Name: Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metodę flokulacji mleka odtłuszczonego do zagęszczania wirusów RNA z próbek wody i ścieków. Ta technika jest opłacalna, łatwa w użyciu i skutecznie wspiera epidemiologię środowiskową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez NSERC Alliance Covid-19 Grant (Nagroda nr 431401363, 2020-2021, dr Yuan i dr Uyaguari-Díaz). MUD składa serdeczne podziękowania Uczelnianemu Programowi Grantów Badawczych (Nagroda nr 325201). Zarówno JF, jak i JZA są wspierane przez program szkoleniowy dla absolwentów Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY i JF otrzymali stypendia w ramach programu Mitacs Accelerate. MUD i jego członkowie laboratorium (KY, JF, JZA) są wspierani przez NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) oraz grant operacyjny Research Manitoba New Investigator (nr 5385). Specjalne podziękowania dla miasta Winnipeg w prowincji Manitoba. Badania te zostały przeprowadzone na Uniwersytecie Manitoba. Pragniemy potwierdzić, że kampusy Uniwersytetu Manitoba znajdują się na pierwotnych ziemiach ludów Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota i Dene oraz na terenie ojczyzny narodu Métis.

1. Porównanie seryjnej ultrafiltracji i flokulacji mleka odtłuszczonego w celu koncentracji wirusów w próbkach ścieków
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Pobrać 2 l złożonych próbek ścieków surowych (dopływających proporcjonalnie do przepływu) w ciągu 24 godzin. Próbki pobrano z trzech głównych oczyszczalni ścieków (oczyszczalni ścieków) w Winnipeg w Kanadzie latem i jesienią 2020 r. (tabela 1).</li>
		<li>Próbki należy przetransportować do laboratorium w odpornych na światło butelkach w pojemniku chłodzącym i przetworzyć je w ciągu 24 godzin. Zebrać dane dotyczące charakterystyki fizykochemicznej i biologicznej ścieków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie stężenia wirusa 
	UWAGA: Sekwencyjna metoda ultrafiltracji i metoda flokulacji organicznej, a mianowicie flokulacja mleka odtłuszczonego (SMF), zostały zastosowane do oceny całkowitej skuteczności odzyskiwania każdej metody przy użyciu opancerzonego RNA jako testowego wirusa23. Inni badacze również wykorzystali opancerzone RNA jako wirusa kontrolnego do oceny metod odzyskiwania koncentracji wirusów otoczkowych, takich jak rodzina Coronaviridae22,24,25,26.
	<ol>
		<li>W celu dodania opancerzonego RNA należy ustawić objętości testowe ścieków dla metod ultrafiltracji i SMF odpowiednio na 140 ml i 500 ml. Za pomocą pipetora nabij 5 x 104 kopie opancerzonego RNA do sześciu próbek świeżych ścieków pobranych w jednym dniu i sześciu próbek świeżych ścieków w innym dniu, dla każdej metody ultrafiltracji; ponadto spike six przechowywał (w temperaturze 4 °C) próbki ścieków pobrane w trzecim, późniejszym terminie i przetworzone kilka dni później dla SMF. 
		UWAGA: Każdy z sześciu zestawów próbek pobranych w różnych terminach składał się z dwóch próbek z każdej z trzech oczyszczalni ścieków. W naszym badaniu pierwszy zestaw świeżych próbek ścieków został pobrany 8 lipca 2020 r., drugi 30 września 2020 r., a próbki ścieków, które mają być przechowywane dla SMF 14 października 2020 r.</li>
		<li>Mieszać przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu zaszczepienia i homogenizacji opancerzonego RNA w próbkach za pomocą mieszadła magnetycznego.</li>
		<li>Usuń wszystkie cząstki lub komórki większe niż 0,2 μm i przeprowadź ultrafiltrację.
		<ol>
			<li>Przefiltruj wzbogacone próbki ścieków (120 ml z każdej 140 ml wzbogaconej próbki) przez gazę i niskobiałkowe filtry krążkowe o średnicy 0,45 μm i 0,2 μm, 47 mm, aby usunąć duże cząstki, osady, eukarionty i bakterie27. Przefiltrowane próbki należy przetworzyć przy użyciu metod ultrafiltracji opisanych poniżej. 
			UWAGA: Próbki ścieków pobrane 8 lipca i 30 września zostały wykorzystane do metod ultrafiltracji o wartości odpowiednio 3 000 x g i 7 500 x g.</li>
			<li>W przypadku sekwencyjnej ultrafiltracji przy 3 000 x g (UF-3k x g), należy zagęścić łącznie 120 ml próbki testowej pobranej pierwszego dnia przy 3 000 x g przez 30 minut, ładując 60 ml próbki dwukrotnie do około 5 ml za pomocą urządzenia odśrodkowego marki A, 30 kDa. Następnie zagęścić objętość 5 ml przy 3 000 x g przez 30 minut za pomocą urządzenia odśrodkowego marki B o stężeniu 30 kDa do 500-1 200 μl.</li>
			<li>W przypadku sekwencyjnej ultrafiltracji przy 7,500 x g (UF-7,5k x g) należy zmienić prędkość wirowania urządzenia odśrodkowego marki B z 3,000 x g na 7,500 x g, aby uzyskać mniejsze objętości końcowe, zgodnie z zaleceniami producenta, i utrzymać prędkość wirowania urządzenia odśrodkowego marki A na tym samym poziomie. 
			UWAGA: Testy przeprowadzono na próbkach pobranych 30 września.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku formatu SMF wykonaj czynności opisane poniżej.</li>
		<li>Próbki ścieków (po 500 ml każda) należy pobrać bezpośrednio do koncentratu za pomocą protokołu SMF16,18, bez filtracji wstępnej za pomocą gazy i niskobiałkowych filtrów membranowych, jak opisano poniżej.</li>
		<li>Rozpuścić 0,5 g odtłuszczonego mleka w proszku w 50 ml syntetycznej wody morskiej, aby uzyskać 1% (w/v) roztwór mleka odtłuszczonego i ostrożnie dostosować pH roztworu do 3,5 za pomocą 1 N HCl. 
		UWAGA: Zakwaszenie sprawia, że wirusy agregują się i wytrącają z wody ze względu na zmianę ich punktu izoelektrycznego16 i poprawia rozpuszczalność mleka w proszku28.</li>
		<li>Dodać 5 ml roztworu mleka odtłuszczonego do 500 ml próbek ścieków surowych, aby uzyskać końcowe stężenie mleka odtłuszczonego 0,01% (w/v).</li>
		<li>Mieszać próbki przez 8 godzin ze średnią prędkością i pozostawić uformowane kłaczki do osiadania przez kolejne 8 godzin w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatanty za pomocą pipet serologicznych, nie naruszając osadzonych kłaczków. Przenieść końcową objętość 50 ml zawierającą kłaczki do probówek wirowych i odwirować przy 8 000 x g przez 30 minut w temperaturze 8 °C.</li>
		<li>Ostrożnie zeskrobać granulki za pomocą wysterylizowanej szpatułki i ponownie zawiesić pozostałe granulki w probówkach w 250 μl 0,2 M buforu fosforanu sodu (pH 7,5) po usunięciu supernatantu. Przenieś zeskrobane i ponownie zawieszone granulki do tych samych 1,5 ml mini-probówek wirówek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić ekstrakcję wirusowego RNA z koncentratów wirusowych próbek ścieków i testy wydajności odzyskiwania przy użyciu zestawu do ekstrakcji RNA o stosunku 25:24:1 alkoholu fenolo-chloroformowego:izoamylowego i β-merkaptoetanolu, zgodnie z instrukcjami producenta, w celu poprawy wydajności ekstrakcji. Na koniec eluować RNA w 50 μl buforu elucyjnego.</li>
	<li>Ilościowa analiza łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)
	<ol>
		<li>Określ ilościowo opancerzone RNA za pomocą dziesięciokrotnych rozcieńczeń (7,8 x 10,4 do 7,8 kopii genów) syntetycznego jednoniciowego konstruktu DNA lub gBlock. W Tabeli 2 przedstawiono startery i zestawy sond, które wykrywają i określają ilościowo opancerzone RNA.</li>
		<li>Zaprojektuj zestawy starterów i sond za pomocą narzędzia do projektowania starterów29 i celuj w region 95 pz (konstrukt gBlock) w genomie opancerzonego RNA.</li>
		<li>Uzyskać krzywe kalibracyjne dla każdej serii RT-qPCR. Uwzględnij kontrole ujemne w każdej serii qPCR. Uruchamianie standardów, przykładów i kontrolek innych niż szablony w trzech egzemplarzach.</li>
		<li>Przygotuj każde 10 μl mieszaniny RT-qPCR w następującej kolejności: 2,5 μl 4x mieszanki głównej, 400 nM każdego startera, sonda 200 nM i 2,5 μl matrycy, a także ultraczysta woda destylowana wolna od DNAzy/RNAzy.</li>
		<li>Przeprowadzaj reakcje z cyklami termicznymi w temperaturze 50 °C przez 5 minut, a następnie 45 cykli w temperaturze 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s w systemie PCR w czasie rzeczywistym. Jeśli CT wynosił <40, należy wziąć pod uwagę, że próbka Armored RNA jest dodatnia.</li>
		<li>Przeprowadź testy qPCR i RT-qPCR przy użyciu albuminy surowicy bydlęcej z surowymi próbkami ścieków, aby ocenić możliwość inhibitorów lub zanieczyszczeń, takich jak kwasy humusowe24. Nie zaobserwowano istotnych różnic między próbkami z enzymem i bez niego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć stężenia na podstawie krzywej wzorcowej. Obliczyć procent skuteczności odzysku, dzieląc odzyskane stężenie przez stężenie wzbogacone.</li>
	<li>Przekształć numery kopii genów przy użyciu funkcji logarytmu10 do analizy. Uruchom ogólny model liniowy przy użyciu narzędzia do analizy statystycznej na danych qPCR. Zastosuj test Tukeya, aby wykryć różnice między metodami i zabiegami. Przyjmij, że wartość p wynosi 0,05, aby był minimalnym poziomem istotności dla testu.</li>
</ol>
2. Filtracja i koncentracja wirusów DNA i RNA dla epidemiologii opartej na wodzie
<ol>
	<li>Do zbierania środowiskowych wód powierzchniowych należy pobrać 10 l próbek środowiskowych wód powierzchniowych i użyć 10 l próbek wody dejonizowanej do kontroli tła. Przechowywać wszystkie próbki w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia w ciągu 24 godzin od pobrania próbki.</li>
	<li>Wykonaj koncentrację wirusów z próbek środowiskowych za pomocą SMF, wykonując czynności opisane poniżej.
	<ol>
		<li>Wykonaj filtrację kapsułkową i próżniową przy użyciu kapsułek do pobierania próbek wód gruntowych o dużej pojemności i membranowych filtrów dyskowych o rozmiarach 0,45 μm, 0,2 μm i 0,1 μm, aby zminimalizować szum podczas sekwencjonowania metagenomicznego, od większych frakcji, takich jak mikroeukarionty i bakterie, po mniejsze, takie jak wirusy.</li>
		<li>Przygotuj 1% wagowo wstępnie flokulowany roztwór odtłuszczonego mleka w 1,32 l syntetycznej wody morskiej z 13,2 g odtłuszczonego mleka w proszku. Doprowadzić pH tej zawiesiny do 3,5 przy użyciu 1 N HCl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosować pH próbek wód powierzchniowych środowiska do 3,5 przy użyciu 1 N HCl.</li>
	<li>Przenieść 100 ml wstępnie flokulowanego, zakwaszonego roztworu mleka odtłuszczonego do 10 l zakwaszonej (pH 3,5) próbki wody środowiskowej (końcowe stężenie mleka odtłuszczonego 0,01% [w/v]).</li>
	<li>Za pomocą mieszadła magnetycznego i mieszadła magnetycznego mieszać próbki przez 8 godzin w temperaturze pokojowej i pozostawić kłaczki do osadzania się grawitacyjnie przez dodatkowe 8 godzin. Nie naruszając kłaczków, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej.</li>
	<li>Podzielić i zrównoważyć pozostałe kłaczki zgodnie z wagą w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml i odwirować je w temperaturze 8 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i rozpuścić otrzymany osad (który teoretycznie zawiera wirusy będące przedmiotem zainteresowania) w 200 μl 0,2 M buforu fosforanu sodu.</li>
	<li>Potraktuj rozpuszczony osad DNazą I i RNazą A, postępując zgodnie z instrukcjami producenta, w celu wyeliminowania wolnego DNA i RNA, które mogą być współwytrącone w wyniku zestawu używanego do ekstrakcji kwasów nukleinowych. Dezaktywuj DNazę I i RNazę A zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wyekstrahuj całkowitą ilość kwasów nukleinowych z rozpuszczonego osadu za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA/RNA, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Określić ilościowo całkowitą ilość wyekstrahowanego DNA i RNA z próbek ścieków za pomocą fluorometru. Próbki o stężeniach >1 ng/μl uważa się za optymalne do kwantyfikacji i sekwencjonowania DNA.</li>
	<li>Wykonaj analizę qPCR w celu ukierunkowania na interesujące wirusy jelitowe i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości w celu zidentyfikowania struktury społeczności wirusowej.</li>
</ol>
3. Bezpośrednie wytrącanie i koncentracja frakcji mikrobiologicznych dla epidemiologii opartej na wodzie
<ol>
	<li>Zbierz 2 l próbek wody z chronionych i dotkniętych cieków wodnych. Jeśli próbka zawiera znaczną ilość zanieczyszczeń, użyj gazy, aby je usunąć. 
	UWAGA: Zdecydowanie zaleca się pobranie duplikatu biologicznego na próbkę.</li>
	<li>Przygotuj 1% (w/v) roztwór odtłuszczonego mleka, rozpuszczając 4,4 g odtłuszczonego mleka w proszku w 440 ml syntetycznej wody morskiej. Doprowadzić pH tej zawiesiny do 3,5 za pomocą 1 N HCl.</li>
	<li>Dostosować pH próbek słodkowodnych do 3,5 przy użyciu 1 N HCl.</li>
	<li>Dodać 20 ml roztworu mleka odtłuszczonego do próbek słodkowodnych o 2 litrach wcześniej skorygowanego pH (końcowe stężenie mleka odtłuszczonego 0,01% [w/v]). Mieszać próbki w temperaturze pokojowej przez 8 godzin.</li>
	<li>Pozostawić kłaczki do osadzania się grawitacyjnie przez kolejne 8 godzin. Ostrożnie usunąć supernatanty za pomocą pompy perystaltycznej. Przenieść osadzone kłaczki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować je w temperaturze 8 000 x g przez 30 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki za pomocą 200 μl 0,2 M buforu fosforanu sodu. Przechowuj próbki w temperaturze -20 °C lub wybierz ~ 0,5 g kłaczków do ekstrakcji DNA drobnoustrojów przy użyciu wybranego zestawu do izolacji kwasów nukleinowych, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Określ stężenie i czystość kwasu nukleinowego DNA za pomocą fluorometru o wysokiej czułości. Próbki o stężeniach >1 ng/μl powinny być optymalne do oznaczania ilościowego i sekwencjonowania DNA.</li>
</ol>

<ol><li>Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wastewater-based+epidemiology+for+community+monitoring+of+SARS-CoV-2%3A+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Environmental+Au%22%5BJournal%5D)">Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges.</a> ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).</li>
<li>Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+concentration-The+critical+step+in+implementing+the+wastewater+based+epidemiology+for+the+COVID-19+pandemic%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review.</a> The Science of The Total Environment. 747, 141245(2020).</li>
<li>Bi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+household+transmission+of+SARS-CoV-2+from+a+population-based+serological+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey.</a> Nature Communications. 12, 3643(2021).</li>
<li>Day, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covid-19%3A+identifying+and+isolating+asymptomatic+people+helped+eliminate+virus+in+Italian+village%5BTitle%5D)+AND+%22British+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village.</a> British Medical Journal. 368, 1165(2020).</li>
<li>Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19%3A+in+the+footsteps+of+Ernest+Shackleton%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton.</a> Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).</li>
<li>Bivins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wastewater-based+epidemiology%3A+global+collaborative+to+maximize+contributions+in+the+fight+against+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19.</a> Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).</li>
<li>Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+SARS-Coronavirus-2+RNA+in+sewage+and+correlation+with+reported+COVID-19+prevalence+in+the+early+stage+of+the+epidemic+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands.</a> Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).</li>
<li>Thompson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+waves%3A+Wastewater+surveillance+of+SARS-CoV-2+for+population-based+health+management%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management.</a> Water Research. 184, 116181(2020).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+RNA+concentrations+in+wastewater+foreshadow+dynamics+and+clinical+presentation+of+new+COVID-19+cases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases.</a> The Science of the Total Environment. 805, 150121(2022).</li>
<li>Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+measuring+the+recovery+of+SARS-CoV-2+from+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater.</a> Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).</li>
<li>Chik, A. H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+approaches+to+quantify+SARS-CoV-2+in+wastewater+using+RT-qPCR%3A+Results+and+implications+from+a+collaborative+inter-laboratory+study+in+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada.</a> Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).</li>
<li>Hjelmsø, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+the+concentration+and+extraction+of+viruses+from+sewage+in+the+context+of+metagenomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing.</a> PLoS One. 12 (1), e0170199(2017).</li>
<li>Philo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+SARS-CoV-2+wastewater+concentration+methods+for+environmental+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance.</a> The Science of the Total Environment. 760, 144215(2021).</li>
<li>Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+concentration+methods+for+quantitative+detection+of+sewage-associated+viral+markers+in+environmental+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+classic+and+emerging+viruses+by+skimmed-milk+flocculation+and+PCR+in+river+water+from+two+geographical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas.</a> Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples%3A+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methods+for+the+concentration+of+viruses+from+urban+sewage+using+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR.</a> Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).</li>
<li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses%2C+bacteria+and+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li>
<li>Assis, A. S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+skimmed-milk+flocculation+method+for+recovery+of+adenovirus+from+sludge%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge.</a> The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).</li>
<li>Goncharova, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+quantitative+RT-PCR+assay+with+armored+RNA+controls+for+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2.</a> Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).</li>
<li>Yu, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+armored+RNA+as+a+control+for+multiplex+real-time+reverse+transcription-PCR+detection+of+influenza+virus+and+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).</li>
<li>Alygizakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methodologies+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+in+wastewater%3A+Protocols+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives.</a> Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125(2021).</li>
<li>Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+human+enteric+viruses+as+alternative+indicators+of+fecal+pollution+to+evaluate+wastewater+treatment+processes%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes.</a> PeerJ. 10, e12957(2022).</li>
<li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19+surveillance+in+Southeastern+Virginia+using+wastewater-based+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology.</a> Water Research. 186, 116296(2020).</li>
<li>Hietala, S. K., Crossley, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Armored+RNA+as+virus+surrogate+in+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+proficiency+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).</li>
<li>Uyaguari-Diaz, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+method+for+amplicon-based+and+metagenomic+characterization+of+viruses%2C+bacteria%2C+and+eukaryotes+in+freshwater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples.</a> Microbiome. 4 (1), 20(2016).</li>
<li>Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+change+in+pH+of+skim+milk+and+ultrafiltered%2Fdiafiltered+retentates+on+milk+protein+concentrate+%28MPC70%29+powder+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties.</a> Journal of Food Science and Technology. 55 (9), Geneious. https://www.geneious.com. 3526-3537 (2018).</li>
<li>Geneious. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.geneious.com">https://www.geneious.com</a> (2021).</li>
<li>Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivability%2C+partitioning%2C+and+recovery+of+enveloped+viruses+in+untreated+municipal+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater.</a> Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).</li>
<li>Philo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+the+skimmed+milk+pellet+extraction+protocol+for+SARS-CoV-2+wastewater+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Environmental+Virology%22%5BJournal%5D)">Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance.</a> Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).</li>
<li>Monteiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+SARS-CoV-2+from+large+volumes+of+raw+wastewater+is+enhanced+with+the+inuvai+R180+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journalof+Environmental+Management%22%5BJournal%5D)">Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system.</a> Journalof Environmental Management. 304, 114296(2022).</li>
<li>Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+throughout+wastewater+treatment+plants+and+a+modeling+approach+to+understand+COVID-19+infection+dynamics+in+Winnipeg%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada.</a> The Science of The Total Environment. 825, 153906(2022).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Jednym z krytycznych etapów tego badania jest eliminacja cząstek stałych poprzez zastosowanie etapu filtracji wstępnej z filtrami membranowymi 0,2 μm i 0,45 μm. Biorąc pod uwagę podział wirusów na cząstki stałe, zwłaszcza wirusy otoczkowe, filtracja wstępna może spowodować znaczne straty w odzyskiwaniu wirusa30. Podczas gdy etap filtracji wstępnej w przypadku metod ultrafiltracji jest prawie zawsze konieczny w przypadku próbek środowiskowych i ścieków, aby zapobiec zatykaniu się urządzeń ultrafilt...

Określenie efektywnego stężenia mikroorganizmów w próbkach powierzchniowych i ściekowych do analizy społeczności mikrobiologicznej i badań epidemiologicznych, jest jednym z ważnych kroków do monitorowania i przewidywania przebiegu epidemii w społecznościach1,2. Pandemia COVID-19 unaoczniła znaczenie doskonalenia metod koncentracji. COVID-19 pojawił się pod koniec 2019 r. i od marca 2023 r. nadal stanowi zagrożenie dla zdrowia ludzkiego, życia społecznego i gospodarki. Skuteczne strategie nadzoru i kontroli mające na celu złagodzenie skutków epidemii COVID-19 w społecznościach stały się ważnym tematem badawczym, ponieważ oprócz szybkiej transmisji i rozprzestrzeniania się wirusa, a także niezgłoszonych i niezdiagnozowanych przypadków bezobjawowych, pojawiają się nowe fale i warianty COVID-19, a także niezgłoszone i niezdiagnozowane przypadki bezobjawowe3,4,5. Wykorzystanie epidemiologii COVID-19 opartej na ściekach przez organizacje społeczeństwa obywatelskiego, agencje rządowe oraz publiczne lub prywatne przedsiębiorstwa użyteczności publicznej było pomocne w szybkim dostarczaniu informacji związanych z epidemią i łagodzeniu skutków epidemii COVID-196,7,8,9. Jednak stężenie SARS-CoV-2, wirusa otoczkowego RNA, w próbkach ścieków nadal stanowi wyzwanie10. Na przykład jednym z tych wyzwań jest podział SARS-CoV-2 w ciałach stałych ścieków, co może mieć wpływ na odzysk, gdy ciała stałe są eliminowane podczas koncentracji11. W takim przypadku kwantyfikacja/ocena powinna koncentrować się zarówno na fazie stałej, jak i wodnej próbek wody w środowisku, a nie tylko na fazie wodnej. Ponadto wybór metody zatężania może być modyfikowany w oparciu o dalsze badania i analizy. Koncentracja cząsteczek wirusa i patogenów w próbkach środowiskowych stała się pilnym tematem badawczym dzięki postępom w dziedzinie sekwencjonowania i mikrobiomu.
Zastosowano różne metody koncentracji wirusów w dziedzinie koncentracji wirusa z próbek wody i ścieków ze środowiska. Niektóre powszechnie stosowane metody to filtracja, flokulacja mleka odtłuszczonego (SMF), adsorpcja/elucja i wytrącanie glikolu polietylenowego12-17. Wśród nich SMF został uznany za tanią i skuteczną metodę, pomyślnie przetestowaną i stosowaną do odzyskiwania wirusów, w tym SARS-CoV-2, ze ścieków i wód powierzchniowych12,15,16,18. Procedura SMF jest stosunkowo nowym podejściem, które zyskało coraz większe uznanie w wielu badaniach środowiskowych jako odpowiednia metodologia jednoczesnego odzyskiwania szerokiej gamy mikroorganizmów, takich jak wirusy, bakterie i pierwotniaki, ze wszystkich rodzajów próbek wody, a mianowicie szlamów, ścieków surowych, ścieków i próbek ścieków19. W porównaniu z innymi znanymi metodologiami odzyskiwania wirusów z próbek środowiskowych, takimi jak ultrafiltracja i elucja alkaliczna glicyny, podejście oparte na liofilizacji lub ultrawirowanie i elucja alkaliczna glicyny, SMF została uznana za najbardziej efektywną metodę o wyższych wskaźnikach odzyskiwania i wykrywania wirusów18,20. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy opancerzony RNA jako wirusa testowego do oceny skuteczności odzyskiwania metod koncentracji wirusa, w tym testów do oceny wyzdrowienia SARS-CoV-221,22.
Tutaj przetestowaliśmy próbki ścieków i wody środowiskowej, aby zademonstrować użyteczność SMF i metody sekwencyjnej ultrafiltracji do koncentracji frakcji mikrobiologicznych do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), metagenomiki opartej na sekwencjach i sekwencjonowania głębokiej amplikonu. SMF jest metodą stosunkowo tańszą i optymalną dla większej objętości próbek w porównaniu z metodami ultrafiltracji. Pomysł zastosowania metody ultrafiltracji sekwencyjnej zrodził się z konieczności zmniejszenia końcowej objętości koncentratów wirusowych w czasie pandemii COVID-19, kiedy podaż powszechnie stosowanych urządzeń do ultrafiltracji była ograniczona i zaistniała potrzeba opracowania alternatywnych metod koncentracji wirusów.

<table><tbody><tr><td>0,2 M bufor fosforanowo-sodowy o pH 7,5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62041AP</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA</td></tr><tr><td>0,2 &mu; m 47-mm membranowe filtry tarczowe Supor-200</td><td>VWR</td><td>66234</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>0,45 &mu; M 47-mm Filtry talerzowe membranowe Supor-200</td><td>VWR</td><td>60043</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444432</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td></tr><tr><td>Opancerzony RNA Quant IPC-1 Kontrola przetwarzania</td><td>Asuragen</td><td>49650</td><td>Asuragen, Austin, TX, USA</td></tr><tr><td>Marka A, Urządzenie odśrodkowe Jumbosep, 30 kDa</td><td>Pall&nbsp;</td><td>OD030C65</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor,</td></tr><tr><td>MI Brand B, Urządzenie odśrodkowe Microsep Advance, 30 kDa</td><td>Pall</td><td>MCP010C46</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor,</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe MI (50 ml)&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050PK</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Dyna Mag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12027</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>GWV Kapsułki do pobierania próbek wód gruntowych o dużej pojemności - 0,45 &mikro; m</td><td>Pall</td><td>12179</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>Kwas solny, roztwór wzorcowy 1N</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC124210025</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji ultra kwasów nukleinowych MagMAX Microbiome</td><td>Applied biosystems</td><td>A42358</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Promega</td><td>P1197</td><td>Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Masterflex, przyrząd Cole-Parmer</td><td>7553-20</td><td>Miernik pH Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Instrument Denver</td><td>RK-59503-25</td><td>Cole-Parmer. Ten produkt został wycofany z produkcji</td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy 25:24:1</td><td>Invitrogen</td><td>15593031</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA</td></tr><tr><td>Zestawy podkładów i sond</td><td>IDT</td><td></td><td>Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA</td></tr><tr><td>Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome</td><td>kit Qiagen Qiagen</td><td></td><td>Sciences, Inc., Germantown, MD, USA</td></tr><tr><td>QuantStudio 5 PCR w czasie rzeczywistym System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A34322</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit 1X dsDNA o wysokiej czułości (HS)</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231</td><td>Termo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 4, z WiFi</td> Zestaw do oznaczania <td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Qubit RNA o wysokiej czułości (HS)</td><td>Invitrogen</td><td>Q32855</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>RNAzywa A</td><td>Invitrogen</td><td>EN0531</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>RNeasy PowerMicrobiome Kit</td><td>Qiagen</td><td>26000-50</td><td>Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA</td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Difco (BD Life Sciences)</td><td>DF0032173</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA</td></tr><tr><td>Bufor fosforanu sodu</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td>Alfa Aesar, Ottawa, ON, Kanada</td></tr><tr><td>Syntetyczna woda morska</td><td>VWR&nbsp;</td><td>RC8363-1</td><td>Firma chemiczna RICCA</td></tr><tr><td>Syntetyczne jednoniciowe DNA gBlock</td><td>IDT</td><td></td><td>Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA</td></tr><tr><td>Urządzenia do filtracji próżniowej VacuCap 90 - 0,1 i mikro; m, 90 mm, napromieniowane promieniami gamma</td><td>Pall</td><td>4621</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>VacuCap 90 Urządzenia do filtracji próżniowej - 0,2 i mikro; m, 90 mm, napromieniowany promieniami gamma</td><td>Pall</td><td>4622</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI&</td></tr><tr><td>beta;-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, Stany Zjednoczone</td></tr></tbody></table>

zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji

Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration

Epidemiologia oparta na wodzie i ściekach pojawiła się jako alternatywne metody monitorowania i przewidywania przebiegu epidemii w społecznościach. Odzyskiwanie frakcji mikrobiologicznych, w tym wirusów, bakterii i mikroeukariontów ze ścieków i próbek wody środowiskowej jest jednym z najtrudniejszych kroków w tych podejściach. W tym badaniu skupiliśmy się na skuteczności odzyskiwania metod sekwencyjnej ultrafiltracji i flokulacji mleka odtłuszczonego (SMF) przy użyciu opancerzonego RNA jako wirusa testowego, który jest również używany jako kontrola w niektórych innych badaniach. Zastosowano filtrację wstępną z membranowymi filtrami dyskowymi 0,45 μm i 0,2 μm w celu wyeliminowania cząstek stałych przed ultrafiltracją, aby zapobiec zatykaniu się urządzeń ultrafiltracyjnych. Próbki testowe, przetworzone metodą sekwencyjnej ultrafiltracji, odwirowano z dwiema różnymi prędkościami. Zwiększona prędkość skutkowała niższymi wskaźnikami odzyskiwania i pozytywności opancerzonego RNA. Z drugiej strony, SMF skutkowało stosunkowo stałymi wskaźnikami odzyskiwania i pozytywności opancerzonego RNA. Dodatkowe testy przeprowadzone na próbkach wody środowiskowej wykazały przydatność SMF do koncentracji innych frakcji mikrobiologicznych. Podział wirusów na cząstki stałe może mieć wpływ na ogólne wskaźniki odzysku, biorąc pod uwagę etap filtracji wstępnej zastosowany przed ultrafiltracją próbek ścieków. SMF z filtracją wstępną działał lepiej, gdy był stosowany do próbek wody środowiskowej ze względu na niższe stężenia ciał stałych w próbkach, a tym samym niższe szybkości rozdzielania na ciała stałe. W niniejszej pracy pomysł zastosowania sekwencyjnej metody ultrafiltracji zrodził się z konieczności zmniejszenia końcowej objętości koncentratów wirusowych w czasie pandemii COVID-19, kiedy podaż powszechnie stosowanych urządzeń do ultrafiltracji była ograniczona i zaistniała potrzeba opracowania alternatywnych metod zagęszczania wirusów.

Ocena metod oznaczania stężenia RNA wirusowego 
Wszystkie sześć próbek przetworzonych przy UF-3k x g było dodatnich i wykazało odzysk na poziomie 13,38% ± 8,14% (Rycina 1). Tylko jedna próbka była dodatnia, gdy próbki przetwarzano przy UF-7,5k x g. Wszystkie próbki przetworzone za pomocą SMF były dodatnie i wykazały odzysk na poziomie 15,27% ± 2,65% (Rycina 1). Średnie wskaźniki odzysku dla UF-3K x g oraz SMF były i...

Stężenie wirusa z próbek wody i ścieków środowiskowych jest trudnym zadaniem, przeprowadzanym głównie w celu identyfikacji i kwantyfikacji wirusów. Chociaż opracowano i przetestowano kilka metod koncentracji wirusów, tutaj wykazujemy skuteczność ultrafiltracji i flokulacji mleka odtłuszczonego dla wirusów RNA z różnymi typami próbek.

Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji

Water and wastewater-based epidemiology have emerged as alternative methods to monitor and predict the course of outbreaks in communities.&#160;The ...

Epidemiologia oparta na wodzie i ściekach pojawiła się jako alternatywna metoda monitorowania i przewidywania przebiegu epidemii w społecznościach. Metoda flokulacji mleka odtłuszczonego stanowi alternatywne podejście do zagęszczania drobnoustrojów. Metoda flokulacji mleka odtłuszczonego stanowi wszechstronną, tanią i łatwą w obsłudze metodę koncentracji frakcji mikrobiologicznych bez znaczących różnic w porównaniu z metodami ultrafiltracji lub filtracji z przepływem stycznym.Podejście to jest stosowane w metagenomice lub celowanych badaniach PCR. Po zagęszczeniu frakcji mikrobiologicznych ekstrakcję kwasów nukleinowych można przeprowadzić przy użyciu komercyjnych zestawów ekstrakcyjnych lub wewnętrznego protokołu. Metoda flokulacji mleka odtłuszczonego jest stosunkowo łatwiejsza w przypadku dużych lub małych objętości próbek wody lub ścieków.W ramach tej metody należy uwzględnić kontrolę tła z wodą Milli-Q. Procedurę zademonstrują Kadir Yanac, Jhannelle Francis i Jocelyn Zambrano-Alvarado, absolwenci z laboratorium Miguela Uyaguariego. Na początek należy pobrać dwa litry 24-godzinnych próbek ścieków surowych o proporcjonalnym przepływie.Próbki należy przetransportować do laboratorium w nieprzepuszczających światła butelkach w zamrażalni i przetworzyć je w ciągu 24 godzin. Uzyskaj dane o charakterystyce ścieków od personelu technicznego oczyszczalni ścieków. Dla każdej metody ultrafiltracji należy zwiększyć pięć razy 10 do czwartej kopii opancerzonego RNA do 140 mililitrów każdej z sześciu próbek świeżych ścieków pobranych w jednym dniu i sześciu świeżych próbek ścieków w innym dniu.Homogenizować opancerzony RNA w próbce, mieszając przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza na mieszadle magnetycznym. W przypadku flokulacji mleka odtłuszczonego lub SMF przygotuj 1% roztwór mleka odtłuszczonego, rozpuszczając 0,5 grama odtłuszczonego mleka w proszku w 50 mililitrach syntetycznej wody morskiej. Dostosuj pH SMF do 3,5 za pomocą jednego zwykłego kwasu solnego.Dodaj pięć mililitrów roztworu odtłuszczonego mleka do 500 mililitrów próbki surowych ścieków. Mieszać próbkę przez osiem godzin i pozostawić uformowane stada na kolejne osiem godzin w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej, nie naruszając osiadłych stad.Przenieść końcową objętość 50 mililitrów zawierającą stada do probówki wirówkowej i odwirowywać przy 8 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i ostrożnie zeskrobać osad za pomocą wysterylizowanej szpatułki. Zawiesić pozostały osad w 250 mikrolitrach 0,2-molowego buforu fosforanu sodu.Przenieś zeskrobane i ponownie zawieszone granulki do tej samej 1,5-mililitrowej mini probówki wirówkowej. Przeprowadzić ekstrakcję wirusowego RNA z koncentratów wirusowych próbek ścieków i testy wydajności odzyskiwania przy użyciu zestawu do ekstrakcji RNA o stosunku 25:24:2:1 fenolu do chloroformu, alkoholu izoamylowego i beta merkaptoetanolu 25:24:2:1 zgodnie z instrukcjami producenta. Na koniec eluuj RNA w 50 mikrolitrach buforu elucyjnego.W przypadku analizy RT-qPCR należy określić ilościowo opancerzony RNA przy użyciu dziesięciokrotnych rozcieńczeń syntetycznego jednoniciowego DNA lub konstruktu gBlock. Uzyskać krzywe kalibracyjne dla każdej serii RT-qPCR. Uwzględnić kontrole ujemne i pobrać próbki w trzech egzemplarzach.Zbierz 10 litrów próbki wód powierzchniowych środowiska. Dołącz 10 litrów wody dejonizowanej do kontroli tła. Wykonaj filtrację kapsułkową i próżniową za pomocą membranowych filtrów dyskowych o rozmiarach 0,45, 0,2 i 0,1 mikrona, aby zminimalizować szum podczas sekwencjonowania metagenomicznego.Po filtracji dostosować pH próbki wody do 3,5 za pomocą jednego zwykłego kwasu solnego. Przygotuj 1% wstępnie flokulowany roztwór mleka odtłuszczonego i dostosuj pH do 3,5. Dodaj 100 mililitrów zakwaszonego roztworu odtłuszczonego mleka do 10 litrów zakwaszonej próbki wody środowiskowej.Mieszać próbkę przez osiem godzin w temperaturze pokojowej na wytrząsarce magnetycznej i pozostawić stada do osadzania się grawitacyjnie przez dodatkowe osiem godzin. Po osiadaniu ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej, nie naruszając stada. Podzielić i zrównoważyć pozostałe stada zgodnie z wagą w 50-mililitrowej probówce wirówkowej i wirówce.Usunąć sklarowany osad i rozpuścić osad w 200 mikrolitrach 0,2-molowego buforu fosforanu sodu. Potraktuj rozpuszczone osady DNazą I i RNazą A zgodnie z instrukcjami producenta, aby wyeliminować wolne DNA i RNA współstrącone podczas procesu ekstrakcji. Po inkubacji dezaktywuj DNazę I i RNazę A. Ekstrahuj kwasy nukleinowe z rozpuszczonego osadu za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA lub RNA.Określić ilościowo całkowitą ilość wyekstrahowanego DNA lub RNA z próbki wód powierzchniowych środowiska za pomocą fluorometru. Wykonaj analizę qPCR w celu ukierunkowania na wirusy jelitowe będące przedmiotem zainteresowania i sekwencjonowanie Illumina w celu zidentyfikowania struktury społeczności wirusowej. Zbierz dwa litry próbek wody z chronionych i dotkniętych cieków wodnych.Jeśli próbka zawiera znaczne zanieczyszczenia, użyj gazy, aby je usunąć. Dodaj 20 mililitrów 1% roztworu mleka odtłuszczonego do wcześniej dostosowanej do pH dwulitrowej próbki słodkiej wody. Mieszać próbkę przez osiem godzin w temperaturze pokojowej i pozostawić stada do osadzania się grawitacyjnie przez dodatkowe osiem godzin.Po osiadaniu ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pompy perystaltycznej. Przenieść osadzone stada do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i odwirować je w temperaturze 8 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach 0,2-molowego buforu fosforanu sodu.Wybierz około 0,5 grama stada do ekstrakcji DNA za pomocą wybranego zestawu do izolacji kwasów nukleinowych, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Określić stężenie i czystość DNA za pomocą fluorometru. Wszystkie sześć próbek przetworzonych za pomocą ultrafiltracji w temperaturze 3 000 G było dodatnich.Natomiast tylko jedna próbka była dodatnia, gdy próbki były przetwarzane z ultrafiltracją w temperaturze 7 500 G. Wszystkie próbki przetworzone za pomocą SMF były dodatnie i skutkowały lepszym odzyskiem. Średnie wskaźniki odzysku 3 000 G i SMF były znacznie i konsekwentnie wyższe niż ultrafiltracja na poziomie 7 500 G. Parametry jakości wody w próbkach pod wpływem oraz kwasy nukleinowe ekstrahowane z próbek wody środowiskowej pobranych w Winnipeg w ciągu trzech sezonów są podsumowane tutaj. Próbki pobrane od kwietnia do października 2022 r. z wody rzeki Assiniboine wykazały najwyższe stężenie DNA z Forested 1, a najniższe stężenie uzyskano z trzeciego obszaru rolniczego.Bardzo ważne jest, aby użyć odpowiedniego stężenia mleka odtłuszczonego i zakwasić próbkę przed użyciem. Technika ta może zapewnić szybkie badanie przesiewowe różnych patogenów mikrobiologicznych obecnych w próbkach środowiskowych, takich jak woda i ścieki. Dodatkowe modyfikacje można wprowadzić za pomocą matryc stałych, takich jak gleba lub osady.

concentration-virus-particles-from-environmental-water-wastewater

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Szybkość wymiany wirusów w systemach morskich i słodkowodnych można oszacować za pomocą techniki redukcji i ponownego pojawienia się. Uzyskane dane pozwalają badaczom wywnioskować tempo śmiertelności mikroorganizmów indukowanej przez wirusy w systemach wodnych.

Szacowanie szybkości produkcji wirusów w systemach wodnych

Badanie opisuje kosztowo efektywną metodę identyfikacji źródła zanieczyszczenia kałowego/moczowego lub zanieczyszczenia azotanami w wodzie z wykorzystaniem qPCR do specyficznej kwantyfikacji ludzkich/świńskich/bydlęcych wirusów DNA, adenowirusów i poliomawirusów, proponowanych jako narzędzia MST.

Kosztowo efektywna metoda śledzenia źródeł mikrobów z wykorzystaniem specyficznych wirusów ludzkich i zwierzęcych

Filtry z wełny szklanej były wykorzystywane do zagęszczania wirusów przenoszonych przez wodę przez liczne grupy badawcze na całym świecie. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą metodę konstruowania filtrów z wełny szklanej i wykazujemy, że są one również skuteczne w zagęszczaniu wodnych patogenów wirusowych, bakteryjnych i pierwotniakowych.

Filtry z wełny szklanej do zagęszczania wirusów przenoszonych przez wodę oraz rolniczych patogenów odzwierzęcych

Opracowano podejście do identyfikacji optymalnych warunków koncentracji wirusa dla małych objętości próbek wody przy użyciu kolców ludzkiego adenowirusa. Opisane tutaj techniki są wykorzystywane do identyfikacji parametrów stężenia dla innych celów wirusowych i stosowane do eksperymentów z stężeniem wirusa na dużą skalę.

Procedura małej objętości do pomiaru stężenia wirusa z wody

Metoda EPA 1615 wykorzystuje filtr elektrododatni do koncentracji enterowirusów i norowirusów w środowisku i wodach pitnych. Niniejszy manuskrypt opisuje procedurę pobierania próbek do analiz metodą 1615.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. I. Pobieranie próbek wirusów

Tutaj prezentujemy procedurę pomiaru całkowitej liczby wirusów zdolnych do hodowli za pomocą linii komórkowej nerki Buffalo Green Monkey. Procedura zapewnia ustandaryzowane narzędzie do pomiaru występowania zakaźnych wirusów w środowisku i wodach pitnych.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. II. Całkowity test na obecność wirusa hodowlanego

Opisujemy tutaj najnowsze osiągnięcia w izolacji wirusów w celu scharakteryzowania nowych genotypów wirusa Faustowirusa, nowej linii gigantycznych wirusów związanej z asfarwirusem. Protokół ten może być stosowany do wysokoprzepustowej izolacji wirusów, zwłaszcza gigantycznych wirusów infekujących ameby.

Szybka strategia izolacji nowych faustowirusów z próbek środowiskowych przy użyciu Vermamoeba vermiformis

Tutaj prezentujemy VirWaTest, który jest prostą, niedrogą i przenośną metodą koncentracji i wykrywania wirusów z próbek wody w miejscu użycia.

VirWaTest, metoda punktowa do wykrywania wirusów w próbkach wody

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

W tym miejscu opisano metody pobierania próbek ze stref eufotowych ekosystemów morskich i słodkowodnych w celu wyizolowania cyjanofagów (i ich gospodarzy) oraz procesy po pobraniu próbek, które wzbogacają pojedyncze genotypy i charakteryzują dynamikę interakcji wirus-gospodarz.

Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium

Poznaj metodę flokulacji mleka odtłuszczonego do zagęszczania wirusów RNA z próbek wody i ścieków. Ta technika jest opłacalna, łatwa w użyciu i skutecznie wspiera epidemiologię środowiskową.

Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji (Wideo) | JoVE Journal

Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji

Przeglądaj więcej filmów