Przygotowanie 3D bezkomórkowych matryc z mięśni szkieletowych płodu myszy do hodowli komórkowej

Według naszej wiedzy, protokół ten jest pierwszym, w którym wyprodukowano bezkomórkowe matryce z mięśni szkieletowych płodu, zapewniając nowatorskie podejście do badania miopatii, które zaczynają rozwijać się w macicy. Protokół ten generuje wskaźniki rozwojowe i specyficzne dla tkanki, które można wykorzystać do badania zachowania komórek mięśniowych i interakcji z macierzą zewnątrzkomórkową w kontrolowanym środowisku. LAMA2-CMD to wrodzona dystrofia mięśniowa, która zaczyna objawiać się po urodzeniu.

Model ten może pomóc w rozwikłaniu mechanizmów związanych z jego wystąpieniem i doprowadzić do opracowania nowych terapii celowanych. Protokół ten można dostosować do różnych tkanek i modeli chorób. W zależności od typu matrycy i komórek można osiągnąć różne poziomy złożoności, co świadczy o wszechstronności systemu.

Jest to bardzo prosty protokół. Najtrudniejszą częścią jest pobieranie i obchodzenie się z próbkami. Ale wraz z praktyką umiejętności techniczne można łatwo poprawić.

Zacznij od przeniesienia jednego uśpionego płodu na raz na szalkę Petriego zawierającą lodowaty PBS. Po wycięciu skóry i kończyn przeciąć brzuszną stronę klatki piersiowej. Usuń mostek i leżące pod nim narządy.

Ułóż płód grzbietem do góry i usuń szyjną część kręgosłupa. Następnie wytnij złogi tłuszczu na grzbiecie i tkankę łączną mięśni głębokiej pleców. Teraz zakotwicz klatkę piersiową za pomocą kleszczy chirurgicznych.

Za pomocą mikroskalpela ostrożnie zeskrob, aby oderwać głębokie mięśnie pleców od otaczającej tkanki. Przechowuj tkanki w PBS na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Przez dłuższy czas przechowuj tkankę w pustej probówce do mikrowirówek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Pierwszego dnia należy stosować całe masy mięśniowe epoksjowe. Dodaj trzy mililitry hipotonicznego buforu zawierającego 1% penicyliny i streptomycyny do każdego dołka 12-dołkowej płytki. Dodaj fragment tkanki mięśniowej do każdego dołka i inkubuj przez noc przez 18 godzin z mieszaniem.

Drugiego dnia usunąć bufor za pomocą pipety z cienką końcówką. Teraz przemyj próbki trzy razy trzema mililitrami PBS, za każdym razem mieszając przez godzinę. Po odrzuceniu PBS inkubować próbki w trzech mililitrach 0,05% roztworu detergentu SDS przez 24 godziny z mieszaniem.

Trzeciego dnia użyj pipety z cienką końcówką, aby usunąć detergent SDS i umyj fragmenty trzykrotnie trzema mililitrami hipotonicznego buforu do płukania z 20-minutowym mieszaniem za każdym razem. Zastąp roztwór studzienek dwoma mililitrami roztworu DNazy i inkubuj fragmenty tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny z mieszaniem. Po usunięciu roztworu DNazy, przemyj fragmenty trzykrotnie trzema mililitrami PBS z 20-minutowym mieszaniem za każdym razem, pozostawiając ostatnie płukanie na noc.

Do kolby T-25 wysianej subkonfluentnymi komórkami C2C12 dodać 500 mikrolitrów trypsyny i ponownie zawiesić w jednym mililitrze kompletnej pożywki. Wymieszaj 10 mikrolitrów zawiesiny z 10 mikrolitrami niebieskiego barwnika trypanowego i załaduj do hemocytometru, aby policzyć liczbę komórek i oszacować żywotność. W okapie z przepływem laminarnym umieść bezkomórkowe matryce lub dECM na szalce Petriego zawierającej PBS z 1% penicyliną i streptomycyną.

Za pomocą mikroskalpela i pęsety podziel matryce na małe kawałki. Przenieś fragmenty do dołków 96-dołkowej płytki, umieszczając od trzech do czterech kawałków w dołku. Dodaj 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki hodowlanej do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Wyrzucić pożywkę z płytki studzienki i dodać 200 mikrolitrów kompletnej pożywki hodowlanej zawierającej 50 000 żywotnych komórek C2C12 do każdej studzienki. Inkubuj płytkę studzienki przez dwa dni. Przenieść dECM wraz z komórkami na 48-dołkową płytkę zawierającą 400 mikrolitrów kompletnej pożywki hodowlanej.

Ostrożnie odsysać pożywkę co dwa dni, aby zapobiec oderwaniu się matrycy i uzupełniać świeżą pożywką do ósmego dnia. W celu różnicowania należy zastąpić całą pożywkę hodowlaną pożywką różnicującą i inkubować przez cztery dni do 12 dnia. Tkanka mięśniowa była czerwonawa natychmiast po izolacji i stała się biała z powodu lizy komórek po inkubacji w buforze hipotonicznym.

SDS powoduje, że mięśnie stają się przezroczyste. Po leczeniu DNazą uzyskano mniejszy, przezroczysty dECM. Kwantyfikacja DNA ujawnia prawie 100% spadek dECM w porównaniu z tkanką natywną.

dECM i tkanka natywna wykazywały podobne barwienie kanalikowe dla lamininy alfa dwa i białka lamininy. Analiza Western blot tkanki natywnej wykazała dwa prążki dla podjednostki lamininy alfa dwa, podczas gdy w dECM wykryto trzy mniejsze prążki. W przypadku całkowitych laminin próbki dECM wykazywały fragmentację białka w porównaniu z tkanką natywną.

Fibronektyna i kolagen I były obecne w przestrzeni śródmiąższowej między komórkami tkanki natywnej a dECM. Podobne prążki fibronektyny były obecne w obu próbkach, co wskazuje, że decelularyzacja nie ma na nią wpływu. W dECM zaobserwowano mniej prążków kolagenu I.

W przypadku kolagenu dożylnego obie próbki wykazały podobne zabarwienie kanalików. Jednak masa cząsteczkowa prążków dECM była niższa. Komórki C2C12 skolonizowały i namnażały się w dECM i połączyły się w wielojądrowe miotuby.

Białka te ulegały ekspresji białka o łańcuchu ciężkim od miozyny po czterech dniach inkubacji w pożywce różnicowej. Zabarwienie wewnątrzkomórkowe i okołokomórkowe zaobserwowano dla lamininy alfa dwułańcuchowej, lamininy całkowitej i fibronektyny. Bezkomórkowe rusztowania szkieletowe płodów myszy mogą być wykorzystywane do wzrostu komórek w systemach kohodowli, zbliżając je do sytuacji in vivo, a tym samym przyczyniając się do zrozumienia chorób mięśni.