Name: Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o niskiej zawartości endotoksyn pochodzących z linii komórek rakowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Poznaj metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o niskiej zawartości endotoksyn z linii komórek SW480 i SW620. Protokół zapewnia niezawodne wyniki badań dzięki aseptycznym technikom i odpowiednim materiałom.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowe Centrum Nauki, Polska, numer grantu 2019/33/B/NZ5/00647. Dziękujemy prof. Tomaszowi Gosiewskiemu i Agnieszce Krawczyk z Zakładu Molekularnej Mikrobiologii Medycznej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego za nieocenioną pomoc w wykrywaniu bakteryjnego DNA w pojazdach elektrycznych.

1. Przygotowanie probówek do ultrawirówek
<ol>
	<li>Używaj sterylnych probówek jednorazowego użytku. Jeśli nie jest to możliwe, należy ponownie użyć probówek ultrawirówek po umyciu ich detergentem za pomocą sterylnej pipety Pasteura lub innych jednorazowych aplikatorów. Pamiętaj, że probówki do ultrawirówek powinny być dedykowane do jednego rodzaju wirowanego materiału (supernatant do hodowli komórkowych/surowica/osocze) i gatunku (człowiek/mysz/itp.).</li>
	<li>Po umyciu detergentem wypłucz probówki ultrawirówki dejonizowaną wodą bez LPS 3x. 
	UWAGA: Nie używaj wody niskiej jakości.</li>
	<li>Wysuszyć probówki ultrawirówkowe, a następnie napełnić je 70% etanolem. Pozostaw rurki z 70% etanolem do dezynfekcji przez noc. Usuń etanol i ponownie wysusz rurki.</li>
	<li>Umieść probówki i nakrętki w opakowaniu do sterylizacji i szczelnie je zamknij. Użyj metody sterylizacji plazmą lub gazem (tlenek etylenu)18,19. Probówki ultrawirówkowe zamknięte w opakowaniu do sterylizacji należy przechowywać w suchym miejscu i zużyć przed upływem terminu ważności. 
	UWAGA: Przeprowadzaj comiesięczne monitorowanie poziomu LPS w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i wodzie używanej do izolacji pojazdów elektrycznych. Monitorowanie powinno obejmować również probówki (np. poprzez badanie wody [kontrola mycia], która była przechowywana w probówkach ultrawirówek przez noc w temperaturze pokojowej [RT]).</li>
</ol>
2. Przygotowanie płodowej surowicy bydlęcej o niskiej zawartości endotoksyn (EE-FBS)
<ol>
	<li>Upewnij się, że używasz FBS o bardzo niskiej zawartości endotoksyny (dostępnej w handlu; patrz tabela materiałów; <0,1 EU/ml).</li>
	<li>Umieścić butelkę FBS o bardzo niskiej zawartości endotoksyny w łaźni wodnej i inkubować w temperaturze 56 °C przez 30 minut. Ten krok jest wymagany do dezaktywacji układu dopełniacza.</li>
	<li>Odpipetować inaktywowany FBS do ultrawirówek i odwirować go przy 100 000 x g przez 4 godziny w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant do sterylnych probówek o pojemności 50 ml, upewniając się, że nie przekracza to 45 ml na probówkę, aby uniknąć zanieczyszczenia nakrętki i zwilżenia pierścienia probówki.</li>
	<li>Tak przygotowaną surowicę EE-FBS przechowywać w temperaturze -20 °C. Sprawdzić stężenie LPS w EE-FBS (krok 6). Stężenie LPS powinno być na tym samym poziomie, co przed ultrawirowaniem.</li>
</ol>
3. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>W tym badaniu posiewu linie komórkowe SW480 i SW620 w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 4,5 g / L glukozy, L-glutaminą, pirogronianem sodu i gentamycyną (50 μl / ml) uzupełniono odpowiednio 10% EE-FBS w kolbach hodowlanych o długości 75 cm2 przy użyciu techniki aseptycznej. Wysiewaj prawie 4,5 x 106 komórek i 6,5 x 106 komórek na kolbę odpowiednio dla SW480 i SW620.</li>
	<li>Zbieraj supernatanty dwa razy w tygodniu (~10 ml na kolbę), gdy komórki osiągną pełną konfluencję (~13,5 x 106 i 20 x 106 komórek na kolbę odpowiednio dla SW480 i SW620) i podziel. Upewnij się, że żywotność komórek jest nie mniejsza niż 99 % i że komórki są hodowane w temperaturze 37 °C w atmosferze 5 % CO2 .</li>
	<li>Zebrać supernatanty z hodowli komórkowej do odpowiednio oznakowanych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować zebrane supernatanty przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia resztek komórek.</li>
	<li>Zebrać sklarowane substancje nad osadem ostrożnie, unikać zasysania zanieczyszczeń, umieścić w oznakowanych probówkach i ponownie odwirować przy 3 200 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatanty z drugiego etapu wirowania do sterylnych, oznakowanych probówek o pojemności 50 ml. Unikaj zwilżania krawędzi rur. Upewnij się, że objętość supernatantu nie przekracza 45 ml i że probówki są trzymane pionowo.</li>
	<li>Owinąć nakrętkę probówki sterylną przezroczystą folią i przechowywać supernatanty w pozycji pionowej w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Przeprowadzaj comiesięczną kontrolę Mycoplasma spp. oraz zanieczyszczenie LPS w świeżych supernatantach (etap 6). Jeśli poziom endotoksyny w supernatantach przekracza 0,05 EU/ml, należy sprawdzić, na jakim etapie mogło dojść do zanieczyszczenia i wznowić proces od początku. W przypadku zanieczyszczenia hodowli komórkowej przez Mycoplasma spp. zostanie wykryte, należy przerwać izolację EV od takich supernatantów.</li>
</ol>
4. Izolacja EV od supernatantów z hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Przygotować filtry strzykawkowe 0,22 μm i strzykawki o odpowiedniej objętości. Przygotować dwie probówki z supernatantami do hodowli (90 ml).</li>
	<li>Napełnić strzykawkę supernatantem i podłączyć filtr do łącznika igły. Umieścić napełnioną strzykawkę z filtrem nad probówką o pojemności 50 ml. Wcisnąć kołnierz tłoka i zebrać ~90 ml filtratu.</li>
	<li>Odpipetować filtrat (7 ml) do probówek ultrawirówek (upewniając się, że ta sama objętość jest pipetowana do każdej probówki w celu uzyskania właściwej równowagi) i odwirować przy 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Wydajność granulowania EV zależy od wielu czynników (np. typu wirnika, jego współczynnika k, długości ścieżki migracji, lepkości medium itp.), które należy zoptymalizować w celu lepszego odzysku EVs20.</li>
	<li>Odrzucić supernatant za pomocą sterylnej pipety Pasteura. Zbierz pozostałe granulki za pomocą długich, przefiltrowanych końcówek pipet i umieść je w dwóch probówkach ultrawirówek. Napełnij je do 7 ml przefiltrowanym, wolnym od endotoksyn PBS, aby wypłukać EV.</li>
	<li>Odwirować zawieszone pelety PBS przy 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć supernatant za pomocą sterylnej pipety Pasteura i dodać 200 μl przefiltrowanego, wolnego od endotoksyn PBS do obu probówek w celu ponownego zawieszenia EV. Delikatnie odpipetuj granulki EVs, aby zebrać wszystkie EVs.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę EVs do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml (jeśli to możliwe, użyj probówki o niskiej zawartości białka). Zachować 10 μl zawiesiny EV w celu przygotowania rozcieńczenia do analizy śledzenia nanocząstek (NTA) oraz do innych celów (np. pomiaru stężenia białka).</li>
	<li>Rozcieńczyć EV filtrowanym PBS (1:1,000) do pomiarów przez NTA, zgodnie z instrukcjami producenta. Zabezpiecz rurki EV, owijając nakrętkę sterylną przezroczystą folią. Przechowuj pojazdy elektryczne w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Wykrywanie specyficznych markerów przez western blotting
<ol>
	<li>Oznaczyć poziom białka w próbkach (np. za pomocą testu Bradforda) i przygotować próbki (20 μg) z buforem ładującym. Przygotować bufor ładujący, mieszając 5 μl buforu do próbki (4x) i 2 μl środka redukującego próbkę (10x) do całkowitej objętości 20 μl. Inkubować próbki w temperaturze 70 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Przygotuj żele poliakrylamidowe z SDS (10%-14%) i załaduj 20 μg EV do każdej studzienki.</li>
	<li>Uruchomić elektroforezę z buforem do biegania (30 g Tris, 144 g glicyny, 10% SDS na 1 l) przez 45 minut przy napięciu 150 V.</li>
	<li>Przeprowadzić półsuchy transfer białek z żelu na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) w maszynie transferowej z buforem Towbin (1,51 g Tris, 7,2 g glicyny, 10% metanolu na 0,5 l) przy napięciu 25 V przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umieścić membranę w buforze TBST (1 ml Tween, 100 ml soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS 10x) na 1 l) w celu zablokowania z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w buforze TBST i inkubować przez 1 godzinę na bujaku w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać rozcieńczone (1:1,000) przeciwciała, anty-CD91 (klon#D8O1A) lub anty-Alix1 (klon#3A9), w 1% BSA i inkubować z membraną przez noc w temperaturze 4 °C na kołysce. Usunąć przeciwciała i przemyć membranę 3x 10 ml 1x TBST przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać kozie przeciwciało anty-królicze lub kozie anty-mysie (rozcieńczenie: 1:2,000) sprzężone z peroksydazą chrzanową, w zależności od pierwszorzędowego przeciwciała na błonie, i inkubować przez 1 godzinę na kołysce w temperaturze RT. Usunąć przeciwciała i przemyć membranę 3x 10 ml 1x TBST przez 10 minut.</li>
	<li>Wymieszać podłoże i luminol w stosunku 1:1, aby uzyskać 1 ml roztworu. Wlej roztwór na membranę. Umieść membranę natychmiast w komorze pomiarowej systemu obrazowania, wybierz moduł chemiluminescencji i zwizualizuj pasma białkowe na ekranie.</li>
</ol>
6. Pomiar poziomu endotoksyn za pomocą testu lizatu amebocytów limulusa (LAL)
<ol>
	<li>Wykonać chromogenny pomiar LAL poziomu endotoksyn, zgodnie z zaleceniem producenta. Krótko mówiąc, zastosuj metodę opartą na interakcji endotoksyny z lizatem amebocytów limulusa (LAL). Granica wykrywalności tej metody wynosi 0,005 EU/mL. 
	UWAGA: Test LAL, pomimo swoich ograniczeń, pozostaje obecnie standardową metodą wykrywania i ilościowego określania zanieczyszczenia endotoksynami w różnego rodzaju roztworach i innych produktach stosowanych w nauce lub medycynie8. Czynnikiem ograniczającym ten zestaw jest stabilność odtworzonego roztworu lizatu amebocen, który jest stabilny tylko przez 1 tydzień w temperaturze -20 °C, jeśli zostanie zamrożony natychmiast po rozpuszczeniu.</li>
	<li>Stosować dziesięciokrotne rozcieńczenie EV i innych próbek oraz 50-krotne rozcieńczenie surowicy. Do dalszych eksperymentów należy używać wyłącznie odczynników o niskiej zawartości endotoksyn, takich jak EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU/ml) i supernatanty hodowlane wolne od LPS.</li>
</ol>
7. Wykrywanie prokariotycznego genu 16S rRNA w próbkach EV
<ol>
	<li>Wyizoluj DNA z próbek EV. Staraj się, aby odczynniki i miejsce izolacji były aseptyczne. Zmierzyć stężenie i jakość DNA (np. za pomocą spektrofotometru).</li>
	<li>Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), jak opisano wcześniej21. Przygotuj 1,5% żel agarozowy z bromkiem etydyny lub zielenią SYBR, aby uwidocznić produkty PCR w świetle ultrafioletowym (UV).</li>
	<li>Przeprowadzić elektroforezę próbki i markera masy z buforem TRIS-acetat-EDTA pod napięciem 75 V przez 45 minut. Wizualizacja prążków DNA za pomocą systemu obrazowania.</li>
</ol>
8. Wyznaczanie efektywnego stężenia LPS do stymulacji w ludzkim modelu monocytów
<ol>
	<li>Przygotuj 2 x 106 monocytów/ml zawiesiny monocytów w RPMI 1640 uzupełnionej L-glutaminą, glukozą i 2% EE-FBS. Dodać 50 μl zawiesiny do dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej22.</li>
	<li>Dodać odpowiednią objętość LPS lub pożywki hodowlanej, aby uzyskać następujące stężenia końcowe: 0 pg/ml (kontrola), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/ml i 100 ng/ml w 100 μl całkowitej objętości zawiesiny komórek. Wykonać trzy egzemplarze każdego stężenia LPS.</li>
	<li>Hodować komórki przez 18 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zebrać supernatant.</li>
	<li>Odwirowywać supernatant o stężeniu 2 000 x g przez 5 minut. Przenieść supernatanty do nowych probówek. Zmierz stężenie TNF8,23 i IL-1023 w pobranych supernatantach za pomocą zestawu cytokin ludzkich z matrycą koralików cytometrycznych (CBA), zgodnie z procedurą producenta, za pomocą cytometru przepływowego.</li>
</ol>

<ol><li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).</li>
<li>van Niel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+directions+in+studying+cell-cell+communication+by+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).</li>
<li>Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS+induced+inflammatory+responses+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+through+NOX4+and+Gi%CE%B1+dependent+PI-3+kinase+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling.</a> Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).</li>
<li>Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+endotoxin+contaminations+in+recombinant+proteins+are+sufficient+to+activate+human+CD1c%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells.</a> PLOS ONE. 9 (12), 113840(2014).</li>
<li>Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CD14+in+host+protection+against+infections+and+in+metabolism+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32(2013).</li>
<li>Takashiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+monocytes+to+macrophages+primes+cells+for+lipopolysaccharide+stimulation+via+accumulation+of+cytoplasmic+nuclear+factor+kB%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).</li>
<li>Schwarz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+activity+of+masked+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Biological activity of masked endotoxin.</a> Scientific Reports. 7, 44750(2017).</li>
<li>Danesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-derived+extracellular+vesicles+activate+monocytes+and+are+associated+with+mortality+in+intensive+care+unit+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients.</a> Frontiers in Immunology. 9, 956(2018).</li>
<li>Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+monocyte-endothelial+cell+interactions+by+platelet+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).</li>
<li>Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles+%28ectosomes%29+shed+by+stored+human+platelets+downregulate+macrophages+and+modify+the+development+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).</li>
<li>Soekmadji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+Extracellular+Vesicles+as+Theranostics+-+an+ISEV+meeting+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766(2020).</li>
<li>Gioannini, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+endotoxin-MD-2+complex+that+produces+Toll-like+receptor+4-dependent+cell+activation+at+picomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).</li>
<li>Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastics%2C+endotoxins%2C+and+the+Limulus+amebocyte+lysate+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parenteral+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test.</a> Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).</li>
<li>Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxins+in+culture+medium+for+human+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization.</a> Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).</li>
<li>Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+EVs+-+How+temperature+affects+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).</li>
<li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+detergent+sensitivity+of+extracellular+vesicle+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations.</a> Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).</li>
<li>Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disinfection+and+sterilization+using+plasma+technology%3A+fundamentals+and+future+perspectives+for+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216(2019).</li>
<li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+oxide+gas+sterilization+of+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science%22%5BJournal%5D)">Ethylene oxide gas sterilization of medical devices.</a> Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).</li>
<li>Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Salamon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+iSeq+and+MiSeq+as+the+two+platforms+for+16S+rRNA+sequencing+in+the+study+of+the+gut+of+rat+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).</li>
<li>Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-derived+microvesicles+modulate+biological+activity+of+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes.</a> Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).</li>
<li>Chaiwut, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+low+concentration+of+lipopolysaccharide+can+induce+the+production+of+various+cytokines+and+chemokines+in+human+primary+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes.</a> BMC Research Notes. 15 (1), 42(2022).</li>
<li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858(2014).</li>
<li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).</li>
<li>Pham, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+extracellular+vesicles+contaminate+human+extracellular+vesicles+produced+in+cell+culture+conditioned+medium+when+%27exosome-depleted+serum%27+is+utilised%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963(2021).</li>
<li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+contamination%3A+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).</li>
<li>Álvarez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+dynamics+model+to+predict+the+human+monocyte+response+to+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins.</a> Frontiers in Immunology. 8, 915(2017).</li>
<li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+flow+filtration+for+highly+efficient+concentration+of+extracellular+vesicles+from+large+volumes+of+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid.</a> Cells. 7 (12), 273(2018).</li>
<li>Gałuszka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+metal+containing+particulate+matter+promotes+Th1+and+Th17+inflammatory+response+by+monocyte+activation+in+organic+and+inorganic+compounds+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227(2020).</li>
<li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+polymyxins%3A+a+systematic+review+of+the+evidence+from+old+and+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies.</a> Critical Care. 10 (1), 27(2006).</li>
<li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+removal+from+protein+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

W ciągu ostatnich kilku lat coraz większego znaczenia nabierają metody prawidłowej izolacji pojazdów elektrycznych, umożliwiające ich dalsze wiarygodne analizy, na przykład w kontekście uzyskania wiarygodnych danych omicznych i funkcjonalnych24. Na podstawie dotychczasowych doświadczeń badawczych wydaje się, że nie tylko rodzaj metody izolacji, ale także inne warunki podczas tej procedury mogą mieć znaczenie. Stosowanie FBS zubożonych w EV jest powszechnie uznawane za konieczność...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs), zgodnie z nomenklaturą MISEV 2018, to zbiorczy termin opisujący różne podtypy pęcherzyków błoniastych wydzielanych przez komórki, które odgrywają kluczową rolę w licznych procesach fizjologicznych i patologicznych1,2. Co więcej, pojazdy elektryczne są obiecujące jako nowe biomarkery różnych chorób, a także jako środki terapeutyczne i nośniki leków. Jednak wykorzystanie ich pełnego potencjału jest trudne, ponieważ nadal istnieje wiele przeszkód technicznych związanych z ich nabyciem3. Jednym z takich wyzwań jest izolacja pojazdów elektrycznych wolnych od endotoksyn, która w wielu przypadkach została zaniedbana. Jedną z najczęstszych endotoksyn jest lipopolisacharyd (LPS), który jest głównym składnikiem ścian komórkowych bakterii Gram-ujemnych i może powodować ostrą reakcję zapalną ze względu na uwalnianie dużej liczby cytokin zapalnych przez różne komórki4,5. LPS indukuje odpowiedź poprzez wiązanie się z białkiem wiążącym LPS, a następnie interakcję z kompleksem CD14/TLR4/MD2 na komórkach szpikowych. Ta interakcja prowadzi do aktywacji szlaków sygnałowych zależnych od MyD88 i TRIF, co z kolei wyzwala czynnik jądrowy kappa B (NFkB). Translokacja NFkB do jądra inicjuje produkcję cytokin6. Monocyty i makrofagi są bardzo wrażliwe na LPS, a ich ekspozycja na LPS powoduje uwalnianie cytokin zapalnych i chemokin (np. IL-6, IL-12, CXCL8 i TNF-α)7,8. Struktura CD14 umożliwia wiązanie różnych gatunków LPS o podobnym powinowactwie i służy jako koreceptor dla innych receptorów toll-podobnych (TLR) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 i 9)6. Liczba prowadzonych badań nad wpływem EV na monocyty/makrofagi wciąż rośnie9,10,11. Szczególnie z perspektywy badania funkcji monocytów, ich subpopulacji i innych komórek odpornościowych, obecność endotoksyn, a nawet ich zamaskowana obecność w EV ma ogromne znaczenie12. Przeoczone zanieczyszczenie pojazdów elektrycznych endotoksynami może prowadzić do mylących wniosków i ukrywać ich prawdziwą aktywność biologiczną. Innymi słowy, praca z komórkami monocytowymi wymaga pewności co do braku zanieczyszczenia endotoksynami13. Potencjalnymi źródłami endotoksyn mogą być woda, komercyjnie pozyskiwane podłoża i surowice, składniki i dodatki do pożywek, szkło laboratoryjne i wyroby z tworzyw sztucznych5,14,15.
Dlatego to badanie miało na celu opracowanie protokołu izolacji EV o niskiej zawartości endotoksyn. Protokół zawiera proste wskazówki, jak uniknąć zanieczyszczenia endotoksynami podczas izolacji pojazdów elektrycznych zamiast usuwania endotoksyn z pojazdów elektrycznych. Wcześniej przedstawiono wiele protokołów dotyczących usuwania endotoksyn z, na przykład, zmodyfikowanych nanocząstek stosowanych w nanomedycynie; jednak żaden z nich nie jest przydatny dla struktur biologicznych, takich jak pojazdy elektryczne. Efektywną depirogenizację nanocząstek można przeprowadzić przez płukanie etanolem lub kwasem octowym, ogrzewanie w temperaturze 175 °C przez 3 godziny, γ napromienianie lub obróbkę trytonem X-100; jednak te procedury prowadzą do zniszczenia EVs16,17.
Prezentowany protokół jest pionierskim badaniem skoncentrowanym na unikaniu zanieczyszczeń endotoksynami w EVs, w przeciwieństwie do poprzednich badań nad wpływem EV na monocyty9. Zastosowanie proponowanych zasad w praktyce laboratoryjnej może pomóc w uzyskaniu wiarygodnych wyników badań, co może być kluczowe przy rozważaniu potencjalnego zastosowania EV jako środków terapeutycznych w klinice12.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Alix (3A9) Mysz mAb&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>2171</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 1250ul Uniwersalne końcówki do pipet, przezroczyste, polipropylenowe, niepirogenne</td><td>GoogLab Scientific</td><td>GBFT1250-R-NS</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CBA Ludzki zestaw cytokin Th1/Th2 II</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>CD9 (D8O1A) Technologia</td><td>sygnalizacji komórkowej</td> mAb królika <td>13174</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania ChemiDoc</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>17001401</tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>ELX800NB, Uniwersalny czytnik mikropłytek</td><td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu Ameryka Południowa Ultra niska endotoksyna</td><td>&nbsp; Biowest</td><td>&nbsp; S1860-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna, 50 mg/ml</td><td>&nbsp; PAN &ndash; Biotech</td><td>P06-13100</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG- HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG- HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Membrana Immun-Blot PVDF</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1620177</tr><tr><td>LPS z Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)</td><td>&nbsp; Enzo Nauki Przyrodnicze, Inc.</td><td>ALX-581-009-L002</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Elektroforetyczne ogniwo transferowe</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1703930</tr><tr><td>Analiza śledzenia nanocząstek&nbsp;</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor próbki NuPAGE LDS (4X)</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>&nbsp; NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Środek redukujący próbki NuPAGE (10x)</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td>przezroczysta folia</td></tr><tr><td>Perfect 100-1000 bp DNA Ladder</td><td>EURx</td><td>E3141-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39552</td><td></td></tr><tr><td>PP Oak Ridge Tube z zaślepkami Thermo</td><td>Scientific</td><td>3929, 03613</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>RPMI-1640 (Gibco)</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystem</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall wX+ ULTRA SERIES z wirnikiem</td> <td>T-1270Thermo Scientific</td><td>75000100</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell GT Poziomy system elektroforezy</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1704401</tr><tr><td>Podłoże chemiluminescencyjne SuperSignal West Pico PLUS</td> Linia komórkowa <td>Thermo Scientific</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>SW480</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Linia komórkowa SW480</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Filtr strzykawkowy 0,22 um</td><td>TPP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Półsucha komórka</td> <td>transferowaBio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>1703940</td><td>Maszyna transferowa</td></tr><tr><td>Pipeta transferowa, 3,5 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1171.001</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o niskiej zawartości endotoksyn pochodzących z linii komórek rakowych

Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to niejednorodna populacja pęcherzyków błonowych uwalnianych przez komórki in vitro i in vivo. Ich wszechobecność i znacząca rola jako nośników informacji biologicznej sprawiają, że są intrygującymi obiektami badań, wymagającymi niezawodnych i powtarzalnych protokołów ich izolacji. Wykorzystanie ich pełnego potencjału jest jednak trudne, ponieważ wciąż istnieje wiele przeszkód technicznych związanych z ich badaniami (np. właściwe pozyskiwanie). W pracy przedstawiono protokół izolacji małych EV (zgodnie z nomenklaturą MISEV 2018) z supernatantu hodowli linii komórek nowotworowych w oparciu o wirowanie różnicowe. Protokół zawiera wytyczne, jak uniknąć zanieczyszczenia endotoksynami podczas izolacji pojazdów elektrycznych i jak prawidłowo je ocenić. Zanieczyszczenie endotoksynami pojazdów elektrycznych może znacznie utrudnić późniejsze eksperymenty, a nawet zamaskować ich prawdziwe skutki biologiczne. Z drugiej strony, przeoczona obecność endotoksyn może prowadzić do błędnych wniosków. Ma to szczególne znaczenie w odniesieniu do komórek układu odpornościowego, w tym monocytów, ponieważ monocyty stanowią populację szczególnie wrażliwą na pozostałości endotoksyn. Dlatego zdecydowanie zaleca się badanie EV pod kątem zanieczyszczenia endotoksynami, zwłaszcza podczas pracy z komórkami wrażliwymi na endotoksyny, takimi jak monocyty, makrofagi, komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego lub komórki dendrytyczne.

Warunkiem wstępnym lub obligatoryjnym krokiem w tym protokole jest wykluczenie możliwego zanieczyszczenia odczynników endotoksynami. Wszystkie stosowane odczynniki, takie jak FBS, DMEM, RPMI, PBS, a nawet probówki do ultrawirówki, muszą być wolne od endotoksyn (&lt;0.005 EU/mL). Utrzymanie reżimu braku zanieczyszczeń endotoksynami nie jest łatwe, ponieważ na przykład zwykła/standardowa surowica do hodowli komórkowych może być ich bogatym źródłem (0,364 EU/mL; patrz Tabela 1).
...

Proponowany protokół zawiera wytyczne dotyczące unikania zanieczyszczenia endotoksyną podczas izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z supernatantów hodowli komórkowych oraz jak prawidłowo je ocenić.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o niskiej zawartości endotoksyn pochodzących z linii komórek rakowych

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

Protokół ten zawiera wytyczne, jak uniknąć zanieczyszczenia endotoksyną podczas izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z supernatantów do hodowli komórkowych oraz jak prawidłowo je ocenić. Główną zaletą tego protokołu jest to, że każde laboratorium zajmujące się pojazdami elektrycznymi może ograniczyć zanieczyszczenie endotoksynami, zachowując procedurę aseptyczną i używając prostego i powszechnie dostępnego sprzętu. Każdy, kto próbuje tej techniki po raz pierwszy, powinien zacząć od nowych pożywek, odczynników i wyrobów z tworzyw sztucznych, które są o niskiej zawartości endotoksyn, nie są znakowane pirogennie.Do tego protokołu należy używać odczynników wolnych od endotoksyn, wody, pożywek hodowlanych, przefiltrowanego PBS, FBS o bardzo niskiej endotoksynie i probówek ultrawirówek. Na początek zbierz supernatant z wcześniej hodowanych linii komórkowych SW480 i SW620 do odpowiednio oznakowanych 15-mililitrowych probówek. Usunąć resztki komórek, odwirowując supernatant o stężeniu 500 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Nie naruszając szczątków, zebrać supernatant do nowej, oznakowanej probówki i odwirować przy 3,200 x g przez 12 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie przenieść 45 mililitrów supernatantu do pionowo umieszczonej sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów, nie zwilżając krawędzi probówki. Owiń nakrętkę probówki sterylną, przezroczystą folią i przechowuj ją pionowo w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu późniejszego odizolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.Izolację należy rozpocząć od przygotowania filtrów strzykawkowych o średnicy 0,22 mikrometra, strzykawek i probówek zawierających około 90 mililitrów supernatantu. Napełnić strzykawkę supernatantem i przymocować filtr do adaptera igły. Przefiltruj supernatant przez filtr do 50-mililitrowej probówki.Odpipetować siedem mililitrów filtratu do przygotowanej probówki ultrawirówki i odwirować przy 100 000 x g przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj sterylnej pipety Pasteura, aby usunąć supernatant. Wciągnij granulki do probówki ultrawirówkowej za pomocą długiej, filtrowanej końcówki pipety.Przepłucz pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, dodając siedem mililitrów przefiltrowanego, wolnego od endotoksyn PBS. Po ultraodwirowaniu wyrzucić supernatant za pomocą sterylnej pipety Pasteura i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBS wolnego od endotoksyn. Przenieś zawiesinę do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki testowej o niskim poziomie wiązania białek.Następnie przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny do nowej 1,5-mililitrowej rurki w celu dalszej analizy. Owiń nakrętkę probówki i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Teraz, w nowej probówce, rozcieńczyć jeden mikrolitr zawiesiny za pomocą przefiltrowanego PBS w stosunku 1 do 1000 do analizy śledzenia nanocząstek.Aby przeprowadzić analizę blottingu, należy najpierw wymieszać 20 mikrogramów próbek z buforem ładującym. Próbki należy inkubować w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie załadować 20 mikrogramów próbki do każdej studzienki 10 do 14% żelu poliakrylamidowego z SDS i wykonywać elektroforezę przez 45 minut przy napięciu 150 woltów, z uruchomionym buforem.Następnie umieść żel w maszynie transferowej z buforem Towbin i wykonaj półsuchy transfer białek na membranę z polifluorku winylidenu pod napięciem 25 woltów przez jedną godzinę. Zablokuj membranę za pomocą 1% BSA, inkubując ją przez godzinę na kołysce. Dodać rozcieńczone BSA przeciwciała, anty-CD9 lub anty-Alix, do błony i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rockerze.Po usunięciu przeciwciał przemyj membranę trzykrotnie 10 mililitrami TBST przez 10 minut. Teraz dodaj kozie przeciwciało wtórne przeciwko królikom lub myszom i ponownie inkubuj na bujaczku przez godzinę w temperaturze pokojowej. Wyrzuć przeciwciało i umyj membranę, jak wykazano wcześniej.Wlej jeden mililitr roztworu zawierającego substrat i luminol w równych proporcjach na membranę. Natychmiast umieść błonę w systemie obrazowania i zwizualizuj prążki białkowe na ekranie. W niniejszym badaniu analiza western blot potwierdziła obecność dwóch markerów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, CD9 i Alix.Średnia wielkość i stężenie pęcherzyków wyizolowanych zarówno z SW480, jak i SW620 były podobne. Stymulacja monocytów różnymi dawkami lipopolisacharydu, czyli LPS, wykazała, że najniższa dawka LPS umożliwiająca wydzielanie interleukiny 10 i czynnika martwicy nowotworu w monocytach wynosiła 50 pikogramów na mililitr. Chromogenny test LAL wykazał, że zanieczyszczenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych LPS wynosiło około 50 pikogramów na mililitr dla obu linii komórkowych.Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać, jest stosowanie odczynników wolnych od LPS lub zubożonych oraz rutynowy pomiar LPS na każdym etapie procedury. Zapobieganie zanieczyszczeniu endotoksynami jest łatwiejsze niż ich eliminacja. Proponowany protokół ogranicza możliwość uzyskania fałszywych wyników z powodu zanieczyszczenia EV endotoksyną i pozwala na ocenę aktywności EV na komórkę.Proponowany protokół jest przydatny dla naukowców pracujących z komórkami wrażliwymi na endotoksyny, takimi jak monocyty, komórki dendrytyczne i makrofagi.

isolation-low-endotoxin-content-extracellular-vesicles-derived-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

To jest protokół izolowania tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od wątroby. Protokół opisuje dwuetapowy proces obejmujący perfuzję kolagenazy, po której następuje różnicowe ultrawirowanie w celu wyizolowania EV tkanki wątroby.

Izolacja tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wątroby

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z całych tkanek, w tym próbek mózgu i nowotworów. Metoda ta oferuje powtarzalną technikę ekstrakcji EV z tkanki stałej w celu dalszych analiz.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki

Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

Ten manuskrypt opisuje, jak ocenić in vivo immunogenność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek nowotworowych (EVs) za pomocą cytometrii przepływowej. EV pochodzące z nowotworów poddawanych immunogennej śmierci komórek indukowanej leczeniem wydają się szczególnie istotne w nadzorze immunologicznym nad nowotworami. Protokół ten stanowi przykład oceny EV guza immunostymulującego indukowanego oksaliplatyną, ale można go dostosować do różnych ustawień.

In vivo (in vivo) Badania przesiewowe immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza za pomocą cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Tutaj opisujemy wzbogacanie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby za pomocą zoptymalizowanej metody różnicowego ultrawirowania.

Metoda wzbogacania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby

Tutaj opisujemy metodę szybkiej homogenizacji wspomaganą separacją magnetyczną do produkcji na dużą skalę nanopęcherzyków pochodzących z endosomów jako nowy typ egzosomów naśladujących (EM), które mają to samo pochodzenie biologiczne i podobną strukturę, morfologię i skład białkowy natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Metoda szybkiej homogenizacji wspomagana separacją magnetyczną do produkcji pęcherzyków pochodzących z endosomów na dużą skalę

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z komórek NK (NK-EVs) mają obiecujący potencjał jako bioterapia przeciwnowotworowa. To oparte na metodologii badanie przedstawia skalowalny proces bioprodukcji w pętli zamkniętej, zaprojektowany do ciągłej produkcji i izolowania dużych ilości NK-EV o wysokiej czystości. Testy kontrolne w trakcie procesu są przeprowadzane w całym procesie bioprodukcji, aby zapewnić, że pojazdy elektryczne spełniają standardy jakości dotyczące wprowadzania produktu do...

Skalowalny proces bioprodukcji do produkcji i izolacji bioterapeutyków przeciwnowotworowych na bazie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek NK

Protokół ten został zaprojektowany tak, aby przyspieszyć i umożliwić skuteczną izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od mleka matki o wysokiej czystości.

Szybka izolacja pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z ludzkiego mleka matki

Poznaj metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o niskiej zawartości endotoksyn z linii komórek SW480 i SW620. Protokół zapewnia niezawodne wyniki badań dzięki aseptycznym technikom i odpowiednim materiałom.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o niskiej zawartości endotoksyn pochodzących z linii komórek rakowych

Przeglądaj więcej filmów