Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o niskiej zawartości endotoksyn pochodzących z linii komórek rakowych

Protokół ten zawiera wytyczne, jak uniknąć zanieczyszczenia endotoksyną podczas izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z supernatantów do hodowli komórkowych oraz jak prawidłowo je ocenić. Główną zaletą tego protokołu jest to, że każde laboratorium zajmujące się pojazdami elektrycznymi może ograniczyć zanieczyszczenie endotoksynami, zachowując procedurę aseptyczną i używając prostego i powszechnie dostępnego sprzętu. Każdy, kto próbuje tej techniki po raz pierwszy, powinien zacząć od nowych pożywek, odczynników i wyrobów z tworzyw sztucznych, które są o niskiej zawartości endotoksyn, nie są znakowane pirogennie.

Do tego protokołu należy używać odczynników wolnych od endotoksyn, wody, pożywek hodowlanych, przefiltrowanego PBS, FBS o bardzo niskiej endotoksynie i probówek ultrawirówek. Na początek zbierz supernatant z wcześniej hodowanych linii komórkowych SW480 i SW620 do odpowiednio oznakowanych 15-mililitrowych probówek. Usunąć resztki komórek, odwirowując supernatant o stężeniu 500 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Nie naruszając szczątków, zebrać supernatant do nowej, oznakowanej probówki i odwirować przy 3,200 x g przez 12 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie przenieść 45 mililitrów supernatantu do pionowo umieszczonej sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów, nie zwilżając krawędzi probówki. Owiń nakrętkę probówki sterylną, przezroczystą folią i przechowuj ją pionowo w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu późniejszego odizolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Izolację należy rozpocząć od przygotowania filtrów strzykawkowych o średnicy 0,22 mikrometra, strzykawek i probówek zawierających około 90 mililitrów supernatantu. Napełnić strzykawkę supernatantem i przymocować filtr do adaptera igły. Przefiltruj supernatant przez filtr do 50-mililitrowej probówki.

Odpipetować siedem mililitrów filtratu do przygotowanej probówki ultrawirówki i odwirować przy 100 000 x g przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj sterylnej pipety Pasteura, aby usunąć supernatant. Wciągnij granulki do probówki ultrawirówkowej za pomocą długiej, filtrowanej końcówki pipety.

Przepłucz pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, dodając siedem mililitrów przefiltrowanego, wolnego od endotoksyn PBS. Po ultraodwirowaniu wyrzucić supernatant za pomocą sterylnej pipety Pasteura i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBS wolnego od endotoksyn. Przenieś zawiesinę do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki testowej o niskim poziomie wiązania białek.

Następnie przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny do nowej 1,5-mililitrowej rurki w celu dalszej analizy. Owiń nakrętkę probówki i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Teraz, w nowej probówce, rozcieńczyć jeden mikrolitr zawiesiny za pomocą przefiltrowanego PBS w stosunku 1 do 1000 do analizy śledzenia nanocząstek.

Aby przeprowadzić analizę blottingu, należy najpierw wymieszać 20 mikrogramów próbek z buforem ładującym. Próbki należy inkubować w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie załadować 20 mikrogramów próbki do każdej studzienki 10 do 14% żelu poliakrylamidowego z SDS i wykonywać elektroforezę przez 45 minut przy napięciu 150 woltów, z uruchomionym buforem.

Następnie umieść żel w maszynie transferowej z buforem Towbin i wykonaj półsuchy transfer białek na membranę z polifluorku winylidenu pod napięciem 25 woltów przez jedną godzinę. Zablokuj membranę za pomocą 1% BSA, inkubując ją przez godzinę na kołysce. Dodać rozcieńczone BSA przeciwciała, anty-CD9 lub anty-Alix, do błony i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rockerze.

Po usunięciu przeciwciał przemyj membranę trzykrotnie 10 mililitrami TBST przez 10 minut. Teraz dodaj kozie przeciwciało wtórne przeciwko królikom lub myszom i ponownie inkubuj na bujaczku przez godzinę w temperaturze pokojowej. Wyrzuć przeciwciało i umyj membranę, jak wykazano wcześniej.

Wlej jeden mililitr roztworu zawierającego substrat i luminol w równych proporcjach na membranę. Natychmiast umieść błonę w systemie obrazowania i zwizualizuj prążki białkowe na ekranie. W niniejszym badaniu analiza western blot potwierdziła obecność dwóch markerów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, CD9 i Alix.

Średnia wielkość i stężenie pęcherzyków wyizolowanych zarówno z SW480, jak i SW620 były podobne. Stymulacja monocytów różnymi dawkami lipopolisacharydu, czyli LPS, wykazała, że najniższa dawka LPS umożliwiająca wydzielanie interleukiny 10 i czynnika martwicy nowotworu w monocytach wynosiła 50 pikogramów na mililitr. Chromogenny test LAL wykazał, że zanieczyszczenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych LPS wynosiło około 50 pikogramów na mililitr dla obu linii komórkowych.

Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać, jest stosowanie odczynników wolnych od LPS lub zubożonych oraz rutynowy pomiar LPS na każdym etapie procedury. Zapobieganie zanieczyszczeniu endotoksynami jest łatwiejsze niż ich eliminacja. Proponowany protokół ogranicza możliwość uzyskania fałszywych wyników z powodu zanieczyszczenia EV endotoksyną i pozwala na ocenę aktywności EV na komórkę.

Proponowany protokół jest przydatny dla naukowców pracujących z komórkami wrażliwymi na endotoksyny, takimi jak monocyty, komórki dendrytyczne i makrofagi.