Pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans

Ten protokół do określania wielkości czerwiu i żywotności zarodka jest stosowany przez wiele laboratoriów C. elegans. Zmniejszenie wielkości zwierzęcia i żywotności zarodka może wskazywać na defekty w ważnych procesach rozwojowych, takich jak mioza, zapłodnienie i embriogeneza. Technika ta zapewnia jasne instrukcje dla początkujących badaczy C.elegans.

Jest stosunkowo prosty w konfiguracji i wykonaniu, i jest świetnym punktem wyjścia do pracy z nowymi zmutowanymi szczepami. Największym wyzwaniem dla tej techniki jest identyfikacja zarodka w porównaniu z zarodkiem niezapłodnionym. Nowi badacze powinni przećwiczyć identyfikację zarodków, oocytów i różnych stadiów larwalnych przed rozpoczęciem tych eksperymentów.

Aby rozpocząć, oznacz tył płytki, przenieś pojedynczy hermafrodytę etapu L4 w dół na płytkę. Upewnij się, że żadne zarodki ani inne robaki nie zostały przeniesione na płytkę. Pozwól robakom rozwinąć się w dorosłe osobniki i złożyć potomstwo przez 24 godziny w standardowej temperaturze hodowli 20 stopni Celsjusza.

Zdobądź talerz trzeciego dnia. Następnego dnia oznacz zestaw nowych płytek i przenieś jednego dnia pojedynczego robaka na nową płytkę. Pozwól robakom złożyć zarodki przez 24 godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Zdobądź talerz czwartego dnia. Trzeciego dnia oznacz zestaw nowych płytek i przenieś pojedyncze robaki z drugiego dnia na nową płytkę. Pozwól robakom złożyć potomstwo przez 24 godziny w temperaturze 20 stopni.

Zdobądź talerz w piątym dniu. Narysuj wzór siatki na 35-milimetrowej pokrywie za pomocą drobnego markera. Umieść pokrywkę z kratką pod płytką testową w celu zliczenia, aby śledzić wcześniej policzone robaki.

Korzystając z różnicowego licznika komórek, policz żywe larwy i niewyklute zarodki w obrębie pojedynczego kwadratu. W przypadku robaków na kwadratowych granicach licz na podstawie lokalizacji głowy robaka. Policz robaki, których głowy dotykają górnej i lewej krawędzi kwadratu.

Zapisać liczbę żywych larw i niewyklutych zarodków w zeszycie laboratoryjnym. Czwartego dnia naciąć płytkę drugiego dnia, licząc żywe larwy i niewyklute zarodki, a następnie zapisz je w zeszycie laboratoryjnym. Piątego dnia naciąć płytkę trzeciego dnia, licząc żywe larwy i niewyklute zarodki, a następnie zapisz je w zeszycie laboratoryjnym.

Po oznaczeniu tylnej części płytki przenieś na nią pojedynczego robaka hermafrodytycznego L4. Upewnij się, że żadne zarodki ani inne robaki nie zostały przeniesione na płytkę. Przenieś pojedynczego samca robaka L4 na płytkę zawierającą hermafrodytę L czterech.

Pozwól robakom łączyć się w pary i składać potomstwo przez 24 godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Trzeciego dnia należy ocenić szalkę dla żywych larw w porównaniu z niewyklutymi zarodkami. Następnego dnia oznacz zestaw nowych płytek i przenieś hermafrodytę i samca na nową płytkę.

Upewnij się, że hermafrodyta osiągnął dorosłość. Pozwól hermafrodytom składać potomstwo przez 24 godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Czwartego dnia należy naciąć szalkę dla żywych larw w porównaniu z niewyklutymi zarodkami.

Trzeciego dnia oznacz zestaw nowych płytek i przenieś hermafrodytę i samca na nową płytkę. Pozwól robakom złożyć potomstwo przez 24 godziny w temperaturze 20 stopni. Oceń szalkę dla żywych i niewyklutych zarodków w piątym dniu.

Korzystając z różnicowego licznika komórek, policz żywe larwy i niewyklute zarodki z płytki pierwszego dnia i zapisz je w zeszycie laboratoryjnym. W czwartym dniu należy policzyć żywe potomstwo i niewyklute zarodki z płytki z drugiego dnia i zapisać je w zeszycie laboratoryjnym. Sprawdź talerz pierwszego dnia dla mężczyzn.

Jeśli doszło do krycia, oczekiwany stosunek genetyczny hermafrodytów do samców wynosi od 50 do 50. Jeśli w dniu jednej z płytek nie ma żadnych samców, krycie między samcem a hermafrodytą nie następuje. Odrzuć tę parę godową i zapisz obserwację w zeszycie laboratoryjnym.

W piątym dniu należy policzyć żywe larwy i niewyklute zarodki z płytki z trzeciego dnia i zapisać je w zeszycie laboratoryjnym. Test żywotności zarodka dla N2 wykazał procent żywotności 98,9%, podczas gdy zarówno HIM-5 (e1490), jak i spo-11 (ok79) wykazały zmniejszenie żywotności zarodka odpowiednio o 74,9% i 0,8%. Średnia wielkość lęgu N2, him-5 (e1490) i spo-11 (ok79) określono odpowiednio na 217, 105 i 219.

Rozpoznanie różnych etapów rozwoju C.elegans jest ważne dla uzyskania dokładnych i powtarzalnych danych. Zalecamy zapoznanie się z rozwojem robaków za pomocą zdjęć i mikroskopu preparacyjnego. Ta procedura jest doskonałym pierwszym krokiem do ustalenia, czy gen jest zaangażowany w proces rozwojowy i może być poprzedzona analizami cytologicznymi w celu określenia, który proces jest zakłócony.