Name: Pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Poznaj metodę pomiaru żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans. Protokół ten umożliwia badanie procesów rozwojowych i identyfikację czynników genetycznych wpływających na rozwój.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium Jaramillo-Lambert jest wspierana przez National Institutes of Health NIGMS R35GM142524. Wszystkie szczepy C. elegans zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez National Institutes of Health, P40 OD010440. Rysunek 1D został stworzony przy użyciu Biorender.com.

UWAGA: Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów wykorzystanych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie płytek eksperymentalnych
<ol>
	<li>Przygotować szalki Petriego o średnicy 35 mm z pożywką Modified Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB). Aby przygotować płytki MYOB, do 1 L ddH2O dodać 20 g Bacto agar, 2 g NaCl, 0,55 g Trizma-HCl, 0,24 g Trizma-OH, 3,1 g Bacto peptone oraz 1,6 mL cholesterolu, a następnie autoklawować przez 40 min w temperaturze 121 °C. Pozostawić do ostygnięcia do 55 °C i stosując technikę sterylną, wlać 4 mL roztopionej pożywki do każdej szalki Petriego o średnicy 35 mm. 
	UWAGA: Z jednego litra MYOB powstaje około 250 płytek, które można przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy. Zaleca się użycie minimum 10 osobników na powtórzenie, przy trzech zestawach powtórzeń dla każdego szczepu.</li>
	<li>Stosując technikę sterylną, zasiać na płytkach małą plamkę (około 50 µL) bakterii OP50 na środku szalki. 
	UWAGA: Małe obszary wzrostu są szczególnie istotne przy ocenie zapłodnienia krzyżowego, ponieważ mniejsza plamka prowadzi do częstszych spotkań samców z hermafrodytami, co zwiększa szansę na kopulację.</li>
</ol>
2. Testy żywotności embrionów (sam zapłodnienie hermafrodytów)
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Oznakuj tył każdej płytki. Należy monitorować każdą płytkę i przypisane do niej nicienie przez cały czas trwania eksperymentu. 
		UWAGA: Preferowana technika znakowania: Dzień 1: nicień 1, Dzień 1: nicień 2 itd.</li>
		<li>Przenieś pojedynczego hermafrodytę w stadium L4 na każdą płytkę. Upewnij się, że na płytkę nie zostały przeniesione embriony ani inne nicienie. Pozostaw nicienie do osiągnięcia stadium dorosłego i zniesienia potomstwa przez 24 h w standardowej temperaturze hodowli 20 °C. Oceń te płytki w dniu 3. 
		UWAGA: Temperaturę eksperymentów można zmienić w przypadku mutacji wrażliwych na temperaturę. Dla mutacji wrażliwych na temperaturę testy żywotności embrionów należy przeprowadzić zarówno w temperaturze dopuszczalnej (15-16 °C), jak i niedopuszczalnej (24-26 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Oznakuj zestaw nowych płytek: Dzień 2: nicień 1, Dzień 2: nicień 2 itd.</li>
		<li>Przenieś pojedyncze nicienie z dnia 1 na nowe płytki. 
		UWAGA: Nicienie te powinny osiągnąć stadium dorosłe, a nicienie typu dzikiego powinny już zacząć znosić embriony.</li>
		<li>Pozostaw nicienie do znoszenia embrionów przez 24 h w temperaturze 20 °C lub innej odpowiedniej temperaturze. Oceń te płytki w dniu 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3
	<ol>
		<li>Oznakuj zestaw nowych płytek: Dzień 3: nicień 1, Dzień 3: nicień 2 itd.</li>
		<li>Przenieś pojedyncze nicienie z dnia 2 na nowe płytki. Pozostaw je do znoszenia potomstwa przez 24 h w temperaturze 20 °C lub innej odpowiedniej temperaturze. Oceń te płytki w dniu 5. 
		UWAGA: W przypadku niższych temperatur czas wyklucia będzie dłuższy. Dostosuj czas odpowiednio.</li>
		<li>Narysuj wzór siatki na pokrywce o średnicy 35 mm za pomocą cienkiego markera. Umieść pokrywkę z siatką pod płytką testową podczas liczenia, aby monitorować wcześniej policzone nicienie (Rysunek 1A-B).
		<ol>
			<li>Używając licznika komórek różnicowych, oceń płytki z dnia 1 pod kątem obecności lub braku potomstwa. Policz żywe larwy i niewykute embriony. 
			UWAGA: W tym momencie upłynął wystarczający czas, aby wszystkie żywotne embriony zdążyły się wykluć. Wszelkie niewykute embriony uznaje się za martwe.</li>
			<li>W obrębie pojedynczego kwadratu policz niewykute embriony i żywe larwy, które znajdują się w całości wewnątrz kwadratu (Rysunek 1C-F).</li>
			<li>W przypadku nicieni znajdujących się na granicach kwadratu, licz je na podstawie położenia głowy nicienia. Licz nicienie, których głowy dotykają górnej i lewej krawędzi kwadratu (nie licz tych dotykających krawędzi dolnej lub prawej; Rysunek 1D). W tym teście nie licz niezapłodnionych oocytów (Rysunek 1F).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zapisz liczbę żywych larw i niewykutych embrionów w zeszycie laboratoryjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 4
	<ol>
		<li>Oceń płytki z dnia 2, licząc żywe larwy i niewykute embriony, zgodnie z opisem w kroku 2.3.3.1. Zapisz liczbę żywych larw i niewykutych embrionów w zeszycie laboratoryjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 5
	<ol>
		<li>Oceń płytki z dnia 3, licząc żywe larwy i niewykute embriony, zgodnie z opisem w kroku 2.3.3.1. Zapisz liczbę żywych larw i niewykutych embrionów w zeszycie laboratoryjnym. Przeanalizuj uzyskane dane, korzystając z metody opisanej w analizie danych. 
		UWAGA: Niektóre mutanty genetyczne mogą mieć opóźniony lub wydłużony cykl rozrodczy. Monitoruj poszczególne szczepy pod kątem dalszego znoszenia embrionów poza płytkami z dnia 3. Jeśli produkcja embrionów nie ustała do dnia 4, kontynuuj przenoszenie osobników dorosłych na nowe płytki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Testy żywotności embrionów (krzyżowanie samców z hermafrodytami)
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Oznakuj tył każdej płytki. Należy monitorować każdą płytkę i przypisane do niej nicienie przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
		<li>Przenieś pojedynczego nicienia hermafrodyta w stadium L4 na każdą płytkę. Upewnij się, że na płytkę nie zostały przeniesione zarodki ani inne nicienie. 
		UWAGA: Zamiast hermafrodyt można użyć szczepów sfeminizowanych, takich jak mutanty z utratą funkcji fog-2, które nie produkują plemników.</li>
		<li>Przenieś pojedynczego samca w stadium L4 na każdą oznakowaną płytkę zawierającą hermafrodyta L4. Upewnij się, że na płytkę nie zostały przeniesione zarodki ani inne nicienie. 
		UWAGA: Do identyfikacji, czy doszło do kopulacji, można użyć szczepów takich jak samce wariantu plg-1, ponieważ samce te po kopulacji pozostawiają czop kopulacyjny w vulvie hermafrodyta.</li>
		<li>Pozostaw nicienie na 24 h w temperaturze 20 °C lub innej odpowiedniej temperaturze, aby mogły się kopulować i złożyć potomstwo. W dniu 3. dokonaj oceny tych płytek pod kątem żywych larw w stosunku do niewyklutych zarodków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Oznakuj zestaw nowych płytek i przenieś nicienie, analogicznie do procedury z dnia 1. opisanego powyżej. W tym przypadku należy przenieść na nowe płytki zarówno hermafrodyta, jak i samca. Upewnij się, że hermafrodyta osiągnął stadium dorosłe.</li>
		<li>Pozostaw hermafrodyty na 24 h w temperaturze 20 °C lub innej odpowiedniej temperaturze, aby zniosły potomstwo. W dniu 4. dokonaj oceny tych płytek pod kątem żywych larw w stosunku do niewyklutych zarodków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3
	<ol>
		<li>Oznakuj zestaw nowych płytek i przenieś nicienie, analogicznie do procedury z dnia 2. powyżej. Przenieś na nowe płytki zarówno hermafrodyta, jak i samca.</li>
		<li>Pozostaw nicienie na 24 h w temperaturze 20 °C lub innej odpowiedniej temperaturze, aby zniosły potomstwo. W dniu 5. dokonaj oceny tych płytek pod kątem żywych larw w stosunku do niewyklutych zarodków.</li>
		<li>Używając różnicującego licznika komórek, policz żywe larwy i niewyklute zarodki z płytek z dnia 1., zgodnie z opisem w kroku 2.3.3.1. 
		UWAGA: Nie utylizuj płytek, ponieważ są one wymagane w dniu 4.</li>
		<li>Zapisz liczbę żywych larw i niewyklutych zarodków w dzienniku laboratoryjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 4
	<ol>
		<li>Policz żywe potomstwo i niewyklute zarodki z płytek z dnia 2., zgodnie z opisem w kroku 2.3.3.1. Zapisz liczbę żywych larw i niewyklutych zarodków w dzienniku laboratoryjnym.</li>
		<li>Sprawdź obecność samców na płytkach z dnia 1. Jeśli doszło do kopulacji, oczekiwany stosunek genetyczny hermafrodyt do samców powinien wynosić 50:50. Jeśli na płytkach z dnia 1. nie ma samców, oznacza to, że kopulacja między samcem a hermafrodytą nie nastąpiła. Odrzuć tę parę kopulacyjną i zapisz tę obserwację w dzienniku laboratoryjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 5
	<ol>
		<li>Policz żywe larwy i niewyklute zarodki z płytek z dnia 3., zgodnie z opisem w kroku 2.3.3.1. Zapisz liczbę żywych larw i niewyklutych zarodków w dzienniku laboratoryjnym. Przeanalizuj uzyskane dane, korzystając z metod opisanych w sekcji analizy danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Oblicz procentową żywotność embrionalną danego powtórzenia biologicznego szczepu, korzystając z równania (1). 
	UWAGA: Liczbę żywego potomstwa oraz niewyklutych embrionów uzyskuje się poprzez zsumowanie dziennych zliczeń z całego okresu eksperymentalnego. 
	<img alt="Równanie żywotności embrionalnej; wzór do obliczania procentowego przeżycia embrionów w badaniach." src="/files/ftp_upload/65064/65064eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 1">      (1)</li>
	<li>Oblicz wielkość lęgu na jednego nicienia dla danego szczepu, sumując liczbę potomstwa (niewyklutych embrionów i larw) wyprodukowanego przez rodzicielskiego hermafrodytę. Oblicz średnią wielkość lęgu za pomocą równania (2). 
	<img alt="Równanie średniej wielkości lęgu; Σ(żywe potomstwo + niewyklute embriony) ÷ rodzicielskie hermafrodyty; wzór." src="/files/ftp_upload/65064/65064eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 2">      (2)</li>
	<li>Przedstaw procentową żywotność embrionalną oraz średnią wielkość lęgu wraz ze średnią i odchyleniem standardowym między powtórzeniami biologicznymi. Przeprowadź test t Studenta w celu porównania danych kontrolnych i eksperymentalnych.</li>
</ol>

<ol><li>Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).</li>
<li>O'Connor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities%3A+aneuploidies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Education%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities: aneuploidies.</a> Nature Education. 1 (1), 172(2008).</li>
<li>Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).</li>
<li>Marcello, M. R., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+and+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).</li>
<li>Robertson, S., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The oocyte-to-embryo transition.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondisjunction+mutants+of+the+nematode+CAENORHABDITIS+ELEGANS%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.</a> Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li>
<li>Chu, D. S., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).</li>
<li>Dernburg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+recombination+in+C.+elegans+initiates+by+a+conserved+mechanism+and+is+dispensable+for+homologous+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis.</a> Cell. 94 (3), 387-398 (1998).</li>
<li>Bhandari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+suppressors+of+top-2+embryonic+lethality+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).</li>
<li>Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+a+novel+mutant+allele+of+topoisomerase+II+in+Caenorhabditis+elegans+reveals+a+unique+role+in+chromosome+segregation+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis.</a> Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).</li>
<li>Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminus+of+SPE-11+is+required+for+proper+embryonic+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans.</a> microPublication Biology. , (2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Rozmnażanie gatunków rozmnażających się płciowo wymaga tworzenia haploidalnych gamet (tj. jaj i plemników) poprzez mejozę, które następnie są łączone w momencie zapłodnienia, przywracając diploidalną liczbę chromosomów i inicjując rozwój embrionalny. Błędy w którymkolwiek z tych procesów mogą prowadzić do niepłodności, śmiertelności zarodka i/lub wad wrodzonych. C. elegans jest potężnym systemem modelowym do badania rozmnażania płciowego. Skutki mutacji genów lub knockdownu ekspresji genów (np. interferencji RNA) można ocenić stosunkowo szybko i łatwo za pomocą opisanych powyżej testów żywotności zarodka i wielkości czerwiu. Wykorzystaliśmy te metody do wstępnej charakterystyki genów zaangażowanych w segregację chromosomów mejotycznych i zapłodnienie/aktywację komórek jajowych 10,11,12. Obserwowane zmniejszenie żywotności zarodka lub wielkości lęgu wskazuje na zakłócenie mejozy, gametogenezy, zapłodnienia lub embriogenezy.
Ponieważ żywotność zarodka i wielkość lęgu są stosunkowo łatwe do oceny poprzez liczenie potomstwa i proste obliczenia matematyczne, są to optymalne eksperymenty wprowadzające dla nowicjuszy badawczych zarówno w laboratorium, jak i w klasie. Łatwość hodowli C. elegans i korzyści ekonomiczne sprawiają, że szczególnie nadają się one do eksperymentalnych zajęć z biologii. Studenci zdobywają cenne doświadczenie badawcze poprzez hodowlę C. elegans , uczą się korzystać z mikroskopów preparacyjnych i mogą zadawać pytania biologiczne w systemie rozwojowym, na które można odpowiedzieć w stosunkowo krótkim czasie (około 5 dni z protokołem opisanym w tym artykule).
Czas liczenia potomstwa jest bardzo ważny dla testów żywotności zarodków. W temperaturze 20 °C embriogeneza trwa około 16 godzin, a dojrzałe reprodukcyjnie osobniki dorosłe rozpoczynają składanie jaj około 60 godzin po wykluciu jako larwy L1. Ponieważ cykl życiowy jest szybki, ważne jest, aby policzyć potomstwo w odpowiednim oknie, dając wystarczająco dużo czasu na wyklucie się zarodków, ale zanim samo potomstwo zacznie składać jaja. Należy również pamiętać, że okresy wzrostu różnią się w zależności od temperatury. Wzrost jest około 2,1 razy szybszy w temperaturze 24-25 °C niż 15-16 °C i około 1,3 razy szybszy w temperaturze 20 °C niż 15-16 °C13. W tym protokole zalecamy, aby liczenie odbywało się 48 godzin po umieszczeniu dorosłych na świeżym talerzu. Takie ramy czasowe zapewniają, że wszystkie zarodki z rozwojem typu dzikiego mają wystarczająco dużo czasu na wyklucie się (>16 godzin), ale nie starzeją się do punktu zdolności reprodukcyjnej. Testy przeprowadzane w temperaturach niższych niż 20 °C mogą wymagać przedłużenia (przenoszenie zwierząt na 4 dni), aby zarodki mogły się wykluć, a wyklute potomstwo osiągnęło stadia larwalne, które są łatwiejsze do zaobserwowania wśród bakterii na płytkach MYOB (stadia L3-L4).
Ograniczeniem do testów żywotności zarodków i wielkości czerwiu jest to, że specyficzny proces rozwojowy, który jest zaburzony, nie jest łatwo widoczny. Jednak te wstępne testy można przeprowadzić za pomocą technik cytologicznych w celu określenia, który proces jest dotknięty. Na przykład rozbiór dorosłych robaków w celu uwolnienia gonady, a następnie barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) i dokładna analiza morfologii DNA w linii zarodkowej może ujawnić, czy procesy mejotyczne są zakłócone. Ponadto barwienie zarodków DAPI może ujawnić, na jakim etapie embriogeneza zostaje zatrzymana.
Podsumowując, opisaliśmy protokół oznaczania liczby wyprodukowanych zarodków (czerwiu) i odsetka zarodków, które są zdolne do życia dla różnych mutantów C. elegans . Test ten może być stosowany zarówno do samozapładniania hermafrodytów, jak i do krzyżówek samców i hermafrodytów. Dzięki krótkiemu cyklowi życia C. elegans, protokół ten można ukończyć w mniej niż 1 tydzień. Testy żywotności embrionów i wielkości czerwiu mogą być wykorzystywane jako pierwsze analizy genów zaangażowanych w mejozę, zapłodnienie lub rozwój embrionalny i są odpowiednimi protokołami zarówno dla bardziej zaawansowanych badaczy, jak i nowicjuszy badawczych (studentów pierwszego roku studiów magisterskich).

Rozmnażanie płciowe w organizmach eukariotycznych wymaga produkcji funkcjonalnych gamet, które łączą się, tworząc zarodek w procesie zapłodnienia. Gamety matczyne i ojcowskie, komórka jajowa (komórki jajowe) i plemniki są tworzone w wyniku wyspecjalizowanych procesów podziału i różnicowania komórek mejozy i gametogenezy1. Mejoza zaczyna się od pojedynczej komórki diploidalnej, a kończy na tworzeniu komórek potomnych, które zawierają połowę liczby chromosomów pierwotnej komórki rodzicielskiej. Od redukcji ploidalności do tasowania materiału genetycznego poprzez niezależny asortyment i rekombinację krzyżową, mejoza pełni wiele ważnych funkcji1. Błędy w mejozie mogą powodować aneuploidię, w której w gamecie jest za dużo lub za mało chromosomów. Występowanie aneuploidii ma ogromny wpływ na zdrowie człowieka, ponieważ nierównowaga chromosomowa jest główną przyczyną poronień i zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa i zespół Edwardsa2.
Zapłodnienie to proces, w którym gamety matki i ojca łączą się, tworząc nowy organizm3. Rozpoznawanie gamet-gamet jest ułatwione przez białka na powierzchni gamet3. Błędy w kompatybilności gamet prowadzą do niepłodności, ponieważ fuzja plemników i komórek jajowych nie jest w stanie postępować. Fuzja plemnika z oocytem wyzwala szereg zdarzeń, które prowadzą do prawidłowego uformowania się aktywnego zarodka, który może rozpocząć podróż rozwojową od zarodka jednokomórkowego do w pełni funkcjonalnego organizmu wielokomórkowego poprzez podziały mitotyczne4. Przez cały okres embriogenezy zdarzenia molekularne, które regulują rozwój, muszą być ściśle regulowane i precyzyjnie zaplanowane, aby umożliwić prawidłowy wzrost organizmu5. Prawidłowe różnicowanie komórkowe we wczesnym okresie rozwoju ma kluczowe znaczenie, ponieważ organizm przechodzi od pluripotencjalnego zarodka do pełnoprawnego organizmu. Ze względu na złożoność tych zdarzeń, zakłócenia mogą prowadzić do wad rozwojowych, które skutkują śmiertelnością zarodka.
Caenorhabditis elegans to doskonały organizm modelowy do badania mejozy, zapłodnienia i rozwoju embrionalnego. C. elegans to przezroczysty nicień, który ma dwie płcie, samce i hermafrodyty. Hermafrodyty C. elegans, które są zdolne do samozapłodnienia, są dominującą płcią6,7. Gonada hermafrodytowa po raz pierwszy wytwarza plemniki w czwartym stadium larwalnym (L4), które są przechowywane w spermatece. W okresie od L4 do dorosłości linia zarodkowa przełącza się na produkcję oocytów, które są następnie zapładniane za pośrednictwem przechowywanych plemników. Samce, które pojawiają się w hermafrodytach w tempie mniejszym niż 0,2%, wytwarzają tylko plemniki i mogą kojarzyć się z hermafrodytami. Po zapłodnieniu krzyżowym plemniki męskie konkurują z plemnikami hermafrodytycznymi w zapłodnieniu oocytów8. Pozwala to na stosunkowo łatwe utrzymanie homozygotycznych mutantów poprzez samozapładnianie stad oraz na manipulacje genetyczne poprzez krzyżowanie genetyczne. Obie płcie pozwalają na badania badające różnice między mejozą w męskich i żeńskich liniach rozrodczych. Ponadto, ze względu na przezroczystą naturę C. elegans i jego jaj, procesy mejozy, gametogenezy, zapłodnienia i embriogenezy można badać u żywych, nienaruszonych zwierząt przy użyciu technik obrazowania fluorescencyjnego.
Podczas analizy nowych mutacji w genach, które mogą odgrywać rolę w mejozie, zapłodnieniu i/lub rozwoju embrionalnym u C. elegans, kluczowym pierwszym krokiem jest określenie żywotności embrionalnej i wielkości potomstwa, ponieważ błędy w tych procesach często prowadzą do niepowodzenia lub zmniejszenia produkcji zdolnego do życia potomstwa. W artykule opisano protokół oceny płodności, żywotności zarodka i wielkości lęgu z samozapładniających się hermafrodytów lub krzyżówek między hermafrodytami a samcami. Chociaż ten klasyczny test był używany w wielu badaniach nad C. elegans, zapewniamy ustandaryzowany protokół konfiguracji i dokładnej kwantyfikacji. W tym protokole izoluje się pojedyncze robaki lub pary samce/hermafrodyty, aby umożliwić krycie i produkcję potomstwa. Produkcja i żywotność potomstwa są obserwowane przez szereg dni w celu określenia liczby zdolnych do życia zarodków potomnych i niezdolnych do życia. Na zakończenie eksperymentu poszczególne lęgi są analizowane w celu obliczenia procentu żywotności zarodka i całkowitej wielkości lęgu.

<table><tbody><tr><td><mocny>Materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalki Petriego</td><td>Tritech research</td><td>T3501</td><td>Częściowo sztaplowane, bez wentylacji.</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td>Dla MYOB</td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td>Dla MYOB</td></tr><tr><td>Cholestrol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C8503</td><td>Dla</td></tr><tr><td>chlorku sodu</td> MYOB <td>J.T. Baker</td><td>FW 58.440</td><td>Dla MYOB</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Dla MYOB</td></tr><tr><td>Trizma chlorowodorek Sigma</td><td></td><td>T3253</td><td>Dla MYOB</td></tr><<tr><td>strong>Szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans szczep typu dzikiego</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>him-5(e1490)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>DR466</td><td></td></tr><tr><td>spo-11(ok79)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>AV106</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt/oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Różnicowy licznik komórek</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-670-12</td><td></td></tr><tr><td>MicroSoft Excel lub Prism</td><td>MicroSoft lub GraphPad</td><td></td><td>Do rejestrowania i tworzenia graficznych reprezentacji danych.</td></tr><tr><td>drut platynowy</td><td>Tritech research</td><td>PT9901</td><td>Do robienia kilofów robaków. 99,5% platyny, 0,5% irydu. Jest to dostarczane w postaci 3 stóp / paczki, co wystarcza do wykonania 36 kilofów ślimakowych (~ 1 cal drutu platynowego na kilof).</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ-745</td><td>Podstawa diaskopowa z mocowaniem ostrości, zintegrowany moduł LED, przewód zasilający, zakres zoomu od 6,7x do 50x [WD 115 mm], okular szerokokątny C-15x/17 (Uwaga: odpowiedniki mikroskopów stereoskopowych są dostępne u innych producentów.)</td></tr><tr><td>uchwyt do robaków</td><td>Tritech research</td><td>TWPH1</td><td>Do robienia kilofów do robaków. Zamontuj ~ 1 w platynowym drucie do uchwytu ślimaka. Alternatywnie, wykałaczki ślimakowe można wykonać, montując drut platynowy w szklanej pipecie Pasteura.</td></tr></tbody></table>

pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans to doskonały organizm modelowy do badań nad mejozą, zapłodnieniem i rozwojem embrionalnym. C. elegans istnieją jako samozapładniające się hermafrodyty, które wytwarzają duże lęgi potomstwa - gdy obecne są samce, mogą produkować jeszcze większe lęgi potomstwa krzyżowego. Błędy w mejozy, zapłodnieniu i embriogenezie można szybko ocenić jako fenotypy bezpłodności, zmniejszonej płodności lub śmiertelności zarodka. W artykule opisano metodę określania żywotności zarodka i wielkości lęgu u C. elegans. Pokazujemy, jak skonfigurować ten test, wybierając robaka na pojedynczą płytkę Modified Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB), ustalamy odpowiednie ramy czasowe do liczenia zdolnych do życia zarodków potomnych i niezdolnych do życia oraz wyjaśniamy, jak dokładnie liczyć żywe próbki robaków. Technika ta może być stosowana do określania żywotności samozapładniających się hermafrodytów, a także do zapłodnienia krzyżowego przez kojarzenie par. Te stosunkowo proste eksperymenty można łatwo zastosować dla nowych badaczy, takich jak studenci studiów licencjackich i studentów pierwszego roku studiów magisterskich.

Przeprowadzono testy żywotności embrionów oraz pomiary wielkości lęgu dla szczepu N2 (typ dziki) oraz dwóch szczepów posiadających mutacje w genach zaangażowanych w mejozę, him-5(e1490) i spo-11(ok79). Ponieważ zarówno him-5, jak i spo-11 odgrywają rolę w tworzeniu crossing-over w mejozie, mutacje w tych dwóch genach prowadzą do powstania gamet aneuploidalnych. Test żywotności embrionów dla N2 wykazał żywotność na poziomie 98,9%, podczas gdy w przypadku him-5(e1490) i spo-11(ok79) odnotowano spadek żywotności potomstwa do odpowiednio 74,9% i 0,8% (Rycina 2A; p &lt; 0,0005). Wyniki te są zgodne z wcześniej opublikowanymi danymi7,9. Średnią wielkość lęgu dla N2, him-5(e1490) i spo-11(ok79) określono odpowiednio na 217, 105 i 219 (Rycina 2B). Zgodnie z wcześniejszymi publikacjami, him-5(e1490) charakteryzuje się znacząco mniejszą wielkością lęgu w porównaniu do typu dzikiego, podczas gdy w przypadku spo-11(ok79) nie zaobserwowano takiej różnicy7,9.
<img alt="Eksperyment z filtrem membranowym w szalce Petri z analizą siatki dla wzrostu mikroorganizmów, wyniki mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Prezentacja układu do liczenia i morfologii embrionów na płytkach. (A) Zdjęcie pokrywki z narysowanym cienkim markerem wzorem siatki w kratkę. (B) Płytka MYOB 35 mm z wzorzystą pokrywką pod spodem, służąca do liczenia. (C) Zdjęcie prezentujące pole widzenia przy małym powiększeniu (10x), pokazujące wiele pól siatki. Białe groty strzałek wskazują kilka larw w tym polu widzenia. Liczenie powinno być przeprowadzane przy większym powiększeniu (tylko jedno pole w polu widzenia), aby móc zaobserwować zarówno larwy, jak i embriony. Pasek skali = 1,000 µm. (D) Schemat pokrywki ze wzorem siatki umieszczonej pod płytką 35 mm. Wstawka przedstawia właściwą technikę określania, które larwy są liczone w danym polu. Liczenie odbywa się od góry do dołu, od lewej do prawej. Należy liczyć wszystkie nicienie, które znajdują się w całości w obrębie pola. Nicienie dotykające granicy powinny być liczone na podstawie położenia głowy nicienia, a nie ogona. Licz nicienie skierowane w stronę aktualnego pola lub pól, które zostały już policzone (tj. krawędzie górna i lewa). Nie licz nicieni, których głowy dotykają krawędzi dolnej lub prawej. Na wstawce niebieskie nicienie zostaną policzone, natomiast czerwone nie. (E) Reprezentatywne zdjęcie zdrowych wyklutych larw N2 L1 (biały grot strzałki). (F) Reprezentatywne zdjęcie niezapłodnionego oocytu (czarny grot strzałki) i niewykutego embrionu (czerwony grot strzałki). Niezapłodnione oocyty nie powinny być liczone w tym teście. Paski skali (E,F) = (100 µm). Uwaga: Zdjęcia w punktach C, E i F zostały wykonane za pomocą mikroskopu Zeiss AxioZoom z dołączoną kamerą w celu zaprezentowania wyglądu larw, embrionów i oocytów na płytkach z nicieniami. W testach żywotności embrionów liczenie odbywa się podczas obserwacji płytek za pomocą stereomikroskopu (bez kamery). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe przedstawiające żywotność embrionów i wielkość lęgów w porównaniu szczepów N2, him-5(e1490) oraz spo-11(ok79)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne wykresy przedstawiające wyniki testów żywotności embrionów oraz wielkości lęgów. (A) Procentowa żywotność embrionów N2, him-5(e1490) oraz spo-11(ok79) w temperaturze 20 °C. (B) Wielkość lęgów N2, him-5(e1490) oraz spo-11(ok79) w temperaturze 20 °C. Dla każdego szczepu oceniono potomstwo co najmniej 28 hermafrodyt. Całkowita liczba niewyklutych embrionów oraz ocenionych larw wyniosła odpowiednio: N2 = 6302, him-5(e1490) = 2,945 oraz spo-11(ok79) = 7,230. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe z trzech oddzielnych powtórzeń indywidualnych. Statystyki obliczono za pomocą testu t Studenta, n.s. = brak istotności, *p &lt; 0.0005. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy ogólną metodę określania żywotności embrionalnej i całkowitej liczby wyprodukowanych zarodków (czerwiu) za pomocą organizmu modelowego C. elegans.

Pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Ten protokół do określania wielkości czerwiu i żywotności zarodka jest stosowany przez wiele laboratoriów C. elegans. Zmniejszenie wielkości zwierzęcia i żywotności zarodka może wskazywać na defekty w ważnych procesach rozwojowych, takich jak mioza, zapłodnienie i embriogeneza. Technika ta zapewnia jasne instrukcje dla początkujących badaczy C.elegans.Jest stosunkowo prosty w konfiguracji i wykonaniu, i jest świetnym punktem wyjścia do pracy z nowymi zmutowanymi szczepami. Największym wyzwaniem dla tej techniki jest identyfikacja zarodka w porównaniu z zarodkiem niezapłodnionym. Nowi badacze powinni przećwiczyć identyfikację zarodków, oocytów i różnych stadiów larwalnych przed rozpoczęciem tych eksperymentów.Aby rozpocząć, oznacz tył płytki, przenieś pojedynczy hermafrodytę etapu L4 w dół na płytkę. Upewnij się, że żadne zarodki ani inne robaki nie zostały przeniesione na płytkę. Pozwól robakom rozwinąć się w dorosłe osobniki i złożyć potomstwo przez 24 godziny w standardowej temperaturze hodowli 20 stopni Celsjusza.Zdobądź talerz trzeciego dnia. Następnego dnia oznacz zestaw nowych płytek i przenieś jednego dnia pojedynczego robaka na nową płytkę. Pozwól robakom złożyć zarodki przez 24 godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Zdobądź talerz czwartego dnia. Trzeciego dnia oznacz zestaw nowych płytek i przenieś pojedyncze robaki z drugiego dnia na nową płytkę. Pozwól robakom złożyć potomstwo przez 24 godziny w temperaturze 20 stopni.Zdobądź talerz w piątym dniu. Narysuj wzór siatki na 35-milimetrowej pokrywie za pomocą drobnego markera. Umieść pokrywkę z kratką pod płytką testową w celu zliczenia, aby śledzić wcześniej policzone robaki.Korzystając z różnicowego licznika komórek, policz żywe larwy i niewyklute zarodki w obrębie pojedynczego kwadratu. W przypadku robaków na kwadratowych granicach licz na podstawie lokalizacji głowy robaka. Policz robaki, których głowy dotykają górnej i lewej krawędzi kwadratu.Zapisać liczbę żywych larw i niewyklutych zarodków w zeszycie laboratoryjnym. Czwartego dnia naciąć płytkę drugiego dnia, licząc żywe larwy i niewyklute zarodki, a następnie zapisz je w zeszycie laboratoryjnym. Piątego dnia naciąć płytkę trzeciego dnia, licząc żywe larwy i niewyklute zarodki, a następnie zapisz je w zeszycie laboratoryjnym.Po oznaczeniu tylnej części płytki przenieś na nią pojedynczego robaka hermafrodytycznego L4. Upewnij się, że żadne zarodki ani inne robaki nie zostały przeniesione na płytkę. Przenieś pojedynczego samca robaka L4 na płytkę zawierającą hermafrodytę L czterech.Pozwól robakom łączyć się w pary i składać potomstwo przez 24 godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Trzeciego dnia należy ocenić szalkę dla żywych larw w porównaniu z niewyklutymi zarodkami. Następnego dnia oznacz zestaw nowych płytek i przenieś hermafrodytę i samca na nową płytkę.Upewnij się, że hermafrodyta osiągnął dorosłość. Pozwól hermafrodytom składać potomstwo przez 24 godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Czwartego dnia należy naciąć szalkę dla żywych larw w porównaniu z niewyklutymi zarodkami.Trzeciego dnia oznacz zestaw nowych płytek i przenieś hermafrodytę i samca na nową płytkę. Pozwól robakom złożyć potomstwo przez 24 godziny w temperaturze 20 stopni. Oceń szalkę dla żywych i niewyklutych zarodków w piątym dniu.Korzystając z różnicowego licznika komórek, policz żywe larwy i niewyklute zarodki z płytki pierwszego dnia i zapisz je w zeszycie laboratoryjnym. W czwartym dniu należy policzyć żywe potomstwo i niewyklute zarodki z płytki z drugiego dnia i zapisać je w zeszycie laboratoryjnym. Sprawdź talerz pierwszego dnia dla mężczyzn.Jeśli doszło do krycia, oczekiwany stosunek genetyczny hermafrodytów do samców wynosi od 50 do 50. Jeśli w dniu jednej z płytek nie ma żadnych samców, krycie między samcem a hermafrodytą nie następuje. Odrzuć tę parę godową i zapisz obserwację w zeszycie laboratoryjnym.W piątym dniu należy policzyć żywe larwy i niewyklute zarodki z płytki z trzeciego dnia i zapisać je w zeszycie laboratoryjnym. Test żywotności zarodka dla N2 wykazał procent żywotności 98,9%, podczas gdy zarówno HIM-5 (e1490), jak i spo-11 (ok79) wykazały zmniejszenie żywotności zarodka odpowiednio o 74,9% i 0,8%. Średnia wielkość lęgu N2, him-5 (e1490) i spo-11 (ok79) określono odpowiednio na 217, 105 i 219.Rozpoznanie różnych etapów rozwoju C.elegans jest ważne dla uzyskania dokładnych i powtarzalnych danych. Zalecamy zapoznanie się z rozwojem robaków za pomocą zdjęć i mikroskopu preparacyjnego. Ta procedura jest doskonałym pierwszym krokiem do ustalenia, czy gen jest zaangażowany w proces rozwojowy i może być poprzedzona analizami cytologicznymi w celu określenia, który proces jest zakłócony.

measuring-embryonic-viability-and-brood-size-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film opisuje tradycyjną, opartą na płytkach metodę pomiaru długości życia C. elegans. Przykładowy protokół mierzy długość życia robaków poddanych działaniu RNAi.

Analiza długości życia: pomiar długowieczności C. elegans

C. elegans podczas składania jaj może dostarczyć ważnych informacji w badaniach rozwojowych, reprodukcyjnych i anatomicznych. Ten film przedstawia ważne etapy testu składania jaj i pokazuje próbkę eksperymentu, w którym lek jest testowany pod kątem toksyczności reprodukcyjnej.

Test składania jaj: metoda ilościowego określania zachowania C. elegans podczas składania jaj

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Opisany jest podstawowy protokół oceny toksyczności substancji chemicznych u zwierzęcia modelowego, Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest wygodna i przydatna przy opracowywaniu farmaceutyków, a także przy ocenie ryzyka związanego z różnymi zanieczyszczeniami środowiska.

Pomiar wpływu substancji chemicznych na wzrost i rozmnażanie Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy metodę Replica Set, podejście do ilościowego pomiaru długości życia/przeżycia i zdrowia C. elegans w sposób wysoce wydajny i solidny, umożliwiając w ten sposób badanie wielu schorzeń bez poświęcania jakości danych. Protokół ten szczegółowo opisuje strategię i udostępnia narzędzie programowe do analizy danych zestawu replik.

Metoda zestawu replik: wysokoprzepustowe podejście do ilościowego pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans

Oddychanie mitochondrialne jest kluczowe dla przetrwania organizmu; dlatego wskaźnik zużycia tlenu jest doskonałym wskaźnikiem zdrowia mitochondriów. W tym protokole opisujemy zastosowanie dostępnego na rynku respirometru do pomiaru podstawowych i maksymalnych wskaźników zużycia tlenu u żywych, nienaruszonych i swobodnie ruchliwych Caenorhabditis elegans.

Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans

Plemnik musi pomyślnie przejść przez jajowód, aby zapłodnić oocyt. W tym miejscu opisujemy test do pomiaru migracji plemników w obrębie macicy hermafrodyty C. elegans. Test ten może dostarczyć danych ilościowych na temat rozmieszczenia plemników w macicy po kryciu, a także na temat prędkości, prędkości kierunkowej i częstotliwości odwrócenia.

Pomiar przewodnictwa i ruchliwości plemników w hermafrodytowym układzie rozrodczym Caenorhabditis elegans

Ten protokół ma na celu ocenę żywotności Drosophila na każdym etapie rozwoju, od zarodka do dorosłego osobnika. Metoda ta może być stosowana do określania i porównywania żywotności różnych genotypów lub warunków wzrostu.

Bezpośrednia i prosta metoda oceny żywotności Drosophila melanogaster od zarodka do dorosłego osobnika

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę pomiaru żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans. Protokół ten umożliwia badanie procesów rozwojowych i identyfikację czynników genetycznych wpływających na rozwój.

Pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów