 50 mililitrów zawierającą stada do probówki wirówkowej i odwirowywać przy 8 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i ostrożnie zeskrobać osad za pomocą wysterylizowanej szpatułki. Zawiesić pozostały osad w 250 mikrolitrach 0,2-molowego buforu fosforanu sodu.

Przenieś zeskrobane i ponownie zawieszone granulki do tej samej 1,5-mililitrowej mini probówki wirówkowej. Przeprowadzić ekstrakcję wirusowego RNA z koncentratów wirusowych próbek ścieków i testy wydajności odzyskiwania przy użyciu zestawu do ekstrakcji RNA o stosunku 25:24:2:1 fenolu do chloroformu, alkoholu izoamylowego i beta merkaptoetanolu 25:24:2:1 zgodnie z instrukcjami producenta. Na koniec eluuj RNA w 50 mikrolitrach buforu elucyjnego.

W przypadku analizy RT-qPCR należy określić ilościowo opancerzony RNA przy użyciu dziesięciokrotnych rozcieńczeń syntetycznego jednoniciowego DNA lub konstruktu gBlock. Uzyskać krzywe kalibracyjne dla każdej serii RT-qPCR. Uwzględnić kontrole ujemne i pobrać próbki w trzech egzemplarzach.

Zbierz 10 litrów próbki wód powierzchniowych środowiska. Dołącz 10 litrów wody dejonizowanej do kontroli tła. Wykonaj filtrację kapsułkową i próżniową za pomocą membranowych filtrów dyskowych o rozmiarach 0,45, 0,2 i 0,1 mikrona, aby zminimalizować szum podczas sekwencjonowania metagenomicznego.

Po filtracji dostosować pH próbki wody do 3,5 za pomocą jednego zwykłego kwasu solnego. Przygotuj 1% wstępnie flokulowany roztwór mleka odtłuszczonego i dostosuj pH do 3,5. Dodaj 100 mililitrów zakwaszonego roztworu odtłuszczonego mleka do 10 litrów zakwaszonej próbki wody środowiskowej.

Mieszać próbkę przez osiem godzin w temperaturze pokojowej na wytrząsarce magnetycznej i pozostawić stada do osadzania się grawitacyjnie przez dodatkowe osiem godzin. Po osiadaniu ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej, nie naruszając stada. Podzielić i zrównoważyć pozostałe stada zgodnie z wagą w 50-mililitrowej probówce wirówkowej i wirówce.

Usunąć sklarowany osad i rozpuścić osad w 200 mikrolitrach 0,2-molowego buforu fosforanu sodu. Potraktuj rozpuszczone osady DNazą I i RNazą A zgodnie z instrukcjami producenta, aby wyeliminować wolne DNA i RNA współstrącone podczas procesu ekstrakcji. Po inkubacji dezaktywuj DNazę I i RNazę A. Ekstrahuj kwasy nukleinowe z rozpuszczonego osadu za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA lub RNA.

Określić ilościowo całkowitą ilość wyekstrahowanego DNA lub RNA z próbki wód powierzchniowych środowiska za pomocą fluorometru. Wykonaj analizę qPCR w celu ukierunkowania na wirusy jelitowe będące przedmiotem zainteresowania i sekwencjonowanie Illumina w celu zidentyfikowania struktury społeczności wirusowej. Zbierz dwa litry próbek wody z chronionych i dotkniętych cieków wodnych.

Jeśli próbka zawiera znaczne zanieczyszczenia, użyj gazy, aby je usunąć. Dodaj 20 mililitrów 1% roztworu mleka odtłuszczonego do wcześniej dostosowanej do pH dwulitrowej próbki słodkiej wody. Mieszać próbkę przez osiem godzin w temperaturze pokojowej i pozostawić stada do osadzania się grawitacyjnie przez dodatkowe osiem godzin.

Po osiadaniu ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pompy perystaltycznej. Przenieść osadzone stada do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i odwirować je w temperaturze 8 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach 0,2-molowego buforu fosforanu sodu.

Wybierz około 0,5 grama stada do ekstrakcji DNA za pomocą wybranego zestawu do izolacji kwasów nukleinowych, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Określić stężenie i czystość DNA za pomocą fluorometru. Wszystkie sześć próbek przetworzonych za pomocą ultrafiltracji w temperaturze 3 000 G było dodatnich.

Natomiast tylko jedna próbka była dodatnia, gdy próbki były przetwarzane z ultrafiltracją w temperaturze 7 500 G. Wszystkie próbki przetworzone za pomocą SMF były dodatnie i skutkowały lepszym odzyskiem. Średnie wskaźniki odzysku 3 000 G i SMF były znacznie i konsekwentnie wyższe niż ultrafiltracja na poziomie 7 500 G. Parametry jakości wody w próbkach pod wpływem oraz kwasy nukleinowe ekstrahowane z próbek wody środowiskowej pobranych w Winnipeg w ciągu trzech sezonów są podsumowane tutaj. Próbki pobrane od kwietnia do października 2022 r. z wody rzeki Assiniboine wykazały najwyższe stężenie DNA z Forested 1, a najniższe stężenie uzyskano z trzeciego obszaru rolniczego.

Bardzo ważne jest, aby użyć odpowiedniego stężenia mleka odtłuszczonego i zakwasić próbkę przed użyciem. Technika ta może zapewnić szybkie badanie przesiewowe różnych patogenów mikrobiologicznych obecnych w próbkach środowiskowych, takich jak woda i ścieki. Dodatkowe modyfikacje można wprowadzić za pomocą matryc stałych, takich jak gleba lub osady.