Name: Przygotowanie 3D bezkomórkowych matryc z mięśni szkieletowych płodu myszy do hodowli komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj protokół dekompozycji mięśni szkieletowych płodu myszy w celu uzyskania trójwymiarowych matryc bezkomórkowych. Ta metoda umożliwia hodowlę myoblastów C2C12 i badanie miopatii wrodzonych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; numer umowy 23049), projekt MATRIHEALTH oraz jednostkę finansującą cE3c UIDB/00329/2020. Chcielibyśmy podziękować naszemu darczyńcy Henrique Meirellesowi, który zdecydował się wesprzeć projekt MATRIHEALTH. Prace te skorzystały z infrastruktury Zakładu Mikroskopii Wydziału Nauk, węzła Portugalskiej Platformy BioObrazowania (numer referencyjny PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), a my dziękujemy Luísowi Marquesowi za pomoc w pozyskiwaniu i przetwarzaniu obrazów. Na koniec dziękujemy Marcie Palmie za wsparcie techniczne i naszemu zespołowi badawczemu za hojny wkład.

<ol><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of extracellular matrix.</a> Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li>
<li>Lamandé, S. R., Bateman, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disorders+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Genetic disorders of the extracellular matrix.</a> Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).</li>
<li>Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk+between+extracellular+matrix+and+skeletal+muscle%3A+implications+for+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 142(2020).</li>
<li>Tome, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+muscular+dystrophy+with+merosin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+de+l%27Academie+des+Sciences.+Serie+III%2C+Sciences+de+la+Vie%22%5BJournal%5D)">Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency.</a> Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).</li>
<li>Gawlik, K. I., Durbeej, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+laminin+and+MDC1A%3A+pathogenesis+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 9(2011).</li>
<li>van Ry, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM-related+myopathies+and+muscular+dystrophies%3A+pros+and+cons+of+protein+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).</li>
<li>Gawlik, K. I., Durbeej, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+laminin+%CE%B12+chain-deficient+mouse+mutants%3A+advancing+the+research+on+LAMA2-CMD%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59(2020).</li>
<li>Kuang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merosin-deficient+congenital+muscular+dystrophy.+Partial+genetic+correction+in+two+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models.</a> Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).</li>
<li>Nunes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+fetal+muscle+development+and+JAK-STAT+activation+mark+disease+onset+and+progression+in+a+mouse+model+for+merosin-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).</li>
<li>McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tissues+as+platforms+for+in+vitro+modeling+of+healthy+and+diseased+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues.</a> Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+skeletal+muscle%3A+A+versatile+biomaterial+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Biomaterials. 283, 121436(2022).</li>
<li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparable+decellularization+of+fetal+and+adult+cardiac+tissue+explants+as+3D-like+platforms+for+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e56924(2019).</li>
<li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li>
<li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li>
<li>Burattini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2C12+murine+myoblasts+as+a+model+of+skeletal+muscle+development%3A+morpho-functional+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization.</a> European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).</li>
<li>Murphy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caesarean+section+and+fostering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Caesarean section and fostering.</a> Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).</li>
<li>Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+DNA-specific+stain+methyl+green+in+the+fluorescent+labeling+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52769(2015).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+guidance+for+quantitative+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).</li>
<li>Paulsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.T.S.+Biosynthesis%2C+tissue+distribution+and+isolation+of+laminins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Laminins%22%5BJournal%5D)">A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins.</a> The Laminins. , 1-26 (1994).</li>
<li>Fedecostante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recellularized+native+kidney+scaffolds+as+a+novel+tool+in+nephrotoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%3A+the+Biological+Fate+of+Chemicals%22%5BJournal%5D)">Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening.</a> Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).</li>
<li>Wagner, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+decellularization+and+recellularization+of+normal+versus+emphysematous+human+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs.</a> Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).</li>
<li>Brouki Milan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+preservation+of+human+skin%3A+A+platform+for+tissue+engineering+and+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery.</a> Methods. 171, 62-67 (2020).</li>
<li>Lamandé, S. R., Bateman, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+VI+disorders%3A+Insights+on+form+and+function+in+the+extracellular+matrix+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond.</a> Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).</li>
<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).</li>
<li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process%3A+a+ToF-SIMS+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li>
<li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tissue+engineering+with+decellularized+rhesus+monkey+kidneys%3A+age-related+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+in+vivo+validation+of+tissue-engineered%2C+small-diameter+vascular+grafts+from+decellularized+aortae+of+fetal+pigs+and+canine+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101(2017).</li>
<li>Wu Young, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+fetal+matrix+suppresses+fibrotic+gene+expression+and+promotes+myogenesis+in+a+rat+model+of+volumetric+muscle+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

ECM to złożona sieć makrocząsteczek, która jest obecna we wszystkich tkankach i odgrywa kluczową rolę w regulacji zachowania i funkcji komórek2. ECM działa jak fizyczne rusztowanie, do którego komórki mogą się przyczepić, i dostarcza wskazówek, które aktywnie modulują procesy komórkowe, takie jak proliferacja, ruchliwość, różnicowanie i apoptoza. Tak więc prawidłowe tworzenie i utrzymywanie ECM jest niezbędne zarówno dla rozwoju, jak i homeostazy1.
<p class="jove_conten...

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest głównym składnikiem tkanek, reprezentującym ich niekomórkowy komponent. Ta trójwymiarowa (3D) struktura nie tylko zapewnia fizyczne wsparcie dla komórek, ale także odgrywa kluczową rolę w procesach biochemicznych związanych z rozwojem organizmów1. Tworzenie specyficznego tkankowo ECM następuje podczas rozwoju, w wyniku złożonych interakcji między komórkami i ich niszami, na które wpływają różne bodźce wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe. ECM jest wysoce dynamiczną strukturą, która ulega chemicznym i mechanicznym rearanżacjom w sposób czasowo-przestrzenny i bezpośrednio wpływa na los komórki2. Jedną z najbardziej godnych uwagi cech ECM jest jego różnorodność funkcjonalna, ponieważ każda tkanka ECM wykazuje unikalną kombinację cząsteczek, które zapewniają różne topologie i właściwości, które są dostosowane do zawartych w nim komórek1.
Sygnalizacja i wsparcie ECM są kluczowe dla rozwoju i homeostazy, a gdy są zakłócone, mogą prowadzić do wielu stanów patologicznych3,4. Jednym z przykładów jest wrodzona dystrofia z niedoborem LAMA2 (LAMA2-CMD), która jest najczęstszą postacią wrodzonej dystrofii mięśniowej. Gen LAMA2 koduje łańcuch α2 lamininy, który jest obecny w lamininie 211 i lamininie 221, a po mutacji może prowadzić do LAMA2-CMD5. Laminina 211 jest główną izoformą występującą w błonie podstawnej otaczającej włókna mięśni szkieletowych. Gdy laminina 211 jest nieprawidłowa lub nie ma jej wcale, połączenie między błoną podstawną a komórkami mięśniowymi zostaje przerwane, co prowadzi do wystąpienia choroby6. Pacjenci z LAMA2-CMD wykazują łagodny lub ciężki fenotyp w zależności od rodzaju mutacji w genie LAMA2.
Gdy funkcja białka α2 lamininy jest zaburzona, pacjenci mogą doświadczyć ciężkiej hipotonii mięśniowej po urodzeniu i rozwinąć przewlekłe zapalenie, zwłóknienie i zanik mięśni, co prowadzi do skrócenia oczekiwanej długości życia. Do tej pory nie opracowano żadnych celowanych metod leczenia, a podejścia terapeutyczne ograniczają się do łagodzenia objawów choroby7. Dlatego zrozumienie podstawowych mechanizmów molekularnych związanych z wystąpieniem tej choroby ma kluczowe znaczenie dla opracowania odpowiednich strategii terapeutycznych6,8. Wcześniejsze prace z użyciem dyW mouse9, modelu LAMA2-CMD, sugerują, że początek choroby zaczyna się w macicy, a konkretnie podczas miogenezy płodu10. Lepsze zrozumienie, w jaki sposób pojawia się wada miogenezy płodu, byłoby przełomem w tworzeniu nowych podejść terapeutycznych dla LAMA2-CMD.
Systemy in vitro zapewniają kontrolowane środowisko do badania interakcji komórka-komórka i komórka-ECM, ale modele hodowli 2D nie są tak skomplikowane jak natywne tkanki. Decelularyzacja tkanek wytwarza specyficzne dla tkanek i rozwoju bezkomórkowe rusztowania ECM, które dokładniej naśladują naturalne mikrośrodowisko komórki w porównaniu z modelami 2D i inżynieryjnymi/syntetycznymi rusztowaniami. Matryce bezkomórkowe (dECM) mają potencjał do zachowania molekularnych i mechanicznych wskazówek tkanki gospodarza, co czyni je lepszymi alternatywnymi modelami do zrozumienia procesów in vivo11.
Istnieją różne techniki, odczynniki i warunki, które mogą być używane do decelularyzacji12,13. W tym badaniu protokół decelularyzacji serca płodu myszy, opisany przez Silva i wsp.14,15, jest dostosowany do mięśni szkieletowych płodu myszy i stwierdzono, że zachowuje wszystkie testowane składniki ECM (laminina α2, lamininy całkowite, fibronektyna, kolagen I i kolagen IV). Protokół obejmuje trzy etapy: lizę komórek przez szok osmotyczny (bufor hipotoniczny), rozpuszczenie błony plazmatycznej i dysocjację białek (0,05% dodecylosiarczanu sodu [SDS]) oraz enzymatyczne niszczenie DNA (leczenie DNazą). Według naszej wiedzy jest to pierwszy ustalony protokół decelularyzacji mięśni szkieletowych płodu myszy.
Aby użyć tego systemu 3D in vitro do badania LAMA2-CMD, kluczowe jest utrzymanie łańcucha α2 lamininy po decelularyzacji. W związku z tym wdrożono protokół optymalizacyjny, w którym przetestowano różne detergenty (SDS i Triton X-100) i stężenia (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% i 0,5%) (dane nie pokazane). Stwierdzono, że optymalnym wyborem do usuwania komórek i zachowania białka α2 lamininy jest 0,05% SDS. Komórki C2C12, dobrze znana linia komórkowa mioblastów16,17, zostały użyte do zasiewu dECM. Komórki te atakują dECM, namnażają się i różnicują wewnątrz tych rusztowań, syntetyzując nowe białka ECM. Udana produkcja tego modelu 3D in vitro oferuje nowe podejście do zrozumienia procesów molekularnych i komórkowych związanych z miogenezą płodu, początkiem LAMA2-CMD, i może być rozszerzona na inne choroby mięśni, w których komunikacja między ECM a komórkami mięśni szkieletowych jest zakłócona.

<table><tbody><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, płaska, TC, sterylna</td><td>Abdos Labware</td><td>P21021</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-dichlorowodorek dimidyno-2-fenyloindolu</td><td>Merck</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żel</td><td>Bio-Rad</td><td>4561093</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, płaska, TC, sterylna</td><td>Abdos Labware</td><td>P21023</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, płaska, TC, sterylna</td><td>Abdos Labware</td><td>P21024</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V</td> Mikroskop fluorescencyjny <td>NZYtech</td><td>MB04601</td><td></td></tr><tr><td>BX60</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat CM1860 UV</td><td>Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>ThermoFisher</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>DMEM wysoka glukoza ze stabilną glutaminą z pirogronianem sodu</td><td>Biowest</td><td>L0103-500</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Zestaw tkanek </td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Merck</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Biowest</td><td>S1560-500</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa z cienką końcówką</td><td>ThermoFisher</td><td>15387823</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Biowest</td><td>S2000-100</td><td></td></tr><tr><td>Hera Guard Szafka przepływowa</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 Heracell 150</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiMark Wstępnie barwione białko Standard</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serum dla koni, pochodzenie z Nowej Zelandii</td><td>Gibco</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>HRP-&alpha;- IgG królika</td><td>abcam</td><td>ab205718</td><td></td></tr><tr><td>HRP-&alpha;- IgG szczura</td><td>abcam</td><td>ab205720</td><td></td></tr><tr><td>HRP-&alpha;- Mysz IgG</td><td>abcam</td><td>ab205719</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ v. 1.53t</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methyl Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67060</td><td></td></tr><tr><td>MM400 Tissue Lyser</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 Spektrofotometr </td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 16% w/v aq. soln., bez metanolu</td><td>Alfa Aesar</td><td>043368-9M</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (100x) </td><td>GRiSP</td><td>GTC05.0100</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa 488 </td><td>Thermo Fisher Sci.</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowa szalka Petriego 60x15mm z otworami wentylacyjnymi (sterylna)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628161</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Zestaw DSDN HS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; 3 Fluorometr</td><td>Invitrogen</td><td>15387293</td><td></td></tr><tr><td>S6E Zoom Mikroskop stereoskopowy</td><td>Dodecyl sodu Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>11667289001</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost&reg; Szkiełka adhezyjne Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Podłoże chemiluminescencyjne</td><td>Thermo Scientific</td><td>15626144</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny TCS SPE</td><td>Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hidroximetil) aminometano (zasada Tris) &ge; 99%</td><td>VWR Chemicals</td><td>28811.295</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsina-EDTA (0,05%) w DPBS (1X)</td><td>GRiSP</td><td>GTC02.0100</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 (50% roztwór)</td><td>ThermoFisher</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright PVDF-CL w rolce membranowej (0,22&mikro; m)</td> <td>Advansta</td><td>L-08024-001</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Kolagen I</td><td>abcam</td><td>ab21286</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Kolagen IV</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Kolagen IV</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-398655</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F-3648</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Laminin &alpha; 2 </td><td>Sigma</td><td>L-0663</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MHC</td><td>D.S.H.B.</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr>&alpha;-<td>Sondy molekularne</td> <td>Mouse Alexa 488</td><td>A11017</td><td></td></tr><tr>&alpha;-<td>Sondy molekularne</td> <td>Mouse Alexa 568</td><td>A11019</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-pan-Laminin</td><td>Sigma</td><td>L-9393</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-fosfo-histon 3</td><td>Merk Millipore</td><td>06-570</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Rabbit Alexa 568</td><td>Sondy molekularne</td><td>A21069</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Rabbit Alexa 488</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11070</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Rat Alexa 488</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11006</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie 3d bezkomórkowych matryc z mięśni szkieletowych płodu myszy do hodowli komórkowej

Preparation of 3D Decellularized Matrices from Fetal Mouse Skeletal Muscle for Cell Culture

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) odgrywa kluczową rolę w dostarczaniu strukturalnego wsparcia dla komórek i przekazywaniu sygnałów, które są ważne dla różnych procesów komórkowych. Dwuwymiarowe (2D) modele hodowli komórkowych nadmiernie upraszczają złożone interakcje między komórkami a ECM, ponieważ brak pełnego wsparcia trójwymiarowego (3D) może zmienić zachowanie komórek, czyniąc je niewystarczającymi do zrozumienia procesów in vivo. Braki w składzie ECM i interakcje komórka-ECM są ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do wielu różnych chorób. 
Jednym z przykładów jest LAMA2-wrodzona dystrofia mięśniowa (LAMA2-CMD), gdzie brak lub zmniejszenie funkcjonalnej lamininy 211 i 221 może prowadzić do ciężkiej hipotonii, wykrywalnej przy urodzeniu lub wkrótce po urodzeniu. Wcześniejsze prace z wykorzystaniem mysiego modelu choroby sugerują, że jej początek następuje podczas miogenezy płodu. Niniejsze badania miały na celu opracowanie modelu 3D in vitro, pozwalającego na badanie interakcji między komórkami mięśniowymi a ECM mięśni płodu, naśladując natywne mikrośrodowisko. Protokół ten wykorzystuje głębokie mięśnie pleców wypreparowane z płodów myszy E18.5, potraktowane buforem hipotonicznym, anionowym detergentem i DNazą. Powstałe matryce bezkomórkowe (dECM) zachowały wszystkie badane białka ECM (laminina α2, lamininy całkowite, fibronektyna, kolagen I i kolagen IV) w porównaniu z tkanką natywną. 
Gdy mioblasty C2C12 zostały zasiane na tych dECM, penetrowały i kolonizowały dECM, co wspierało ich proliferację i różnicowanie. Co więcej, komórki C2C12 wytwarzały białka ECM, przyczyniając się do przebudowy swojej niszy w obrębie dECM. Stworzenie tej platformy in vitro stanowi nowe, obiecujące podejście do wyjaśnienia procesów związanych z powstawaniem LAMA2-CMD i ma potencjał, aby zostać zaadaptowanym do innych chorób mięśni szkieletowych, w których braki w komunikacji między ECM a komórkami mięśni szkieletowych przyczyniają się do postępu choroby.

Celem protokołu decelularyzacji jest otrzymanie dECM, które ściśle odzwierciedlają skład tkanki natywnej. Aby ocenić skuteczność procesu decelularyzacji, zastosowano różne metody, w tym badanie morfologii tkanki, pomiar poziomu DNA, barwienie na F-aktynę oraz analizę kluczowych składników ECM z wykorzystaniem immunohistochemii i techniki western blotting. W szczególności przeanalizowano pięć głównych składników ECM tkanek mięśni szkieletowych.
W trakcie całego protokołu wygląd próbek ulega zmi...

W tej pracy zoptymalizowano protokół decelularyzacji w celu uzyskania zdecelularyzowanych matryc mięśni szkieletowych płodu myszy. Mioblasty C2C12 mogą kolonizować te matryce, namnażać się i różnicować. Ten model in vitro może być wykorzystany do badania zachowania komórek w kontekście chorób mięśni szkieletowych, takich jak dystrofie mięśniowe.

Przygotowanie 3D bezkomórkowych matryc z mięśni szkieletowych płodu myszy do hodowli komórkowej

The extracellular matrix (ECM) plays a crucial role in providing structural support for cells and conveying signals that are important for various ...

Według naszej wiedzy, protokół ten jest pierwszym, w którym wyprodukowano bezkomórkowe matryce z mięśni szkieletowych płodu, zapewniając nowatorskie podejście do badania miopatii, które zaczynają rozwijać się w macicy. Protokół ten generuje wskaźniki rozwojowe i specyficzne dla tkanki, które można wykorzystać do badania zachowania komórek mięśniowych i interakcji z macierzą zewnątrzkomórkową w kontrolowanym środowisku. LAMA2-CMD to wrodzona dystrofia mięśniowa, która zaczyna objawiać się po urodzeniu.Model ten może pomóc w rozwikłaniu mechanizmów związanych z jego wystąpieniem i doprowadzić do opracowania nowych terapii celowanych. Protokół ten można dostosować do różnych tkanek i modeli chorób. W zależności od typu matrycy i komórek można osiągnąć różne poziomy złożoności, co świadczy o wszechstronności systemu.Jest to bardzo prosty protokół. Najtrudniejszą częścią jest pobieranie i obchodzenie się z próbkami. Ale wraz z praktyką umiejętności techniczne można łatwo poprawić.Zacznij od przeniesienia jednego uśpionego płodu na raz na szalkę Petriego zawierającą lodowaty PBS. Po wycięciu skóry i kończyn przeciąć brzuszną stronę klatki piersiowej. Usuń mostek i leżące pod nim narządy.Ułóż płód grzbietem do góry i usuń szyjną część kręgosłupa. Następnie wytnij złogi tłuszczu na grzbiecie i tkankę łączną mięśni głębokiej pleców. Teraz zakotwicz klatkę piersiową za pomocą kleszczy chirurgicznych.Za pomocą mikroskalpela ostrożnie zeskrob, aby oderwać głębokie mięśnie pleców od otaczającej tkanki. Przechowuj tkanki w PBS na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Przez dłuższy czas przechowuj tkankę w pustej probówce do mikrowirówek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Pierwszego dnia należy stosować całe masy mięśniowe epoksjowe. Dodaj trzy mililitry hipotonicznego buforu zawierającego 1% penicyliny i streptomycyny do każdego dołka 12-dołkowej płytki. Dodaj fragment tkanki mięśniowej do każdego dołka i inkubuj przez noc przez 18 godzin z mieszaniem.Drugiego dnia usunąć bufor za pomocą pipety z cienką końcówką. Teraz przemyj próbki trzy razy trzema mililitrami PBS, za każdym razem mieszając przez godzinę. Po odrzuceniu PBS inkubować próbki w trzech mililitrach 0,05% roztworu detergentu SDS przez 24 godziny z mieszaniem.Trzeciego dnia użyj pipety z cienką końcówką, aby usunąć detergent SDS i umyj fragmenty trzykrotnie trzema mililitrami hipotonicznego buforu do płukania z 20-minutowym mieszaniem za każdym razem. Zastąp roztwór studzienek dwoma mililitrami roztworu DNazy i inkubuj fragmenty tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny z mieszaniem. Po usunięciu roztworu DNazy, przemyj fragmenty trzykrotnie trzema mililitrami PBS z 20-minutowym mieszaniem za każdym razem, pozostawiając ostatnie płukanie na noc.Do kolby T-25 wysianej subkonfluentnymi komórkami C2C12 dodać 500 mikrolitrów trypsyny i ponownie zawiesić w jednym mililitrze kompletnej pożywki. Wymieszaj 10 mikrolitrów zawiesiny z 10 mikrolitrami niebieskiego barwnika trypanowego i załaduj do hemocytometru, aby policzyć liczbę komórek i oszacować żywotność. W okapie z przepływem laminarnym umieść bezkomórkowe matryce lub dECM na szalce Petriego zawierającej PBS z 1% penicyliną i streptomycyną.Za pomocą mikroskalpela i pęsety podziel matryce na małe kawałki. Przenieś fragmenty do dołków 96-dołkowej płytki, umieszczając od trzech do czterech kawałków w dołku. Dodaj 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki hodowlanej do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Wyrzucić pożywkę z płytki studzienki i dodać 200 mikrolitrów kompletnej pożywki hodowlanej zawierającej 50 000 żywotnych komórek C2C12 do każdej studzienki. Inkubuj płytkę studzienki przez dwa dni. Przenieść dECM wraz z komórkami na 48-dołkową płytkę zawierającą 400 mikrolitrów kompletnej pożywki hodowlanej.Ostrożnie odsysać pożywkę co dwa dni, aby zapobiec oderwaniu się matrycy i uzupełniać świeżą pożywką do ósmego dnia. W celu różnicowania należy zastąpić całą pożywkę hodowlaną pożywką różnicującą i inkubować przez cztery dni do 12 dnia. Tkanka mięśniowa była czerwonawa natychmiast po izolacji i stała się biała z powodu lizy komórek po inkubacji w buforze hipotonicznym.SDS powoduje, że mięśnie stają się przezroczyste. Po leczeniu DNazą uzyskano mniejszy, przezroczysty dECM. Kwantyfikacja DNA ujawnia prawie 100% spadek dECM w porównaniu z tkanką natywną.dECM i tkanka natywna wykazywały podobne barwienie kanalikowe dla lamininy alfa dwa i białka lamininy. Analiza Western blot tkanki natywnej wykazała dwa prążki dla podjednostki lamininy alfa dwa, podczas gdy w dECM wykryto trzy mniejsze prążki. W przypadku całkowitych laminin próbki dECM wykazywały fragmentację białka w porównaniu z tkanką natywną.Fibronektyna i kolagen I były obecne w przestrzeni śródmiąższowej między komórkami tkanki natywnej a dECM. Podobne prążki fibronektyny były obecne w obu próbkach, co wskazuje, że decelularyzacja nie ma na nią wpływu. W dECM zaobserwowano mniej prążków kolagenu I.W przypadku kolagenu dożylnego obie próbki wykazały podobne zabarwienie kanalików. Jednak masa cząsteczkowa prążków dECM była niższa. Komórki C2C12 skolonizowały i namnażały się w dECM i połączyły się w wielojądrowe miotuby.Białka te ulegały ekspresji białka o łańcuchu ciężkim od miozyny po czterech dniach inkubacji w pożywce różnicowej. Zabarwienie wewnątrzkomórkowe i okołokomórkowe zaobserwowano dla lamininy alfa dwułańcuchowej, lamininy całkowitej i fibronektyny. Bezkomórkowe rusztowania szkieletowe płodów myszy mogą być wykorzystywane do wzrostu komórek w systemach kohodowli, zbliżając je do sytuacji in vivo, a tym samym przyczyniając się do zrozumienia chorób mięśni.

preparation-3d-decellularized-matrices-from-fetal-mouse-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejsza praca szczegółowo opisuje przygotowanie trójwymiarowych (3D) rusztowań fibrynowych do hodowli i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych. Takie rusztowania mogą być wykorzystywane do badania wpływu różnych związków biologicznych na zachowanie komórek macierzystych, a także modyfikowane w celu włączenia systemów dostarczania leków.

Przygotowanie trójwymiarowych rusztowań fibrynowych do zastosowań w hodowli komórek macierzystych

Sztucznie wytworzona tkanka mięśniowa ma ogromny potencjał w medycynie regeneracyjnej, jako model chorób, a także jako alternatywne źródło mięsa. W niniejszej pracy opisujemy proces tworzenia konstruktu mięśniowego, w tym przypadku z progenitorowych mioblastów mysich, oraz jego stymulację impulsami elektrycznymi.

Inżynieria tkanek mięśni szkieletowych z murynych komórek progenitorowych mioblastów i zastosowanie stymulacji elektrycznej

Do tej pory, grube ubytki tkanek są zazwyczaj rekonstruowane za pomocą autologicznych płatów tkankowych lub tkanek zmodyfikowanych. W niniejszym protokole przedstawiamy nową metodę inżynierii unaczynionego płata tkankowego z autologiczną szypułką, która ma służyć jako substytut płatów autologicznych.

Zaprojektowana unaczyniona płat mięśniowa

W tych badaniach podajemy metodologię nowatorskich, noworodkowych, mysich rusztowań serca do wykorzystania w badaniach regeneracyjnych.

Rusztowania serca noworodków: nowe matryce do badań regeneracyjnych

Tkankowa matryca zewnątrzkomórkowa (ECM) jest kluczowym mediatorem funkcji komórki. W artykule opisano metody syntezy czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM, które są stabilne w hodowli bez konieczności sieciowania chemicznego do zastosowań w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Macierz zewnątrzkomórkowa serca (ECM) to złożona sieć molekuł, które zarządzają kluczowymi procesami w tkankach i organach, jednocześnie znosząc fizjologiczną przebudowę przez całe życie. Standaryzowana decelularyzacja serc płodów i dorosłych pozwala na porównawcze badania eksperymentalne obu tkanek w kontekście 3D poprzez uchwycenie natywnej architektury i właściwości biomechanicznych.

Porównywalna decelularyzacja eksplantatów tkanek serca płodu i dorosłych jako platformy podobne do 3D do badań in vitro

Ten protokół opisuje produkcję filamentu polikaprolaktonu (PCL) z wbudowanymi mikrosferami kwasu polimlekowego (PLA), które zawierają matryce decelularyzowane (DM) do druku 3D strukturalnych konstrukcji inżynierii tkankowej.

Nowatorski proces druku 3D matryc bezkomórkowych

Celem tego protokołu jest produkcja całych włókien macierzy zewnątrzkomórkowej przeznaczonych do gojenia ran, które są odpowiednie do oceny przedklinicznej jako część regeneracyjnego implantu rusztowania. Włókna te są wytwarzane przez hodowlę fibroblastów na membranach z pustych włókien i ekstrahowane przez rozpuszczenie błon.

Produkcja włókien macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez protektorową hodowlę komórek z pustych włókien

Precyzyjna identyfikacja fibro-adipogennych komórek progenitorowych (FAP) i komórek macierzystych mięśni (MuSCs) jest kluczowa dla badania ich funkcji biologicznej w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące izolacji, oczyszczania i hodowli FAP i MuSC z mięśni dorosłych myszy.

FACS-Izolacja i hodowla włóknisto-adipogennych progenitorów i mięśniowych komórek macierzystych z niezakłóconych i uszkodzonych mięśni szkieletowych myszy

Ten protokół dostarcza metod generowania tkanek serca i mięśni szkieletowych w inżynierii 3D oraz opisuje ich zastosowanie w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków. Opisane metody wykorzystują system detekcji magnetycznej, aby ułatwić jednoczesną ocenę 24 tkanek równolegle.

Przedkliniczne testy leków w skalowalnych tkankach mięśniowych modyfikowanych w 3D

Ten protokół opisuje wytwarzanie 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem ludzkich osteocytów osadzanych w żelach metacrylanowych żelatyny (GelMA) uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową. Metoda ta jest nisko kosztowa, skalowalna i kompatybilna z podstawowym sprzętem laboratoryjnym, zapewniając platformę translacyjną do badania procesów chorobowych układu mięśniowo-szkieletowego.

Platforma hodowli kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

Poznaj protokół dekompozycji mięśni szkieletowych płodu myszy w celu uzyskania trójwymiarowych matryc bezkomórkowych. Ta metoda umożliwia hodowlę myoblastów C2C12 i badanie miopatii wrodzonych.

Przygotowanie 3D bezkomórkowych matryc z mięśni szkieletowych płodu myszy do hodowli komórkowej

Przeglądaj więcej filmów